Aquí, presentamos un protocolo para inducir hipoxia en ratones neonatos administrándolos en ambientes controlados con diferentes concentraciones de oxígeno. Los modelos de ratón sometidos a variaciones de oxígeno al nacer han variado de forma duradera la expresión de miRNAs implicados en la inducción de cambios fenotípicos del comportamiento como el autismo.
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Artículo de método
La hipoxia altera los niveles de miRNAs implicados en la herencia no mendeliana del trastorno del espectro autista en ratones
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Resumen
Resumen
La hipoxia puede ocurrir en diversos grados por diferentes razones durante el período perinatal, afectando el desarrollo. Nuestro objetivo es examinar las consecuencias de la hipoxia neonatal de leve a grave en ratones, centrándonos en su posible relación con las disfunciones cerebrales fetales neurodegenerativas relacionadas con el trastorno del espectro autista (TEA).
Inducimos hipoxia en ratones neonatos administrándolos en ambientes controlados con diferentes concentraciones de oxígeno. Los resultados mostraron niveles elevados de HIF-1α (un marcador de hipoxia) en la corteza cerebral y el hipocampo, así como un aumento de la neurodegeneración en estas regiones. Además, observamos una expresión alterada de miRNAs relacionados con el TEA (miR-19a-3p, miR-361-5p, miR-150-5p, miR-126-3p y miR-499a-5p) en grupos hipóxicos, lo que coincide con los resultados previos en modelos humanos y animales de TEA. Estas alteraciones moleculares se acompañaron de cambios de comportamiento como disminución del movimiento, la velocidad, la interacción social y los comportamientos repetitivos, así como una mayor tendencia a exhibir un comportamiento de búsqueda de esquinas en ratones sometidos a condiciones hipóxicas. Aunque los cambios conductuales y moleculares fueron detectables en el grupo de 12% deO2 (hipoxia leve), los cambios más pronunciados se observaron en los grupos de hipoxia más grave, con 10% deO2 y 8% deO2.
En general, los resultados sugieren que la hipoxia neonatal puede inducir cambios moleculares duraderos asociados con enfermedades neurodegenerativas con consecuencias conductuales. Además, incluso en un parto normal, la exposición a la hipoxia durante el desarrollo temprano puede afectar la memoria y el aprendizaje. Los resultados ponen de manifiesto la necesidad de una detección e intervención precoz en los recién nacidos expuestos a la hipoxia para prevenir problemas neurológicos a largo plazo. Los niveles de miRNA se regulan durante el desarrollo, y sus modificaciones en los tejidos, especialmente en las células germinales, constituyen un factor de riesgo para la próxima generación. Los análisis proporcionan una base para estudiar las vías reguladoras que afectan a los cambios funcionales y conductuales bajo hipoxia.
Introducción
Definida como un estado de deficiencia de oxígeno, la hipoxia puede provocar respuestas celulares y moleculares únicas que son críticas para comprender su papel en diversas patologías. Puede alterar las secuencias de desarrollo, lo que provoca alteraciones y lesiones moleculares, celulares y neuronales. Además, la exposición temprana a la hipoxia interrumpe el desarrollo del sistema nervioso central (SNC), perjudicando la conectividad axonal y el desarrollo de sinapsis1.
Además, aunque se ha demostrado que la hipoxia tiene efectos adversos en el desarrollo del SNC, también puede desempeñar un papel fisiológico crítico en condiciones específicas, como durante la embriogénesis. La hipoxia fisiológica normal se refiere a una situación en la que los niveles de oxígeno son naturalmente bajos durante el desarrollo embrionario de manera beneficiosa. Este proceso permite que las células embrionarias produzcan energía al promover el metabolismo anaeróbico, apoya el desarrollo del sistema circulatorio al acelerar la vascularización, asegura el desarrollo adecuado del corazón y los huesos, y estimula la migración de las células de la cresta neural2. Por el contrario, la hipoxia que ocurre fuera de su contexto fisiológico puede tener efectos adversos en el desarrollo y la salud en general, incluido el desarrollo embrionario, lo que puede conducir a la prematuridad o incluso a la letalidad embrionaria1. Por lo tanto, es un importante problema de salud pública, ya que muchos recién nacidos experimentan condiciones hipóxicas durante el parto normal, a menudo sin reconocimiento inmediato por parte de los cuidadores o el personal médico3. Además, las alternancias en la conectividad neuronal asociadas con la hipoxia están relacionadas con trastornos del neurodesarrollo, incluidos los trastornos del espectro autista (TEA) y las discapacidades intelectuales.
Desde una perspectiva molecular, la hipoxia puede influir en el neurodesarrollo alterando la expresión de genes que regulan las funciones sinápticas, interrumpiendo así la conectividad neuronal y contribuyendo al desarrollo de trastornos del neurodesarrollo4.
Clínicamente, la hipoxia neonatal afecta el desarrollo del SNC a través de vías hormonales y metabólicas1. En respuesta a la hipoxia aguda, el hipotálamo libera rápidamente la hormona liberadora de corticotropina y la arginina vasopresina, que luego desencadena la liberación de hormona adrenocorticotrópica desde la hipófisis anterior, seguida de la producción de glucocorticoides en la corteza suprarrenal fetal y el grado de esta respuesta se correlaciona con la intensidad y la duración de la hipoxia. Esta rápida respuesta del eje hipotálamo-hipófisis-suprarrenal (HPA) al estrés agudo subraya el papel crítico de los glucocorticoides en la limitación de los impactos fisiológicos del estrés y el mantenimiento de la homeostasis fetal al influir en la expresión génica asociada, la síntesis de proteínas y el metabolismo celular 5,6.
La disminución de los niveles normales de oxígeno activa varias respuestas a la hipoxia, la mayoría de las cuales están reguladas por factores de transcripción, factores inducibles por hipoxia (HIF) y sensores de oxígeno celular como las prolil hidroxilasas (PHD)1. HIF-1, un regulador de la homeostasis deO2 como se muestra en estudios in vitro 7, es un heterodímero compuesto por HIF-1α y HIF-1β8. En condiciones hipóxicas, se reduce el reemplazo del átomo de hidrógeno por un grupo hidroxilo en el complejo, lo que lleva a la acumulación de HIF-1α, que luego se dimeriza con HIF-1β. Como resultado, el dímero HIF-1 se transloca al núcleo, donde activa la transcripción de cientos de genes1.
La naturaleza dependiente del oxígeno de las neuronas las hace particularmente susceptibles al estrés hipóxico. Por lo tanto, la hipoxia puede tener un impacto significativo en la fisiología cerebral, con implicaciones a largo plazo en la función neuronal, al perjudicar la búsqueda de rutas axonales y el desarrollo de sinapsis9. Estas alteraciones en las conexiones neuronales pueden predisponer a diversos trastornos del neurodesarrollo como los TEA y la discapacidad intelectual 9,10.
La asfixia perinatal se define como la privación de oxígeno durante el trabajo de parto y puede ocurrir como resultado de eventos perinatales como hemorragia materno-fetal, compresión del cordón umbilical, complicaciones placentarias, ruptura uterina, distocia de hombro o incapacidad del recién nacido para respirar por primera vez. Este grave evento afecta aproximadamente a cuatro millones de recién nacidos en todo el mundo cada año y resulta en un millón de muertes neonatales 11,12,13. Aunque la mayoría de los bebés sobreviven a episodios de hipoxia, algunos pacientes desarrollan encefalopatía hipóxico-isquémica, que puede provocar problemas neurológicos permanentes como trastornos convulsivos, parálisis cerebral, retrasos cognitivos y déficits motores. Además, la asfixia y la isquemia pueden causar disfunción de varios órganos y sistemas, como el SNC (28%), el sistema cardiovascular (25%), los riñones (50%) y los pulmones (23%)11.
Además, la inmadurez del sistema de vasculatura cerebral y la mala autorregulación son factores que predisponen a los recién nacidos a riesgos isquémicos. En estos procesos, la inflamación y el estrés oxidativo son los principales mediadores de la lesión hipóxico-isquémica neonatal y de los mecanismos de muerte celular asociados. La apoptosis anormal puede exponer al cerebro en desarrollo a riesgos de trastornos motores y cognitivos14.
Dada la complejidad del TEA, es esencial comprender la genética subyacente que parece tener una estructura poligénica, así como los factores ambientales que determinan su desarrollo. En particular, la base poligénica del TEA implica una etiología multifactorial, en la que las predisposiciones genéticas interactúan con factores externos, incluida la hipoxia. La concordancia del 60%-92% observada en los gemelos monocigóticos destaca la importancia de las influencias genéticas, mientras que la discordancia indica que los factores ambientales también juegan un papel. La prevalencia del autismo se estima en 13/10.000, y se cree que esta tasa ha aumentado en los últimos años15. Los estudios apoyan la hipótesis de que la exposición a factores ambientales durante el embarazo puede aumentar el riesgo de autismo, pero los resultados de estos estudios suelen ser inconsistentes debido a las diferencias en los criterios diagnósticos, los grupos de comparación, el tamaño de la muestra y los métodos de evaluación de la exposición15,16.
Aunque los hallazgos neuropatológicos distintivos no están claros, los estudios revelan anomalías cerebrales microscópicas y funcionales. Estas anormalidades sugieren que el período etiológicamente relevante puede ser en el útero y que la patogenia puede comenzar durante el período prenatal15. Las exposiciones durante el embarazo son el foco principal de la investigación epidemiológica sobre los posibles factores de riesgo para el autismo. En particular, la hipótesis de que las complicaciones obstétricas pueden aumentar el riesgo de TEA está respaldada por muchos estudios, pero la magnitud y las consecuencias de estos efectos varían de un estudio a otro17.
Además de los factores genéticos, los mecanismos epigenéticos juegan un papel clave en la regulación de la expresión génica en condiciones hipóxicas. En particular, los miRNAs presentan un mecanismo regulador clave en la respuesta celular a la hipoxia, como su impacto en el HIF. Durante las primeras etapas de la hipoxia, cambios específicos en los niveles de miARN pueden contribuir a la acumulación de HIF-1 y al mantenimiento de niveles estables de HIF-2 y HIF-318. Aunque el perfil de expresión de muchos miRNAs está alterado en condiciones de hipoxia e isquemia, se ha demostrado que un número limitado de miRNAs asociados a la hipoxia desempeñan un papel funcional y afectan a la expresión de HIF . Esto explica por qué los diferentes tejidos humanos difieren en las respuestas hipóxicas debido a la expresión de miARN específicos del tejido18.
Los datos emergentes también indican que se han implicado miRNAs específicos en la patología del TEA. En nuestro trabajo anterior, demostramos que miR-19a-3p, miR-361-5p, miR-150-5p, miR-126-3p y miR-499a-5p, que se sabe que regulan la supervivencia celular, la diferenciación y las respuestas al estrés en el cáncer, exhiben una expresión aberrante en pacientes con TEA, lo que podría influir en los resultados del desarrollo neurológico. Luego confirmamos estos hallazgos en muestras de sangre, hipotálamo y esperma de modelos de ratón de TEA, mostrando una asociación consistente de cambios en la regulación génica con la enfermedad19. Estos resultados indican que la regulación negativa de estos miRNAs en etapas cruciales de crecimiento y desarrollo puede tener un impacto significativo en el desarrollo de enfermedades como el TEA. Esto demuestra aún más la profunda influencia de la hipoxia neonatal en las características moleculares y conductuales.
En este estudio, probamos el impacto de la hipoxia neonatal leve a moderada en el riesgo de desarrollar autismo en la edad adulta. Para ello, los ratones neonatos fueron expuestos a diferentes niveles de hipoxia. De hecho, los ratones que experimentaron hipoxia al nacer muestran cambios de comportamiento en la edad adulta y, lo que es más importante, a nivel molecular, alteraciones asociadas con el TEA. Por lo tanto, nuestros resultados proporcionaron información valiosa sobre los efectos a largo plazo de la hipoxia.
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Protocolo
Todos los protocolos experimentales fueron aprobados por el Comité Local de Ética de Experimentos con Animales de la Universidad de Erciyes (HAYDEK) y se realizaron bajo la licencia número 21/216.
1. Sujetos animales
NOTA: En este estudio participaron ratones Balb/c de la Unidad de Transgénicos del Centro de Genoma y Células Madre Betül-Ziya EREN (GENKÖK) de la Universidad de Erciyes.
- Utilice ratones Balb/c de 2 meses de edad que pesen una media de 18-25 g. Mantener los ratones a una temperatura de 20 ± 2°C, con una humedad de 52 ± 3% en un ciclo de luz/oscuridad de 12 h (6-18 h).
- Alimente a los ratones con gránulos de ratón estándar, con cambios semanales de ropa de cama, y permita el acceso ilimitado a alimentos y agua.
NOTA: Los estudios moleculares se realizaron en los Laboratorios de Genómica e Hipoxia del GENKÖK y en el Laboratorio de Histología y Embriología de la Universidad de Bozok. Un "punto STOP" indica dónde puede hacer una pausa y conservar su trabajo a la temperatura especificada.
2. Establecimiento del modelo de hipoxia
- Diseñe el experimento para incluir 4 grupos, incluyendo 3 hipóxicos y 1 grupo de control simulado.
- Aparear ratones hembra sanos con ratones machos sanos para formar ratones hembra hembra sanos y embarazadas, que finalmente se clasificarán en los siguientes grupos: hipoxia severa (8% O2) (n = 4), hipoxia moderada (10% O2) (n = 4), hipoxia leve (12% O2) (n = 4) y normoxia (21% O2) como grupo de control simulado (n = 4).
- Para inducir hipoxia, transfiera las ratas preñadas al laboratorio de hipoxia y comience a monitorearlas 72 h antes del día E21.5.
- Detectar el punto de parto de las ratas preñadas en los grupos hipóxicos y colocarlas inmediatamente en cámaras de hipoxia. Ajuste los niveles de oxígeno para cada cámara como se describe para cada grupo (mostrado en el paso 2.2.).
- Mantenga a los recién nacidos en condiciones hipóxicas solo durante 5 minutos, luego transfiéralos inmediatamente a condiciones normales de alojamiento.
NOTA: Mantener a los sujetos en condiciones hipóxicas durante períodos más largos puede resultar en letalidad. - Utilice 2 neonatos (elegidos al azar) de cada grupo para confirmar el daño inducido por la hipoxia y determinar el sexo. Mantenga a las crías restantes junto a sus madres en condiciones normales de alojamiento hasta el final del período de lactancia para realizar pruebas moleculares y conductuales adicionales para la fase de la edad adulta (ver diseño experimental en la Figura 1 suplementaria).
3. Determinación del sexo para evaluar las posibles diferencias en los efectos hipóxicos entre géneros en la etapa neonata
- Pesar individualmente a cada ratón (seleccionado al azar (x2/grupo)) para calcular la dosis necesaria de anestésicos. Administrar ketamina a 100 mg/kg y xilacina a 10 mg/kg por vía intraperitoneal.
- Una vez que el ratón esté completamente anestesiado, se procederá a la eutanasia mediante luxación cervical y se recogerán inmediatamente los tejidos de la cola en tubos estériles de 1,5 ml marcados (un punto STOP, -80 °C)
- Recoja y transfiera inmediatamente todos los tejidos cerebrales a tubos de centrífuga que contengan un 10% de formaldehído para su posterior análisis (un punto STOP, 25 °C).
- Preparar los tejidos para la extracción de ADN.
- Prepare las muestras de cola y descongele a 25 °C (si es necesario). Añadir a las muestras 300 μL de tampón de lisis que contenga 1 M de Tris, 0,5 M de EDTA, 4% de SDS, dH2O y proteinasa K.
- Homogeneizar las muestras.
- Mezcle bien las muestras mediante vórtice e incube durante la noche a 55 °C.
- Al día siguiente, agregue 100 μL de acetato de amonio y mezcle brevemente por vórtice. Centrífuga a 12.000 g durante 20 min a 25 °C
- Realizar la separación de fases.
- Transfiera con cuidado la fase acuosa transparente a nuevos tubos estériles de 1,5 ml etiquetados.
- Añadir 500 μL de isopropanol e incubar durante 5 min a 25 °C (un punto STOP, -20 °C). Centrífuga a 12.000 g durante 10 min a 25 °C
- Lava la bolita de ADN.
- Después de inspeccionar el gránulo en el fondo del tubo, deseche con cuidado el sobrenadante.
- Agregue 1000 μL de etanol al 70% y golpee suavemente el tubo para hacer flotar el pellet. Centrífuga a 7500 g durante 10 min a 25 °C
- Purifica el ADN.
- Después de inspeccionar el gránulo en el fondo del tubo, deseche con cuidado el sobrenadante.
- Utilice una micropipeta de 10 μL para eliminar el etanol residual y deje que se seque por completo.
- Agregue 100 μL de agua libre de nucleasas (NFW) para resuspender el pellet. Incubar a +4 °C durante 10-15 min.
- Cuantificar y almacenar el ADN.
- Mida la concentración de ADN con un espectrofotómetro. Almacene las muestras de ADN a +4 °C hasta su uso posterior. (un punto de STOP).
- Realizar la reacción en cadena de la polimerasa (PCR).
- Diseñe cebadores SRY-F, SRY-R e indirectos PAX6-F, PAX6-R (consulte la Tabla complementaria 1).
- Prepare una mezcla de PCR de la siguiente manera (por muestra): 5 μL de tampón de PCR (10x), 4 μL de MgCl2, 4 μL de dNTPs, 0,5 μL de cada uno de los cuatro cebadores, 31 μL de dH2O y 0,5 μL de polimerasa Taq.
NOTA: La polimerasa Taq debe agregarse al final y justo antes de usarla para garantizar una amplificación óptima. - Prepare los tubos de PCR etiquetados y colóquelos en una rejilla de enfriamiento a +4 °C. Distribuya 45 μL de la mezcla en los tubos.
- Golpee suavemente el bloque para asegurarse de que las gotas de la mezcla de PCR estén en el fondo del tubo.
- Añadir 5 μL de muestras de ADN y pipetear brevemente. Vértice brevemente y luego centrifuga los tubos.
- Coloque los tubos en la máquina de PCR y ajuste el programa a las siguientes condiciones: Inicialmente, incubación a 95 °C durante 5 min, 40 ciclos de desnaturalización a 94 °C durante 1 min, recocido a 57 °C durante 45 s y extensión a 72 °C durante 1 min. Después de los ciclos, una extensión final a 72 °C durante 10 min, seguida de una retención a 40 °C indefinidamente.
- Visualice las muestras resultantes mediante electroforesis en gel de agarosa al 2%.
NOTA: Las muestras que muestran dos bandas son machos, y las que tienen una sola banda son hembras.
4. Confirmación del daño por hipoxia en ratones neonatos
- Evalúe microscópicamente los tejidos cerebrales recolectados de ratones sacrificados para confirmar el daño hipóxico y examine inmunohistoquímicamente para probar HIF-1α.
- Fijar y parafinar incrustar el tejido.
- Conserve los pañuelos en formaldehído durante 12 h, luego lávelos con agua durante 6 h.
- Fijar los tejidos deshidratando en series de alcohol etílico durante 1 día para cada concentración: 70%, 80%, 90%, luego 3 h en alcohol etílico al 100%. Coloque los pañuelos de papel en xileno durante 15 minutos para que se aclaren.
- Transfiera los pañuelos a las series de parafina I, II y III durante 1 hora cada uno. Después de la tercera hora, oriente las muestras de cerebro correctamente e insértelas en parafina limpia.
- Con un micrótomo giratorio, corte secciones de 5 μm de grosor de los bloques de parafina.
- Prepara las diapositivas.
- Para la tinción con hematoxilina y eosina (HE), coloque secciones en portaobjetos de vidrio liso.
- Para la inmunohistoquímica, coloque secciones en portaobjetos de vidrio cargados positivamente.
NOTA: (un punto de PARADA), las diapositivas se pueden archivar en esta etapa para su posterior evaluación y trabajo.
- Realice la tinción HE.
- Sumerja las muestras en la solución de xileno I durante 10 min.
- Sumerja las muestras en la solución de xileno II durante 10 minutos más.
- Transfiera las muestras a una serie de concentraciones de alcohol decrecientes, cada una durante 1 min: 100%, 96% y 80%.
- Lave las muestras con agua destilada durante 2 min.
- Sumerja las muestras en hematoxilina durante 8 min, luego lávelas en agua destilada durante 2 min.
- Después del lavado, trate las muestras con alcohol ácido durante 1 s, seguido de un lavado de 1 minuto.
- Coloque las muestras en agua amoniacal durante 10 s, luego repita el lavado de 1 minuto.
- Coloque las muestras en alcohol al 70% durante 30 s.
- Sumerja las muestras en eosina durante 10 min.
- Transfiera gradualmente las muestras aumentando las concentraciones de alcohol durante 1 minuto cada una: 96%, 96% y 100%.
- Sumerja las muestras en soluciones de xileno I, xileno II y xileno III durante 1 minuto cada una.
- Cubra con un cubreobjetos.
- Examina con un microscopio.
- Después de la tinción de HE, examine todos los tejidos cerebrales de cada grupo bajo un microscopio óptico.
- Evaluar las áreas del hipocampo y cortical para detectar degeneración neuronal y edema pericelular/perivascular.
- Fijar y parafinar incrustar el tejido.
- Realice la tinción HIF-1α.
- Incubar las muestras en portaobjetos cargados positivamente durante la noche a 67 °C en una incubadora para asegurar una fijación adecuada.
- Pase secciones a través de soluciones de xileno I y xileno II para completar la desparafinación.
- Rehidrate las secciones colocándolas secuencialmente en soluciones de etanol al 100%, 96%, 80% y 70% durante 5 minutos cada una, seguido de enjuague en agua destilada durante 5 minutos.
- Desenmascare los epítopos calentando secciones en el microondas con ácido cítrico 0,01 M (pH 6,0) a 665 W durante dos ciclos de 5 minutos.
- Enfríe las secciones a temperatura ambiente (RT) durante 20 min.
- Delinee el perímetro de las secciones con un bolígrafo hidrofóbico, luego lave las secciones 3 veces en PBS durante 5 minutos cada una.
- Incubar secciones en peróxido de hidrógeno al 3% en metanol durante 10 min para bloquear la actividad de la peroxidasa endógena.
- Lave las secciones nuevamente 3 veces en PBS durante 5 minutos cada vez.
- Para evitar la unión inespecífica de inmunoglobulinas, incubar secciones con un reactivo bloqueante de rayos UV durante 7 min.
- Incubar secciones durante la noche a 4 °C con el anticuerpo primario anti-HIF-1α (dilución 1:200).
- Lave las secciones 3 veces en PBS durante 5 minutos cada vez.
- Aplique el anticuerpo secundario biotinilado en secciones e incube en RT durante 40 min.
- Lave las secciones nuevamente 3 veces en PBS durante 5 minutos cada vez.
- Aplique la solución de estreptavidina en las secciones e incube durante 30 min en RT.
- Lave las secciones 3 veces en PBS durante 5 minutos cada vez.
- Desarrolle la reacción de tinción aplicando 3,3'-diaminobenzidina (DAB) y observando bajo un microscopio óptico.
- Contratiñir las secciones con una solución de hematoxilina Gill II modificada para teñir los núcleos.
- Deshidratar secciones pasándolas a concentraciones crecientes de etanol (70%, 80%, 96% y 100% de etanol).
- Limpie las secciones incubándolas en soluciones de Xileno I y Xileno II durante 10 minutos cada una.
- Monte las secciones con un medio de montaje y un cubreobjetos.
- Examine las secciones montadas bajo un microscopio óptico y evalúe áreas del hipocampo y la corteza prefrontal.
- Mida los niveles de inmunorreactividad utilizando software de procesamiento de imágenes de código abierto.
5. Experimentos conductuales
- Después de la confirmación de la hipoxia, permita que los ratones restantes completen el período de lactancia con sus madres.
- Realice la determinación del sexo en el día postnatal 21 en función de la distancia anogenital, luego aloje a los animales en diferentes jaulas según su sexo. Cuando los ratones de los grupos de control hipóxico y simulado alcancen los 2 meses de edad, sométalos a experimentos de comportamiento.
- Antes de realizar pruebas de comportamiento, aclimate a los sujetos al entorno de prueba durante 15-30 minutos antes de la prueba.
- Asegúrese de desinfectar todos los dispositivos/aparatos entre sujetos y ensayos con etanol al 70%.
- Realizar la prueba de reconocimiento de objetos novedosos (NOR).
- Coloque la cámara en una posición en la que los sujetos puedan verse y supervisarse claramente.
- Instala un software de seguimiento de video adecuado.
- Prepare el campo de pruebas (una caja de 60 cm × 60 × cm × 40 cm) con dos objetos no más grandes que el ratón. Asegúrese de que los dos objetos sean de tamaño y forma similares y de fácil acceso (a 10 cm × 10 cm de distancia de las paredes y paralelos).
- Día 1: Fase de familiarización:
- Coloca el ratón en la arena con los dos objetos idénticos. Permita que el ratón explore libremente los objetos durante un tiempo determinado (por ejemplo, 10 minutos).
- Durante esta sesión, observe y registre la cantidad de tiempo que el ratón pasó con cada objeto. Además, registre el número de veces que el ratón se giró o interactuó con cada objeto
- Día 2: Introducción al objeto de la novela:
- Reemplace uno de los objetos conocidos del día 1 por un objeto nuevo (diferente en apariencia, textura o forma).
- Devuelve el ratón a la arena, permitiéndole volver a explorar libremente durante la misma cantidad de tiempo que en la primera sesión.
- Registre el tiempo total que el ratón pasó con el objeto conocido (desde el día 1) y el objeto nuevo. Registre el número de veces que el ratón giró o interactuó con cada objeto.
- Calcule el Índice de Discriminación (ID) para evaluar la memoria y el aprendizaje del ratón utilizando la fórmula:
Índice de discriminación (DI) = {(Tiempo dedicado a un objeto nuevo − Tiempo dedicado a un objeto familiar)/(Tiempo total dedicado a ambos objetos)} × 100.
NOTA: Un DI más alto indica un mayor interés en el objeto novedoso, lo que sugiere una mejor memoria y habilidades de aprendizaje. Un DI cercano a 0 indica que no hay preferencia, lo que sugiere un interés igual o una mala memoria para el objeto familiar. - Utilice el DI para evaluar objetivamente las habilidades de aprendizaje y memoria del ratón, basándose en su curiosidad natural y su capacidad para reconocer y diferenciar entre objetos familiares y nuevos.
- Realizar la prueba de suspensión trasera (TST)
- Instale la cámara en una posición en la que los ratones sean claramente visibles y puedan ser monitoreados. Instala un software de seguimiento de video adecuado.
- Prepare la configuración experimental con espacio para acomodar a 3 ratones simultáneamente.
- Utilice paneles de cartón de 25 cm de altura con intervalos de 20 cm para aislar a los ratones y que no puedan verse entre sí durante la prueba.
- Corta tiras de cinta adhesiva de 12 cm de largo y fíjalas con cuidado a la cola de cada ratón, asegurándote de que la cola esté bien sujeta sin causar daños. Coloque la cinta en el extremo de la cola (2 cm) para que el ratón pueda suspenderse sin lastimarse.
- Grabe a los ratones durante 6 minutos mientras están suspendidos.
- Al final de la duración, detenga la grabación, retire el mouse y devuélvalo a la jaula de la carcasa. Analice los videos para determinar la duración del movimiento activo y la duración de la inmovilidad.
NOTA: Esto proporcionará información sobre la respuesta al estrés, ya que la inmovilidad a menudo indica un estado de indefensión o estrés aprendido. El grado de inmovilidad se usa comúnmente para medir la desesperación conductual o la respuesta al estrés en ratones, que puede estar relacionada con los efectos del estrés o los estados depresivos. - Con base en los patrones observados de movimiento e inmovilidad, evalúe el estado emocional y los mecanismos de afrontamiento del estrés de los ratones en respuesta a la suspensión forzada.
- Realizar prueba de enterramiento de mármol
- Llene una jaula vacía (20 cm × 35 cm × 15 cm) con una mazorca de maíz de 5 cm de altura. Coloca 20 canicas en 5 filas con 4 canicas cada una. Asegúrese de que las canicas se distribuyan uniformemente sobre la superficie.
- Coloque al sujeto en una esquina de la jaula, asegurando el libre acceso a toda la jaula.
- Dale al ratón 20 minutos para explorar la jaula. Durante este tiempo, el ratón puede exhibir algún comportamiento de enterramiento, tratando de cubrir las canicas con mazorcas de maíz. Después de 20 minutos, retire el ratón de la jaula.
- Cuente el número total de canicas que el ratón enterró debajo de la mazorca de maíz durante el período de 20 minutos. Registre el número total de canicas enterradas, ya que esta es la medida clave del comportamiento.
NOTA: El número de canicas enterradas se usa comúnmente como un indicador de ansiedad, comportamiento compulsivo o neofobia en roedores. Un mayor número de canicas enterradas a menudo se asocia con niveles más altos de ansiedad o tendencias compulsivas. - Con base en el número total de canicas enterradas, evalúe los comportamientos relacionados con la ansiedad y las tendencias compulsivas en ratones, que se pueden usar para evaluar los efectos de los tratamientos o las condiciones experimentales.
- Realizar una prueba de interacción social.
- Instale la cámara en una posición en la que los ratones sean claramente visibles y puedan ser monitoreados.
- Conecte la cámara a la computadora y configure el software de seguimiento de video adecuado. Coloque una caja rectangular (60 cm × 40 cm × 25 cm) con dos paredes (40 cm × 25 cm) con dos puertas (8 cm) para separar las tres cámaras.
- Coloque una jaula (15 cm × 10 cm) que contenga un ratón conocido con el sujeto del experimento y otra jaula (15 cm × 10 cm) que contenga un ratón que no haya tenido ninguna interacción previa con el sujeto del experimento.
- Comience a grabar y coloque el sujeto en el compartimento central.
NOTA: Los ratones utilizados en esta prueba, distintos de los animales de experimentación, deben ser del mismo sexo y estar sanos. - Monitoree el sujeto durante 5 minutos y grábelo con la cámara de video. Al final de la duración, detenga la grabación, retire el mouse y devuélvalo a la jaula de la carcasa.
- Utilizando el software SIT, analice el tiempo de interacción social y las tendencias de novedad social de los ratones y compárelos con el grupo de control simulado.
NOTA: Dedicar más tiempo a comportamientos sociales (p. ej., acicalarse u olfatear) y menos tiempo dedicado a evitar o mostrar agresión puede interpretarse como una demostración de alta sociabilidad. Evitar la interacción, pasar más tiempo aislado o mostrar una mayor agresividad puede sugerir ansiedad, retraimiento social o reducción de la capacidad para interactuar socialmente.
- Realice una prueba de campo abierto.
- Coloque la cámara donde los ratones puedan ser vistos claramente y monitoreados. Conecte la cámara al ordenador y configure un software de seguimiento de vídeo adecuado.
- Coloca la arena de prueba (una caja de 60 cm × 60 cm × 40 cm) y divide la caja con líneas imaginarias para crear 16 cuadrados.
- Comience a grabar y coloque con cuidado el mouse en el centro de la arena. Observe y registre el comportamiento del ratón durante 5 minutos.
- Al final de la duración, detenga la grabación, retire el mouse y devuélvalo a la jaula de la carcasa.
- Utilizando el software de seguimiento, mida los comportamientos externos e internos de caminar, trepar, escapar, acicalarse, inmovilidad, cruces totales, defecación y micción para evaluar los niveles de ansiedad, actividad locomotora, exploratoria y emocional de los sujetos.
- Realice la prueba del laberinto acuático de Morris (MWM).
- Prepare el laberinto de agua de 120 cm de diámetro y 60 cm de profundidad en una posición estable en un laboratorio de comportamiento a 23 ± 1 °C.
- Divida el laberinto en cuatro cuadrantes imaginarios y cuelgue diferentes señales visuales (en forma y color) en el centro de cada cuadrante de las paredes del laberinto aproximadamente a 20 cm de la base. Coloque una plataforma de 17 cm de largo y 10 cm de diámetro a 20 cm de la pared.
NOTA: El laberinto, las señales y la plataforma no deben cambiar de posición o ubicación para que los ratones puedan entrenar su memoria con precisión. - Llena el laberinto con agua a 21-26 °C hasta 1 cm por debajo de la plataforma y tíñelo con un tinte acrílico negro multisuperficie.
NOTA: en caso de utilizar otras cepas de ratones, el agua debe estar coloreada con un color de contraste de los ratones para poder controlarlos. - Coloque la cámara en una posición que capture la imagen completa y conéctela al software MWM de la computadora.
NOTA: El lugar de la plataforma debe estar asignado en el programa para el quinto día de prueba. - La prueba tiene una duración de 5 días con cuatro ensayos cada uno. Durante los primeros cuatro días, comience a grabar y comience la prueba colocando cuidadosamente al sujeto en un cuadrante diferente cada día, con la cara dirigida hacia la pared del tanque.
- Asigne la ubicación de la plataforma en el horario de pruebas del día 5.
NOTA: Esto impide que los sujetos formen una memoria asociativa. La colocación cuidadosa de los sujetos en el agua y el mantenimiento de la temperatura correcta es esencial para evitar agregar estrés externo. Las pruebas duran 5 minutos y finalizan automáticamente cuando (i) se alcanza la plataforma, (ii) expira el límite de tiempo de 5 minutos. Con el transcurso de los días, los sujetos deberían aprender la ubicación de la plataforma y encontrarla en menos tiempo. - Al quinto día, retire la plataforma y coloque con cuidado a los ratones en un cuadrado del laberinto como se describió anteriormente.
NOTA: La prueba finaliza automáticamente cuando (i) el ratón encuentra y entra en la plataforma, (ii) expira el límite de tiempo de 5 minutos. Los sujetos sanos deben encontrar la ubicación de la plataforma anterior. El software calculará automáticamente el tiempo que tardó el ratón en encontrar la plataforma en cada prueba y ayudará a evaluar la memoria a corto y largo plazo y las capacidades de aprendizaje de los sujetos.
6. Confirmación del daño por hipoxia en ratones adultos
- Una vez completadas las pruebas conductuales, sacrifique a los sujetos por dislocación cervical.
- Recolectar muestras de tejido y sangre del hipocampo de 6 ratones de cada grupo, incluido el grupo de control simulado, para su análisis molecular (sección 7).
- Coloque los cerebros de los 4 ratones restantes en una solución de formaldehído al 10% para examinar los efectos de la exposición a la hipoxia durante el período neonatal en la morfología del cerebro adulto.
- Utilice la misma técnica que se explicó anteriormente en la sección 4 para realizar el análisis histológico de cerebros de ratones adultos.
7. Aislamiento de ARN total a partir de muestras de fase adulta
- Agregue 500 μL de trizol a cada muestra de tejido y 500 μL de sangre.
- Para el tejido cerebral, homogeneice las muestras con una jeringa.
- Incubar la mezcla a RT durante 5 min.
- Agregue 200 μL de cloroformo a cada tubo e incube durante 5 minutos adicionales a RT.
- Centrifugar a 12.000 g durante 20 min a +4 °C.
- Transfiera con cuidado la fase acuosa (ARN) a un nuevo tubo estéril.
- Añadir isopropanol (proporción 1:1 a la fase acuosa) e incubar la mezcla durante la noche. (un punto STOP/ -20 °C).
- Al día siguiente, centrifugar a 12.000 g durante 10 min a +4 °C.
- Deseche con cuidado el sobrenadante y agregue 1000 μL de etanol al 75% al pellet.
- Centrifugar a 7.500 × g durante 5 min a +4 °C.
- Repita el paso de lavado con etanol dos veces.
NOTA: si el pellet es demasiado pequeño, un lavado es suficiente. - Deseche el sobrenadante y deje que el pellet se seque al aire a RT.
- Una vez completamente seco, vuelva a suspender el pellet con 50 μL de NFW e incube en hielo a +4 °C durante 10-15 min.
- Mida la concentración de ARN espectrofotométricamente.
- Almacene las muestras de ARN a -80 °C hasta su posterior análisis.
8. Síntesis de ADN complementario (ADNc)
- Trabajando en una gradilla de enfriamiento a +4 °C, prepare las muestras de ARN aisladas de la sangre y los tejidos cerebrales.
- Prepare los tubos de PCR etiquetados.
- Mezcle los reactivos del kit de síntesis de ADNc de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
- Prepare un total de 14 μL de la mezcla de reacción para cada muestra y distribúyala en los tubos.
- Agregue 6 μL de muestra de ARN a la mezcla.
- Realizar la síntesis de ADNc en el dispositivo de PCR siguiendo las condiciones de temperatura y tiempo especificadas por el fabricante.
NOTA: El ADNc sintetizado en esta etapa puede almacenarse a -80 °C hasta su uso posterior. - Diluir el ADNc sintetizado en una proporción de 1:5.
- Almacene el ADNc diluido a -80 °C para futuros análisis de qPCR.
9. PCR cuantitativa en tiempo real para la expresión de miRNA (miR-19a-3p, miR-361-5p, miR-150-5p, miR-126-3p, miR-499a-5p y ARN nuclear pequeño U6 como control de normalización)
- Diseñe los cebadores para cada miARN (consulte la Tabla complementaria 2 para ver las secuencias).
- Prepare la mezcla de reacción PCR de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
- Dispense 14 μL de la mezcla de reacción en cada pocillo de una placa de PCR de 96 pocillos.
- Añada 6 μL del ADNc diluido 1:5 a cada pocillo para obtener un volumen total de reacción de 20 μL.
- Realice PCR por duplicado para cada muestra para minimizar la variación siguiendo este programa: desnaturalización inicial a 95 °C durante 120 s, 45 ciclos de desnaturalización a 95 °C durante 10 s, recocido y amplificación a 56 °C durante 60 s, y análisis de la curva de fusión a 60 °C durante 15 s, luego a 95 °C.
- Analice los resultados utilizando valores Ct (umbral de ciclo) y normalice los datos utilizando el método 2-ΔΔCt .
10. Análisis estadístico
- . Evalúe la normalidad de los datos mediante histogramas, gráficos Q-Q y la prueba de Shapiro-Wilk para analizar los datos de expresión de miARN.
- Si los datos se distribuyen normalmente, utilice el ANOVA de un factor.
- Si los datos no se distribuyen normalmente, aplique la prueba de Kruskal-Walli, la prueba t de Student o la prueba U de Mann-Whitney.
- Al evaluar las diferencias de género dentro de cada grupo, utilice la prueba t del estudiante o la prueba U de Mann-Whitney, dependiendo de la distribución de los datos. La significación estadística se determina mediante un valor p de <0,05.
NOTA: Todos los análisis deben realizarse utilizando un software estadístico adecuado. En este caso, se utiliza GraphPad Prism 8. - Evalúe la normalidad de los datos utilizando histogramas, gráficos Q-Q y la prueba de Shapiro-Wilk para analizar los resultados de los experimentos de comportamiento.
- Si los datos se distribuyen normalmente, utilice un ANOVA de dos factores.
- Para los datos que normalmente no se distribuyen, realice la prueba de Kruskal-Walli, la prueba t de Student o la prueba U de Mann-Whitney.
- Evalúe las diferencias de género dentro de cada grupo utilizando la prueba t del estudiante o la prueba U de Mann-Whitney, dependiendo de la distribución de los datos. De nuevo, considere los resultados estadísticamente significativos si el valor p es < 0,05.
- Para los análisis inmunohistoquímicos, utilice el ANOVA de dos vías seguido de la prueba post-hoc de Tukey para comparar los grupos de mujeres y hombres.
- Para comparar los grupos de mujeres y hombres dentro de cada condición de hipoxia, use la prueba post-hoc de Sidak. La significación estadística se determina si el valor p es < 0,05.
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Resultados
En este estudio, ratones Balb/c preñados fueron expuestos a condiciones hipóxicas de 8%O2 (grave), 10%O2 (moderado) y 12%O2 (leve) durante el parto, y los ratones recién nacidos se mantuvieron en estas condiciones hipóxicas durante 5 min para establecer modelos de hipoxia neonatal leve, moderada y grave. El grupo designado como grupo de control simulado fue sometido a condiciones de parto normóxicas (21%O2) y luego se le permitió vivir...
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Discusión
La hipoxia perinatal, un importante problema de salud neonatal, puede causar cambios moleculares, celulares y neuronales al interrumpir procesos críticos del desarrollo y se ha asociado con varios trastornos del neurodesarrollo, incluido el trastorno del espectro autista (TEA)1. Si bien la hipoxia grave ha sido ampliamente estudiada por sus efectos inmediatos, las consecuencias a largo plazo de la hipoxia leve a moderada durante el período perinatal siguen siendo ...
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Divulgaciones
Los autores declaran no tener ningún conflicto de intereses.
Agradecimientos
Este estudio fue financiado por el Consejo de Investigación Científica y Tecnológica de Turquía (TÜBİTAK), y los autores agradecen a Celalettin Göktaş (Centro de animales transgénicos) y a la bióloga Selda Taşdemir (Laboratorio de comportamiento).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| (-20 y degrau; C) Congelador | Siemens | KD86NAWE0N | |
| (+4 & deg; C) Bloqueo | Biociencia Antágena | https://antagen.net/product/384-well-pcr-plate-rack-cat-rkp384/ | |
| (+4 & deg; C) Frigorífico | Siemens | KD86NAWE0N | |
| (-20 y degrau; C) Bloqueo | Sientífico de cuchillo | https://www.cleaverscientific.com/electrophoresis-products/coolcube-storage-rack/ | |
| Etanol absoluto | Merck | 1070172511 | |
| Acetato de amonio | Sigma | 238074-500G | |
| Balance analítico | Adam Equipment | LAB214i | |
| Cloroformo | Merck | 1024451000 | |
| Ácido cítrico y nbsp; | Merck | 100241 | |
| Ordenador | HP | https://www.hp.com/us-en/shop/pdp/hp-all-in-one-24-cr1000t-238-9p2v3av-1 | |
| EDTA | Sigma | E9884-1KG | |
| Entellan | Merck | 107961 | |
| Eosina | Merck | 109844 | |
| Ependorf (1,5 mL) | ?solab | 078.03.021 | |
| Sistema Ethovision | Noldus | https://noldus.com/ethovision-xt | |
| Etuv | NUVE | EN 400/500 N/A | |
| Tubos Falcon (15 mL) | Isolab | 078.02.001 | |
| Formaldehído | Merck | 104002 | |
| Cámara de calor | Samsung | SC2000 | |
| Hematoxilina | Merck | 105175 | |
| HIF-1 y alfa; Anticuerpo | Bioss | bs-20398R | |
| Cámaras de hipoxia | Biospherix | Cámara A | |
| Isopropuesta | Merck | 1096342511 | |
| Light Cycler 480 II | Roche | 5015278001 | |
| Jaula de la Prueba de Enterramiento de Mármol | Vishnu & nbsp; | https://guide.labanimal.com/product/standard-housing-stainless-steel | |
| Tubos microcentrífugas (1,5 mL) | Greiner | 616201 | |
| Puntas de micropipeta (100 y micro; L) | Greiner | 774353 | |
| Puntas de micropipeta (1000 y micro; L) | Greiner | 778353 | |
| Micropipetas (10 & micro; L) | Gilson | FD10001 | |
| Micropipetas (100 y micro; L) | Gilson | FD10004 | |
| Micropipetas (1000 y micro; L) | Gilson | FD10003 | |
| Puntas de micropipetas (10 y micro; L) | Greiner | 772353 | |
| Micropipetas (2 y micro; L) | Gilson | GFAM00064 | |
| Microscopía | Olimpo | Bx53 | |
| Kit de síntesis de ADNc de miRCURY (Kit de síntesis de ADNC) | Qiagen | 339340 | |
| Kit de PCR verde MIRCURY LNA SYBR | Qiagen | 339346 | |
| Planchas multipozo | Roche | 4729692001 | |
| Nano Espectrofotómetro | Shimadzu | C101-E112 | |
| La arena de la Prueba de Recognición de Objetos Novelosos | Biotecnología Global | 137 | |
| Arena de Pruebas en Campo Abierto | Biotecnología Global | 117 | |
| Oxycycler | Biospherix | A42OC | |
| Parafina | Leica | 39602012 | |
| Tableta PBS | Sigma | P4417-50TAB | |
| Dispositivo PCR | Sensoquest | T3-0140 | |
| Giro de placas | Peqlab | 91-PSPIN-P | |
| Prisma | GraphPad | https://www.graphpad.com/ | |
| Proteinasa K | Sigma | P6556-10MG | |
| Reactivo de aislamiento de reactivos de lisis QIAzol | Qiagen | 79306 | |
| SDS | Sigma | 8170342500 | |
| Anticuerpo de apoyo y nbsp; | Abcam | A0545-1ML | |
| Las tres cámaras de la Prueba de Interacción Social | Biotecnología Global | 118 | |
| Girar | Gilson | PMC880 | |
| Jeringuilla (2 mL) | Baybi | https://beybi.com.tr/urunler/medikal-urunler/medikal-sarf-malzemeleri/parcali-enjektorler | |
| Configuración de la prueba de suspensión trasera | Self Made, puedes encontrar algo similar en Harvard Apparatus | Self Made puedes encontrar algo similar en (https://www.harvardapparatus.com/tail-suspension-test.html) | |
| Termomezclador | Eppendorf | #5355 | |
| Base de Trizma | Sigma | 1503-1KG | |
| Vórtice | Heidolph | 541-10000-00-1 | |
| Xilenos | Isolab | 9,90,01,92,501 |
Referencias
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