Este protocolo permite el aislamiento de suficientes condrocitos primarios en un plazo de 6 a 8 h, lo que facilita nuevas investigaciones en profundidad de la biología del cartílago y los mecanismos de la enfermedad del cartílago.
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Artículo de método
Aislamiento in vitro y cultivo de condrocitos primarios de ratón para la biología del cartílago
En este artículo
Resumen
Resumen
La destrucción del cartílago articular conduce a una actividad alterada de los condrocitos, que es un factor causal importante en una variedad de enfermedades del cartílago, incluida la osteoartritis (OA) y la artritis reumatoide (AR). Como el tipo de célula más abundante en el cartílago, un estudio en profundidad de las propiedades biológicas de los condrocitos es esencial para el desarrollo de estrategias efectivas de tratamiento de enfermedades. El aislamiento y el cultivo de condrocitos primarios proporcionan importantes materiales experimentales para la investigación de la enfermedad del cartílago y contribuyen a desentrañar los mecanismos de lesión y reparación del cartílago. Este protocolo proporciona una descripción detallada de los métodos de aislamiento y cultivo in vitro para condrocitos primarios derivados de ratones. Mediante el uso del protocolo optimizado de colagenasa II, el aislamiento de condrocitos se puede completar en 8 h para muestras de cartílago de la articulación de la rodilla de ratón neonatal. El rendimiento celular es de aproximadamente 1-2 × 10³ células/mg de tejido cartilaginoso, variando con la frescura del tejido y la densidad celular inicial; Las células aisladas exhiben una viabilidad del >90%. Este protocolo utiliza condrocitos primarios de ratón como ejemplo, mostrando las características morfológicas y el estado de adhesión de las células cultivadas durante 1, 2 y 5 días después del aislamiento. La reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa con transcripción inversa (RT-qPCR) y el western blot mostraron que el tratamiento con interleucina-1β (IL-1β) redujo el colágeno tipo II alfa 1 (Col2a1) y aumentó la expresión de metalopeptidasa de matriz 13 (Mmp13), lo que confirma que los condrocitos aislados responden a estímulos inflamatorios. En comparación con los métodos convencionales, este protocolo emplea una mayor concentración de colagenasa para reducir el impacto del tiempo de aislamiento prolongado en la viabilidad celular, al tiempo que evita el daño celular potencial del tratamiento con tripsina. Los condrocitos primarios obtenidos son puros y viables, adecuados para estudios en profundidad sobre los mecanismos relacionados con la lesión del cartílago, que tienen importantes implicaciones para la investigación in vitro y el tratamiento clínico de la enfermedad del cartílago.
Introducción
La destrucción del cartílago articular es una de las principales causas de diversas enfermedades del cartílago, como la OA y la AR 1,2. Los condrocitos, el tipo celular predominante en el cartílago, son esenciales para mantener la homeostasis y facilitar la reparación en respuesta a la lesión3. Las alteraciones en la actividad de los condrocitos no solo afectan la integridad estructural del cartílago, sino que también inducen respuestas inflamatorias y degeneración tisular progresiva4. Por lo tanto, una investigación en profundidad de las propiedades biológicas de los condrocitos es crucial para dilucidar la etiopatogenia de estas enfermedades.
En los últimos años, el papel de los condrocitos en las respuestas inflamatorias ha recibido una atención cada vez mayor. Los estudios han demostrado que las citocinas inflamatorias, como la IL-1β y el factor de necrosis tumoral-α (TNF-α), comprometen significativamente los procesos metabólicos de los condrocitos, lo que resulta en una mayor expresión de enzimas que degradan la matriz y una disminución de la síntesis de la matriz 5,6,7. Estos cambios finalmente conducen a la degeneración gradual del cartílago y la disfunción articular. Por lo tanto, investigar las alteraciones biológicas de los condrocitos en condiciones patológicas dentro de modelos in vitro se ha vuelto particularmente imperativo. Sobre la base del cultivo tradicional de monocapas bidimensionales (2D), los avances recientes en el cultivo tridimensional (3D) de condrocitos y las tecnologías de organoides se han adoptado cada vez más en la investigación relacionada con el cartílago. Estos sistemas refinados ofrecen un microambiente fisiológicamente más relevante y proporcionan información valiosa sobre el comportamiento de los condrocitos en contextos de enfermedad8.
La selección de una fuente celular determina críticamente si los hallazgos in vitro recapitulan con precisión la fisiopatología de las articulaciones. A diferencia de las líneas de condrocitos inmortalizadas o los explantes de cartílago, los condrocitos primarios conservan el fondo genético nativo, las vías de señalización del calcio mecanosensibles y la estabilidad fenotípica del cartílago articular, exhibiendo así una capacidad condrogénica superior y comportamientos biológicos que reflejan más de cerca los de las células de cartílago residentes9. Se han documentado diferencias sistemáticas en las fuentes de señalización de calcio y los canales iónicos clave y las vías posteriores entre los condrocitos primarios y la línea celular ATDC510. En consecuencia, al investigar la fisiología o patología articular, se deben priorizar los condrocitos primarios. Por lo tanto, optimizar el aislamiento y el cultivo de condrocitos primarios es esencial para modelar con precisión la biología relacionada con la enfermedad y explorar posibles fármacos terapéuticos 11,12,13,14,15. Sin embargo, los métodos existentes comprometen la viabilidad celular o la integridad del fenotipo debido a la digestión prolongada16,17.
Aquí, describimos un protocolo para el aislamiento in vitro y el cultivo de condrocitos primarios derivados del tejido del cartílago de ratón, que produce rápidamente suficientes células. En comparación con los protocolos convencionales de digestión prolongada de baja concentración de enzimas, este estudio ha optimizado las condiciones de digestión enzimática y los pasos de pretratamiento tisular. Esta optimización ha reducido significativamente el tiempo de digestión a 6-8 h al tiempo que evita el daño celular potencial del tratamiento con tripsina15,17. Con este método, se pueden obtener aproximadamente 1-2 × 103 condrocitos de cada mg de tejido de cartílago de ratón. Este protocolo ofrece una guía confiable para aislar y cultivar condrocitos primarios in vitro, proporcionando un modelo sólido para estudios de enfermedades del cartílago.
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Protocolo
Todos los experimentos con animales fueron aprobados por el Comité de Ética del Hospital Xi'an Honghui (No. 202309009), y los procedimientos experimentales se adhirieron estrictamente a los principios de las 3R de reemplazo, reducción y refinamiento para la experimentación con animales.
La Figura 1A ilustra un diagrama esquemático de la preparación de reactivos y equipos. La Tabla de Materiales incluye información sobre los reactivos y equipos utilizados en este protocolo.
1. Ratones experimentales
NOTA: En este estudio se utilizaron cuatro ratones C57BL/6J de 3 días de edad, de tipo salvaje.
- Mantenga las jaulas a una temperatura constante de 25 °C ± 2 °C y una humedad del 50%-60%, con un ciclo de luz/oscuridad de 12 h/12 h. Proporcione una dieta estéril para ratones de grado libre de patógenos específicos (SPF) (esterilizada por irradiación con 60Co) y agua estéril ad libitum.
- Recolecte cartílago de la articulación de la rodilla (~ 10 mg / ratón) de cuatro ratones de 3 días de edad post mortem para aislar los condrocitos primarios.
2. Recolección y procesamiento de muestras de cartílago
- Procesamiento de ratones y disección de tejidos
- Eutanasia a los ratones neonatales dentro de los 3 días posteriores al nacimiento. Esterilice la superficie del cuerpo limpiando con alcohol medicinal al 75%.
- Aísle las articulaciones de la rodilla del ratón con instrumentos quirúrgicos estériles. Colóquelos en 1x PBS estéril.
- Extirpe cuidadosamente los músculos, huesos, membrana sinovial y otros tejidos conectivos proliferativos que rodean la articulación de la rodilla con instrumentos quirúrgicos estériles. Retenga solo el tejido cartilaginoso de la articulación de la rodilla.
- Enjuague las muestras de tejido 3 veces con 1 PBS estéril. Deseche el líquido.
NOTA: La Figura 1B ilustra un diagrama esquemático simplificado de la adquisición y el preprocesamiento del tejido cartilaginoso.
Figura 1: Flujo de trabajo simplificado de preparación de materiales y procesamiento de muestras de cartílago. (A) Diagrama esquemático de la configuración de reactivos y equipos, incluidos reactivos, consumibles e instrumentos principales. (B) Protocolo paso a paso para procesar tejidos cartilaginosos de las articulaciones de la rodilla del ratón. Abreviaturas: PBS = solución salina tamponada con fosfato. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
3. Aislamiento y cultivo de condrocitos primarios
- Transfiera el tejido de cartílago aislado a una nueva placa de cultivo celular de 6 pocillos. Con una cuchilla quirúrgica estéril No. 11, pique el tejido en trozos pequeños de aproximadamente 0,25 mm3 de tamaño. Enjuague una vez con 1x PBS estéril preenfriado. Deseche el líquido.
- Agregue 2 ml de solución de digestión precalentada (37 °C) que contenga colagenasa II de alta concentración (25 mg/ml, disuelta en medio basal estéril Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12 [DMEM/F12]) para cubrir el bloque de tejido.
- Incubar la placa de cultivo celular en una incubadora humidificada al 5% deCO2 a 37 °C durante 15 min para la digestión enzimática. Después de la incubación, deseche el líquido.
- Repita los pasos 3.2 y 3.3.
NOTA: La digestión enzimática de alta concentración es un paso preliminar. Su objetivo es predigerir el tejido, descomponer parcialmente su estructura para una mejor digestión posterior y eliminar las adherencias de la matriz que puedan existir debido al corte de la periferia del tejido. - Añadir 2 ml de solución de digestión precalentada (37 °C) que contenga colagenasa II de baja concentración (5 mg/ml, disuelta en medio basal estéril DMEM/F12) para cubrir el bloque tisular.
- Incubar la placa de cultivo celular en una incubadora humidificada al 5% deCO2 a 37 °C durante 6-8 h para su digestión y observar el progreso de la separación celular. De vez en cuando, realice agitación horizontal lenta (80-120 rpm) o pipeteo suave para mejorar la eficiencia de la lisis.
NOTA: Para el tejido de ratón neonatal, la liberación celular es visible alrededor de las 3 h, con un aislamiento completo que se puede lograr entre 6 y 8 h. Durante el tratamiento con colagenasa II de 6-8 h, observe la lisis cada hora y termine la digestión cuando no se vean trozos de tejido evidentes a simple vista y el 90% de las células estén libres y en suspensión bajo un microscopio. Durante el proceso de digestión, se pueden observar condrocitos similares a vacuolas que se desprenden gradualmente de la masa de tejido cartilaginoso bajo un microscopio óptico. Este paso se puede repetir varias veces para minimizar el daño a los condrocitos causado por la digestión prolongada, y la solución de digestión se puede reemplazar con una solución de digestión de colagenasa II fresca de baja concentración para aumentar el rendimiento celular. - Filtre todos los productos de digestión a través de un filtro celular de 100 μm en un tubo de centrífuga estéril de 50 ml.
NOTA: Utilice un filtro celular de 100 μm para evitar la pérdida de agregados de condrocitos y aumentar el rendimiento. Los fragmentos de tejido residual se eliminan durante el intercambio de médium. - Enjuague la placa de cultivo celular con 1x PBS estéril. Filtrar a través del filtro celular nuevamente.
- Recoja todo el filtrado del paso anterior en un tubo de centrífuga de 15 ml. Centrifugar a 300 × g durante 5 min a temperatura ambiente con el freno apagado. Deseche el sobrenadante después de la centrifugación.
- Añadir 2 ml de 1x PBS estéril y volver a suspender suavemente el precipitado soplando ligeramente y aspirando con una pipeta. Transfiera a un tubo de centrífuga estéril de 15 ml. Centrifugar a 300 × g durante 5 min a temperatura ambiente con el freno apagado. Deseche el sobrenadante después de la centrifugación.
- Vuelva a suspender el precipitado del paso 4.10 con 2 ml de medio completo estéril DMEM / F12 recién preparado, que contiene 15% de suero fetal bovino (FBS) y 1% P / S. Enumere la suspensión celular recolectada con un hemocitómetro, luego coloque las células en una placa de cultivo estéril de 10 cm a 2-2,5 × 105 células / cm2. Suplemento a un volumen final de 10 mL con medio completo.
NOTA: La densidad de siembra de condrocitos debe ser de 2-2,5 × 105 células/cm2, ya que la siembra de densidad baja o media puede conducir a un cambio fenotípico de los condrocitos articulares hacia los fibroblastos. La actividad de proliferación y la viabilidad de las células primarias aisladas se pueden evaluar mediante ensayos MTT opcionales o tinción de exclusión con azul de tripano (paso opcional). - Incubar en una incubadora humidificada al 5% deCO2 a 37 °C.
- Reemplace con medio completo DMEM / F12 nuevo (que contenga 10% de FBS, 1% P / S) después de observar que las células están completamente adheridas a la pared bajo un microscopio óptico.
- Cambie el medio cada 2 días. Continúe cultivando hasta que la confluencia alcance el 70%, momento en el que se pueden realizar experimentos posteriores.
NOTA: La concentración sérica en el medio de cultivo se puede aumentar al 15% según la condición celular. La Figura 2 ilustra un diagrama esquemático simplificado de la digestión, el aislamiento y el cultivo de células primarias del tejido cartilaginoso.
Figura 2: Procedimiento simplificado para la digestión del tejido cartilaginoso, el aislamiento de células primarias y el cultivo. El cartílago se picó y se digirió continuamente con una solución de digestión de colagenasa II de alta concentración durante 15 min, se repitió una vez, luego se digiere con una solución de digestión de colagenasa II de baja concentración durante 6-8 h para aislar las células. A continuación, se filtró el tejido digerido y se recogió y centrifugó el filtrado. El pellet celular se lavó con 1x PBS y se cultivó en medio DMEM / F12 hasta que la confluencia alcanzó el 70%, momento en el que las células estuvieron listas para experimentos posteriores. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
4. Verificación funcional de los condrocitos primarios
- Metabolismo y cambios de los condrocitos en condiciones inflamatorias.
- Tratar las células con 10 ng/mL de IL-1β durante 24 h para simular condiciones inflamatorias.
- Para RT-qPCR y western blotting, extraer ARN total o proteína total para detectar los indicadores metabólicos de la matriz extracelular de condrocitos, como COL2A1, MMP13.
NOTA: La Figura 3 ilustra un diagrama esquemático de la validación funcional de los condrocitos primarios y los procedimientos experimentales posteriores. La información de anticuerpos se proporciona en la Tabla de materiales. Los procedimientos detallados para western blot y RT-qPCR se proporcionan en la Tabla 1, Tabla 2, Tabla 3, Tabla 4 y Tabla 5. Todos los métodos siguieron los protocolos estándar11,18.
Figura 3: Diagrama esquemático del programa de validación funcional de condrocitos primarios. Afecciones inflamatorias inducidas por el tratamiento con IL-1β; efectos sobre los fenotipos asociados al cartílago evaluados por RT-qPCR y Western blot. Abreviaturas: IL-1β = interleucina-1β; RT-qPCR = reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa con transcripción inversa. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Condiciones del flujo de trabajo de Western Blot | |
| Paso | Condición / Reactivo |
| Preparación en gel SDS-PAGE | 8 % (p/v) de gel separador de Tris-HCl |
| Electroforesis de apilamiento | 80 V, 30–40 min |
| Resolución de electroforesis | 120 V, 1–1,5 h |
| Transferencia | Semiseco, 15 V, 30–60 min |
| Bloqueante | Tampón de bloqueo rápido, 2 h a temperatura ambiente |
Tabla 1: Condiciones del flujo de trabajo de Western blotting. Resumen de las condiciones de Western blotting, incluida la composición de SDS-PAGE, los parámetros de electroforesis, la configuración de transferencia y el procedimiento de bloqueo.
| Mezcla de reacción de transcripción inversa | |
| Componente | Volumen (μL) |
| 5× Tampón de reacción de transcriptasa inversa del transcriptor | 4 |
| Mezcla de desoxinucleótidos (10 mM cada uno) | 2 |
| Inhibidor protector de la ARNasa (40 U/μL) | 0.5 |
| Transcriptasa inversa del transcriptor (20 U/μL) | 0.5 |
| Agua libre de nucleasas | hasta 20 |
| Volumen total | 20 |
Tabla 2: Mezcla de reacción de transcripción inversa. Composición de la reacción de transcripción inversa para la síntesis de ADNc.
| Información básica para RT-qPCR de condrocitos primarios de ratón | ||||
| Nombre del gen | Secuencia (5'3 ') | Temperatura de recocido (°C) | ||
| mGapdh | Adelante | TGGCCTTCCGTGTTCCTAC | 60 | |
| Marcha atrás | GAGTTGCTGTTGAAGTCGCA | |||
| mCol2a1 | Adelante | TGACCTCAACTACATGGTCTACA | 60 | |
| Marcha atrás | CTTCCCATTCTCGGCCTTG | |||
| mMmp13 | Adelante | CTTCTTCTTGTTGAGCTGGACTC | 60 | |
| Marcha atrás | CTGTGGAGGTCACTGTAGAGACT | |||
Tabla 3: Información básica para RT-qPCR de condrocitos primarios de ratón. Secuencias y temperatura de recocido (60 °C) de cebadores utilizados para cuantificar las transcripciones de Gapdh, Col2a1 y Mmp13 en condrocitos primarios de ratón.
| Mezcla de reacción RT-qPCR | |
| Componente | Volumen (μL) |
| 2 × Mezcla maestra de qPCR SYBR Green | 10 |
| Plantilla de ADNc diluido | 8 |
| Cebador directo (10 μM) | 1 |
| Imprimación inversa (10 μM) | 1 |
| Volumen total | 20 |
Tabla 4: Mezcla de reacción RT-qPCR. Mezcla de reacción RT-qPCR (20 μL) con mezcla maestra SYBR Green, plantilla y cebadores.
| Protocolo de ciclo RT-qPCR | ||
| Paso | Temperatura (°C) | Hora |
| Desnaturalización inicial (×1) | 95 | 10 minutos |
| Desnaturalización (×40) | 95 | 5 s |
| Recocido/extensión (×40) | 60 | 15 s |
| Extensión (×40) | 72 | 30 s |
| Curva de fusión (×1) | 95 55 95 | 60 s 30 s 30 s |
Tabla 5: Protocolo de ciclo RT-qPCR. Se realizó desnaturalización a 95 °C durante 5 s, recocido/extensión a 60 °C durante 15 s y un análisis final de la curva de fusión durante 40 ciclos.
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Resultados
Como se describe en la Figura 1, Figura 2 y Figura 3, realizamos el protocolo y aislamos con éxito los condrocitos primarios de las articulaciones de la rodilla del ratón. De aproximadamente 10 mg de cartílago de ratón neonatal, obtuvimos aproximadamente 1 × 104 células con >90% de viabilidad. En el primer día de cultivo in vitro , los condrocitos primarios de ratón exhibieron una morfología r...
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Discusión
El aislamiento y cultivo de condrocitos primarios son esenciales para dilucidar la fisiopatología de las enfermedades del cartílago22. En el cultivo primario de condrocitos, la optimización de la concentración de colagenasa y el tiempo de digestión es crucial, ya que equilibra la degradación de la matriz extracelular al tiempo que reduce el daño celular potencial17. En este documento, describimos un método confiable y reproducible para aislar condrocitos primarios de tejido...
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Divulgaciones
Los autores declaran que no tienen conflictos de intereses.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (No. 82370909). La Figura 1, la Figura 2 y la Figura 3 se crearon con Figdraw.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 1&veces; PBS en polvo (2 L) | Servicebio | G0002-2L | |
| Placas de cultivo celular de 100 mm | Servicebio | CCD-100 | |
| 100 μ Tamiz de células m | Sangon Biotech | F613463-0001 | |
| Tubo de centrífuga cónico de 15 ml (estéril, sin enzimas) | Servicebio | EP-1501-J | |
| Tubo de centrífuga cónico de 50 ml (estéril, sin enzimas) | Servicebio | EP-5001-J | |
| placa de cultivo celular de 6 pocillos | Servicebio | CCP-6H | |
| Anticuerpo policlonal de conejo anti-COL2A1 | Vía Inmunológica | YT1022 | Anticuerpos primarios; WB: 1/500 |
| Anticuerpo monoclonal de ratón anti-GAPDH | Tecnología de proteínas | 60004-1-IG | Anticuerpos primarios; WB: 1/2000 |
| Anticuerpo policlonal de conejo anti-MMP13 | Vía Inmunológica | YT2796 | Anticuerpos primarios; WB: 1/1000 |
| Banco aséptico ultra limpio | Termo Fisher | 51029704 | |
| Incubadora de cultivos celulares | Termo Fisher | 51033782 | |
| Colagenasa II | Solarbio | C8150 | |
| Imprimaciones personalizadas (Gapdh, Col2a1, Mmp13) | Sangon Biotech | Diseñado con Primer BLAST | |
| DMEM/F12 medio | Hyclone | SH30023.01 | |
| Suero fetal bovino | ExCell | FCS500 | |
| HRP-Anticuerpo policlonal anti-ratón de cabra | Vía Inmunológica | RS0001 | Anticuerpos Secundarios; WB: 1/10000 |
| HRP-Anticuerpo policlonal anti-conejo de cabra | Vía Inmunológica | RS0002 | Anticuerpos Secundarios; WB: 1/10000 |
| Microscopio de contraste de fase invertida | OLIMPO | CKX53 | |
| Micropipeta | Termo Fisher | ||
| Centrífuga de sobremesa en miniatura | SOL | SN-TDL-6 | |
| Cuchilla quirúrgica n.º 11 | Servicebio | QXJZ-11 | |
| Solución de penicilina-estreptomicina (100X) | Tiempo de beyo. | C0222 | |
| Juego de instrumentos de disección de animales pequeños | Servicebio | QXTZ01 |
Referencias
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