Aquí, presentamos un protocolo para inducir hipoxia en ratones neonatos administrándolos en ambientes controlados con diferentes concentraciones de oxígeno. Los modelos de ratón sometidos a variaciones de oxígeno al nacer han variado de forma duradera la expresión de miRNAs implicados en la inducción de cambios fenotípicos del comportamiento como el autismo.
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Artículo de método
La hipoxia altera los niveles de miRNAs implicados en la herencia no mendeliana del trastorno del espectro autista en ratones
En este artículo
Resumen
Resumen
La hipoxia puede ocurrir en diversos grados por diferentes razones durante el período perinatal, afectando el desarrollo. Nuestro objetivo es examinar las consecuencias de la hipoxia neonatal de leve a grave en ratones, centrándonos en su posible relación con las disfunciones cerebrales fetales neurodegenerativas relacionadas con el trastorno del espectro autista (TEA).
Inducimos hipoxia en ratones neonatos administrándolos en ambientes controlados con diferentes concentraciones de oxígeno. Los resultados mostraron niveles elevados de HIF-1α (un marcador de hipoxia) en la corteza cerebral y el hipocampo, así como un aumento de la neurodegeneración en estas regiones. Además, observamos una expresión alterada de miRNAs relacionados con el TEA (miR-19a-3p, miR-361-5p, miR-150-5p, miR-126-3p y miR-499a-5p) en grupos hipóxicos, lo que coincide con los resultados previos en modelos humanos y animales de TEA. Estas alteraciones moleculares se acompañaron de cambios de comportamiento como disminución del movimiento, la velocidad, la interacción social y los comportamientos repetitivos, así como una mayor tendencia a exhibir un comportamiento de búsqueda de esquinas en ratones sometidos a condiciones hipóxicas. Aunque los cambios conductuales y moleculares fueron detectables en el grupo de 12% deO2 (hipoxia leve), los cambios más pronunciados se observaron en los grupos de hipoxia más grave, con 10% deO2 y 8% deO2.
En general, los resultados sugieren que la hipoxia neonatal puede inducir cambios moleculares duraderos asociados con enfermedades neurodegenerativas con consecuencias conductuales. Además, incluso en un parto normal, la exposición a la hipoxia durante el desarrollo temprano puede afectar la memoria y el aprendizaje. Los resultados ponen de manifiesto la necesidad de una detección e intervención precoz en los recién nacidos expuestos a la hipoxia para prevenir problemas neurológicos a largo plazo. Los niveles de miRNA se regulan durante el desarrollo, y sus modificaciones en los tejidos, especialmente en las células germinales, constituyen un factor de riesgo para la próxima generación. Los análisis proporcionan una base para estudiar las vías reguladoras que afectan a los cambios funcionales y conductuales bajo hipoxia.
Introducción
Definida como un estado de deficiencia de oxígeno, la hipoxia puede provocar respuestas celulares y moleculares únicas que son críticas para comprender su papel en diversas patologías. Puede alterar las secuencias de desarrollo, lo que provoca alteraciones y lesiones moleculares, celulares y neuronales. Además, la exposición temprana a la hipoxia interrumpe el desarrollo del sistema nervioso central (SNC), perjudicando la conectividad axonal y el desarrollo de sinapsis1.
Además, aunque se ha demostrado que la hipoxia tiene efectos adversos en el desarrollo del SNC, también puede dese....
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Protocolo
Todos los protocolos experimentales fueron aprobados por el Comité Local de Ética de Experimentos con Animales de la Universidad de Erciyes (HAYDEK) y se realizaron bajo la licencia número 21/216.
1. Sujetos animales
NOTA: En este estudio participaron ratones Balb/c de la Unidad de Transgénicos del Centro de Genoma y Células Madre Betül-Ziya EREN (GENKÖK) de la Universidad de Erciyes.
- Utilice ratones Balb/c de 2 meses de edad que pesen una media de 18-25 g. Mantener los ratones a una temperatura de 20 ± 2°C, con una humedad de 52 ± 3% en un c....
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Resultados
En este estudio, ratones Balb/c preñados fueron expuestos a condiciones hipóxicas de 8%O2 (grave), 10%O2 (moderado) y 12%O2 (leve) durante el parto, y los ratones recién nacidos se mantuvieron en estas condiciones hipóxicas durante 5 min para establecer modelos de hipoxia neonatal leve, moderada y grave. El grupo designado como grupo de control simulado fue sometido a condiciones de parto normóxicas (21%O2) y luego se le permitió vivir.......
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Discusión
La hipoxia perinatal, un importante problema de salud neonatal, puede causar cambios moleculares, celulares y neuronales al interrumpir procesos críticos del desarrollo y se ha asociado con varios trastornos del neurodesarrollo, incluido el trastorno del espectro autista (TEA)1. Si bien la hipoxia grave ha sido ampliamente estudiada por sus efectos inmediatos, las consecuencias a largo plazo de la hipoxia leve a moderada durante el período perinatal siguen siendo .......
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Divulgaciones
Los autores declaran no tener ningún conflicto de intereses.
Agradecimientos
Este estudio fue financiado por el Consejo de Investigación Científica y Tecnológica de Turquía (TÜBİTAK), y los autores agradecen a Celalettin Göktaş (Centro de animales transgénicos) y a la bióloga Selda Taşdemir (Laboratorio de comportamiento).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| (-20 y degrau; C) Congelador | Siemens | KD86NAWE0N | |
| (+4 & deg; C) Bloqueo | Biociencia Antágena | https://antagen.net/product/384-well-pcr-plate-rack-cat-rkp384/ | |
| (+4 & deg; C) Frigorífico | Siemens | KD86NAWE0N | |
| (-20 y degrau; C) Bloqueo | Sientífico de cuchillo | https://www.cleaverscientific.com/electrophoresis-products/coolcube-storage-rack/ | |
| Etanol absoluto | Merck | 1070172511 | |
| Acetato de amonio | Sigma | 238074-500G | |
| Balance analítico | Adam Equipment | LAB214i | |
| Cloroformo | Merck | 1024451000 | |
| Ácido cítrico y nbsp; | Merck | 100241 | |
| Ordenador | HP | https://www.hp.com/us-en/shop/pdp/hp-all-in-one-24-cr1000t-238-9p2v3av-1 | |
| EDTA | Sigma | E9884-1KG | |
| Entellan | Merck | 107961 | |
| Eosina | Merck | 109844 | |
| Ependorf (1,5 mL) | ?solab | 078.03.021 | |
| Sistema Ethovision | Noldus | https://noldus.com/ethovision-xt | |
| Etuv | NUVE | EN 400/500 N/A | |
| Tubos Falcon (15 mL) | Isolab | 078.02.001 | |
| Formaldehído | Merck | 104002 | |
| Cámara de calor | Samsung | SC2000 | |
| Hematoxilina | Merck | 105175 | |
| HIF-1 y alfa; Anticuerpo | Bioss | bs-20398R | |
| Cámaras de hipoxia | Biospherix | Cámara A | |
| Isopropuesta | Merck | 1096342511 | |
| Light Cycler 480 II | Roche | 5015278001 | |
| Jaula de la Prueba de Enterramiento de Mármol | Vishnu & nbsp; | https://guide.labanimal.com/product/standard-housing-stainless-steel | |
| Tubos microcentrífugas (1,5 mL) | Greiner | 616201 | |
| Puntas de micropipeta (100 y micro; L) | Greiner | 774353 | |
| Puntas de micropipeta (1000 y micro; L) | Greiner | 778353 | |
| Micropipetas (10 & micro; L) | Gilson | FD10001 | |
| Micropipetas (100 y micro; L) | Gilson | FD10004 | |
| Micropipetas (1000 y micro; L) | Gilson | FD10003 | |
| Puntas de micropipetas (10 y micro; L) | Greiner | 772353 | |
| Micropipetas (2 y micro; L) | Gilson | GFAM00064 | |
| Microscopía | Olimpo | Bx53 | |
| Kit de síntesis de ADNc de miRCURY (Kit de síntesis de ADNC) | Qiagen | 339340 | |
| Kit de PCR verde MIRCURY LNA SYBR | Qiagen | 339346 | |
| Planchas multipozo | Roche | 4729692001 | |
| Nano Espectrofotómetro | Shimadzu | C101-E112 | |
| La arena de la Prueba de Recognición de Objetos Novelosos | Biotecnología Global | 137 | |
| Arena de Pruebas en Campo Abierto | Biotecnología Global | 117 | |
| Oxycycler | Biospherix | A42OC | |
| Parafina | Leica | 39602012 | |
| Tableta PBS | Sigma | P4417-50TAB | |
| Dispositivo PCR | Sensoquest | T3-0140 | |
| Giro de placas | Peqlab | 91-PSPIN-P | |
| Prisma | GraphPad | https://www.graphpad.com/ | |
| Proteinasa K | Sigma | P6556-10MG | |
| Reactivo de aislamiento de reactivos de lisis QIAzol | Qiagen | 79306 | |
| SDS | Sigma | 8170342500 | |
| Anticuerpo de apoyo y nbsp; | Abcam | A0545-1ML | |
| Las tres cámaras de la Prueba de Interacción Social | Biotecnología Global | 118 | |
| Girar | Gilson | PMC880 | |
| Jeringuilla (2 mL) | Baybi | https://beybi.com.tr/urunler/medikal-urunler/medikal-sarf-malzemeleri/parcali-enjektorler | |
| Configuración de la prueba de suspensión trasera | Self Made, puedes encontrar algo similar en Harvard Apparatus | Self Made puedes encontrar algo similar en (https://www.harvardapparatus.com/tail-suspension-test.html) | |
| Termomezclador | Eppendorf | #5355 | |
| Base de Trizma | Sigma | 1503-1KG | |
| Vórtice | Heidolph | 541-10000-00-1 | |
| Xilenos | Isolab | 9,90,01,92,501 |
Referencias
- Bonkowsky, J. L., Son, J. -H. Hypoxia and connectivity in the developing vertebrate nervous system. Dis Model Mech. 11 (12), dmm037127(2018).
- Dunwoodie, S. L. The role of hypoxia in development of the mammalian embryo. Dev Cell. 17 (6), 755-773 (2009).
- B....
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Reimpresiones y permisos
