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Artículo de método

Recolección de líquido de lavado nasal murino sin contaminación de sangre

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DOI:

10.3791/68451

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11 de julio de 2025

 ,  ,  ,  , 
1Department of Microbiology, Kindai University Faculty of Medicine, 2Department of Arts and Sciences, Kindai University Faculty of Medicine

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

El presente protocolo describe un método novedoso para evitar la contaminación sanguínea en el líquido de lavado nasal (FLN) murino. Dado que este método garantiza la recolección de NLF sin contaminación de la sangre, permite detecciones más precisas de componentes inmunológicos y diversos patógenos respiratorios.

Resumen

Las muestras de las vías respiratorias superiores, incluidos el líquido de lavado nasal (NLF, por sus siglas en inglés) y los hisopos nasales, son útiles para detectar patógenos, incluidos virus y bacterias, que pueden causar enfermedades respiratorias. El NLF se ha utilizado para examinar los componentes celulares y humorales del sistema respiratorio, por ejemplo, en la evaluación de la inducción de inmunoglobulina (Ig) A después de las vacunaciones de la mucosa. En roedores experimentales, las muestras de NLF se pueden recolectar por vía transfaríngea o transtraqueal. Aunque se ha informado que la vía transfaríngea es más eficiente en la recolección de muestras de NLF que la ruta transtraqueal, las muestras de NLF recolectadas por la vía transfaríngea a menudo estaban contaminadas con sangre, lo que afectaba los niveles de contenido celular y humoral en las muestras originales de NLF. Por lo tanto, este estudio tuvo como objetivo establecer un nuevo método de recolección de NLF en ratones experimentales para minimizar la contaminación sanguínea. Brevemente, antes de que se separara la mandíbula inferior del ratón, se colocaron bolas de algodón en la boca para absorber la sangre. Una vez interrumpido el sangrado, las muestras de NLF se recogieron insertando una micropipeta en la coana y enjuagando con 200 μL de solución salina tamponada con fosfato dos veces (volumen final: 400 μL/ratón). Para detectar la contaminación de la sangre, se utilizó una prueba forense de luminol simple y sensible que detecta hemoglobina. La prueba de luminol demostró que la contaminación de la sangre era detectable en las muestras de NLF recolectadas por el método convencional (sin bolas de algodón), pero no en las recolectadas por el método novedoso (con bolas de algodón). Debido a la contaminación de la sangre, las concentraciones totales de IgA e IgG en las muestras de NLF fueron más altas en el método convencional que en el método novedoso; Se sabe que la sangre contiene niveles mucho más altos de IgA e IgG que el NLF. Por lo tanto, este método único se puede utilizar como un método simple y sensible para recolectar muestras de NLF de ratones experimentales para evitar la contaminación de la sangre.

Introducción

Tanto en la investigación clínica como en la básica, los métodos adecuados de recolección de muestras son cruciales para evaluar los resultados. El lavado nasal es una técnica de irrigación utilizada para analizar los componentes celulares y humorales de las vías respiratorias 1,2,3. Clínicamente, el líquido de lavado nasal (NLF) se ha utilizado como una muestra no invasiva eficaz para el descubrimiento de biomarcadores, con varios estudios que respaldan su uso en diversas enfermedades respiratorias, como la sinusitis, la fibrosis quística y los trastornos respiratorios generales 4,5,6,7. En animales de experimentación, el NLF también se ha utilizado para estudiar modelos de enfermedades respiratorias, como la gripe, la enfermedad por coronavirus-2019 (COVID-19) y la enfermedad alérgica 3,8,9. Este método es ampliamente utilizado para determinar biomarcadores inflamatorios clave, como las células polimorfonucleares y las citocinas, que a menudo se examinan como indicadores de respuestas a alérgenos, asma e infecciones respiratorias 10,11,12. Más recientemente, para investigar la eficacia y la seguridad de posibles vacunas candidatas intranasales, a menudo se han recogido muestras de NLF de animales de experimentación, y se han cuantificado los niveles de patógenos e inmunoglobulinas (Ig) en las muestras de NLF como indicadores13.

En ratones experimentales, el NLF se puede recolectar utilizando el método transfaríngeo o transtraqueal. En el método transfaríngeo, la cabeza murina, incluida la región palatinofaríngea, se separó de la laringe y luego se insertó un catéter a través de la abertura faríngea en el coana para inyectar solución salina tamponada con fosfato (PBS) y recoger NLF de la fosa nasal14. El método transtraqueal obtuvo acceso a las vías respiratorias a través de la tráquea sin cortar la cabeza, y el NLF se recolectó de la fosa nasal, minimizando el riesgo de contaminación de la sangre. Aunque estos dos métodos principales se han empleado para la recolección de NLF en ratones experimentales, ambos métodos convencionales tienen sus propias limitaciones. Se ha demostrado que el método transtraqueal produce cantidades más bajas de NLF que el método transfaríngeo debido a la fuga de líquido de lavado transtraqueal en la cavidad oral. El estudio previo mostró que, después de la inyección de PBS, los volúmenes de líquido recuperados en NLF fueron 70%-80% y 90%-100% en los métodos transtraqueal y transfaríngeo, respectivamente14. A pesar de que el método transfaríngeo puede ser considerado mejor con mayores cantidades de NLF que el método transtraqueal, la contaminación sanguínea durante el procedimiento fue inevitable hasta cierto punto14,15. De manera similar, varios estudios han reportado que las muestras de NLF a menudo estaban contaminadas con altos niveles de proteínas séricas en sangre 16,17,18. Esto puede interferir con la detección y cuantificación de biomarcadores específicos de NLF para enfermedades respiratorias19. Esto también puede afectar las concentraciones de Ig, particularmente IgA e IgG, en muestras de NLF, ya que la sangre contiene mayores cantidades de IgA e IgG que NLF.

Para abordar estos desafíos, este estudio tuvo como objetivo establecer un método transfaríngeo único, simple y confiable para recolectar muestras de NLF de ratones experimentales, maximizando el rendimiento de la muestra y minimizando la contaminación de la sangre. Durante los procesos experimentales, se colocaron bolas de algodón en la boca del ratón para inhibir la contaminación de la sangre, y luego se inyectó PBS para recolectar muestras de NLF de la fosa nasal. Los niveles de contaminación sanguínea en NLF se determinaron mediante una técnica forense, quimioluminiscencia basada en luminol, que permite la semicuantificación de los niveles de hemoglobina (Hb) en muestras de NLF; la reacción de luminol en NLF recogida por el nuevo método fue negativa. Por lo tanto, el nuevo método actual puede mejorar la calidad de la muestra de NLF para varios experimentos biológicos, como ensayos de inmunoabsorción enzimática de anticuerpos (ELISA), perfiles de citocinas, determinaciones de biomarcadores inmunológicos y médicos, y modelos murinos de enfermedades respiratorias.

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Protocolo

Todos los procedimientos experimentales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Facultad de Medicina de la Universidad de Kindai y realizados de acuerdo con los criterios descritos por los Institutos Nacionales de Salud (NIH)20. En este estudio se utilizaron ratones machos C57BL/6 de 4 meses de edad. La información sobre los reactivos y el equipo utilizado en este estudio se enumera en la Tabla de Materiales.

1. Colección NLF

  1. Eutanasia de un ratón con isoflurano21 al 5% siguiendo protocolos aprobados institucionalmente.
  2. Coloque el ratón boca arriba sobre una placa quirúrgica y fíjelo sujetando las cuatro extremidades.
  3. Extraiga sangre del corazón con una jeringa de 1 ml.
  4. Abra la cavidad abdominal con unas tijeras para exponer los órganos viscerales y el diafragma.
  5. Haga una incisión en el diafragma y las costillas con unas tijeras para hacer visible la aurícula derecha.
  6. Perfore la aurícula derecha con unas tijeras para extraer más sangre.
  7. Coloque tres bolas de algodón en la boca del animal mientras tira de la lengua.
  8. Separe la mandíbula inferior con unas tijeras mientras eleva la cabeza (posición de la nariz hacia arriba) para inhibir la contaminación de la sangre en el NLF.
  9. Reemplace las bolas de algodón por otras nuevas para evitar la contaminación de la sangre.
  10. Una vez que se haya detenido el sangrado, inyecte 200 μl de PBS estéril en la choana y recoja el NLF expulsado de las fosas nasales en un tubo de 1,5 mL.
  11. Repita el paso 1.10 una vez más.

2. Detección de contaminación sanguínea por quimioluminiscencia de luminol

  1. Disuelva 1 mg de luminol y 5 mg de peróxido de sodio (Na, 2,O2) con 1 mL de agua estéril utilizando un tubo de 1,5 mL para hacer la solución madre.
    NOTA: La concentración final es de 1 mg/mL de luminol y 5 mg/mL deNa2O2.
  2. Cubra el tubo con papel de aluminio y guárdelo a 4 °C hasta su uso.
  3. Diluya la solución madre 10 veces con agua desionizada para hacer una solución de trabajo.
    NOTA: La concentración final es de 0,1 mg/mL de luminol y de 0,5 mg/mL deNa2O2.
  4. Pipetear 2 μL de muestras de NLF en pocillos de una placa de 96 pocillos.
  5. Agregue 100 μL de la solución de luminol diluida a cada pocillo.
  6. Agite brevemente la placa de 96 pocillos para mezclar las muestras con la solución de luminol.
  7. Observe directamente la quimioluminiscencia de luminol en la oscuridad.
  8. Semicuantificar la concentración de Hb utilizando un luminómetro, si es necesario.

3. Cuantificación de IgA e IgG por ELISAs

  1. Cubra los pocillos de placas de 96 pocillos con 100 μL/pocillo de un anticuerpo anti-ratón IgA (20 ng/pocillo; 200 ng/mL) o IgG (10 ng/pocillo; 100 ng/mL) (consulte la Tabla de materiales).
  2. Selle las placas e incube a 4 °C durante la noche.
  3. Lave las placas tres veces con 300 μL/pocillo de un tampón de lavado que contenga 0,05% Tween 20 en PBS cada vez y, a continuación, seque las placas con toallas de papel.
  4. Añadir 200 μL de un diluyente de ensayo que contenga un 10% de suero fetal bovino (FBS) y un 0,2% de Tween 20 en PBS a cada pocillo.
  5. Incubar las placas a temperatura ambiente (RT) durante 60 min.
  6. Aspire el diluyente del ensayo y luego seque las placas con toallas de papel.
  7. Prepare 100 ng/mL de un patrón de IgA o IgG de ratón con el diluyente de ensayo y realice diluciones en serie dobles: 50 ng/mL, 25 ng/mL, 12,5 ng/mL, 6,25 ng/mL, 3,13 ng/mL, 1,56 ng/mL y 0,78 ng/mL.
    NOTA: El volumen requerido de cada patrón es de 100 μL por pocillo.
  8. Diluir las muestras con el diluyente de ensayo en las diluciones adecuadas: suero (104 a 106), NLF (10, 50, 200 y 500) y BALF (101 a 104).
    NOTA: El volumen requerido de cada muestra es de 100 μL por pocillo.
  9. Agregue 100 μL de patrones de IgA o IgG y muestras a los pocillos apropiados.
  10. Incubar las placas a RT durante 75 min.
  11. Lave las placas tres veces con 300 μL/pocillo del tampón de lavado cada vez y, a continuación, seque las placas con toallas de papel.
  12. Diluir un anticuerpo anti-ratón F(ab')2 conjugado con peroxidasa (véase la tabla de materiales) con el diluyente del ensayo a la dilución adecuada: 10dilución de 4 veces.
    NOTA: El volumen requerido es de 100 μL por pocillo.
  13. Añadir 100 μL del anticuerpo F(ab')2 anti-ratón conjugado con peroxidasa diluida a cada pocillo.
  14. Incubar las placas a RT durante 75 min.
  15. Lave las placas cinco veces con 300 μL/pocillo del tampón de lavado cada vez y, a continuación, seque las placas en torres de papel.
  16. Añadir 100 μL de una solución de sustrato que contenga tetrametilbencidina (TMB) y peróxido de hidrógeno a cada pocillo.
  17. Incubar las placas a RT durante 5 min.
  18. Agregue 50 μL de una solución de parada, ácido sulfúrico 2 N (2N H2SO4), a cada pocillo.
  19. Mida la absorbancia a 450 nm utilizando un lector de microplacas.
  20. Determine las concentraciones de IgA e IgG en cada muestra utilizando las curvas estándar.

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Resultados

Utilizando el método convencional o novedoso, se recogieron muestras de NLF de ratones C57BL/6 por vía transfaríngea. Como se muestra en la Figura 1, las muestras de NLF recolectadas por el método convencional estaban ligeramente teñidas de rosa (Figura 1A); las muestras de NLF recolectadas por el nuevo método fueron claras (Figura 1B). Dado que la diferencia parecía ser el resultado de la contaminación de la sangre en las muestras ...

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Discusión

El lavado nasal es una técnica valiosa para adquirir información bioquímica, citológica y biológica en enfermedades respiratorias, como la influenza y la COVID-1923. Además de identificar varias células infiltrantes, la composición no celular del tracto respiratorio puede examinarse a partir de las muestras de NLF utilizando varios métodos, como ELISA, inmunoblot y reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Agradecemos a Seiichi Omura, Ph.D., Cong Thanh Nguyen, M.D., Ph.D., Kota Moriguchi, M.D., Reona Shiro, M.D., y Sandesh Rimal, M.S., Departamento de Microbiología, Facultad de Medicina de la Universidad de Kindai, y Hirotaka Ebina, Ph.D., Shinya Okamura, Ph.D., y Yasuo Yoshioka, Ph.D., Grupo de Vacunas contra el Virus, BIKEN Innovative Vaccine Research Alliance Laboratories, Instituto de Investigación de Enfermedades Microbianas, Universidad de Osaka, para discusiones útiles. También expresamos nuestro agradecimiento a los miembros del Instituto de Investigación en Ciencias de la Vida de la Universidad de Kindai por su excelente asistencia técnica. Este trabajo contó con el apoyo del Ministerio de Educación, Cultura, Deportes, Ciencia y Tecnología de Japón, a través de la Beca Monbukagakusho (MEXT, 2021-2025) (I.A.), Grant-in-Aid for Scientific Research KAKENHI de la Sociedad Japonesa para la Promoción de la Ciencia (JSPS) JP23K06493 (F.S.), JP21K07287/JP24K10500 (A.-M. P.) y JP22K18378/JP24K10163 (I.T.), y las Subvenciones de Mejora de la Investigación de la Universidad de Kindai KD2406 (F.S.) y KD2506 (I.T.).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Aguja de fijación de animalesNatsume Seisakusho Co., Ltd., Tokio, JapónKN-358-AFijamos un ratón con agujas de fijación de animales. Acero inoxidable; longitud total, 23 mm; y punta de aguja, 15 mm.
BD OptEIATM  Juego de reactivos de sustrato TMBBD Biosciences, San Diego, CA, USA555214Agregamos 100 μ L de solución de sustrato TMB por pocillo.
Campana NANAUsamos una campana para anestesia.
Placas inmunológicas no estériles de 96 pocillos de fondo plano transparente ThermoFisher Scientific, Rochester, NY, EE. UU. 442404Utilizamos placas inmuno no estériles de 96 pocillos de fondo plano transparente con tratamiento de superficie MaxiSorp para ensayos inmunoabsorbentes ligados a enzimas.
Bola de algodónSansho Co., Ltd., Tokio, Japón94-1951Usamos bolas de algodón para evitar la contaminación de la sangre. El diámetro de las bolas de algodón era de 7 mm.
Suero fetal bovinoSigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, EE. UU.172012-500 MLAgregamos 10% de suero fetal bovino al diluyente del ensayo.
Pinzas (micropinzas para experimentos de investigación, punta curva)Sansho Co., Ltd., Tokio, Japón91-1506Utilizamos pinzas para la disección. Modelo, HSC 551-10; y en toda su longitud, 105 mm.
Fórceps (pinzas de precisión)Sansho Co., Ltd., Tokio, Japón91-2772Usamos fórceps para la disección. Modelo, HSC 607-12; longitud total, 120 mm; y diámetro de la punta, 0,3 mm.
Cabra Anti-Ratón IgA-UNLBSouthernBiotech, Birmingham, AL, USA1040-01Recubrimos placas inmunológicas no estériles de 96 pocillos de fondo plano transparente con 100 μ L/pocillo (20 ng/pocillo) de inmunoglobulina A total.
IsofluranoViatris Inc., Canonsburg, PA, EE. UUNAUsamos isoflurano para anestesia.
Juego de reactivos de reacción de luminolFUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation, Osaka, Japón124-06511Utilizamos un conjunto de reactivos de reacción de luminol para detectar hemoglobina en muestras de NLF.
MicrotuboWatson Co., Ltd., Tokio, Japón131-7155CUtilizamos microtubos para recolectar NLF y BALF (microtubo de 1,5 ml con tapa de bloqueo, fondo redondo, tapa suave al tacto).
Milli-Q waterMerck KGaA, Darmstadt, GermanyMilli-Q Direct 8Utilizamos agua MilliQ para hacer una solución de rectión de luminol.
Mini-Shaker PSU-2TBiosan Ltd., Riga, LetoniaPSU-2TAgitamos placas de 96 pocillos con el Mini-Shaler PSU-2T.
Cepa de ratónCLEA Japan, Inc., Tokio, JapónNAutilizamos ratones machos C57BL/6 de 4 meses de edad.
Nunc MicroWell 96-Well, Nunclon Delta-Treated Microplate Flat-Bottom ThermoFisher Scientific Nunc A/S . Kamstrupvej, Roskilde, Dinamarca136101Utilizamos la microplaca de fondo plano NuncTM MicroWellTM de 96 pocillos, tratada con Nunclon Delta, de fondo plano para la prueba de luminol.
AffiniPure conjugado con peroxidasa F(ab')2 IgG anti-ratón de cabra, F(ab')2 Fragmento específico (reacción cruzada mínima a proteínas de suero humano, bovino y de caballo)Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc., West Grove, PA, USA115-036-072Agregamos 100 μ L de IgG de cabra anti-ratón AffiniPure conjugada con peroxidasa F(ab')2, F(ab')2 fragmento específico, como anticuerpo de detección (dilución de 10.000 veces) para cada pocillo.
Solución salina tamponada con fosfatoSigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, EE. UU.D8537-500MLUtilizamos solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (modificada sin cloruro de calcio y cloruro de magnesio, líquida, filtrada estérilmente, adecuada para el cultivo celular) para la recolección de NLF y BALF.
Pipeta Watson Co., Ltd., Tokio, JapónNAUsamos un 200-μ Pipeta L para lavado nasal.
Punta de pipetaWatson Co., Ltd., Tokio, JapónNAUtilizamos una 200-μ L punta de pipeta multifit para lavado nasal.
Monolaurato de polioxietileno (20) de sorbitán (Tween 20)FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation, Osaka, Japón167-11515Agregamos 0,05% de Tween 20 al tampón de lavado y 0,2% de Tween 20 al diluyente del ensayo.
Anticuerpo IgG (reactividad mínima al cromo) Anticuerpo BioLegend de Cabra Purificado Anti-IgG, San Diego, CA, USA405301Recubrimos placas inmuno no estériles de 96 pocillos de fondo plano transparente con 100 μ L/pocillo (10 ng/pocillo) de inmunoglobulina G total.
Tijeras pequeñas, de doble puntaSansho Co., Ltd., Tokio, Japón91-7005Usamos tijeras para la disección. Modelo, S-4A; y en toda su longitud, 115 mm.
Ácido sulfúricoWako Pure Chemical Industries, Ltd, Tokio, Japón192-04755Agregamos 50 μ L de ácido sulfúrico 2 N a cada pocillo para detener la reacción.
Catéter intravenoso SurfloTerumo Corporation, Tokio, Japón SR-FS2032Utilizamos un catéter intravenoso surflo e inyectamos PBS en la tráquea para el lavado broncoalveolar. catéter, 20G; longitud del catéter, 32 mm; diámetro interno del catéter, 0,80 mm; diámetro exterior del catéter, 1,1 mm; y la aguja interna, 22G.
Tijeras rectas quirúrgicasSansho Co., Ltd., Tokio, Japón91-7004Usamos tijeras para la disección. Modelo, S-3B; y en toda su longitud, 120 mm.
Placa quirúrgicaNatsume Seisakusho Co., Ltd., Tokio, JapónKN-321-BUtilizamos una placa de corcho para la disección. Profundidad, 20 cm; ancho, 15 cm; y altura 3 cm.
Synergy H1 Lector de microplacas multimodo híbridoAgilent Technologies, Inc., Santa Clara, CA, EE. UUNAMedimos la absorbancia de las muestras a 450 nm, utilizando el lector de microplacas multimodo híbrido Synergy H1.
JeringaTerumo Corporation, Tokio, Japón SS-01TUsamos una jeringa de 1 ml para la extracción de sangre del corazón.
Hilo  Niccho Kogyo Co., Ltd. Tokio, Japón,NAAtamos un catéter con hilo para asegurar un posicionamiento adecuado durante el procedimiento.
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Referencias

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