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Artículo de método

Diagnóstico rápido de la infección por Mycobacterium tuberculosis y la resistencia a los fármacos basado en PCR de fluorescencia en tiempo real

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DOI:

10.3791/68445

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15 de julio de 2025

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1The Fifth Division Hospital of Xinjiang Production and Construction Corps, 2Laboratory Medicine, Guangdong Provincial People's Hospital (Guangdong Academy of Medical Sciences), Southern Medical University

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

En este trabajo se presenta un protocolo para la detección de Mycobacterium tuberculosis y su resistencia a fármacos mediante la tecnología de PCR cuantitativa de fluorescencia en tiempo real (qPCR).

Resumen

La tuberculosis (TB) es un importante problema de salud que afecta de manera desproporcionada a las poblaciones vulnerables. La aparición y propagación de la tuberculosis resistente a los medicamentos representa una grave amenaza para la salud pública mundial. Los métodos diagnósticos tradicionales para Mycobacterium tuberculosis (MTB), como la baciloscopía y el cultivo, tienen limitaciones significativas y, a menudo, dan lugar a un retraso en el tratamiento clínico. Para hacer frente a este reto, se desarrolló un esquema de diagnóstico eficiente basado en PCR fluorescente en tiempo real. Los ácidos nucleicos MTB de alta calidad se pueden extraer de las muestras de prueba y se puede identificar el estado de resistencia en los sitios clave de resistencia. En comparación con los métodos tradicionales, este enfoque reduce significativamente el tiempo de detección a solo unas pocas horas, lo que permite determinar el estado de infección y resistencia poco después de la visita inicial de un paciente. La sensibilidad de detección supera el 85% y la especificidad alcanza el 95%. Esta tecnología no invasiva no solo minimiza las molestias del paciente, sino que también respalda un diagnóstico preciso en instituciones médicas de base debido a su bajo costo y alta eficiencia. En general, el enfoque representa una mejora significativa en el diagnóstico de la tuberculosis.

Introducción

La tuberculosis (TB), una enfermedad infecciosa crónica causada por Mycobacterium tuberculosis (MTB), se encuentra entre las diez principales causas mundiales de muerte1. La tuberculosis resistente a los medicamentos (TB-DR) representa un desafío importante para los esfuerzos de control de la tuberculosis. El Plan de Acción para Construir Comunidades Libres de Tuberculosis (2022-2027), publicado por el Centro Chino para el Control y la Prevención de Enfermedades (CDC de China), hace hincapié en la necesidad de realizar un cribado precoz de la resistencia a los medicamentos en todos los pacientes con tuberculosis pulmonar confirmada bacteriológicamente2. Aboga por la adopción de nuevas tecnologías de diagnóstico molecular para mejorar las capacidades de detección de la TB-DR, acortar los plazos de diagnóstico, maximizar la identificación de los casos de TB-DR, garantizar un tratamiento y una gestión estandarizados e implementar las medidas de control de infecciones necesarias3. Además, la Comunicación sobre el fortalecimiento de la prevención y el control de la tuberculosis reproductiva (n.º 4, 2023) exige la promoción de técnicas de diagnóstico avanzadas en todo el país. Insta a que todos los pacientes con tuberculosis confirmada bacteriológicamente se sometan a un cribado oportuno de la resistencia para lograr el cribado universal, mejorar la estandarización del diagnóstico y mejorar el acceso a la atención sanitaria4.

La TB-DR se refiere a los casos de tuberculosis que son resistentes a al menos un medicamento antituberculoso. Las clasificaciones actuales incluyen tuberculosis resistente a la rifampicina (RR), monorresistente, polirresistente, multirresistente (MDR), prerresistente a los fármacos (pre-XDR) y extremadamente resistente a los fármacos (XDR). Un metaanálisis global de la epidemiología de la TB-DR revela tasas de resistencia alarmantes: TB-MDR en 11,6%, resistencia a isoniazida en 15,7%, resistencia a rifampicina en 9,4% y monorresistencia en 11,8%. Estos datos subrayan la gravedad y la complejidad de la DR-TB5.

La rifampicina y la isoniazida son fármacos fundamentales para el tratamiento de la tuberculosis. Sin embargo, la Organización Mundial de la Salud (OMS) señala que, si bien se dispone de tecnologías de diagnóstico rápido para la resistencia a la rifampicina, faltan herramientas análogas para la resistencia a la isoniazida. Esta brecha impide el diagnóstico oportuno de la tuberculosis multirresistente (TB-MDR). La definición provisional de "TB resistente a rifampicina" refleja esta limitación diagnóstica, destacando la insuficiente capacidad para detectar rápidamente la resistencia a otros fármacos 6,7. La OMS estima que los casos de tuberculosis resistente a la isoniazida son dos veces más prevalentes que los casos resistentes a la rifampicina. La dependencia exclusiva del cribado de la resistencia a la rifampicina corre el riesgo de pasar por alto la tuberculosis monorresistente a la isoniazida (TB-Hr)8. Los pacientes con TB-HR no detectados tratados con regímenes estándar se enfrentan a riesgos elevados de fracaso del tratamiento, recaída y progresión a TB-MDR9. La resistencia al etambutol también es preocupante. Como fármaco fundamental para el tratamiento de la tuberculosis y la tuberculosis multirresistente, la encuesta de referencia de 2017 de China sobre la tuberculosis represiva informó de tasas de resistencia al etambutol del 4,9% en los casos nuevos y del 17,2% en los casos de retratamiento10.

En la actualidad, para la detección de la resistencia a los medicamentos de la tuberculosis residual, el cultivo artificial sigue siendo el método preferido en algunos laboratorios, pero la tecnología de PCR fluorescente en tiempo real es superior a los métodos convencionales para detectar la resistencia a los medicamentos de la tuberculosis: detección y cuantificación: la PCR fluorescente en tiempo real proporciona un análisis cuantitativo preciso a través del monitoreo en tiempo real de las señales fluorescentes, mientras que los métodos convencionales carecen de esta precisión. Los métodos de experimentación tradicionales requieren mucho tiempo y mano de obra, requieren personal capacitado y son altamente subjetivos. Por el contrario, la PCR en tiempo real captura sondas fluorescentes y señales por computadora, minimizando los errores humanos. Los métodos convencionales de análisis de datos son más subjetivos, mientras que la PCR en tiempo real logra un análisis preciso y objetivo a través de curvas de amplificación, curvas estándar y otros métodos de análisis. Estos avances hacen que la PCR fluorescente en tiempo real sea el método preferido para detectar la resistencia a los fármacos de la tuberculosis11.

En resumen, la tuberculosis resistente a los medicamentos (TB-DR) se ha convertido en una crisis mundial. La resistencia a los fármacos clave (isoniazida, rifampicina y etambutol) complica aún más los esfuerzos de control de la tuberculosis. La detección oportuna y precisa de la resistencia a los medicamentos es crucial para orientar los regímenes de tratamiento personalizados, mejorar el éxito terapéutico y mitigar la amenaza de la tuberculosis reproductiva.

Para abordar el desafío diagnóstico, este estudio utilizó un kit que puede identificar Mycobacterium tuberculosis y detectar mutaciones resistentes a los medicamentos en 3,5 horas utilizando muestras de esputo. Esto se logró con el apoyo de qPCR de fluorescencia en tiempo real. El método es simple, rentable y preciso, lo que lo convierte en una herramienta valiosa en la lucha contra la TB-DR.

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Protocolo

Esta investigación ha sido aprobada por el Comité de Ética del Hospital de la Quinta División del Cuerpo de Producción y Construcción de Xinjiang; El número de ética es LLWYH2025001 y no hay conflicto ético. Los reactivos y el equipo utilizado se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Recogida de muestras

  1. Utilice frascos de esputo con tapón de rosca estandarizados internacionalmente recomendados por la Organización Mundial de la Salud (OMS), o cajas de plástico selladas y cajas de papel encerado, para recolectar muestras de esputo.
  2. Etiquete los envases de esputo con el nombre del paciente, el número (el número de secuencia ambulatorio para pacientes nuevos o el número de registro para pacientes de seguimiento), los elementos de examen y los números de secuencia de contenedores 1, 2, 3 (1 = esputo inmediato el mismo día, 2 = esputo nocturno, 3 = esputo matutino al día siguiente). Para los pacientes sin esputo, recoja muestras a través de la recolección de esputo inducido por aerosoles.
    NOTA: El personal debe evaluar la calidad de las muestras de esputo recolectadas. El volumen de la muestra debe mantenerse generalmente en 3-5 mL. Las muestras calificadas incluyen esputo seco, esputo marrón manchado de sangre, esputo que contiene una pequeña cantidad de sangre fresca o esputo mucoso. Las muestras no calificadas, como la saliva, deben volver a enviarse para su análisis después de recibir más orientaciones.

2. Preprocesamiento de esputo

  1. Agregue 1-2 veces el volumen de la solución de NaOH al 4% al recipiente de esputo en función del volumen del esputo recolectado. Agitar y mezclar el contenido durante 2 min.
  2. Coloque el recipiente en una cabina de bioseguridad a temperatura ambiente durante 15 min, agitándolo varias veces durante este período para asegurar la licuefacción completa del esputo.
    NOTA: Manipule el NaOH con cuidado debido a su naturaleza corrosiva. Si el esputo no está completamente licuado, aumente el tiempo de agitación. Este paso es particularmente importante a lo largo del experimento.

3. Preparación de reactivos (área pre-PCR)

  1. Preparación de reactivos: Preparar reactivos en el área designada para pre-PCR. Descongele los reactivos congelados a temperatura ambiente. Vórtice durante 5-10 s. Centrífuga a 3000 × g durante 5-10 s a temperatura ambiente.
    NOTA: Este reactivo es un sistema dual (A/B) y debe prepararse por separado.
  2. Preparación de la mezcla maestra de PCR
    1. Mezcla A: En un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL, combine (n + 3) × 19,6 μL de RIF PCR Mix A y (n + 3) × 0,4 μL de enzima TB. Vórtice durante 5-10 s. Centrífuga a 3000 × g durante 5-10 s a temperatura ambiente (PCR Mix A: 60 μL).
    2. Mezcla B: En otro tubo de microcentrífuga de 1,5 mL, combine (n + 3) × 19,6 μL de RIF PCR Mix B y (n + 3) × 0,4 μL de enzima TB. Vórtice y centrífuga como se indicó anteriormente (PCR Mix B: 60 μL).
  3. Almacenamiento y uso: Almacene las mezclas maestras preparadas a ≤-18 °C. Si no se utiliza inmediatamente, utilícelo dentro de las 4 h.
    NOTA: El mismo protocolo se aplica a los reactivos EMB e INH.
  4. Alícuota de la mezcla maestra de PCR: Dispense 20 μL de la mezcla de PCR A y la mezcla B en tubos de reacción de pared delgada de PCR separados. Transfiera los tubos alículos en bolsas selladas al área de extracción.

4. Extracción de ácido nucleico y carga de muestras (área de extracción)

  1. Centrifugar 1,2 mL de esputo totalmente licuado a 15.058 × g durante 5 min a temperatura ambiente. Deseche el sobrenadante y conserve el pellet. Opcional: Centrifugar toda la muestra digerida si el equipo lo permite.
  2. Vuelva a suspender el pellet en solución salina de 1,2 mL, vórtice y centrífuga a 15.058 × g durante 5 minutos a temperatura ambiente. Repita este paso de lavado tres veces.
  3. Añada 250 μL de tampón de extracción TB al pellet. Vórtice y realice lisis térmica a 99 °C durante 10 min. Deje enfriar a temperatura ambiente. Centrifugar a 15.058 × g durante 1 min a temperatura ambiente y recoger el sobrenadante (muestra extraída).
    NOTA: Para muestras viscosas, aumente el volumen del tampón de licuefacción o extienda el tiempo de vórtice. Si las muestras son únicamente para la extracción de ADN, prolongue el tiempo de licuefacción para asegurar una digestión completa.
  4. Con una micropipeta, añada 5 μL de la muestra extraída o de controles negativos/positivos a cada tubo de reacción de pared fina de PCR. Selle los tubos inmediatamente y etiquételos adecuadamente.
  5. Tubos de PCR cargados en vórtice durante 5-10 s y centrífuga brevemente (5-10 s). Transfiera los tubos al área de amplificación de PCR.

5. Amplificación por PCR (área de amplificación)

NOTA: Los programas para la detección de resistencia a rifampicina, etambutol e isoniazida se establecieron en un termociclador Hongshi (Tabla 1, Tabla 2 y Tabla 3). Las condiciones de ciclismo están incluidas.

  1. Coloque los tubos de reacción de pared delgada de PCR cargados en el termociclador para la amplificación.
  2. Acceda a la interfaz del ciclador. Haga clic en Asistente de experimentos y seleccione el tipo de experimento como Curva de fusión estándar (como se muestra en la Figura 1).
  3. Haga clic en Editor de placas, seleccione horizontalmente dos pocillos en blanco adyacentes y asigne la plantilla de fármaco correspondiente desde el panel derecho para definir una muestra (como se muestra en la Figura 2).
  4. Configure los controles negativos/positivos y la información de muestra. Haga clic en Iniciar para iniciar el programa. La duración es de 2 h y 22 min.
  5. Al finalizar, transfiera los tubos de reacción de pared delgada de PCR (sellados) a una bolsa sellada. Asegure el cierre y manéjelo como residuo biopeligroso.
  6. Haga clic en Analizar en el termociclador para procesar los datos.
    NOTA: Los límites de detección de este método son los siguientes: Grupo compuesto: 10 bacterias/mL; Rifampicina: 20.000 bacterias/mL; Isoniazida: 10.000 bacterias/mL; Etambutol: 10.000 bacterias/mL. (Los datos del límite de detección (LoD) se derivan del análisis estadístico de 765 casos clínicos proporcionados en el manual de instrucciones del reactivo).

6. Interpretación de los resultados

  1. Determine las mutaciones comparando las diferencias de temperatura de fusión (Tm) entre las muestras de prueba y los controles positivos.
    NOTA: Tipo salvaje (sensible a los medicamentos): Los valores de Tm de la muestra coinciden con el control positivo en los cuatro canales (desviación ≤1 °C). Mutante (resistente a los medicamentos): el valor de Tm en cualquier canal es ≥2 °C más bajo que el control positivo (ΔTm ≥2 °C).

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Resultados

Este estudio utilizó PCR de fluorescencia en tiempo real y análisis de curva de fusión para analizar muestras de esputo de 17 pacientes con tuberculosis. Además, 30 pacientes se sometieron a pruebas de resistencia a la rifampicina y 20 se sometieron a pruebas de resistencia a la isoniazida y al etambutol. El método de PCR de fluorescencia en tiempo real demostró una tasa de detección positiva del 88,2% para el complejo Mycobacterium tuberculosis .

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Discusión

La aparición de cepas del complejo Mycobacterium tuberculosis (MTBC) resistentes a los medicamentos a escala mundial ha complicado significativamente el tratamiento de los pacientes con tuberculosis (TB). En particular, la tuberculosis multirresistente (MDR) y la extremadamente resistente a los fármacos (XDR) plantean desafíos formidables para el control de la tuberculosis12. La detección rápida de la resistencia a los medicamentos es crucial para diseñar...

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Divulgaciones

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Agradecimientos

Este estudio fue financiado por una subvención especial del Proyecto de Tuberculosis del Cuerpo.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
centrífuga
Xiamen Zhishan Biotechnology Co., Ltd.
Kit de detección de mutaciones de resistencia al etambutol de Mycobacterium tuberculosisXiamen Zhishan Biotechnology Co., Ltd.
Kit de detección de mutaciones de resistencia a la isoniazida de Mycobacterium tuberculosisXiamen Zhishan Biotechnology Co., Ltd.
Mycobacterium tuberculosis Detección de mutaciones de resistencia a la rifampicina KiXiamen Zhishan Biotechnology Co., Ltd.Sistema de
PCR en tiempo real SLAN-96PShanghai Hongshi Medical Technology Co., Ltd.SLAN-96P
Xiamen Zhishan Biotechnology Co., Ltd.
Pipeta
Tampón de lisis de alta velocidad241107012403080124011101 24031001 Solución de procesamiento de esputo 24110701 TopPette

Referencias

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