Medición de monofosfato de guanosina cíclico (cGMP) en tejidos sólidos mediante un ensayo competitivo de inmunoabsorción enzimática (ELISA)

Resumen

Este protocolo mide las concentraciones de monofosfato de guanosina cíclico (cGMP) en tejidos sólidos utilizando un ensayo competitivo de inmunoabsorción enzimática (ELISA). El protocolo describe cómo procesar tejido sólido, realizar ELISA competitivo, convertir las absorbancias a concentraciones de cGMP en picomoles por mililitro y calcular las concentraciones finales como nanomoles de cGMP por gramo de tejido.

Resumen

Una vía importante que produce monofosfato de guanosina cíclico (GMPc) es la vía del óxido nítrico (NO)-GMPc. En esta vía, el NO estimula la actividad catalítica de la guanilil ciclasa soluble (sGC), que convierte el trifosfato de guanosina en cGMP. El NO es de interés porque, en los mamíferos, actúa como vasodilatador principal, inhibidor de la agregación plaquetaria, mediador de la función inmunitaria, neurotransmisor y para mejorar la resistencia durante la actividad física, entre otras funciones fisiológicas. La medición de la abundancia de NO en diferentes tejidos podría ayudar a dilucidar sus funciones. Sin embargo, el NO no se puede medir directamente debido a su vida media de menos de unos segundos. Por lo general, los metabolitos del NO, nitrato y nitrito, se miden para estimar la abundancia del NO. Esto se debe a que estas moléculas pueden interconvertirse in vivo a través de reacciones redox. Un método menos común para estimar la abundancia de NO requiere medir la concentración de GMPc, una molécula de señalización aguas abajo del NO. Sin embargo, la medición del GMPc en los tejidos rara vez se realiza, a pesar de crear la posibilidad de comprender mejor las funciones del NO en los órganos. Por lo tanto, existe la necesidad de un protocolo para medir las concentraciones de cGMP en órganos y tejidos sólidos. En este protocolo, los tejidos porcinos recolectados se homogeneizaron, se realizó ELISA competitivo en muestras procesadas y las absorbancias se convirtieron en nanomoles de cGMP por gramo de tejido original. En resumen, este protocolo describe un método simplista para medir las concentraciones de cGMP en tejidos sólidos utilizando el kit ELISA GMP cíclico.

Introducción

El monofosfato de guanosina cíclico (GMPc) es una molécula de señalización capaz de inducir cambios fisiológicos a través de la vía del óxido nítrico (NO)-GMPc. En la vía NO-cGMP, el NO se une a la guanilil ciclasa soluble, una enzima citosólica que convierte el trifosfato de guanosina en cGMP, aumentando su actividad catalítica ^1,2. El aumento posterior de las concentraciones de GMPc activa vías de señalización que promueven la vasodilatación³, lo que conduce a una disminución de la presión arterial ^4,5, la principal respuesta fisiológica característica de la presencia de NO in vivo. Además, se sabe que el NO influye en la función inmunitaria⁶, mejora la resistencia durante la actividad física⁴ y previene la coagulación de la sangre al inhibir la agregación plaquetaria⁷.

La medición directa del NO se ve dificultada por su vida media in vivo⁸ de menos de segundos en la mayoría de los tejidos biológicos. En consecuencia, dilucidar los efectos fisiológicos del NO requiere un método para medir su abundancia ex vivo. Por lo tanto, los métodos cuantitativos utilizables evitan la medición directa del NO. Un método común para estimar las concentraciones de NO en los tejidos es medir los metabolitos más estables del NO: nitrito y nitrato 4,5,9,10,11. La principal complicación de utilizar las concentraciones de nitrito y nitrato como medidas de la abundancia de NO es que ambos metabolitos también sirven como precursores de NO y como molécula de almacenamiento, respectivamente. Los metabolitos del NO, especialmente el nitrato, son abundantes en ciertos alimentos. Por lo tanto, los cambios en las concentraciones de cGMP, siendo el cGMP aguas abajo del NO, son útiles para estimar las cantidades de NO activo, y la abundancia de NO se puede determinar sin la interferencia de nitrito y nitrato previamente presentes.

Investigaciones anteriores se han basado en la medición de las concentraciones de cGMP en plasma¹² y plaquetas¹³, pero menos comúnmente se observa la medición de las concentraciones de cGMP en tejidos sólidos. La capacidad de medir las concentraciones de GMPc en tejidos sólidos permitiría la caracterización de la actividad del NO en órganos específicos. El objetivo fue identificar un método simplista para medir el GMPc en tejidos sólidos utilizando ELISA competitivo. Una ventaja de usar ELISA competitivo es que requiere equipos que se encuentran comúnmente en la mayoría de los laboratorios interesados en el NO, como un lector de microplacas que se usa a menudo para otros fines. En comparación, algunos otros métodos de medición requieren equipos que se utilizan con poca frecuencia durante los experimentos centrados en el NO, como los microscopios^14,15, un contador de centelleo¹⁶ o un láser¹⁷. Además de su accesibilidad, la medición de cGMP con ELISA competitivo es sensible; Las concentraciones de cGMP se pueden detectar hasta 0,1 picomoles (pmol) de cGMP/mL¹⁸. Con pequeñas modificaciones en el protocolo¹⁸ del kit ELISA (Tabla de Materiales) cGMP, se estableció un método para medir las cGMP en tejidos sólidos utilizando ELISA competitivo.

Protocolo

Todos los procedimientos con animales se realizaron de acuerdo con el protocolo de Estudio en Animales de la Rama de Medicina Molecular aprobado por el Comité de Cuidado y Uso de Animales del NIDDK (ASP K049-MMB-23). La recolección de tejido siguió las pautas establecidas por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales del Instituto de Investigación en Salud MedStar (número de protocolo: 2006001373 2020-017). En el estudio se utilizaron cerdos cruzados de Yorkshire adultos jóvenes (dos machos y dos hembras), de 3 meses de edad y con un peso de entre 30 y 35 kg. La Figura 1 ilustra un esquema que muestra los pasos del protocolo del kit ELISA cGMP. Los reactivos y equipos utilizados en el estudio se enumeran en la Tabla de Materiales.

Figura 1: Esquema del protocolo. Un esquema que ilustra los pasos del protocolo del kit ELISA cGMP. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

1. Preparación de muestras de tejido

NOTA: Los tejidos se perfundieron con una solución de heparina sódica antes de la recolección y luego se almacenaron a -80 °C antes de su uso. Consulte Park et ^al.19 para obtener detalles sobre la recolección de las muestras de tejido.

1. Procesamiento de muestras de tejido
   1. Enfríe un pulverizador de pañuelos, pinzas y vierta hielo seco durante 10 minutos antes de comenzar el procedimiento.
   2. Pesar un exceso de tejido, ya que algunos pueden perderse durante la pulverización (rendimiento de alrededor del 90%).
      NOTA: Anteriormente, un exceso de 170 mg daba resultados exitosos. La masa se puede aumentar o disminuir, si se desea. Asegúrese de que la masa de tejido dé como resultado un volumen de muestra suficiente para las etapas de acetilación de la muestra de tejido y dilución de la muestra de tejido.
   3. Agregue el pañuelo al pulverizador sobre hielo seco.
   4. Congele rápidamente el tejido con nitrógeno líquido y permita que el nitrógeno líquido se vaporice por completo.
   5. Vuelva a colocar la tapa del pulverizador y golpéela con un mazo 15 veces.
      NOTA: Si la configuración del pulverizador no está disponible o no se puede usar, la muestra debe cortarse en trozos lo más pequeños posible con tijeras o un bisturí mientras se mantiene congelada o al menos refrigerada en hielo. Este paso asegura una buena homogeneización y es crucial, especialmente para los tejidos más duros.
   6. Tara un tubo homogeneizador de cuentas y transfiere el tejido pulverizado al tubo con la cuchara fría y las pinzas.
   7. Registre la masa del tejido agregado al tubo homogeneizador de perlas para convertir las concentraciones de molaridad a moles por masa más tarde. Mantenga la muestra en hielo.
   8. Al tubo de homogeneización, agregue un volumen en microlitros de ácido clorhídrico 0,1 N igual a un múltiplo de la masa de tejido en miligramos.
      NOTA: Las diluciones apropiadas hacen que las muestras medidas caigan en la curva estándar. Estas diluciones se encuentran para diferentes tipos de tejidos a través de prueba y error. En experimentos anteriores, una proporción de dilución de 1:10 para el tejido del músculo esquelético y una proporción de dilución de 1:5 para el tejido hepático dieron resultados exitosos. Como referencia, si se diluyen 100 mg de tejido, una proporción de dilución de 1:10 requeriría 1.000 μL de ácido clorhídrico 0,1 N, y una proporción de dilución de 1:5 requeriría 500 μL.
   9. Homogeneizar las muestras de tejido utilizando un molino de perlas, un homogeneizador o una técnica comparable.
      NOTA: De vez en cuando, enfríe la muestra durante la homogeneización con hielo. Si no se dispone de un homogeneizador de molino de bolas, se pueden sustituir por otros métodos de homogeneización que alteren eficazmente las células y creen un homogeneizado de tejidos, incluido el uso de un homogeneizador rotativo o un homogeneizador ultrasónico.
   10. La centrífuga homogeneiza durante 30 minutos a una velocidad de 17.000 x g manteniendo una temperatura de muestra de 4 °C.
       NOTA: Los homogeneizados de tejido muscular esquelético insuficientemente diluidos se vuelven demasiado viscosos y gelatinosos. Esto se puede ver mejor después de la centrifugación.
   11. Transfiera el sobrenadante a un tubo de microcentrífuga y centrifugue el sobrenadante durante 10 min a 17.000 x g manteniendo una temperatura de 4 °C.
   12. Transfiera una alícuota de sobrenadante a un tubo de microcentrífuga y mantenga la muestra en hielo.
       NOTA: La acetilación de 250 μL de sobrenadante dio resultados exitosos. Para pausar el protocolo, congele estas muestras a -80 °C y guárdelas hasta 48 h. Se recomienda que el volumen de sobrenadante para el proceso de acetilación se mida el día de la acetilación.

2. Preparación estándar

NOTA: Prepare los estándares el día de la preparación de la microplaca ELISA.

1. Preparación de tampones ELISA
   1. Agregue tampón concentrado ELISA 10x descongelado a una botella de vidrio que contenga 90 ml de agua ultrapura.
      NOTA: Tenga cuidado de enjuagar el concentrado tampón ELISA 10x residual con el tampón ELISA preparado y devuelva el tampón a la botella de vidrio. Almacenar a 4 °C durante un máximo de 2 meses.
2. Preparación de stock estándar
   1. Agregue 1 ml de tampón ELISA al vial estándar y agite para disolver.
      NOTA: Almacenar a 4 °C durante un máximo de 6 semanas.
3. Dilución en serie estándar
   1. Etiquete un tubo de estándar B y nueve tubos de estándar 0 a estándar 8.
   2. Agregue 9.9 mL de tampón ELISA al tubo etiquetado como estándar B.
   3. Transfiera 100 μL del material estándar (300 pmol/mL de cGMP) al tubo B estándar y vórtice a fondo.
   4. Transfiera 1.000 μL de la solución en el tubo estándar B al tubo estándar 1.
   5. Añada 500 μL de tampón ELISA al tubo etiquetado como estándar 0 y a los tubos etiquetados como estándar 2 a estándar 8.
   6. Patrón de vórtice 1 y, a continuación, transfiera 500 μl de solución del patrón 1 al estándar 2.
   7. Patrón de vórtice 2 y luego transfiera 500 μL de solución del estándar 2 al estándar 3.
   8. Continúe transfiriendo 500 μL del estándar n-1 al estándar n, asegurándose de vórtice los estándares a fondo después de cada adición.
   9. Deseche 500 μL de solución del estándar 8.
      NOTA: Asegúrese de utilizar los patrones de vórtice donde se especifican para una curva estándar óptima. Los patrones 0 a 8 tienen un volumen de 500 μL. Almacene los patrones a 4 °C hasta su uso. Utilizar patrones el día de su dilución.

3. Acetilación

NOTA: Durante la reacción de acetilación, se agrega un grupo acetilo al grupo hidroxilo 2' de la molécula de cGMP, lo que modifica la estructura de cGMP y conduce a un aumento en la afinidad de unión de los anticuerpos, mejorando la sensibilidad del ensayo ~ 10 veces. En muestras que contienen más de 1,0 pmol/mL de cGMP, las mediciones se pueden tomar sin acetilación y este paso se puede omitir. La necesidad de acetilación debe determinarse experimentalmente, caso por caso.

1. Preparación de hidróxido de potasio
   1. Agregue 10 ml de agua ultrapura a la botella de hidróxido de potasio para crear una solución de 4 M.
      NOTA: No tape el frasco ya que el hidróxido de potasio se disuelve. Almacene durante meses a temperatura ambiente.
2. Acetilación de muestras de tejido
   1. A una alícuota de 250 μL de la muestra, añadir 50 μL (5:1) de hidróxido de potasio 4 M y seguir rápidamente la adición con 12,5 μL (20:1) de anhídrido acético.
   2. Vórtice durante 15 s.
   3. Añada 12,5 μL de hidróxido de potasio 4 M a la muestra y al vórtice brevemente.
   4. Opcional: Si las muestras de músculo esquelético se solidifican siguiendo los pasos de acetilación, centrifugar las muestras a 17.000 x g durante 10 min.
3. Acetilación de patrones
   1. Al tubo etiquetado como estándar 0, agregue 100 μL de hidróxido de potasio 4 M, seguido inmediatamente de 25 μL de anhídrido acético.
   2. Vortex el estándar durante 15 s.
   3. Añada 25 μL de hidróxido de potasio 4 M al patrón y al vórtice brevemente.
   4. Repita estos pasos para el resto de las normas numeradas.
      NOTA: Agite todas las muestras y patrones durante la misma duración para garantizar resultados consistentes.

4. Dilución de la muestra de tejido

1. Agregue proporciones predeterminadas de tampón ELISA y una alícuota de muestra acetilada a un tubo de microcentrífuga.
   NOTA: Se requieren dos diluciones diferentes para cada muestra. Las proporciones de dilución que hacen que las concentraciones de cGMP medidas caigan en la curva estándar se encuentran mediante prueba y error. Las diluciones deben determinarse experimentalmente para cada tipo de tejido con el fin de que el porcentaje caiga entre el 20% y el 80%. En experimentos anteriores que midieron tejidos hepáticos, las proporciones de dilución de 1:2 y 1:3 produjeron resultados exitosos con los valores porcentuales apropiados. Estas proporciones también han dado resultados exitosos para el músculo esquelético. Sin embargo, las variaciones en el tejido muscular esquelético pueden requerir muestras más diluidas.
2. Opcional: Si se forma un precipitado cuando la muestra de tejido se añade al tampón ELISA, centrifugar la muestra durante 10 minutos a 17.000 x g.

5. Preparación de microplacas ELISA

1. Preparación del trazador de acetilcolinesterasa (AChE)
   1. Añada 6 ml de tampón ELISA al vial trazador de AChE y agite suavemente para disolver.
      NOTA: Almacene la muestra a 4 °C durante un máximo de 2 semanas. No haga vórtice.
2. Preparación del antisuero
   1. Agregue 6 ml de tampón ELISA al vial de Antiserum y agite suavemente para disolver.
      NOTA: Conservar a 4 °C durante al menos 4 semanas. No haga vórtice.
3. Incubación de muestras y estándar
   1. Estándar de vórtice 0.
   2. A la microplaca ELISA, agregue 50 μL de alícuotas estándar de 0 a 5 pocillos (NSB y B₀; Figura 2).
   3. A dos de los pozos (NSB; Figura 2) que contenga el estándar 0, agregue 50 μL de tampón ELISA.
   4. Utilice una punta de pipeta para añadir 50 μL de alícuotas de los patrones 1 a 8 a la microplaca ELISA por duplicado. Comience con el estándar más diluido (estándar 8) y luego continúe con el siguiente más diluido hasta que se agreguen todos los estándares.
      NOTA: Aspire y dispense cada patrón varias veces antes de agregarlo a un pocillo. Patrones de vórtice antes de agregarlos a los pozos.
   5. Agite cada muestra antes de agregar 50 μL de alícuotas en los pocillos por duplicado o triplicado.
   6. Agregue 50 μL de trazador de AChE a cada pocillo NSB, B₀, estándar y de muestra (Figura 2).
   7. Añadir 50 μL de antisuero a cada pocillo B₀, patrón y pocillo de muestra (Figura 2).
   8. Cubrir la microplaca ELISA e incubar a 4 °C durante 18 h.
      NOTA: Asegúrese de usar el vórtice siempre que se le indique para producir resultados consistentes.
4. Preparación del tampón de lavado
   1. A una botella de vidrio, agregue 200 ml de agua ultrapura y 500 μl de concentrado tampón de lavado 400x.
   2. Con una jeringa, agregue 100 μL de polisorbato 20 al frasco de vidrio.
   3. Agite suavemente el frasco para mezclar.
      NOTA: Guarde el tampón de lavado a 4 °C durante un máximo de 2 meses. Duplique los volúmenes de agua ultrapura, 400 veces el concentrado tampón de lavado y el polisorbato 20 para obtener una microplaca completa de muestras de 96 pocillos.
   4. Transfiera el tampón de lavado a una botella de lavado antes de usarlo.
5. Preparación de reactivos de Ellman
   NOTA: Prepare el día de la elaboración de la microplaca ELISA.
   1. A un recipiente protegido contra la luz, agregue 20 ml de agua ultrapura.
   2. Utilice una alícuota de agua ultrapura para disolver el reactivo de Ellman.
   3. Transfiera el reactivo de Ellman al recipiente protegido contra la luz.
   4. Use el reactivo de Ellman para enjuagar la botella en la que vino.
   5. Transfiera toda la solución de nuevo al recipiente protegido contra la luz con una pipeta.
6. Lavado de microplacas ELISA
   1. Deseche el contenido de la microplaca ELISA invirtiéndola. Asegúrese de que los pocillos se vacíen golpeando la microplaca ELISA invertida en una toalla de papel.
   2. Llene los pocillos con tampón de lavado usando la botella de lavado.
   3. Agite suavemente la microplaca ELISA durante 5 segundos y, a continuación, vierta el tampón de lavado y extraiga el líquido restante sobre una toalla de papel.
   4. Llene la microplaca ELISA con tampón de lavado, agite suavemente la microplaca ELISA durante 30 s y vierta su contenido. Repita esto cuatro veces, golpeando la microplaca ELISA en una toalla de papel después de cada descarga para eliminar el líquido restante.
      NOTA: Evite lecturas de absorbancia inexactas lavando a fondo la microplaca ELISA.
7. Desarrollo y lectura de microplacas ELISA
   1. Transfiera el reactivo de Ellman a un depósito.
   2. Trabajando rápidamente, utilice una pipeta multicanal para alícuota 200 μL de reactivo de Ellman en los pocillos blanco, NSB, B₀, TA, estándar y de muestra.
   3. Agregue 5 μL de trazador de AChE al pocillo de TA.
   4. Cubra la microplaca ELISA con parafilm, colóquela en un recipiente protegido de la luz e incube a temperatura ambiente durante 60-90 min con agitación.
      NOTA: Utilice los pocillos B₀ como indicadores del tiempo de incubación adecuado. Los pozos ideales B₀ aparecen visiblemente amarillos pero no oscuros.
   5. Retire la película de parafina y lea la microplaca ELISA a una densidad óptica de 412 nm.
      NOTA: Los pocillos B₀ con una absorbancia entre 0,3 UA y 1,0 UA, con los blancos restados, indican que la microplaca ELISA está adecuadamente desarrollada.
   6. Opcional: Si la microplaca ELISA está poco desarrollada, reemplace la película de parafina y deje que se incube en un recipiente protegido de la luz durante un período adicional. Si la microplaca ELISA está demasiado desarrollada, deseche el reactivo de Ellman, enjuague una vez con tampón de lavado y vuelva a desarrollar la microplaca de ELISA con el reactivo de Ellman.

Figura 2: Diseño de la microplaca. Un ejemplo de un diseño de microplaca para el competitivo ELISA. NSB indica un pozo de unión no específico. B₀ indica un pozo de unión máximo. TA indica un pozo de actividad total. Std. indica un pozo estándar con su número correspondiente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

6. Conversión a concentración

1. Cálculos de trazadores AChE enlazados
   1. Promedie las absorbancias de los dos espacios en blanco y reste el promedio de las absorbancias de cada pozo.
      NOTA: Utilice las absorbancias rescritas en blanco para el resto de los cálculos.
   2. Calcule las absorbancias promedio de los pozos NSB, B₀ y en blanco.
   3. Utilice la siguiente ecuación para calcular la absorbancia B₀ corregida:
      
      NOTA: Corr. significa corregido, Abs. representa absorbancia y Avg. representa promedio. Si la absorbancia promedio de los pozos en blanco (con el promedio en blanco restado) es un número negativo, use cero para el cálculo.
   4. Calcule la relación para cada patrón y muestra utilizando la siguiente ecuación:
      
   5. Multiplique la proporción de cada muestra por 100 para calcular el porcentaje .
      NOTA: Las muestras entre el 20% y el 80% caen en la curva estándar.
2. Cálculos de curvas estándar
   1. Promedie la proporción de los pozos duplicados de cada estándar (1 a 8).
   2. Calcule el logit de la relación promediada de cada patrón utilizando la siguiente ecuación:
      
   3. Usando las concentraciones conocidas de cada patrón (Tabla 1) como los valores X y el logit de cada patrón como los valores Y, calcule la pendiente y la intersección con el Y.
   4. Calcule el coeficiente de determinación utilizando el logaritmo₁₀ de las concentraciones estándar de cGMP conocidas como los valores X y el logit de cada patrón como los valores Y.
      NOTA: Verifique que el coeficiente de determinación esté cerca de 1.
3. Cálculos de concentración de cGMP en pmol/mL
   1. Calcule el logit de cada muestra utilizando la siguiente ecuación:
      
   2. Para calcular la concentración de GMPc en cada muestra (en picomoles de GMPc por mililitro de muestra), utilice la siguiente ecuación:
      
      NOTA: D.R. significa relación de dilución. La suma homogeneizada de D.R. para muestras de hígado diluidas con una proporción de dilución de 1:5 de ácido clorhídrico es igual a 6. La suma de Tampón D.R. para muestras de hígado diluidas con una proporción de dilución de 1:2 de Tampón ELISA es igual a 3. Por lo tanto, los términos agrupados entre paréntesis se multiplican por 18.
4. Cálculos de concentración de cGMP en nmol/g
   1. Calcule los nanomoles de cGMP por pozo con la siguiente ecuación:
      
   2. Calcule los gramos de tejido en cada muestra acetilada con la siguiente ecuación:
      
      NOTA: "mg de tejido" es la masa de tejido añadida al tubo de homogeneización en miligramos. "volumen de HCl utilizado" es el volumen de ácido clorhídrico 0,1 N utilizado para diluir las muestras para la homogeneización.
   3. Calcule los gramos de tejido en cada muestra diluida con tampón ELISA utilizando la siguiente ecuación:
      
      NOTA: "volumen de muestra diluida" es el volumen de muestra diluida por tampón ELISA. "250 μL" es el volumen de la muestra acetilada. Los "reactivos" mencionados son los reactivos de acetilación 4 M KOH y el anhídrido acético.
   4. Calcula los gramos de tejido por pocillo con la siguiente ecuación:
      
      NOTA: "volumen de tampón" es el volumen de tampón ELISA utilizado para diluir las muestras de tejido antes de añadir las muestras a los pocillos.
   5. Divida los nanomoles de GMPc por pocillo por los gramos de tejido por pocillo para calcular la concentración de GMPc en nmol/g.

Número estándar	Concentraciones de cGMP (pmol/mL)
Estándar 1	3.0
Estándar 2	1.5
Estándar 3	0.75
Estándar 4	0.375
Estándar 5	0.1875
Estándar 6	0.09375
Estándar 7	0.046875
Estándar 8	0.0234375

Tabla 1: Concentraciones estándar. Las concentraciones conocidas de los patrones 1 a 8.

Resultados

Los cerdos domésticos de Yorkshire tratados con cloruro de sodio en la dieta (0,15 mmol/kg) o nitrato marcado con ¹⁵N (0,15 mmol/kg) administrados una vez al día durante cinco días consecutivos como bolo en comida se perfundieron con una solución de heparina sódica (cloruro de sodio al 0,9%) antes de la recolección de tejidos; Todos los detalles de la colección fueron publicados previamente¹⁹. Las concentraciones de cGMP en los glúteos, los músculos y el hígado de cuatro cerdos domésticos de Yorkshire se midieron de acuerdo con el protocolo ELISA descrito. Los tejidos hepáticos se diluyeron en una proporción de dilución de 1:5, y los músculos glúteos en una proporción de dilución de 1:10, con ácido clorhídrico (HCl) 0,1 N para precipitar proteínas. Los homogeneizados diluidos en HCl se acetilaron y luego se diluyeron con tampón ELISA en una proporción de dilución de 1:2 y 1:3 para muestras de músculo hepático y glúteo. Las concentraciones de GMPc se midieron como se describió anteriormente. Las absorbancias se convirtieron en picomoles de cGMP por mililitro de muestra preparada y luego en nanomoles de cGMP por gramo de tejido (nmol/g de tejido) como se indica en el protocolo anterior.

Las concentraciones de GMPc medidas en los tejidos hepáticos produjeron resultados experimentales óptimos en las condiciones anteriores. Las concentraciones de GMPc en el grupo control y en el grupo tratado con nitrato en el hígado porcino son de 0,0202 nmol/g ± 0,003 nmol/g de tejido y de 0,0364 nmol/g ± 0,011 nmol/g de tejido, respectivamente (Figura 3). Varios valores confirman la fiabilidad de los resultados. Las absorbancias de los pocillos B₀ con los blancos restados, que oscilan entre 0,466 y 0,475, se encuentran dentro del rango de 0,3 UA a 1,0 UA, lo que verifica un desarrollo suficiente de microplacas con el reactivo de Ellman. La alta calidad de la curva estándar se manifiesta tanto en los aumentos incrementales de las absorbancias del estándar 1 al estándar 8 como en la linealidad de la curva estándar, verificada por un coeficiente de determinación de 0,99. El porcentaje por cada pozo medido (31,5%-71,2%) está entre el 20% y el 80%, lo que valida que todas las muestras caen en la curva estándar. Las muestras que poseen las características indicadas son aptas para la interpretación.

Las concentraciones de GMPc medidas en los tejidos musculares de los glúteos produjeron resultados experimentales subóptimos. La etiqueta de subóptimo se asigna a los resultados del músculo glúteo porque la mayoría de los valores porcentuales de los pocillos del músculo glúteo (3,69%-27,3%) cayeron por debajo del 20%, lo que indica que se necesitaron muestras más diluidas para que las absorbancias cayeran en la curva estándar. Las concentraciones de GMPc en el grupo control y en el grupo tratado con nitrato en el músculo glúteo porcino son de 1,22 nmol/g ± 0,49 nmol/g de tejido y de 0,732 nmol/g ± 0,18 nmol/g de tejido, respectivamente (gráfico no mostrado). Las muestras de músculo glúteo comparten las absorbancias de los pocillos y estándares B₀ de las muestras hepáticas. El uso de estas muestras subóptimas puede llevar a conclusiones incorrectas; por lo tanto, es necesario preparar muestras más diluidas y volver a medir las concentraciones de cGMP.

Figura 3: Concentración de GMPc en tejido hepático. Concentración media de GMPc del hígado porcino tratado con cloruro de sodio (0,15 mmol/kg) o nitrato marcado con ¹⁵N (0,15 mmol/kg) en nmol/g de tejido. n = 4; Las barras de error indican la desviación estándar; los datos se analizaron mediante la prueba t de Welch; ns no significa significación. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discusión

El protocolo proporciona instrucciones sobre los pasos necesarios para medir las concentraciones de cGMP en tejidos sólidos utilizando ELISA competitivo. Las variaciones en las concentraciones de cGMP pueden indicar diferencias en la abundancia de NO en los tejidos. Al investigar estas diferencias en los tejidos sólidos, se puede dilucidar la información sobre el NO en varios órganos.

En el protocolo, las muestras de tejido se homogeneizaron primero en preparación para el ELISA. Esto comenzó congelando rápidamente una masa de tejido sólido y luego pulverizándola. La ruptura de los tejidos antes de la etapa de homogeneización está destinada a ayudar al homogeneizador de perlas a lisar las células. Los tejidos se homogeneizaron en ácido clorhídrico 0,1 N para precipitar proteínas, técnica utilizada en otros métodos^20,21. Finalmente, los sólidos y el precipitado se separaron de los componentes solubles mediante centrifugación. Para hacer la curva estándar, se diluyó en serie un stock de cGMP (300 pmol de cGMP/mL) para hacer ocho patrones diferentes. Los patrones y las muestras se acetilaron para mejorar la sensibilidad del ensayo mediante la detección de concentraciones de hasta 0,1 pmol de cGMP/mL. Este aumento de la sensibilidad se logra cuando el grupo acetilo forma un enlace con el GMPc, mejorando la capacidad de cada anticuerpo (presente en el antisuero) para unirse al GMPc^{acetilado 18}. La acetilación tanto de los patrones como de las muestras garantiza la uniformidad en la unión de las buenas prácticas de fabricación actuales entre los pocillos. El paso de acetilación puede omitirse tanto para los patrones como para las muestras si se espera que la concentración de cGMP en los pocillos de la microplaca supere 1,0 pmol/mL¹⁸.

En preparación para la adición de muestras a los pocillos, las muestras se diluyeron aún más con tampón ELISA. La dilución adicional permitió que las muestras cayeran en la curva estándar y se asemejaran más a los contenidos de los pozos NSB, B₀ y estándar, creando uniformidad. Junto con las muestras y los estándares, se mezclan varias otras soluciones en los pozos. En los pocillos de NSB, se añade tampón ELISA (con y sin los reactivos de acetilación) mientras se retiene el antisuero. Esto es para determinar la cantidad de trazador AChE (acetilcolinesterasa unida a cGMP) que se une a la IgG de ratón adherida al pocillo en ausencia del anticuerpo específico que compone el antisuero. Los pocillos B₀ contenían tampón ELISA (con los reactivos de acetilación), trazador AChE y antisuero; por lo tanto, los pozos B₀ exhiben la capacidad de unión del trazador AChE sin la competencia de cGMP. Una vez que todos los pocillos se llenan adecuadamente, la microplaca se incuba y luego se lava. El reactivo de Ellman se añadió a los pozos. Por último, se añadió un trazador AChE al TA mucho después de que se añadiera el reactivo de Ellman. Este pozo representa la actividad catalítica del trazador AChE, independientemente de la cantidad de trazador que los anticuerpos se hayan unido a la microplaca. La microplaca se desarrolló a temperatura ambiente, lo que permitió que el trazador AChE catalizara una reacción colorimétrica.

Varios pasos en el protocolo pueden alterar los resultados del ensayo; Se debe tener especial cuidado al realizar los pasos que siguen para obtener resultados óptimos. La identificación de las diluciones adecuadas para cada tipo de tejido para la etapa de homogeneización y después de la acetilación es necesaria para garantizar que las muestras caigan en la curva estándar. Al preparar los patrones, las soluciones deben ser completamente vertiginosas o mezcladas antes de la eliminación de una alícuota o después de la adición de una alícuota. Este paso es importante para alcanzar las concentraciones esperadas de cGMP de cada estándar. Durante los pasos de acetilación, cada patrón y muestra debe ser vertiginado en vórtice durante la misma duración para lograr lecturas de absorbancia consistentes. Los patrones y las muestras también deben ser vertiginosos inmediatamente antes de la adición de una alícuota al pocillo apropiado. Esta práctica da como resultado concentraciones de cGMP más precisas. El lavado a fondo de la microplaca también mejora la precisión de los valores de absorbancia, ya que elimina todo el trazador AChE no unido del pocillo. Después de la adición del reactivo de Ellman, se debe permitir el tiempo adecuado para que la microplaca se desarrolle, prestando atención al color y, lo que es más importante, a las absorbancias de los pocillos B₀ . Es importante reconocer que la concentración de cGMP entre duplicados o triplicados puede variar más en las muestras con niveles más bajos de cGMP en comparación con aquellas con concentraciones más altas. La medición de una muestra más concentrada puede ayudar a abordar este problema. Además, para tener en cuenta cualquier variabilidad entre las microplacas, las muestras del mismo tipo de tejido deben medirse en la misma placa, siempre que sea posible. Se espera que el seguimiento de estas pautas mejore la calidad de los datos resultantes del ensayo.

El protocolo anterior se puede extrapolar a otros tejidos blandos y sólidos. El desarrollo posterior de la subsección de preparación de tejidos del protocolo anterior puede dar lugar a un método adecuado para el procesamiento de tejidos duros, incluido el hueso, que puede ser de interés debido a su vascularización. El desarrollo continuo de esta técnica puede dar lugar a un método adecuado para medir las concentraciones de GMPc en una amplia variedad de tejidos sólidos, lo que resulta en un método útil para recopilar información adicional sobre la abundancia de NO en prácticamente cualquier tejido. Si bien el protocolo ELISA competitivo mencionado anteriormente es una técnica útil para medir el GMPc y estimar la abundancia de NO, tiene dos limitaciones notables: (1) Este ensayo no distingue entre el GMPc sintetizado por guanilil ciclasa soluble y el GMPc sintetizado por partículas de guanilil ciclasa (pGC). Los péptidos natriuréticos estimulan la actividad de la pGC²² y, por lo tanto, los cambios en el GMPc a través de esta vía no indican cambios en la abundancia de NO; (2) Además, las enzimas fosfodiesterasas (PDE) influyen en los resultados del ensayo ELISA. Varios PDE hidrolizan el GMPc, reduciendo su concentración tras la estimulación de la sGC en NO²³. Por lo tanto, la actividad catalítica de los PDE puede oscurecer la conexión entre las concentraciones de cGMP y la abundancia de NO. La adición de un inhibidor de la PDE5, como el sildenafilo, para prevenir la pérdida de GMPc es aconsejable para los experimentos centrados principalmente en la obtención de concentraciones exactas de GMPc, en lugar de obtener mediciones para observar las tendencias en las concentraciones de GMPc. Los inhibidores de la PDE5 pueden administrarse como sildenafilo a los animales aproximadamente 1 h antes de la recogida de la muestra (los efectos duran hasta 4 h²⁴) o, si dicha administración no es factible, se puede añadir sildenafilo a las muestras recogidas. Al inhibir las PDE después de la recolección de tejidos, agregue sildenafilo al ácido clorhídrico 0.1 N para que los tejidos se homogeneicen en presencia de sildenafilo. Es necesario realizar mediciones con y sin sildenafilo para garantizar que no haya interferencias entre el tratamiento animal y el sildenafilo.

Incluso con sus limitaciones, el ensayo se utiliza como una información sobre la transmisión descendente de la señal de NO. En conclusión, el acoplamiento de la medición de las concentraciones de GMPc en tejidos sólidos con otros métodos de medición de NO permite una mejor comprensión de los efectos del NO en los órganos.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Jeringa oral transparente BD de 1 ml	Becton Dickinson	50382903052177
Tubo de ensayo de fondo redondo de 14 ml	Halcón	352059
Microtubos de 2,0 ml, surtidos	Plásticos Olympus	24-283A
30-300 µ Pipeta multicanal L	Eppendorf	3125000052
Anhídrido acético (en kit cGMP)	Compañía química de las Islas Caimán	400031	98% puro Peligro: Inflamable, Corrosivo: quema gravemente la piel, daño ocular, toxicidad aguda Manejo seguro: Mantener alejado de fuentes de ignición, trabajar en un área ventilada, usar guantes
Trazador de acetilcolinesterasa cGMP (en kit cGMP)	Compañía química de las Islas Caimán	481020	fosfato de potasio dibásico, cloruro de sodio  fosfato de potasio monobásico, albúmina bovina, azida de sodio, EDTA, trazador cGMP AChE Peligro: Peligro para la salud: toxicidad orgánica por exposición repetida, Corrosivo: daño ocular, Irritante cutáneo y respiratorio Safe Handling: Trabajar en un área ventilada, usar guantes
Antisuero ELISA cGMP (en kit cGMP)	Compañía química de las Islas Caimán	481022	fosfato de potasio dibásico, cloruro de sodio  fosfato de potasio monobásico, albúmina bovina  azida de sodio, EDTA, anti-cGMP policlonal de conejo Antisuero Peligro: Peligro para la salud: toxicidad orgánica por exposición repetida, Corrosivo: daño ocular, Irritante cutáneo y respiratorio, Toxicidad aguda Manejo seguro: Trabaje en un área ventilada, use guantes
Estándar ELISA cGMP (en kit cGMP)	Compañía química de las Islas Caimán	481024	fosfato de potasio dibásico, cloruro de sodio  fosfato de potasio monobásico, albúmina bovina  azida de sodio, EDTA, estándar cGMP Peligro: Peligro para la salud: toxicidad orgánica por exposición repetida, Corrosivo: daño ocular, Irritante cutáneo y respiratorio Manejo seguro: Trabaje en un área ventilada, use guantes
Kit ELISA GMP cíclico	Compañía química de las Islas Caimán	581021
Concentrado de tampón ELISA 10X (en kit cGMP)	Compañía química de las Islas Caimán	400060	1 M de fosfato, 1% de BSA, 4 M de cloruro de sodio, 10 mM de EDTA, 0,1% de azida de sodio Peligro: Peligro para la salud: toxicidad orgánica por exposición repetida, Corrosivo: daño ocular, Irritante cutáneo y respiratorio Manejo seguro: Trabaje en un área ventilada, almacene en un recipiente con tapa que se pueda cerrar, use guantes
Depósito de reactivos ELISA	Pierce (ahora Thermo Fisher Scientific)	15075
Reactivo de Ellman (en kit cGMP)	Compañía química de las Islas Caimán	400050	fosfato de potasio dibásico, cloruro de sodio, fosfato de potasio monobásico, acetiltiocolina (yoduro), 5,5'-ditiobis-(ácido 2-nitrobenzoico) Peligro: Toxicidad aguda, Peligro para la salud: toxicidad orgánica, Corrosivo: Daño ocular, Irritante de la piel, irritante respiratorio Manejo seguro: Trabaje en un área ventilada, use guantes
Ácido clorhídrico	Sigma-Aldrich	320331	Peligro: Corrosivo: corroe el metal, quema gravemente la piel, Daño ocular, Irritante respiratorio Manejo seguro: Trabaje en un área ventilada, use guantes
Nitrógeno líquido	El oxígeno de Robert		Nitrógeno Peligro: Gas comprimido: Riesgo de quemaduras criogénicas, fractura, asfixia Manejo seguro: Trabaje en un área ventilada, use guantes
Placa recubierta de IgG anti-conejo para ratones (en kit cGMP)	Compañía química de las Islas Caimán	400006	Peligro: Ninguno
Nuevo equilibrio MF clásico	Mettler Toledo
Agitador orbital	Stovall Life Science Inc. (ahora IBI Scientific)	15-453-211 (Varía)
Parafilm	Compañía Bemis, Inc.	3023-4526 (Varía)
Polisorbato 20 (en kit cGMP)	Compañía química de las Islas Caimán	400035	Peligro: Ninguno
Hidróxido de potasio (en kit cGMP)	Compañía química de las Islas Caimán	400029	85% puro Peligro: Corrosivo: corroe metales y piel, Daño ocular, Toxicidad aguda Manejo seguro: Trabaje en un área ventilada, use guantes
Homogeneizador Precellys Evolution	Bertin Technologies	PE000062-PEVO0-A
Precellys Lysing Kit Homogeneizador de Tejidos Duros	Bertin Technologies	P000911-LYSK0-A
Lector de microplacas Sense	HIDEX	425-301
Centrífuga Sorvall Legend Micro 17R	Thermo Fisher Scientific	75002441
Pulverizador de tejidos	Trituradora de celdas	Kit de trituradora de celdas
Genio del vórtice 2	Industrias científicas	SI-0246
Botella de lavado	Sigma-Aldrich	Z423092
Concentrado de tampón de lavado 400X (en kit cGMP)	Compañía química de las Islas Caimán	400062	fosfato de potasio dibásico, fosfato de potasio monobásico, agua Peligro: Corrosivo: Daño ocular, Toxicidad aguda,Irritante de la piel, Toxicidad de órganos Manejo seguro: Trabaje en un área ventilada, use guantes