Este protocolo detalla el uso de larvas de Drosophila para identificar compuestos anticonvulsivos únicos para el tratamiento de la epilepsia.
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Artículo de método
Actividad convulsiva inducida por electrochoque en larvas de Drosophila
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Resumen
Resumen
La epilepsia presenta una importante carga para la salud que se ve agravada por el elevado número de individuos refractarios a los fármacos. Si bien algunos pacientes refractarios a los medicamentos responden a tratamientos no farmacológicos (por ejemplo, estimulación del nervio vago, dieta cetogénica, etc.), el último recurso para muchos es la cirugía desafiante y costosa para aliviar las convulsiones. Si bien en general se reconoce que se requieren medicamentos anticonvulsivos con una gama más amplia de objetivos, el obstáculo para lograrlo es la identificación de nuevos objetivos farmacológicos. Los modelos de animales genéticamente manejables son prometedores en este sentido. La mosca de la fruta, Drosophila melanogaster, se ha convertido en un poderoso modelo para investigar las bases mecanicistas de las convulsiones y mejores tratamientos para ellas. Muchas mutaciones identificadas en moscas dan lugar a que las larvas y los adultos presenten una actividad similar a la de las convulsiones en respuesta a una fuerte estimulación (eléctrica, mecánica y/o térmica). Muchas de estas mutaciones se encuentran en genes homólogos a los que contribuyen a las epilepsias genéticas humanas (por ejemplo, el canal Na+ dependiente de voltaje). Ahora también es posible reemplazar un gen de mosca con su equivalente humano que, además, porta una mutación relacionada con la enfermedad. Así, la humilde mosca se ha convertido en un avatar para modelar la enfermedad humana. Este estudio describe un método adecuado para utilizar larvas de Drosophila para el cribado de fármacos de bajo a medio rendimiento con el fin de identificar compuestos únicos, y sus objetivos, que tienen potencial anticonvulsivo.
Introducción
La epilepsia sigue siendo una carga importante para la salud, que afecta aproximadamente al 1% de la población mundial. A pesar de que ahora existen más de 30 medicamentos anticonvulsivos (ASM) para el tratamiento clínico, alrededor de un tercio de las personas con epilepsia siguen siendo refractarias a los medicamentos, lo que significa que no responden bien al tratamiento farmacológico 1,2. Además, los fármacos disponibles son solo paliativos y, como tales, no previenen la epileptogénesis ni proporcionan una cura3. Por lo tanto, existe una necesidad crítica de identificar mejores tratamientos para la epilepsia. Un obstáculo para el desarrollo de tratamientos más eficaces es la identificación de nuevas dianas farmacológicas. De hecho, casi todos los ASMs actuales afectan a objetivos similares: canales iónicos, incluido el canal de sodio dependiente de voltaje (Nav), y neurotransmisión inhibitoria mediada por ácido γ-aminobutírico (GABA)4,5. Es generalmente aceptado que es poco probable que el uso continuado de los métodos tradicionales de desarrollo de fármacos cambie radicalmente este escenario.
Los animales modelo de laboratorio, incluyendo, pero no limitado a, la mosca de la fruta Drosophila melanogaster y el pez cebra Danio rerio, tienen utilidad para la identificación de nuevas ASMs 6,7,8. De hecho, una búsqueda en PubMed de 'Drosophila + seizure' arroja 342 resultados, mientras que la misma búsqueda de pez cebra devuelve 578 resultados (ambas búsquedas se realizaron el 29de enero de 2025). Aunque se ve empequeñecido por el número de estudios similares en ratones (~15.000), el número de estudios que utilizan sistemas modelo sigue creciendo. Estos estudios son posibles debido a la conservación mecanicista de la función del SNC en todos los filos. Además, las convulsiones inducidas en moscas y peces se tratan eficazmente con ASMs utilizados clínicamente, lo que demuestra que, si bien los matices del comportamiento convulsivo pueden parecer externamente diferentes, los mecanismos subyacentes tienen mucho en común 7,9,10.
La mosca de la fruta, Drosophila, ha hecho muchas contribuciones fundamentales para comprender la biología humana. Con respecto a la epilepsia, este sistema modelo proporciona una caja de herramientas genéticas sin precedentes combinada con neuronas identificables y experimentalmente accesibles7. Además, ya se han publicado los conectomas tanto para el SNC larvario como para el adulto, y se han identificado numerosas líneas de impulsores genéticos específicos de la célula11,12. Significativamente, se identificó fortuitamente una clase de mutación en la que las moscas adultas responden a una fuerte estimulación mecánica mediante una pérdida de postura y una actividad similar a las convulsiones (por ejemplo, zumbido de las alas, sacudidas de las patas, etc.). Esta clase de mutación se ha denominado "sensible al bang"13,14,15,16. Desde entonces, se ha identificado una segunda clase de mutación convulsiva que responde al aumento de la temperatura, reflejando las convulsiones febriles humanas17,18. Sin embargo, la manejabilidad experimental de las moscas adultas es algo reducida en comparación con la etapa larvaria de este mismo modelo de insecto. Por ejemplo, puede ser difícil alimentar con medicamentos a las moscas adultas, y las técnicas más invasivas, como la electrofisiología y la optogenética, pueden ser más desafiantes. Por el contrario, la larva de Drosophila come constantemente para expandir su volumen corporal ~ 100 veces en solo 5 días para permitir la pupa. Por lo tanto, podemos estar seguros de una alimentación farmacológica adecuada en las etapas larvarias. La embriogénesis está bien documentada y puede ser estadificada con precisión, y a su vez ha identificado hitos clave en el desarrollo del SNC, incluyendo la primera adquisición de propiedades eléctricas neuronales hastala formación de circuitos. Una vez eclosionada, una larva pasa por 3 mudas (o estadios) hasta que, en el día 5, se convierte en "vagabunda", momento en el que deja la comida para encontrar un lugar seguro para pupar. Después de ~100 h de pupa, una mosca adulta emerge con un nuevo cuerpo y SNC (Figura 1).
Las técnicas para inducir convulsiones en adultos no son adecuadas para las etapas larvarias. Las larvas carecen de pelos sensoriales, cuya activación sincronizada durante la estimulación mecánica puede provocar una convulsión. Por lo tanto, para superar estas dificultades, se desarrolló una técnica de electrochoque para inducir convulsiones en la etapa larvaria errante. El análisis comparativo posterior de las técnicas de inducción de convulsiones tanto en larvas como en adultos revela que el electrochoque larvario depende mucho menos del tipo de mutación (por ejemplo, sensible a la explosión frente a la temperatura). Por lo tanto, sugerimos que esta técnica debería ser el método preferido para probar nuevas mutaciones en las que se desconoce el método óptimo de inducción de convulsiones20. La técnica de electrochoque larvario es sencilla, rápida y requiere un equipo mínimo. Esta técnica proporciona un medio eficiente para detectar nuevos compuestos, o terapias genéticas, para determinar la eficacia anticonvulsiva en una variedad de mutaciones que reflejan la diversidad genética de la epilepsia humana.
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Protocolo
La mosca de la fruta, Drosophila melanogaster, se utiliza en este estudio (consulte la sección de Resultados para obtener más detalles). Esta técnica es la más adecuada para las larvas errantes de tercer estadio (L3). El protocolo experimental es relativamente simple, pero requiere práctica para perfeccionarlo. En nuestra experiencia, los nuevos estudiantes necesitan alrededor de 2 semanas para dominar el ensayo y se benefician enormemente de ver a otros investigadores más experimentados realizar el ensayo en tiempo real utilizando un microscopio de disección con cámara o similar. Los reactivos y el equipo utilizado en este estudio se enumeran en la Tabla de Materiales.
1. Selección de larvas
- Recoja las larvas de los lados de los viales/frascos para moscas que contengan alimento estándar (5 L de agua, 390 g de glucosa, 360 g de maíz, 250 g de levadura, 40 g de agar, 135 mL de nipagina, 15 mL de ácido propiónico).
- Utilice únicamente larvas que se estén moviendo activamente y que hayan dejado que la comida se arrastre por los lados del recipiente (tercer estadio errante, L3). No seleccione pre-pupas, que exhiben una locomoción muy reducida.
2. Procedimiento de electrochoque
- Retire un solo L3 errante y transfiéralo a una pequeña placa de Petri de plástico (el tamaño no importa) y lávelo suavemente con ddH2O para eliminar los residuos de comida. Un pincel pequeño (000) es adecuado para esto.
- Transfiera la larva lavada individualmente, con un pincel, a un plato de plástico vacío (nuevamente, el tamaño no importa). Seque la larva con un pequeño fragmento de toalla de papel sostenido con pinzas. Retire el exceso de ddH2O, pero no seque completamente las larvas para evitar que se peguen al plato de plástico.
- Deje que la larva se recupere durante 30 s. Esto facilitará la colocación de la sonda de electrochoque (ver más abajo).
- Observe las larvas bajo un microscopio de disección de baja potencia (15-20x) y, una vez que se reanude el comportamiento normal de gateo, coloque suavemente la sonda de electrochoque (consulte el paso 3 para obtener detalles y la Figura 2A) en la superficie dorsal anterior de la larva por encima de la posición aproximada del SNC (consulte la Figura 2C).
NOTA: Este paso es crítico, se debe aplicar suficiente presión para proporcionar una buena conductividad entre el alambre de la sonda y la cutícula, pero tenga cuidado de no dañar las larvas. Por lo tanto, aplaste la larva entre un tercio y la mitad de su profundidad. - Aplique un pulso de 2 s de voltaje constante, cuya intensidad se ha predeterminado a través de una curva de valoración (Figura 3). Cualquier estimulador de voltaje aislado es adecuado aquí. El que se usa aquí se muestra en la Figura 2B.
- Después de la descarga eléctrica, inicie un temporizador. En respuesta al choque, las larvas inician una parálisis transitoria seguida de espasmos ocasionales de la actividad muscular de la pared corporal y el comportamiento de balanceo, deteniendo el comportamiento normal de gateo.
- Detenga el temporizador cuando la larva se haya alejado claramente de su ubicación original en el plato. La duración de la convulsión, o tiempo de recuperación (RT), se define como el período entre el inicio del estímulo y la reanudación del comportamiento normal de gateo (p. ej., una onda peristáltica completa hacia adelante que resulta en un movimiento hacia adelante).
- Al final de cada día, limpie cuidadosamente los cables de la sonda enjuagándolos primero con etanol al 100% seguido de ddH2O. Inspeccione cuidadosamente los cables con aumento y, si es necesario, use pinzas para raspar suavemente cualquier residuo de los cables. Tenga mucho cuidado de no alterar la distancia entre los dos cables al hacerlo.
3. Construcción de la sonda de electrochoque
- Se requerirán 2 x 1 m de longitud de cable eléctrico (debe ser delgado y flexible, es decir, con una capacidad nominal de ~ 3 A). Hasta el extremo de cada cable, suelde un alambre de tungsteno de 5 cm de longitud (para maximizar el contacto, enrolle el alambre de tungsteno alrededor de un extremo expuesto del cable eléctrico antes de soldar). Suelde conectores de ajuste a presión (por ejemplo, enchufes tipo banana) al otro extremo de los cables, adecuados para una fácil conexión al estimulador de voltaje.
- Asegure ambos cables de tungsteno a un portaelectrodos de manera que los cables queden paralelos entre sí (Figura 2). Se utilizan pequeñas secciones de capilares de vidrio (~2 cm de longitud) para mantener los cables en su lugar debajo del tornillo de bloqueo de la sonda.
- Use pinzas para doblar los alambres de manera que lleguen a una distancia de 1 a 2 mm cerca de donde salen del soporte del cable. Doblar los alambres de tungsteno no es fácil porque los alambres conservan una "memoria", por lo que se requiere perseverancia. Los consejos para ayudar en este proceso incluyen el uso de cinta aislante eléctrica y/o blu-tack (o masilla de modelar similar) para ayudar a mantener los cables en la orientación/distancia correcta.
4. Calibración de la sonda
- Asegúrese de que haya poblaciones de L3 errante de un tipo silvestre adecuado (control negativo) y de un mutante convulsivo (control positivo). Se necesitarán ~ 100 de cada uno.
- Prepare las larvas, una a la vez, como se describió anteriormente.
- Utilice la sonda para aplicar un rango de voltajes a suficientes larvas de cada genotipo para cada voltaje probado. Se sugiere aplicar 0 V, 2 V, 4 V, 6 V, 8 V, 10 V y 12 V durante 2 s entre 10-15 larvas por voltaje. Electrocuta a cada larva solo una vez.
- Mida el tiempo de recuperación de cada larva y calcule el promedio de cada paso de voltaje aplicado para ambos genotipos.
- Traza los promedios en un gráfico y ajusta los datos con una línea recta.
- Seleccione un voltaje con una diferencia clara y significativa entre el mutante de control y el mutante de convulsión. Tenga cuidado de no elegir un voltaje que produzca un tiempo de recuperación demasiado largo; De lo contrario, la productividad se verá afectada debido al largo tiempo de espera para la recuperación.
NOTA: Este estudio utilizó a menudo un voltaje de estimulación que da como resultado un tiempo de recuperación de 50-100 s para el tipo salvaje y de 200-300 s para el tipo salvaje. En la Figura 3 se muestran ejemplos de curvas de calibración. Es importante usar 0 V para tener en cuenta el acto de presionar la sonda sobre la superficie dorsal de una larva. Esto causará cierto grado de parálisis, que probablemente sea un mecanismo de defensa de la larva.
5. Ejecución de experimentos
- Larva de electroshock del genotipo(s) deseado(s) o exposición al fármaco y medir el tiempo de recuperación de las convulsiones.
NOTA: Para las larvas de prueba, un n = 20 suele ser suficiente, pero un cálculo de potencia basado en un análisis piloto proporcionará un número n más definitivo. - Ejecute siempre un control negativo (p. ej., de tipo salvaje) y uno positivo (p. ej., parabss) durante cada experimento. No es necesario que los números n sean altos; n = 5 es suficiente. Esto proporcionará la confianza de que el ensayo ha funcionado como se esperaba (por ejemplo, sin problemas con la sonda o el estimulador).
- Aplique un punto de corte (por ejemplo, 300 s) para evitar tiempos de recuperación demasiado largos y considere solo las convulsiones cuantificables como aquellas con tiempos de recuperación superiores a 30 s.
6. Detección de drogas
- Agregue medicamentos, disueltos en un solvente apropiado, directamente a la superficie del alimento y deje que se absorban (y si usa etanol, tiempo para la evaporación del solvente). O, alternativamente, se puede agregar un medicamento (en el solvente apropiado) a la comida para moscas derretida. Consulte la sección Resultados para obtener más información.
- Para agregar el medicamento a los alimentos derretidos, saque los alimentos de los viales, vuelva a derretirlos y, a medida que los alimentos se enfríen a 40 °C, agregue el medicamento, mezcle con un mezclador de vórtice y luego vuelva a verter 5 ml de alimentos derretidos en viales y deje enfriar antes de usar.
- Ejecute un gradiente de concentración para identificar la concentración óptima del fármaco.
NOTA: Un buen punto de partida es añadir 3 mM de solución de fármaco, ya sea directamente sobre la superficie del alimento (200 μL por vial estándar de Drosophila ) o para hacer una concentración de 3 mM en el alimento derretido. Se puede permitir que las hembras adultas pongan huevos directamente en este alimento, o se pueden agregar larvas en etapas seleccionadas según sea necesario. El disolvente o disolventes utilizados deben añadirse solos a los viales seleccionados como control del vehículo.
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Resultados
Numerosas mutaciones de Drosophila exhiben un comportamiento similar a las convulsiones 7,20. La base genética de estas mutaciones es variada, lo que imita favorablemente las causas genéticas igualmente variadas de la epilepsia humana. Tres de las mutaciones de Drosophila más estudiadas son parabangsenseless (parabss), julius seizure (jus) y easy-shock (eas). La mutación...
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Discusión
El método de electrochoque para inducir convulsiones en larvas de Drosophila proporciona un cribado simple pero eficiente para identificar nuevos compuestos anticonvulsivos o manipulaciones genéticas. Sin embargo, debido a que se trata de un ensayo cualitativo, su principal limitación es que el método no puede identificar fácilmente tamaños de efecto pequeños. Sin embargo, el rendimiento medio que permite, que se presta para cribar hasta ~5 compuestos por semana, por investigado...
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Divulgaciones
Los autores declaran no tener intereses contrapuestos.
Agradecimientos
Agradecemos a todo el personal del laboratorio Baines que ha desarrollado conjuntamente esta técnica durante muchos años y, en particular, a Richard Marley, que se ha esforzado mucho para que esta técnica sea robusta y fiable. Agradecemos a Anna Munro por dibujar las larvas, que se muestran en la Figura 2. El trabajo en el laboratorio de Baines que ha contribuido al desarrollo de esta técnica ha sido generosamente apoyado por BBSRC, MRC y Wellcome Trust. Este trabajo cuenta actualmente con el apoyo financiero de una beca de investigación del Wellcome Trust a R.A.B. (Grant 217099/Z/19/Z). El desarrollo de esta técnica también se benefició del Manchester Fly Facility, que se estableció con fondos de la Universidad y el Wellcome Trust (Subvención 087742/Z/08/Z).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Portaelectrodo | Instrumentos de precisión mundial | M3301 | |
| Capilares de vidrio | Instrumentos de Harvard | GC100F-10 | |
| Alambre de tungsteno (99,95%) | Goodfellow Cambridge, Reino Unido | 0,1 mm de diámetro | |
| Estimulador de voltaje | Digitimer Ltd, Reino Unido | DS2A mkII | Estimulador aislado de voltaje constante |
Referencias
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