Método MALDI-ToF MS para la caracterización de polímeros sintéticos con dispersión variable y grupos terminales

Resumen

Este protocolo proporciona instrucciones detalladas y ejemplos para la preparación de muestras, la adquisición de datos y el análisis de datos para caracterizar polímeros sintéticos con dispersión y grupos finales variables mediante espectrometría de masas de tiempo de vuelo/ionización por desorción/ionización láser asistida por matriz.

Resumen

La espectrometría de masas de tiempo de vuelo de ionización/desorción láser asistida por matriz (MALDI-ToF MS) es una herramienta analítica eficaz para caracterizar polímeros sintéticos, que ofrece una determinación precisa del peso molecular y conocimientos estructurales, como masas unitarias repetidas e identificación de grupos finales. Este protocolo detalla los pasos para el análisis de polímeros, incluida la preparación de muestras con la selección adecuada de matrices y cationes, la adquisición de datos y un método de calibración para garantizar mediciones de masa precisas. Destaca la versatilidad de MALDI-ToF MS en el análisis de polímeros, desde materiales monodispersos hasta altamente dispersos, al tiempo que observa limitaciones en la resolución de muestras altamente dispersas. Al comparar las masas teóricas y observadas, incluidos los patrones isotópicos, el método permite una confirmación confiable de unidades repetidas y grupos finales. El protocolo apoya a los nuevos usuarios al presentar datos representativos sobre la selección de matrices, la interpretación espectral en rangos de dispersión y la caracterización de polímeros con características isotópicas únicas o formaciones de iones metaestables. Las estrategias de resolución de problemas incluyen abordar problemas como la interferencia de la matriz y las muestras que se ionizan sin un catión adicional durante la preparación de la muestra. En general, esta guía sirve como base para utilizar MALDI-ToF MS como una técnica rápida y confiable para el análisis de polímeros.

Introducción

La espectrometría de masas de tiempo de vuelo de ionización/desorción láser asistida por matriz (MALDI-ToF MS) es una técnica analítica altamente eficaz para caracterizar polímeros sintéticos 1,2,3,4. Muchos polímeros se pueden caracterizar mediante resonancia magnética nuclear (RMN) para confirmar la estructura de la unidad de repetición. Sin embargo, la mayoría de los grupos extremos son una fracción de los picos de las unidades de repetición, incluso para polímeros de bajo peso molecular, y a medida que aumenta el peso molecular de un polímero, las señales del grupo final parecen difíciles de cuantificar en la RMN⁵. Sin embargo, los datos de MALDI-ToF MS confirman que estos son los grupos finales, incluso con pesos moleculares más altos. Esta técnica de espectrometría de masas es conocida por su capacidad de ionización suave y genera principalmente iones poliméricos cargados individualmente con una fragmentación mínima². Esto permite una determinación precisa del peso molecular y un análisis estructural detallado que ofrece resultados rápidos y precisos, proporcionando información valiosa como masas unitarias repetidas, identificaciones de grupos finales y, para polímeros de baja dispersidad, la determinación del peso molecular promedio numérico (M_n), peso molecular promedio (M_w) y dispersidad (Đ)⁶.

MALDI-ToF MS puede analizar polímeros con dispersión variable, pero tiene limitaciones a mayor dispersidad. Para polímeros monodispersos como los dendrímeros, este método es ideal para confirmar su masa e identificar grupos terminales⁷. Para polímeros con baja dispersidad (1.01-1.09) y algunos polímeros de dispersión moderada (Đ = 1.1-1.3), MALDI-ToF MS también se puede usar para determinar la masa de la unidad de repetición del polímero, la masa del grupo final, Đ, M_n y M_w⁸. Sin embargo, para polímeros altamente dispersos (Đ = 1,3-10), esto se convierte en un desafío. Para polímeros ampliamente dispersos, las fracciones más bajas exhiben una intensidad mucho mayor que sus contrapartes de mayor peso molecular, lo que lleva a una dispersidad artificialmente más baja que otras técnicas de caracterización como la cromatografía de exclusión por tamaño (SEC). Esto se describe como un "sesgo de baja masa". La masa unitaria de repetición promedio y los grupos finales se pueden confirmar a partir de los resultados de peso molecular más bajo, pero es imposible determinar el verdadero M_n, M_w y Đ para polímeros de alta dispersidad de MALDI-ToF MS⁹. Por lo tanto, se debe agregar SEC como una técnica de caracterización para polímeros ampliamente dispersos para determinar los verdaderos M_n, M_w y Đ.

La optimización de la preparación de muestras es esencial para una resolución máxima de alta calidad en un espectro de masas MALDI-ToF ^2,10. El primer paso consiste en seleccionar una matriz adecuada basada en la polaridad del polímero. Para polímeros no polares, se utilizan comúnmente matrices como trans-2-[3-terc-butilfenil)-2-metil-2-propenilideno] (DCTB), radical libre galvinoxilo (GFR) y 9-nitroantraceno (9-NA)¹¹. Los polímeros polares se adaptan mejor a matrices como el ácido α-ciano-4-hidroxicinámico (CHCA), el ditranol, el ácido 2-(4-hidroxifenilazo)benzoico (HABA) y el ácido 2,5-dihidroxibenzoico (DHB)12,13,14. Para este protocolo, se seleccionó DCTB como matriz primaria debido a su efectividad con polímeros no polares, y se utilizó CHCA para polímeros polares. La selección de cationes también juega un papel importante, ya que los metales alcalinos como el sodio y el potasio ionizan eficazmente los polímeros que contienen oxígeno, mientras que los metales de transición como la plata son más adecuados para los hidrocarburos insaturados^10,14.

Una vez seleccionada la matriz y el analito, se determinan las proporciones óptimas de catión:analito:matriz para las mezclas de solución de muestra. Esta mezcla de solución de muestra se agregará a la placa objetivo en una cantidad de 1 μL. No tener una o más de las proporciones correctas de las selecciones catión:analito:matriz puede afectar la sensibilidad de la adquisición de datos de la MS MALDI-ToF. Para los datos representativos a continuación, la preparación de la muestra se ha optimizado para obtener la mejor resolución ^2,15.

Después de preparar la solución de muestra y agregarla a la placa objetivo MALDI-ToF MS, esta muestra se inserta en el instrumento MALDI-ToF MS para comenzar la adquisición de datos. Para este estudio, los datos se recopilaron exclusivamente en modo de iones positivos y se utilizó un espectrómetro de masas MALDI-ToF más nuevo, basado en trabajos anteriores de Payne et ^al.16. Los parámetros importantes de MALDI-ToF MS, como la potencia del láser, el diámetro del rayo láser, la ganancia del detector y el tiempo de retardo de extracción pulsada, se pueden ajustar para mejorar la resolución durante la adquisición. Hay dos modos disponibles para la adquisición de datos de la EM MALDI-ToF: lineal y reflectrón¹⁷. Se prefiere el modo reflectrón para lograr una mayor resolución de señal en comparación con el modo lineal^18,19. En modo lineal, los iones acelerados viajan directamente a través del tubo de vuelo hasta el detector. Por el contrario, el modo reflectrón implica pasar por el tubo de vuelo una vez y luego reflejar los iones a través del tubo de vuelo por segunda vez antes de llegar al segundo detector, lo que aproximadamente duplica su trayectoria de vuelo. Este enfoque permite la diferenciación de iones con masas similares pero velocidades variables^20,21. La potencia del láser también puede ser un factor para aumentar la relación señal-ruido o disminuir la fragmentación de un polímero²². La potencia láser más baja posible para ablacionar una muestra mejorará la relación señal-ruido y también reducirá la posibilidad de fragmentación²². Después de optimizar la resolución de la señal y maximizar la relación señal-ruido, la adquisición puede proporcionar datos de alta calidad para el analito polimérico seleccionado.

La calibración es esencial para una medición de masa precisa en MALDI-ToF MS. Se utilizan dos métodos principales: calibración interna y externa, ambos basados en calibrantes con masas conocidas que cubren el rango esperado del analito⁶. Para los polímeros analizados en los datos representativos, se seleccionaron calibradores de dendrímeros monodispersos para calibrar en amplios rangos de masa²³. La calibración interna, donde el calibrante se mezcla con el catión, el analito y la matriz, mejora la precisión de la masa porque tanto el calibrante como el analito experimentan las mismas condiciones, y cualquier cambio de masa de calibración los afecta por igual. Sin embargo, este método puede conducir a la superposición de picos con las señales poliméricas resultantes, lo que complica el análisis²⁴. Por el contrario, la calibración externa, empleada en este protocolo, evita la superposición de picos al preparar y detectar el catión: calibrante: matriz por separado del catión: analito: matriz en la placa objetivo. Sin embargo, pueden surgir pequeñas imprecisiones de masa debido a ligeras diferencias en la colocación de la muestra y la respuesta local del instrumento, como variaciones en la intensidad del láser o la eficiencia de ionización en todo el objetivo, de modo que el calibrante y el analito deben estar cerca el uno del otro²⁴. En los datos representativos, la diferencia de masa observada utilizando el método de calibración externa fue inferior a 0,100 Da del valor teórico.

Finalmente, para todos los polímeros, los datos de MALDI-ToF MS se pueden analizar para determinar la masa de la unidad de repetición y realizar un análisis de grupo final de los polímeros. La masa de la unidad de repetición se puede confirmar comparando la masa de la unidad de repetición teórica utilizando herramientas de software con la masa de la unidad de repetición observada en los espectros de masas MALDI-ToF. Si coinciden, es probable que el polímero tenga la estructura de unidad repetida esperada (o un isómero). El análisis de grupos terminales MALDI-ToF MS para polímeros comienza calculando la masa teórica del analito. Esto incluye la masa combinada de la unidad de repetición, los grupos finales y el catión seleccionado de la preparación de la muestra. En el caso de macromoléculas monodispersas, el cálculo incluye la masa total de un analito junto con la masa del catión seleccionado. Las herramientas de software para dibujar estructuras químicas pueden ayudar en estos cálculos. La masa teórica del software se compara con la masa observada de los espectros de masas MALDI-ToF para verificar si el polímero coincide con la estructura molecular esperada. Sin embargo, si la masa unitaria repetida observada coincide aproximadamente con el valor teórico, pero la masa total de un n-mer especificado, incluidos los grupos terminales y el catión, no lo hace, la discrepancia puede sugerir la presencia de grupos finales inesperados. Para identificar grupos terminales desconocidos, se revisan las condiciones de reacción para determinar moléculas o reactivos alternativos que podrían haber reaccionado para formar los grupos terminales observados. Este paso es crucial para caracterizar con precisión toda la estructura del polímero.

Este protocolo proporciona un método paso a paso para el análisis MALDI-ToF MS de polímeros sintéticos, diseñado para ayudar a los usuarios, especialmente a los principiantes, con la preparación de muestras, la optimización del método del instrumento, la adquisición de datos y el análisis de datos. Los datos representativos ilustran la selección de matrices para un polímero dado; espectros y análisis de polímeros con dispersión variable, incluidas muestras monodispersas, moderadamente dispersas y altamente dispersas; el análisis de grupos finales de polímeros, que incluye aquellos con distintos patrones de resolución isotópica (p. ej., halogenados) y aquellos propensos a la formación de iones metaestables (p. ej., terminados en azida); el análisis de datos de polímeros utilizando MALDI-ToF MS, que incluye una comparación de masas observadas y teóricas para confirmar la masa unitaria repetida y la masa total del polímero, incluidos los grupos terminales y los aductos catiónicos; y un ejemplo de resolución de problemas para la interferencia de la matriz de polímeros de baja masa y polímeros autoionizantes.

Este protocolo no solo proporciona una base para la caracterización de polímeros MALDI-ToF MS, sino que también ofrece orientación sobre la preparación de muestras, la optimización paso a paso del método del instrumento (Figura 1) y la interpretación de espectros para polímeros sintéticos comerciales y recién sintetizados.

Protocolo

PRECAUCIÓN: Revise las hojas de datos de seguridad (SDS) de todos los productos químicos antes de su uso. Realice todas las preparaciones de muestras y preparaciones de placas MALDI-ToF MS en una campana extractora y use el equipo de protección personal (EPP) adecuado, incluidas gafas de seguridad, una bata de laboratorio y guantes.

1. Preparación de la muestra

1. Preparación de la solución madre de matriz, catión, calibrante y analito
   1. Prepare la solución madre de cationes alcalinos disolviendo 2 mg del catión deseado en 1 ml de un disolvente seleccionado por su compatibilidad con el analito y el catión. Para la muestra 1, se disolvieron 2 mg de trifluoroacetato de sodio en 1 ml de THF.
   2. Prepare la solución madre de matriz disolviendo 20 mg de la matriz deseada en 1 ml de un disolvente compatible basado en la solubilidad del analito. Ejemplo: Para los datos representativos (Muestra 1), disuelva 20 mg de DCTB en 1 ml de tetrahidrofurano (THF).
   3. Prepare la solución madre del calibrante siguiendo las instrucciones del proveedor.
   4. Preparar la solución de analito disolviendo 10 mg del analito en 1 ml de un disolvente adecuado. Para la muestra 1, se disuelven 10 mg del analito en 1 ml de THF.
2. Preparación de la placa diana MALDI-ToF MS
   1. Limpie la placa de destino MALDI-ToF MS.
   2. Prepare la muestra de adquisición de analito y la solución de muestra de calibración. Agregue las soluciones madre de catión, analito y matriz en una proporción de 1:5:20 μL en el tubo A y el vórtice. Para calibración externa: Agregue las soluciones catiónicas, calibrantes y matriciales en una proporción de 1:5:20 μL en el tubo B y el vórtice.
   3. Agregue la mezcla de solución de muestra de analito y calibrante a la placa objetivo MALDI-ToF MS. Pipetear 0,5 μl de la mezcla de solución de muestra de catión:analito:matriz (tubo A) en la placa diana MALDI-ToF MS utilizando el método de gota seca. Pipetear 0,5 μl de la mezcla catión:calibrante:matriz (tubo B) en un punto adyacente al analito en la placa diana MALDI-ToF MS utilizando el método de gota seca. Registre la ubicación exacta de cada punto (letra de fila y número de columna) para localizar fácilmente la muestra y el calibrador durante la adquisición de datos.

2. Adquisición de datos

1. Inserte la placa de destino MALDI-ToF MS y seleccione un método de adquisición
   1. Inserte la placa de destino MALDI-ToF MS en el instrumento. Coloque la placa de destino en el soporte con la orientación correcta y no empuje demasiado la placa de destino MALDI-ToF MS.
   2. Acople la placa de destino MALDI-ToF MS en el instrumento utilizando el software de control del instrumento.
   3. Seleccione y abra un archivo de método en el software de control del instrumento. Elija un método reflector positivo (RP) o lineal positivo (LP) dentro del rango de masa del analito.
   4. Supervise el software de control del instrumento para confirmar que se ha insertado la placa objetivo y que la configuración del método está completa.
      NOTA: Estos polímeros representativos tienen oxígenos; por lo tanto, se selecciona el modo positivo (la mayoría de los compuestos tienen la adquisición completada en modo positivo). Para los datos representativos, se seleccionó un método RP para el modo reflector en todas las muestras.
2. Adquisición inicial de datos
   1. En el software de control del instrumento, ubique la cámara que muestra la placa objetivo MALDI-ToF MS y un diagrama de los pocillos con las letras de columna y los números de fila que se muestran. Haga clic en el pocillo MALDI-ToF MS que contiene la mezcla catión:analito:matriz para seleccionar la adquisición de datos.
   2. Ajuste el rango de detección de masa en el software de control del instrumento a un amplio rango de 500-20000 Da para garantizar que la masa esperada del analito se capture por completo. Utilice el cursor para ajustar el rango aproximadamente 2x por debajo y por encima de la masa esperada del analito después de una adquisición inicial.
   3. Adquisición de datos
      1. Presione el botón Start en el software de control del instrumento para comenzar la adquisición de datos MALDI-ToF MS.
      2. Presione Detener o permita que la adquisición de MALDI-ToF MS se complete automáticamente.
      3. Haga clic en Agregar para agregar el espectro único de la MS MALDI-ToF al búfer de espectro de suma.
         NOTA: La memoria tampón de espectro único de la EM MALDI-ToF almacena un espectro de masas MALDI-ToF individual, y la memoria tampón de espectro de suma acumula datos de múltiples adquisiciones, lo que aumenta la intensidad de la señal.
      4. Vuelva a colocar el láser MALDI-ToF MS viendo la alimentación de la cámara y haga clic en Cualquier lugar dentro del mismo pocillo seleccionado para mover el láser a una nueva posición.
      5. Repita las adquisiciones de MS MALDI-ToF para agregar espectros únicos de MS MALDI-ToF al búfer de suma. Repita los pasos 2.2.3.1 a 2.2.3.4 hasta que los resultados de la EM MALDI-ToF sean satisfactorios.
      6. Evalúe el espectro de masas MALDI-ToF para la resolución y el ruido de referencia. Si el espectro de la MS MALDI-ToF presenta una alta resolución y un ruido de referencia mínimo, continúe con el paso de calibración. Si no es así, considere optimizar el método de adquisición de datos (por ejemplo, ajustar la potencia del láser, la ganancia del detector o la configuración de extracción de iones pulsados).
3. Optimización de la adquisición de datos (véase Figura 1)
   1. Ajuste la potencia del láser MALDI-ToF MS, la ganancia del detector y la extracción de iones pulsados uno a la vez para mejorar la resolución y/o disminuir el ruido de fondo
   2. Para duplicar el método MALDI-ToF MS, copie y pegue el método MALDI-ToF MS LP o RP con un nuevo nombre. Abra el archivo de método MS MALDI-ToF pegado que se creó y cambie el nombre del archivo.
   3. Adquiera un espectro de masas MALDI-ToF inicial siguiendo todos los pasos de la sección 2.2 para la adquisición inicial de datos, en la sección de adquisición de datos. Amplíe un conjunto de picos del MALDI-ToF MS con la intensidad más alta para evaluar la resolución y el ruido de referencia en el software de control del instrumento.
   4. Optimización de adquisiciones
      1. Ajuste de la potencia del láser MALDI-ToF MS
         1. Comience con una potencia de láser MS MALDI-ToF baja de ~ 4% y siga los pasos 2.2.3.1 y 2.2.3.2 para que la adquisición de datos inicial inicie y detenga la adquisición de datos.
         2. Observe y compare la resolución y el ruido de referencia de la memoria tampón única de la EM MALDI-ToF y el espectro inicial en la memoria tampón de suma.
         3. Aumente la potencia del láser MALDI-ToF MS en incrementos del 2% al 10% para mejorar la ionización. Siga los pasos 2.2.3.1 y 2.2.3.2 para que la adquisición de datos inicial inicie y detenga la adquisición de datos después de cada incremento.
         4. Seleccione la potencia láser más baja que proporcione picos de alta intensidad con un ruido mínimo.
            NOTA: Cuando la potencia del láser MALDI-ToF MS es del 50% o superior, existe una mayor posibilidad de fragmentación de la muestra.
      2. Optimice el diámetro del láser MALDI-ToF MS
         1. En la pestaña del detector, ajuste el diámetro del láser MALDI-ToF MS para probar configuraciones medias, grandes y ultra. Siga los pasos 2.2.3.1 y 2.2.3.2 para que la adquisición de datos inicial inicie y detenga la adquisición de datos.
         2. Observe y compare la resolución y el ruido de referencia de la memoria tampón única de la EM MALDI-ToF y el espectro inicial en la memoria tampón de suma.
         3. Seleccione el diámetro del láser MALDI-ToF MS que proporcione una resolución óptima con un ruido de referencia mínimo.
            NOTA: El diámetro del láser MALDI-ToF MS controla el diámetro del rayo láser.
      3. Ajuste de la ganancia del detector MALDI-ToF MS
         1. En pequeños incrementos, aumente o disminuya la ganancia del detector MALDI-ToF MS. Siga los pasos 2.2.3.1 y 2.2.3.2 para que la adquisición de datos inicial inicie y detenga la adquisición de datos para cada aumento o disminución de la ganancia del detector de la EM MALDI-ToF.
         2. Observe la intensidad y la resolución de la señal de los espectros de masas MALDI-ToF en el software de control del instrumento con cada ajuste de la memoria tampón única de la EM MALDI-ToF y el espectro inicial en la memoria tampón de suma.
         3. Mantenga la ganancia del detector MALDI-ToF MS que proporciona la mejor intensidad y una buena resolución de señal.
      4. Modificación de la extracción de iones pulsados de la MS MALDI-ToF
         1. Ajuste la extracción de iones pulsados MALDI-ToF MS en incrementos de 10 ns. Siga los pasos 2.2.3.1 y 2.2.3.2 para que la adquisición de datos inicial inicie y detenga la adquisición de datos, para cada aumento o disminución en la ganancia del detector.
         2. Evalúe cómo los cambios en la extracción de iones pulsados mejoran la resolución de la señal MALDI-ToF MS.
            NOTA: La extracción de iones pulsados de MALDI-ToF MS se define como un retardo de tiempo entre la ionización del láser. Al aumentar o disminuir la extracción de iones de pulso, los iones de diferentes energías permanecerán en el campo eléctrico durante tiempos más cortos o más largos. El tiempo más largo puede permitir que los analitos de la misma masa y los iones cargados positivamente que se ablacionan en momentos ligeramente diferentes se aceleren completamente a la misma velocidad que los iones de analito de la misma masa cuando se aplica el voltaje. Esto se puede utilizar para aumentar la resolución y disminuir el ruido de fondo de la señal²⁵.
   5. Una vez que se logre la resolución óptima y la relación señal-ruido más alta, guarde el archivo de método MS MALDI-ToF optimizado para su uso actual y futuro.
4. Calibración de MS MALDI-ToF
   1. Adquiera el espectro de masas MALDI-ToF de calibración seleccionando la muestra de calibración en la placa objetivo y siguiendo todos los pasos de la sección 2.2 para la adquisición inicial de datos
      1. Acceda a los puntos de referencia de calibración. Navegue a la pestaña de calibración en el software de control del instrumento. Abra la lista de control de masas correspondiente al calibrador utilizado.
   2. Haga coincidir los picos de calibración del espectro de masas MALDI-ToF con las masas de referencia en la lista de control de masas.
      1. En la lista de control de masas, seleccione la masa correspondiente al primer pico de calibración en el espectro de masas MALDI-ToF. El espectro de masas MALDI-ToF se acercará automáticamente al pico de calibración seleccionado.
      2. Establezca el pico de referencia haciendo clic a la izquierda de la señal del calibrador. Se seleccionará el pico.
      3. Seleccione Aplicar para establecer la señal de calibrador como masa de referencia en la lista de control de masas.
      4. Repita este proceso para todos los picos de calibración adicionales. Seleccione la siguiente masa de interés de la lista de control de masas, alinee el pico de calibrador correspondiente y aplique la configuración de referencia.
5. Adquisición de muestras de analito polimérico calibrado
   1. Localice y seleccione el pocillo que contiene el pozo de mezcla catión:analito:matriz en el software de control del instrumento.
   2. Realice la adquisición de datos siguiendo todos los pasos de la sección 2.2 con el método optimizado y calibrado abierto.
   3. Agregue un nombre de archivo apropiado y guarde el espectro de masas del analito calibrado MALDI-ToF para su posterior análisis.
6. Retire la placa de destino MALDI-ToF MS con el software de control del instrumento. Limpiar la placa de destino MALDI-ToF MS

Figura 1: Árbol de decisión para la optimización del método del instrumento. Esta guía está diseñada para ayudar a los usuarios principiantes a optimizar sistemáticamente los parámetros del método del instrumento. Comience con la configuración predeterminada o inicial y ajuste un parámetro a la vez aumentando o disminuyendo según las mejoras observadas. A continuación, continúe en la dirección que mejore (1) la intensidad máxima, (2) la calidad de referencia (bajo ruido) y (3) proporcione una resolución isotópica y máxima estrecha. Este enfoque ayuda a identificar las condiciones óptimas para espectros confiables y de alta calidad. Si la muestra de polímero no ioniza ni produce un espectro utilizable en modo reflector, cambie al modo lineal y utilice este mismo árbol de decisión para optimizar los parámetros. Tenga en cuenta que el modo lineal a menudo da como resultado picos más amplios y una resolución isotópica limitada o nula, pero puede ser efectivo para polímeros de mayor masa o polímeros que pueden perder ionización en modo reflector. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

3. Análisis e interpretación de datos

1. Abra el software de análisis de datos MALDI-ToF MS y cargue el espectro de muestras de analito MALDI-ToF MS.
2. Seleccione el método de procesamiento MALDI-ToF MS correcto para las muestras de analito. Aquí, todas las muestras tenían resolución isotópica y se seleccionó el primer pico para todos los picos con el método de procesamiento MALDI-ToF MS seleccionado.
   NOTA: Los parámetros de procesamiento de MALDI-ToF MS se pueden adaptar para muestras de polímeros sintéticos. Por ejemplo, un técnico de instrumentos de MALDI-ToF MS desarrolló un método de procesamiento MALDI-ToF MS para polímeros durante una sesión de capacitación técnica. Payne et al. crearon un método de procesamiento masivo promedio de MS MALDI-ToF para aplicaciones específicas¹⁶. Póngase en contacto con el equipo técnico de polímeros del fabricante de MALDI-ToF MS para obtener información y asesoramiento sobre la edición del método de procesamiento de MALDI-ToF MS.
3. Encuentre picos utilizando el software de análisis MALDI-ToF MS.
4. Comparar la masa de polímero teórica y experimental
   1. Registre la masa teórica del polímero. Dibuje la estructura esperada de la macromolécula, incluido el catión, en un software de dibujo químico. Abra la ventana de análisis en el software de dibujo químico y registre la masa teórica.
      1. Macromoléculas monodispersas: Registre la masa exacta y el peso molecular de la macromolécula seleccionando la estructura y el catión juntos.
      2. Polímeros bajos, moderados y muy dispersos: Para la masa de la unidad de repetición, seleccione la columna vertebral del polímero solo para registrar la masa de la unidad de repetición. Para la masa total de un n-mer especificado, establezca el número de unidad de repetición en una masa dentro del rango de espectro de la EM MALDI-ToF que se muestra en el software de análisis de la EM MALDI-ToF. Seleccione toda la estructura del polímero, incluidos los grupos catiónicos y finales, para registrar la masa de un n-mer especificado.
   2. Comparar la masa teórica registrada con la masa observada del espectro de la EM MALDI-ToF
      1. Para el cálculo de la masa total de macromoléculas monodispersas, siga los pasos que se describen a continuación.
         1. Acérquese al pico con la intensidad más alta en el espectro MALDI-ToF MS, asegurándose de que la vista incluya un rango de masa de al menos 2x por debajo y por encima de la masa teórica.
         2. Compare la masa teórica con la masa observada en el espectro de masas MALDI-ToF. Si la diferencia es inferior a 0,100 Da, es probable que la masa de la macromolécula monodispersa esperada sea precisa.
         3. Examine el espectro de la EM MALDI-ToF en busca de picos adicionales que puedan indicar la presencia de estructuras inesperadas.
         4. Si se detectan discrepancias, evalúe las posibles variaciones estructurales. Revise el esquema de reacción y calcule las masas de las estructuras alternativas para comparar.
      2. Para repetir el cálculo de masa unitaria de polímeros bajos, moderados y altamente dispersos, siga los pasos que se describen a continuación.
         1. Seleccione y amplíe dos picos separados por la masa unitaria de repetición en el espectro de MS MALDI-ToF que exhiben la intensidad más alta.
         2. Para cada par de picos adyacentes, reste la masa observada del pico de masa más alto del pico de masa más bajo para calcular la masa de la unidad de repetición. Repita este proceso para el siguiente conjunto de picos para confirmar la consistencia de la masa unitaria de repetición.
         3. Compare la masa de la unidad de repetición calculada con la masa de la unidad de repetición teórica. Si los valores observados y teóricos coinciden y exhiben diferencias de masa consistentes, es probable que la masa de la unidad de repetición del polímero sea correcta.
      3. Para la masa total de un n-mer especificado de polímeros bajos, moderados y altamente dispersos, siga los pasos que se describen a continuación.
         1. Amplíe el pico en el espectro de masas MALDI-ToF correspondiente a la masa total teórica, así como los picos una unidad repetida por encima y por debajo.
         2. Compare la masa teórica con la masa observada en el espectro de masas MALDI-ToF. Si la diferencia es inferior a 0,100 Da, es probable que los grupos finales esperados sean precisos.
         3. Inspeccione el espectro de masas MALDI-ToF en busca de picos adicionales que puedan sugerir estructuras inesperadas.
         4. Si se identifican discrepancias, evalúe grupos finales alternativos o variaciones estructurales. Revise el esquema de reacción y calcule las masas para posibles grupos finales alternativos o estructuras cíclicas.

Resultados

Muestra 1: Tris [G1] (OH) ₆ monodisperso
La generación 1 de un dendrímero monodisperso que consiste en un núcleo de 1,1,1-tris(hidroximetil)propano con tres ácidos bis(hidroximetil)propiónico protegidos con bencilideno en la periferia (Tris[G1]Bnz₃) se hizo reaccionar con gas Pd/C y H₂ en metanol:cloroformo 1:1 para eliminar los grupos bencilideno y dio como resultado un dendrímero con 6 grupos hidroxilo para formar Tris[G1](OH)₆ (Figura 2A).

Tris[G1](OH)₆ se analizó utilizando NaTFA como agente catiónico con CHCA como matriz. Se utilizó CHCA porque es altamente efectivo con compuestos polares e interactúa con grupos hidroxilo de Tris [G1] (OH) ₆ para proporcionar una capa homogénea en la placa objetivo. La preparación de la muestra de MALDI-ToF MS se inició haciendo soluciones madre de NaTFA (1 mg/ml en THF), el analito (5 mg/ml en THF) y CHCA (5 mg/ml en THF). Una vez hechas estas soluciones, 1 μL de la solución catiónica de Na⁺ , 5 μL de la solución de analito y 20 μL de la solución de matriz se combinaron en un tubo de microcentrífuga y se agitaron en vórtice (relación de 1:25:100 catión:analito:matriz para un total de 26 mL). A continuación, se extrajo 1 μL de esta mezcla del tubo de microcentrífuga y se secó en la placa diana MALDI-ToF MS. Esta muestra se analizó en modo reflector y el pico se confirmó en el espectro de la MS MALDI-ToF comparando los valores teóricos y observados (Figura 2B, rojo).

Figura 2: (A) Esquema de reacción para la modificación de la muestra 1 a Tris[G1](OH)₆. Los grupos bencilideno se eliminaron con una reacción de Pd / C y H₂ para formar Tris [G1] (OH) ₆. Se utilizó MALDI-ToF MS para determinar la finalización de la reacción. (B) Espectros de masas MALDI-ToF de la muestra 1, Tris[G1](OH)₆ y un espectro de matriz en blanco superpuesto, que incluía la matriz y la sal ([CHCA + Na]⁺). El espectro completo de MS MALDI-ToF y el zoom de Tris[G1](OH)₆ muestran un valor de masa observado para [Tris[G1](OH)₆ + Na⁺]⁺ es 505.239 Da y tiene una diferencia de +0.013 Da de la masa teórica de 505.226 Da. Al comparar el espectro de la matriz de la EM MALDI-ToF en blanco (negro) con el espectro de la EM Tris[G1](OH)₆ MALDI-ToF (rojo), se pueden ignorar todas las crestas que no sean 505,26 Da. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Se observó el aducto Na⁺ para Tris[G1](OH)₆ . El valor de masa teórico de [Tris[G1](OH)₆ + Na]⁺ está compuesto por la masa del pico monoisotópico de Tris[G1](OH)₆ (482,2362 Da) más la masa del catión sodio (22,9892 Da) que produce una masa total de 505,226 Da. El valor de masa observado para [Tris[G1](OH)₆ + Na]⁺ es 505,239 Da, que coincidió con el valor teórico con una diferencia de +0,013 Da.

Para garantizar la eliminación completa de los tres grupos de bencilideno, se analizó más a fondo el espectro de MS MALDI-ToF entre 505-769 Da. Este rango de masas permite la detección de cualquier grupo periférico que no se detectó. Habría presencia de un pico, [Tris[G1]Bnz₂(OH)₂ + Na]⁺, que indicaría que se eliminó un bencilideno a 681.289 Da ([Tris[G1]Bnz₃ + Na]⁺ 769.3194 Da - 88.0313 Da), y a 593.257 Da pico ([Tris[G1]Bnz₃ + Na]⁺ 769.3194 Da -176.0626 Da) para [Tris[G1]Bnz₁(OH)₄ + Na]⁺ que indicaría que se eliminaron dos grupos de bencilideno de Tris[G1]Bnz₃ (Figura 3). Estos picos y Tris [G1] Bnz₃ no están presentes; por lo tanto, la reacción se completó y se sintetizó Tris [G1] (OH) ₆ .

Figura 3: Estructuras y masas teóricas de Tris[G1]Bnz₃, los intermedios de Tris[G1]Bnz₂(OH)₂, Tris[G1]Bnz₁(OH)₄ y la muestra 1 Tris[G1](OH)_6. El punto negro indica el producto. Se eliminaron las estructuras y masas teóricas de uno y dos grupos bencilideno y se eliminó el Tris[G1](OH)₆ completamente hidroxilado Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

En la región de bajo peso molecular por debajo de 900, están presentes múltiples picos que no se alinean con la masa monodispersa de Tris [G1] (OH) ₆ . La mayoría de las matrices tienen problemas menores de ruido por debajo de 1000, por lo que se incluye un espectro de MS MALDI-ToF en blanco para confirmar que Tris[G1](OH)₆ es puro. La muestra en blanco de la matriz incluyó las soluciones madre de matriz (CHCA) y catión (Na⁺). Para la mezcla de muestras de análisis se utilizaron las mismas cantidades de relación de concentración de catión: matriz del Tris[G1]OH₆ (1:100 mg/ml). A continuación, se añadió 1 μL de la mezcla a la placa de muestra y se secó para su análisis.

La adquisición preliminar de datos, la adquisición de calibración y la adquisición de datos se completaron para adquirir un espectro de matriz MS MALDI-ToF en blanco. En la Figura 2B (negro), la matriz en blanco de MALDI-ToF MS (negro) y el espectro Tris[G1](OH)₆ de la muestra (rojo) se superpusieron en el análisis flexible para comparar y confirmar qué picos no están asociados con el producto. Cualquier pico identificado en el espectro de la matriz MALDI-ToF MS en blanco y el Tris[G1](OH)₆ puede ignorarse y, por lo tanto, el único pico es 505.226 Da, que corresponde a la muestra 2. Por ejemplo, los picos de 445,016 Da y 656,141 Da en el espectro de la EM Tris[G1](OH)₆ MALDI-ToF (Figura 2B roja) también se encuentran en el espectro de la matriz de la EM MALDI-ToF en blanco (Figura 2B negra) en 445,017 Da y 656,144 Da y tienen una diferencia de +0,001 Da y +0,003 Da, respectivamente. Estos picos no se incluirán en el análisis ya que coinciden y tienen diferencias similares con la matriz en blanco y el espectro de la MS Tris[G1](OH)₆ MALDI-ToF. Por lo tanto, la masa de Tris[G1](OH)₆ se confirma a través de MALDI-ToF MS, pero serán necesarios otros análisis como SEC y RMN para confirmar la pureza de la muestra.

Muestra 2: Poli(2,2-dimetilpropanoato) con un cloruro y un grupo terminal de protones
El ácido 3-cloro-2,2-dimetilpropanoico se polimerizó utilizando carbonato de potasio como base (Figura 4A). Una muestra de poli(2,2-dimetilpropanoato) (PDMP) con cloruro en un extremo y un protón en el otro extremo (M_n = 980 Da) se ionizó con MALDI-ToF MS para determinar las arquitecturas poliméricas formadas durante la reacción y analizar los diferentes grupos extremos. La preparación de la muestra de MALDI-ToF MS se inició elaborando soluciones madre de NaTFA (2 mg/mL en THF), el analito (5-7 mg/mL en THF) y DCTB (20 mg/mL en THF). Una vez hechas estas soluciones, se combinaron 5 μL de la solución catiónica de Na⁺ , 5 μL de la solución de analito y 10 μL de la solución de matriz en un tubo de microcentrífuga y se agitaron en vórtice (relación de 10:25:200 catión:analito:matriz para un total de 20 mL). A continuación, se extrajo 1 μL de esta mezcla del tubo de microcentrífuga y se secó en la placa diana MALDI-ToF MS. Para la matriz, se seleccionó DCTB ya que funciona con muchos otros poliésteres, sin embargo, se han probado otras matrices como CHCA, HABA, GFR y DHB. CHCA, HABA y GFR ionizaron bien la muestra, sin embargo, DHB no tuvo éxito. El ion NaTFA funcionó mejor en comparación con el trifluoroacetato de potasio (KTFA), el trifluoroacetato de cesio (CsTFA), el trifluoroacetato de litio (LiTFA) y el trifluoroacetato de plata (AgTFA) porque interactúa mejor con los oxígenos de los grupos éster.

El espectro de MS MALDI-ToF (Figura 4B) confirmó que la distribución de peso molecular de PDMP con un grupo final de cloruro para la muestra 3 estaba en el rango de 600 Da a 1600 Da. Esto significa que la muestra tenía baja dispersidad, lo que llevó a que los valores de M_n, M_w y Đ fueran 980 Da, 1070 Da y 1,09, respectivamente, utilizando el software de análisis MALDI-Tof MS. El pico monoisotópico se resolvió suficientemente en el modo reflectrón, lo que permitió el uso de la identificación exacta de masas.

Figura 4: Esquema de reacción y espectro de masas de la MS MALDI-ToF de la muestra 2. (A). Esquema de reacción para la síntesis de PDMP utilizando ácido 3-cloro-2,2-dimetilpropanoico. (B) Espectro de masas de la EM MALDI-ToF de la muestra 2. Este espectro completo de MS MALDI-ToF muestra la distribución general de la muestra de PDMP con un grupo final de cloruro (M_n = 980 Da) ionizado con Na⁺. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Para confirmar la masa de la unidad de repetición del polímero, se calculó la diferencia de masa entre dos picos adyacentes. La unidad de repetición del polímero tiene un peso molecular promedio observado de 100.056 Da y esto se confirmó tomando la masa promedio de ocho picos (distribución principal) en el rango de 600 Da a 1300 Da, que es solo +0.004 Da por debajo de la unidad de repetición teórica de PDMP (100.052 Da) y, además, tiene una masa de grupo final que corresponde a un hidrógeno (en el extremo frontal) y un cloruro (en el reverso) fin).

El espectro MALDI-ToF MS reveló tres distribuciones distintas, cada una correspondiente al polímero resultante con diferentes grupos finales. Estos grupos finales se identificaron y confirmaron calculando sus masas teóricas y comparándolas con las masas observadas en el espectro MALDI-ToF MS. Para identificar aún más los grupos finales, se seleccionó un n-mer individual para el análisis (Figura 5).

La distribución principal de PDMP mostró que el polímero tenía un hidrógeno (en el extremo frontal) y un cloruro (en el extremo posterior; azul). El valor de masa teórico del 8-mer de PDMP (Figura 5) está compuesto por la masa de las unidades de repetición (100.0524 Da x 8) más la masa del grupo final Cl (+ 34.9689 Da) y la masa del grupo final de hidrógeno (+ 1.0078 Da) más la masa del catión de sodio (+ 22.9892 Da) que produce una masa total de 8-mer de 859.385 Da. El valor de masa observado para 8-mer [H-PDMP_8-Cl + Na]⁺ es 859.426 Da, que es solo +0.041 Da diferente del valor teórico.

La siguiente distribución (naranja) mostró que el polímero reemplazaba el protón en el extremo frontal con un sodio y un cloruro en el extremo posterior. El valor de masa teórico del 8-mer del PDMP desprotonadado se compone de la masa de las unidades de repetición (100.0524 Da x 8) más la masa del grupo final Cl (+ 34.9689 Da) y la masa de dos grupos de sodio (+ (22.9892 Da x 2)) que produce una masa total de 8-mer de 881.367 Da. El valor de masa observado para 8-mer [Na-PDMP_8-Cl + Na]⁺ es 881.413 Da, que es solo +0.046 Da diferente del valor teórico.

Por último, la tercera distribución (verde) de PDMP confirmó la presencia de especies oligoméricas cíclicas. El valor de masa teórico del 8-mer del PDMP cíclico se compone de la masa de las unidades repetidas (100.0524 Da × 8) más la masa de un grupo de sodio (+ 22.9892 Da), lo que produce una masa total de 8-mer de 823.409 Da. El valor de masa observado para el cíclico de 8 meros [PDMP8 + Na]+ es 823.448 Da, que es solo +0.039 Da diferente del valor teórico.

La presencia de halógenos en el polímero puede identificarse mediante MALDI-ToF MS. El grupo final del polímero lineal tiene un Cl, que se indica por la relación aproximadamente 3:1 de picos [M⁺] y [M+2]⁺ . La diferencia entre los picos [M⁺] y [M+2]⁺ observados y teóricos se ha mostrado en la Tabla 1. La abundancia porcentual teórica y observada para el segundo pico a 761,3 Da [M+2]⁺ es del 42,3 % y 42,2 %, respectivamente (siendo el primer pico del 100 %), lo que confirma la presencia de un grupo Cl en el grupo final polimérico. Se encontró que la especie cíclica estaba 36 Da por debajo del compuesto sodiado lineal y 58 Da por debajo del compuesto disodiado. Además, este compuesto cíclico no tenía la proporción 3:1 que tiene una especie monoclorada. Este cloruro podría haberse eliminado mediante un ataque S_N2 con el carboxilato en el extremo opuesto, lo que llevó al cierre del anillo.

Figura 5: Espectro de masas de la EM MALDI-ToF de una repetición individual de la muestra 2. Este espectro de MS MALDI-ToF muestra el pico principal como PDMP con grupos extremos de hidrógeno y cloruro (M_n = 980 Da) ionizados con Na⁺. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Tabla 1: Comparación entre la abundancia porcentual máxima observada y teórica y la intensidad isotópica máxima de los picos [M⁺] y [M+2]⁺ (con [M⁺] = 100 %) del PDMP lineal con grupo final de hidrógeno y cloruro (M_n = 980 Da) de MALDI-ToF MS. El grupo final del polímero lineal tiene un Cl que es indicativo por la relación aproximadamente 3:1 de picos [M⁺] y [M+2]⁺ . Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Muestra 3: Poli(2,2-dimetilpropanoato) con un amonio cuaternario y grupos terminales de protones.
El ácido 3-bromo-2,2-dimetilpropanoico se polimerizó utilizando trietilamina (TEA) como base, sin embargo, se determinó que el TEA estaba reemplazando al Br en el grupo final (Figura 6A). Se utilizó una muestra de PDMP con un amonio cuaternario en un lado y un protón en el otro extremo (M_n = 1410 Da) para comparar la distribución isotópica con las que tenían un grupo final de Cl. La preparación de la muestra de MALDI-ToF MS se inició haciendo soluciones madre de KTFA (2 mg/ml en THF), el analito (5-7 mg/ml en THF) y DCTB (20 mg/ml en THF). Una vez hechas estas soluciones, 5 μL de la solución catiónica K⁺ , 5 μL de la solución de analito y 10 μL de la solución de matriz se combinaron en un tubo de microcentrífuga y se agitaron en vórtice (relación de 10:25:200 catión:analito:matriz para un total de 20 mL). A continuación, se extrajo 1 μL de esta mezcla del tubo de microcentrífuga y se secó en la placa diana MALDI-ToF MS. Para la matriz, se seleccionó DCTB ya que funciona con muchos otros poliésteres. El catión de potasio se agregó para confirmar si la muestra se autoionizaba.

El polímero contiene nitrógeno cuaternario (cargado positivamente) en el grupo final, que puede autoionizarse. Esto fue confirmado por los espectros MALDI-ToF MS ya que la relación masa-carga (m/z) no cambió independientemente de si se utilizó K⁺ o Na⁺ en la preparación de la muestra. Además, los espectros MALDI-ToF MS confirmaron la presencia de amonio cuaternario cargado positivamente en el grupo terminal, ya que Br es un buen grupo saliente.

Los espectros de MS MALDI-ToF confirmaron que la distribución de peso molecular de PDMP con un grupo final de amonio cuaternario estaba dentro del rango de 600 Da a 2200 Da (Figura 6B). Esto significa que la muestra tenía una baja dispersidad, lo que llevó a que los valores de M_n, M_w y Đ fueran 1410 Da, 1540 Da y 1,08, respectivamente, utilizando el software de análisis MALDI-Tof MS.

Figura 6: Esquema de reacción y espectro de masas de MS MALDI-ToF de la muestra 3. (A) Esquema de reacción para la muestra 3. Esquema de reacción para la síntesis de PDMP utilizando ácido 3-bromo 2,2-dimetilpropanoico con trietilamina como base. (B) Este espectro completo de MS MALDI-ToF muestra la distribución general del PDMP lineal con un grupo final de amonio cuaternario (M_n = 1410 Da). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Para confirmar si el polímero tenía la misma unidad de repetición (monómero), se calculó la diferencia entre dos picos adyacentes. La unidad de repetición del polímero tiene un peso molecular promedio observado de 100.0535 Da. Esto se confirmó observando el promedio de doce picos (distribución principal), que van desde 900 Da a 2300 Da, que es solo +0.0011 Da por encima de la unidad de repetición teórica (100.0524 Da).

El espectro de la EM MALDI-ToF presentaba dos distribuciones diferentes. Una de las distribuciones mostró que el polímero tiene un ácido carboxílico y un amonio cuaternario cargado positivamente como grupos terminales (negro), mientras que la otra distribución (púrpura) mostró la pérdida de protones del ácido carboxílico y una adición de iones de potasio. Para identificar aún más los grupos finales, se seleccionó un n-mer individual para el análisis (Figura 7).

El valor de masa teórico de los 12 meros de PDMP con el grupo final de amonio cuaternario está compuesto por la masa de las unidades repetidas (100,0524 x 12) más la masa del grupo final de amonio cuaternario (+ 101,1199) y la masa del grupo final de hidrógeno (+ 1,0078) que produce una masa total de 12 meros de 1302,757 Da. El valor de masa observado para 12-mer [H-PDMP_12-TEA]⁺ es 1302.730 Da, que es solo -0.027 Da por debajo del valor teórico.

El valor de masa teórico del 12 meros de PDMP con el grupo final de amonio cuaternario en un lado y el reemplazo del protón con otro ion de potasio se compone de la masa de las unidades repetidas (100.0524 × 12) más la masa del grupo final de amonio cuaternario (+ 101.1199) y la masa del grupo final de potasio (+ 38.9637) que produce una masa total de 12 meros de 1340.713 Da. El valor de masa observado para 12-mer [K-PDMP_12-TEA]⁺ es 1340.700 Da, que es solo -0.013 Da por debajo del valor teórico.

Figura 7: Espectro de masas de la EM MALDI-ToF de una repetición individual de la muestra 3. Este espectro de MS MALDI-ToF muestra la distribución primaria del PDMP lineal con un grupo terminal de amonio cuaternario (M_n = 1410 Da). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Muestra 4: Poli lineal (latón de etileno)
La siguiente muestra de polímero caracterizada por MALDI-ToF MS es poli(metalato de etileno) lineal (l-PEB). Esto se sintetizó a partir del monómero macrocíclico de etileno brassilato, que tiene un anillo de diecisiete miembros que contiene dos grupos éster (Figura 8A). Para comprender el grupo funcional y el cambio arquitectónico dentro de la estructura polimérica, se exploraron cuatro técnicas de caracterización diferentes: MALDI-ToF MS, ¹H-NMR, SEC y espectroscopia infrarroja por transformada de Fourier (FTIR). ¹H-NMR, SEC y FTIR confirman la eliminación del diéster cíclico y la formación de α-propargil-ω-hidroxi-PEB. Sin embargo, estas técnicas no detectaron ningún tipo de formación de subproductos. Por otro lado, el espectro de MS MALDI-ToF (Figura 8B) de l-PEB exhibe tres distribuciones de masa diferentes que indican la formación de tres PEB diferentes: α-hidroxi-ω-hidroxi-PEB (1), α-propargil-ω-propargil-PEB (2) y α-propargil-ω-hidroxi-PEB (3), respectivamente (Figura 8B).

Figura 8: Espectro MALDI-TOF de l-PEB con Na⁺. (A) Estructuras lineales de poli(etileno brassilato). (1) α-hidroxi-ω-hidroxi-PEB (2) α-propargil-ω-propargil-PEB (3) α-propargil-ω-hidroxi-PEB. (B) Se identificaron tres distribuciones, que incluyen α-hidroxi-ω-hidroxi-PEB (1), α-propargil-ω-propargil-PEB (2) y α-propargil-ω-hidroxi-PEB (3). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

La muestra de l-PEB se analizó en el MALDI-ToF MS utilizando DCTB como matriz para polímeros no polares. La preparación de la muestra de MALDI-ToF MS se inició haciendo soluciones madre de NaTFA (1 mg/ml en THF), el analito (5 mg/ml en THF) y DCTB (20 mg/ml en THF). Una vez hechas estas soluciones, 1 μL de la solución catiónica de Na⁺ , 5 μL de la solución de analito y 20 μL de (4) la solución de matriz se combinaron en un tubo de microcentrífuga y se dividieron en vórtice (relación de 1:25:400 catión:analito:matriz para un total de 26 mL). A continuación, se extrajo 1 μL de esta mezcla del tubo de microcentrífuga y se secó en la placa diana MALDI-ToF MS. Los MW observados para cada distribución estaban dentro de una desviación de 0,03 Da de los pesos moleculares exactos de los iones [M + Na]⁺ .

El valor de masa teórico para el 6-mer de α-hidroxi-ω-hidroxi-PEB (1) está compuesto por la masa de las unidades repetidas (270.1831 Da x 6), más la masa del grupo final 2-hidroxietoxi (+ 61.0290 Da), más la masa del grupo final de hidrógeno (+ 1.008 Da), más catión de sodio (+ 22.9892 Da) que produce un total de 1706.124 Da. El valor de masa observado para el 6-mer de α-hidroxi-ω-hidroxi-PEB (1) es de 1706,133 Da, que fue solo +0,009 Da por encima del valor teórico.

El valor de masa teórico para el 5-mer de α-propargil-ω-propargil-PEB (2) se compone de la masa de las unidades repetidas (270.1831 Da x 5), más la masa del latón de etileno menos OCH₂CH₂O (+ 210.1620 Da), más la masa de dos grupos terminales de éter propargílico (+ 55.0184 Da x 2), más catión de sodio (+ 22.9892 Da) que produce un total de 1694.103 Da. El valor de masa observado para el 5-mer de α-propargil-ω-propargil-PEB (2) es 1694.127 Da, que fue solo +0.024 Da por encima del valor teórico.

El valor de masa teórico para el 6-mer de α-propargil-ω-hidroxi-PEB (3) se compone de la masa de las unidades repetidas (270,1831 Da x 6), más la masa del grupo final de propargil éter (+ 55,0184 Da), más la masa del grupo final de hidrógeno (+ 1,008 Da), más catión de sodio (+ 22,9892 Da) que produce un total de 1700,113 Da. El valor de masa observado para 6-mer de α-propargil-ω-hidroxi-PEB (3) es de 1700,139 Da, que fue solo +0,026 por encima del valor teórico.

Muestra 5: Poli lineal azidificado (latón de etileno)
Además, el I-PEB (muestra 6) se funcionalizó con ácido 6-azidohexanoico mediante esterificación de sus grupos terminales de alcohol (Figura 9), obteniendo l-PEB azidificado (muestra 7). El producto obtenido también se analizó en el MS MALDI-ToF (Figura 10) utilizando las técnicas de preparación de muestras como polímero original (muestra 6). Los MW observados para cada distribución estaban dentro de una desviación de 0,04 Da de los pesos moleculares exactos de los iones [M + Na]⁺. Después de la esterificación, los iones [M + Na]⁺ de l-PEB con dos grupos extremos hidroxilados (1) muestran un cambio en la masa debido a su conversión de (1) a α-azido-ω-azido-PEB (4). Además, los l-PEB con un grupo terminal hidroxilo y un grupo final propargil (3) se convirtieron en un α-propargil-ω-azido-PEB (5). Sin embargo, (2) sigue sin reaccionar debido a sus dos grupos terminales de alquino.

Figura 9: Esterificación de poli(metalato de etileno) lineal con grupo extremo de alcohol mediante esquema de reacción de ácido 6-azidohexanoico. α-hidroxi-ω-hidroxi-PEB (1) se convierte en α-azido-ω-azido-PEB (4) y α-propargil-ω-hidroxi-PEB se convierte (3) en α-propargil-ω-azido-PEB (5). α-propargil-ω-propargil-PEB (2) permanece sin reaccionar debido a los grupos terminales de alquino que no experimentan una reacción de esterificación. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

El valor de masa teórico para el 6-mer de α-propargil-ω-azido-PEB (5) está compuesto por la masa de las unidades repetidas (270.1831 Da × 6), más la masa del grupo final de éter propargílico (+ 55.0184 Da), más la masa del grupo final de azidohexanoato (+ 140.0824 Da), más catión de sodio (+ 22.9892 Da) que produce un total de 1839.188 Da. El valor de masa observado para 6-mer de α-propargil-ω-azido-PEB (5) es 1839.184 Da, que es solo -0.004 Da por debajo del valor teórico. Además, la presencia de picos de iones metaestables (5-N₂) para (5) es otra indicación de funcionalización de azida, ya que los iones metaestables solo se formarán si hay una azida presente en la molécula.

El valor de masa teórico para el 6-mer del pico metaestable (5-N₂ + Na⁺) es 1815.126 Da, que se determinó utilizando la ecuación del gráfico de diferencia de masa del pico metaestable y los picos α-azido-ω-hidroxi-PEG (Figura 11). El valor de masa observado para 6-mer del pico metaestable es 1815.089 Da, que es solo -0.031 Da por debajo del valor teórico. El gráfico indica que, dentro del rango de masa de 1000 a 2000 Da, el valor de masa teórico del pico metaestable es de 24 a 24,1 Da menor que el de (5).

El valor de masa teórico para el 6-mer de α-azido-ω-azido-PEB (4) está compuesto por la masa de las unidades repetidas (270.1831 Da × 6), más la masa del grupo final de 6-azidohexanoato (+ 140.0824 Da), más la masa del grupo final de 2-oxietil-6-azidohexanoato (+ 200.1035 Da), más catión de sodio (+ 22.9892 Da) que produce un total de 1994.273 Da. El valor de masa observado para el 6-mer de α-azido-ω-azido-PEB (4) es 1994.296 Da, que es +0.023 Da por encima del valor teórico.

Figura 10: Espectro MALDI-ToF de l-PEB azidificados con Na⁺. Estos incluyen tres distribuciones de α-propargil-ω-propargil-PEB (2), α-azido-ω-azido-PEB (4) y α-propargil-ω-azido-PEB (5). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 11: Ilustración gráfica de la diferencia de masa entre α-azido-ω-hidroxi-PEG y su compuesto metaestable en relación con la masa de α-azido-ω-hidroxi-PEG (masa promedio 1700 Da). Este gráfico se deriva del espectro MALDI-ToF de α-azido-ω-hidroxi-PEG. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Muestra 6: Un polímero de peine ampliamente disperso
El esquema de reacción final es un polímero de peine que tiene unidades repetidas de tioéter con cadenas laterales de poli (etilenglicol)⁹. La muestra de polímero de peine hecha de 400 M_n metil éter-PEG-propargil y 1,6-hexanedithiol (CP MeO-PEG-400 HDT; Figura 12A) se analizó mediante NaTFA. Se eligió el sodio como contraión porque los éteres y tioéteres se ionizan más fácilmente con sodio, litio y potasio en lugar de metales alcalinotérreos más altos como el cesio. Estas muestras se analizaron con una matriz no polar, DCTB, aunque también se probaron matrices adicionales (CHCA y DT) con matrices deficientes. La preparación de la muestra de MALDI-ToF MS se inició haciendo soluciones madre de NaTFA (1 mg/ml en THF), el analito (5 mg/ml en THF) y DCTB (20 mg/ml en THF). Una vez hechas estas soluciones, 1 mL de la solución catiónica, 5 mL de la solución de analito y 20 mL de la solución de matriz se combinaron en un tubo de microcentrífuga y se agitaron en vórtice (relación de 1:25:400 catión:analito:matriz para un total de 26 mL). A continuación, se extrajo 1 ml de esta mezcla del tubo de microcentrífuga y se secó en la placa objetivo MALDI-ToF MS. Debido a que se agregó NaTFA a la muestra como un contraion, el espectro de masas de la MS MALDI-ToF exhibió los aductos de Na⁺ esperados de la muestra conocida. Además, también se observaron aumentos de aproximadamente 16 Da, 32 Da y 48 Da por encima de estos picos y se discutirán más adelante en este documento.

Figura 12: Esquema de reacción para la muestra 6 y espectro de masas MALDI-ToF de la muestra 6 (A) Estructura química y condiciones de reacción de un polímero de peine a base de ditiol-yno con varios espaciadores HDT y cadenas laterales de PEG de 400 M_n . (B) Espectro de masas MALDI-ToF de la muestra 6, CP MeO-PEG-400 HDT. Unidad de repetición mayor = 550.30 Da, Unidad de repetición menor = 44.02 Da Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

MALDI-ToF MS confirmó la amplia distribución (dispersión por SEC = 2,88; Figura 12B) de CP MeO-PEG-400 HDT. El pico monoisotópico (que comprende exclusivamente los isótopos elementales más abundantes, a saber, ¹²C, ¹H, ¹⁶O y ³²S) estaba suficientemente resuelto, lo que permitió el uso de la identificación exacta de masas. Todos los cálculos de masa teórica se determinaron utilizando masas monoisotópicas para cada elemento. Debido a la amplia dispersión de la muestra (2,88 por SEC), el espectro de masas MALDI-ToF no se pudo utilizar para calcular el M_n, M_w o Đ. MALDI-ToF MS sobresale con la caracterización de polímeros estrechamente dispersos (Đ < 1.3) pero puede tener dificultades con la caracterización completa de polímeros ampliamente dispersos. Al describir polímeros con dispersidades amplias, solo el extremo de menor peso molecular del espectro de masas estará bien resuelto y visible con MALDI-ToF MS, excluyendo cualquier especie de mayor peso molecular. Este fenómeno se conoce como sesgo de baja masa. Debido a este hecho, no se puede lograr la caracterización completa de los polímeros de peine a través de MALDI-ToF MS solo. Por esta razón, SEC se utilizó junto con MALDI-ToF MS para obtener valores precisos de M_n, M_w y Đ.

Para confirmar la presencia del polímero de peine, se adoptó un enfoque similar para un polímero lineal o cíclico estándar. Cada unidad repetida del polímero de peine contiene una distribución estrecha de cadenas laterales M_n = 400 PEG, por lo que se exploraron las unidades repetidas de polímero de peine para determinar la presencia del producto deseado en cada una. Además, quedó una pequeña cantidad de material de partida de la polimerización en la solución de reacción (300-700 Da) que también se caracterizó.

En todo el espectro de MS MALDI-ToF, se pueden ver los MW más bajos y más altos para 6 a 15 meros del MeO-PEG-OH. Originalmente, en el espectro MALDI-ToF MS del material de partida MeO-PEG-propargyl, estos MeO-PEG-OH no eran visibles (Figura 13; espectro superior). La aparición de estos picos se debe a la concentración relativa del MeO-PEG-propargyl al MeO-PEG-OH. A medida que avanza la reacción del polímero de peine, el MeO-PEG-propargyl se incorpora al producto. Debido a esto, la proporción del material de partida alquino en comparación con el MeO-PEG-OH comienza a disminuir, lo que muestra MeO-PEG-OH no funcionalizado en el espectro de MS MALDI-ToF (Figura 13; espectro inferior).

En cuanto a la distribución en masa del producto, se utilizaron valores de masa exactos para todos los cálculos posteriores. El valor de masa teórico de una unidad repetida del material de partida [MeO-(PEG₁₀)-CH₂CCH + Na]⁺ es 44.0262 Da. Esta masa de unidad de repetición multiplicada por el número de unidades de repetición, que será 10 para cada cadena lateral, (44.0262 Da x 10) más la masa del grupo extremo α-metoxi (+ 31.0183 Da) y la masa del grupo extremo ω-propargil (+ 39.0235 Da) más la masa del catión de sodio (+ 22.9892 Da) produce una masa total de 10 meros de 533.2932 Da. El valor de masa observado para el PEG + Na⁺ de 10 meros es 533,239 Da, que es -0,054 Da por debajo del valor teórico (Figura 13). En los espectros completos de MALDI-ToF MS, están los 6 a 9 meros por debajo y los 11 a 15 meros por encima para esta serie. La secuencia de picos más pequeños y desplazados en el espectro de bajo peso molecular corresponde al material de partida MeO-PEG-OH no funcionalizado donde el valor de masa teórico del 11-mer se compone de la masa de las unidades repetidas (44.0262 Da x 11) más la masa del grupo final α-metoxi (+ 31.0184 Da) y la masa del grupo final ω-hidrógeno (+ 1.008 Da) y la masa del catión de sodio (+ 22.9892 Da) que produce un total de 11-mer masa de 539.304. El valor de masa observado para el 11-mer + Na⁺ es 539.252 Da, que es solo -0.052 Da por debajo del valor teórico.

Figura 13: Espectros de masas MALDI-ToF (ampliados de 530-615 Da) del material de partida (arriba) y especies de bajo peso molecular de la muestra 8 (abajo), CP MeO-PEG-400 HDT. La proporción del material de partida alquino en comparación con el MeO-PEG-OH (espectro superior y rojo) comienza a disminuir, lo que muestra MeO-PEG-OH (espectro inferior y azul) no funcionalizado en el espectro de masas CP MeO-PEG-400 HDT MALDI-ToF (espectro inferior). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

En cuanto a los polímeros de peine cíclico, sus masas con diversos grados de polimerización pueden multiplicarse por las partes individuales del n-mer deseado. El valor de masa teórico del 2-mer [CP-MeO-PEG₁₆ HDT + Na]⁺ está compuesto por la masa de las unidades repetidas de cada cadena PEG, de las cuales hay aproximadamente 8 por cadena, (44.0262 Da x 16) más la masa de los grupos terminales terminales de cada cadena PEG (+ 15.0235 Da x 2) más la masa de los carbonos que alguna vez fueron el grupo propargil y ahora han reaccionado con los tioles (+ 41.0391 Da x 2) más la masa del HDT que ha reaccionado con los alquinos (+ 148,0380 Da x 2) y la masa del catión sódico (+ 22,9892 Da) que produce una masa total de 2 meros de 1167,599 Da. El valor de masa observado para el 2-mer [CP-MeO-PEG₁₆ HDT + Na]⁺ es 1167.626 Da, que es +0.027 Da por encima del valor teórico (Figura 14). Aunque se observaron estructuras cíclicas de menor peso molecular, no se pudieron observar los compuestos lineales con tioles en ambos extremos o dobles enlaces en ambos extremos.

Estos polímeros que contienen tioéter también pueden sufrir oxidación, convirtiendo los tioéteres en sulfóxidos⁹. Esto explica la adición de múltiples oxígenos (+ 15.9949 Da x n) dependiendo del grado de oxidación; esto difiere del aducto K+, que es una diferencia de +15.9739 Da del aducto Na⁺ . Para la oxidación única del 2-mer [CP-MeO-PEG₁₆ HDT + Na]^+, el valor de masa teórico es de 1183,594 Da, mientras que el valor de masa observado fue de 1183,620 Da con solo un aumento de +0,026 Da del valor teórico. Para la doble oxidación del 2-mer [CP-MeO-PEG₁₆ HDT + Na]⁺, el valor de masa teórico es de 1199,590 Da, mientras que el valor de masa observado fue de 1199,613 Da con un aumento de solo +0,023 Da del valor teórico. Finalmente, para la triple oxidación del 2-mer [CP-MeO-PEG16 HDT + Na]⁺, el valor de masa teórico es de 1215,585 Da, mientras que el valor de masa observado fue de 1215,617 Da con un aumento de solo +0,032 Da del valor teórico.

Figura 14: Espectro de masas MALDI-ToF de la muestra 8, CP MeO-PEG-400 HDT. Acercar de 1165 a 1254 Da muestra productos de polímero de peine cíclico de 2 meros con diferentes cantidades de unidades repetidas de PEG unidas y diversos grados de oxidación de tioéter. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

La oxidación se puede confirmar aún más realizando un estudio de contra-iones. Esto implica utilizar un catión ionizante diferente, como K⁺, y comparar el desplazamiento de los picos en los espectros de la EM MALDI-ToF. Se ejecutó una muestra de CP MeO-PEG-400 HDT en el MS MALDI-ToF utilizando KTFA en lugar de NaTFA (Figura 15). Esto desplaza todas las masas de los picos hacia arriba en +15.9739 Da debido a la diferencia de masa entre Na⁺ y K⁺. Para el análisis con el aducto K⁺ , no hubo polímero no oxidado (1183.574 Da_Theo) en los espectros MALDI-ToF MS. Para la oxidación simple del 2-mer [CP-MeO-PEG₁₆ HDT + K]⁺ el valor de masa teórico es 1199.569 Da mientras que el valor de masa observado fue 1199.567 Da (solo -0.002 Da), para la doble oxidación del 2-mer [CP-MeO-PEG₁₆ HDT + K]⁺ el valor de masa teórico es 1215.564 Da mientras que el valor de masa observado fue 1215.572 Da que abarca una diferencia (solo +0.008 Da), para la triple oxidación del 2-mer [CP-MeO-PEG₁₆ HDT + K]⁺ el valor de masa teórico es 1231.558 Da mientras que el valor de masa observado fue 1231.563 Da (solo +0.005 Da), y para la oxidación cuádruple recién formada del 2-mer [CP-MeO-PEG₁₆ HDT + K]⁺ el valor de masa teórico es 1247.553 Da mientras que el valor de masa observado fue 1247.551 Da (solo -0.002 Da). Cabe señalar que los polímeros se oxidaron aún más entre los aductos de Na⁺ y K⁺ , lo que resultó en la pérdida del producto no oxidado y la formación de la oxidación cuádruple del CP MeO-PEG-400 HDT. También se puede observar que, si bien el polímero vuela con aductos de Na⁺ y K⁺ , la relación señal-ruido es significativamente mayor para los aductos de Na⁺ , lo que acentúa la opción de usar Na⁺ para la caracterización primaria.

Figura 15: Espectro de masas MALDI-ToF de la muestra 8, CP MeO-PEG-400 HDT. El zoom de 1195-1254 Da muestra productos de polímero de peine cíclico de 2 meros con diferentes cantidades de unidades repetidas de PEG unidas y diversos grados de oxidación de tioéter. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discusión

MALDI-ToF MS es una técnica altamente efectiva para la caracterización de polímeros sintéticos, que ofrece mediciones precisas con una fragmentación mínima debido a su mecanismo de ionización suave. En este método, la matriz absorbe energía de un láser y la transfiere al analito²⁶. Esta energía hace que el polímero se vaporice, se ionice a través de la interacción con un agente catiónico y se desorbe en el vacío. Los analitos ionizados viajan a través del tubo de vuelo, donde se detectan en función de su relación masa-carga (m/z)^26,27. Este método es adecuado para determinar la masa de moléculas monodispersas y es igualmente efectivo para polímeros moderadamente dispersos (Đ = 1.1-1.3) y altamente dispersos, donde se pueden determinar la masa unitaria repetida y los grupos terminales. Para polímeros moderadamente dispersos, MALDI-ToF MS también proporciona dispersidad (Ð), peso molecular promedio numérico (M_n) y peso molecular promedio en peso (M_w).

Sin embargo, se deben tener en cuenta varias limitaciones de la técnica. MALDI-ToF MS exhibe un sesgo de baja masa cuando se analizan polímeros con alta dispersidad (Đ > 1.3), lo que significa que los polímeros de menor masa en la distribución dominan el espectro, mientras que las especies de mayor masa son picos de baja intensidad o ausentes^28,29. Además, la resolución disminuye significativamente para polímeros por encima de 10,000 Da, y los polímeros que superan los 15,000 Da podrían analizarse mejor en modo lineal. Sin embargo, el modo lineal sacrifica la resolución máxima isotópica en comparación con el modo reflector. Además, MALDI-ToF MS se basa en la capacidad del polímero para ionizarse de manera efectiva. Los polímeros con sistemas conjugados o heteroátomos se ionizan más fácilmente que los hidrocarburos saturados como el polietileno o el polipropileno, que a menudo requieren modificaciones químicas para ionizarse^30,31.

La preparación de muestras es un paso crucial para lograr resultados exitosos. Uno de los aspectos más importantes es seleccionar la matriz adecuada para el analito polimérico^11,32. Por ejemplo, las matrices como DCTB y GFR funcionan bien para polímeros no polares, mientras que DHB y CHCA se pueden comparar para polímeros polares para identificar qué matriz proporciona los picos más resueltos. Además, la elección de un disolvente adecuado para disolver tanto la matriz como el analito garantiza una cocristalización adecuada, lo que mejora la ablación láser y mejora la resolución en los espectros MALDI-ToF MS 33,34,35 resultantes. Del mismo modo, elegir el agente de catión apropiado es esencial para maximizar la eficiencia de ionización y producir picos claros y distinguibles.

Una vez que se han seleccionado la matriz y el agente de catión, se puede optimizar la relación matriz:analito:catión. Comience preparando soluciones madre del catión seleccionado (1 mg/ml en THF), analito (5 mg/ml en THF) y matriz (20 mg/ml en THF). Se recomienda una relación de volumen inicial de 1:5:20 μL (catión:analito:matriz), correspondiente a relaciones de concentración de aproximadamente 1:25:400 mg/mL en un volumen total de 26 μL. Si esta mezcla inicial no produce espectros bien resueltos, se puede realizar una optimización sistemática utilizando un enfoque basado en cuadrículas (Tabla 2)^10,16. En esta configuración, el volumen del analito es fijo, mientras que el volumen de la matriz se multiplica incrementalmente por 4 en las columnas, y el volumen de cationes se multiplica por 4 en las filas. Esta cuadrícula permite a los usuarios identificar la relación óptima para la ionización y la resolución. Si una de las condiciones de la cuadrícula exterior proporciona un rendimiento mejorado, se puede generar una nueva cuadrícula centrada en esa relación, continuando el múltiplo de 4 ajustes para un mayor refinamiento. Un buen punto de partida es evaluar si el espectro contiene picos de alta intensidad, bajo ruido de referencia y resolución isotópica bien resuelta. Este proceso puede llevar mucho tiempo, especialmente para polímeros nuevos o complejos que pueden requerir probar varias matrices y cationes en una cuadrícula de preparación de 3 x 3.

Tabla 2: Se puede crear y probar una cuadrícula sistemática de proporciones experimentales. Se utilizará una proporción de 1:5:20 μL de catión, analito y matriz, respectivamente, para iniciar (1:25:400 mg/mL) catión:analito:matriz para un total de 26 mL. El volumen del analito se fija en 5 μL (25 mg/mL). La matriz y la relación catiónica se multiplican incrementalmente por 4 en las columnas y en las filas, respectivamente. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Después de la aplicación de muestra a la placa diana MALDI-ToF MS, utilizando el método de gota seca, la placa MALDI-ToF MS se carga en el instrumento MALDI-ToF MS. Los parámetros de adquisición de datos de MALDI-ToF MS, como la potencia del láser, el diámetro del rayo láser, la ganancia del detector y la extracción de iones de pulso, se pueden ajustar para lograr una mayor resolución y una separación de picos más clara. Estos se pueden cambiar sistemáticamente para determinar la intensidad máxima, reducir el ruido de referencia y mejorar la resolución máxima (Figura 1).

La optimización de los parámetros instrumentales y las proporciones de preparación de muestras no sigue un flujo de trabajo estrictamente lineal. Los operadores pueden comenzar con un método de preparación de muestras preferido y cribar en modo lineal para evaluar si el polímero se ioniza, o pueden ajustar primero el método del instrumento (por ejemplo, potencia láser, extracción por pulsos) antes de modificar las proporciones de mezcla de muestras utilizando la cuadrícula de preparación de 3 x 3. A menudo es necesaria la flexibilidad en el flujo de trabajo, especialmente cuando se analizan materiales nuevos, desconocidos o mal caracterizados.

Una vez completada la optimización, se puede reutilizar un protocolo de preparación de muestras, aunque aún puede producirse una ligera variabilidad entre operadores o entre días. Realizar una calibración para cada ejecución de adquisición minimiza la variación, y las diferencias en la masa máxima generalmente permanecen por debajo de 0.1 Da cuando se siguen protocolos consistentes. Por lo tanto, la reproducibilidad entre usuarios y días es posible si tanto el método del instrumento como la preparación de la muestra siguen siendo los mismos. Si los problemas persisten, en la Tabla 3 se proporciona una tabla con problemas comunes que puede experimentar un usuario y soluciones.

Tabla 3: Problemas comunes y estrategias de resolución de problemas basadas en la experiencia práctica. La tabla ayuda con los problemas encontrados durante la preparación de muestras, la adquisición de datos y el análisis de datos. Para la resolución de problemas específicos del instrumento, consulte el manual del fabricante de MALDI-ToF MS o un técnico calificado. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

La calibración es un paso crítico para garantizar la precisión de las mediciones de masa. Se pueden emplear calibraciones externas e internas, pero es vital que los calibradores utilizados se encuentren dentro del rango de masa del analito polimérico. La calibración adecuada garantiza que la masa del analito se determine correctamente.

El análisis de datos se realiza donde se abre el espectro de masas de la MS MALDI-ToF y se puede seleccionar la selección de picos para un análisis posterior. La masa de macromoléculas monodispersas, así como polímeros bajos, moderados y altamente dispersos de un n-mer específico, se puede confirmar comparando la masa observada con los valores teóricos calculados utilizando software de dibujo químico. Estas comparaciones ayudan a verificar la masa total de una macromolécula monodispersa o, en el caso de polímeros bajos, moderados y altamente dispersos de un n-mer especificado, se identifican los grupos terminales y se confirma la masa de la unidad de repetición.

En resumen, la optimización de la matriz, las condiciones de catinación y las proporciones experimentales es fundamental para lograr datos de MS MALDI-ToF de alta resolución. La calibración garantiza mediciones de masa precisas. El análisis de datos mediante la selección de picos y la comparación de masas teóricas permite una caracterización exhaustiva del polímero, incluida la identificación de grupos terminales y la masa de la unidad de repetición. Esta técnica se puede utilizar para macromoléculas monodispersas, además de polímeros sintéticos de baja dispersión, moderada dispersión y alta dispersión. Las direcciones futuras incluyen la expansión de la caracterización de arquitecturas de polímeros complejos, como mezclas de películas delgadas de polímeros, polímeros cíclicos y polímeros hiperramificados a través de métodos de preparación de muestras sin solventes y espectrometría de masas en tándem (MS / MS)36,37,38. Las combinaciones de instrumentos, como el uso de cromatografía de exclusión por tamaño (SEC) para fraccionar una muestra, seguida de MALDI-ToF MS para el análisis estructural, se pueden utilizar para identificar estructuras de baja masa, determinar la dispersión fraccional y caracterizar grupos finales en muestras de polímeros altamente dispersas 39,40,41. Además, los nuevos enfoques de análisis de datos, incluida la entrada manual o la generación asistida por software de gráficos de defectos de masa de Kendrick, permiten la conversión de espectros de masas en mapas bidimensionales, lo que facilita la identificación de múltiples grupos finales dentro de una muestra ^2,42.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Clorhidrato de 1-(3-dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimida	Productos químicos TCI	D1601	https://www.tcichemicals.com/US/en/p/D1601
1,1,1-Tris(hidroximetil)propano	Millipore Sigma	148083	https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/aldrich/148083?srsltid=AfmBOoqaMzcy1xravp1h2QE 0myfY5gjuEBfOIv2o882Wb _xcB4Ol4CMW
1,5,7-Triazabiciclo[4.4.0]dec-5-eno	Millipore Sigma	345571	https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/aldrich/345571?srsltid=AfmBOooLQXIhWaMnO63nE xu-Y5MJoJID6RJiby0NXyu DHOxXYjle_kMT
1,6-hexaneditiol 98% (HDT)	TCI	H0334	https://www.tcichemicals.com/US/en/p/H0334
ácido 2-(4-hidroxifenilazo)benzoico) (HABA)	Millipore Sigma	H5126	https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/aldrich/h5126
Ácido 2,2-Bis(hidroximetil)propiónico	Millipore Sigma	106615	https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/aldrich/106615?srsltid=AfmBOopCRoa1N_UiDK 56NKhDKdlAN8feUrMxVYhul Muz2en6NYEGIh4b
2,2-dimetoxi-2-fenilacetofenona 99% (DMPA)	Sigma-Aldrich	196118	https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/aldrich/196118?srsltid=AfmBOoqVTif6KNwIr6A -bIgnXbkrvWKIUNH6qOsc RseQLNVKi0DMWPb-
Ácido 2,5-dihidroxibenzoico (DHB)	Millipore Sigma	149357	https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/aldrich/149357
4-(Dimetilamino)piridina	Millipore Sigma	522821	https://www.sigmaaldrich.com/US/en/search/522821?focus=products&page=1&perpage= 30& ordenar=relevancia& term=522821 & type=producto
Ácido 6-bromohexanoico	Millipore Sigma	150452	https://www.sigmaaldrich.com/US/en/search/6-bromohexanoic-acid?focus=products&page=1 y por página = 30 & ordenar=relevancia& term= ácido 6-bromohexanoico%20& type=producto
Benzaldehído dimetil acetal	Millipore Sigma	226076	https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/aldrich/226076?srsltid= AfmBOorbjP7zD9MO3g5Xk LL3rNZ02PhfkXoRfe3EjRK7 TrqJ-kEOrTCN
Ácido benzoico	Millipore Sigma	242381	https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sial/242381?srsltid=AfmBOook_iIcMnwuB3e _j-KetQyyHJ6Qq86jSK8 ZVxC3BorQgkO8Xg5I
Bruker UltraFlextreme	Bruker Daltonics		https://www.bruker.com/en/products-and-solutions/mass-spectrometry/maldi-tof/ultraflextreme.html
Cloroformo	Fisher Scientific	AA32614K7	https://www.fishersci.com/shop/products/chloroform-acs-99-8-thermo-scientific/AA32614K7 ?searchHijack=true& searchTerm= chloroform-acs-99-8-thermo-scientific & searchType=Rápido& GatoEmparejadoNo =AA32614M6
Ditranol, PA, 98,5-101% (DT)	Fisher Scientific	18-602-270	https://www.fishersci.com/shop/products/dithranol-bp-98-5-101-spectrum-chemical/18602270
Latón de etileno	Millipore Sigma	W354309	https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/aldrich/w354309?utm_source=google&utm_medium= CPC& utm_campaign=8692675663& utm _content=86098110623& gad_source= 1& gclid=CjwKCAiApY-7BhBjEiwAQMr rEdJTcKN5TEFkP1uHvRlVign3lwg2cj5 _spBUCrfi6exZ3Ur5sJkARxoCfWsQ AvD_BwE
Galvinoxilo, radical libre	Millipore Sigma	G307	https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/aldrich/g307?srsltid= AfmBOopoWGDMXtLk5Erf0rVyl 7j442uyg8rIWkfBjhHZ2z0dDktH3y8-
Metanol	Fisher Scientific	A456	https://www.fishersci.com/shop/products/methanol-optima-lc-ms-grade-thermo-scientific/A4564
Paladio, 10% sobre carbono, Tipo 487, seco	Fisher Scientific	AAA1201206	https://www.fishersci.com/shop/products/palladium-10-carbon-type-487-dry-thermo-scientific-1/AAA1201206#?keyword=palladium%20on%20carbon
Polietileno glicol) éter monometílico 350  Mn  (MeO-PEG-OH 360)	Fisher Scientific	AA4156022	https://www.fishersci.com/shop/products/polyethylene-glycol-monomethylether-350-thermo-scientific/AA4156022
Trifluoroacetato de potasio (KTFA)	Millipore Sigma	281883	https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/aldrich/281883
Alcohol propargílico	Fisher Scientific	A10295.0F	https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/A10295.0F?SID=srch-hj-A10295.0F
Bromuro de propargil 97% (80% p/p en tolueno estabilizado con MgO)	Fisher Scientific	AAL1059514	https://www.fishersci.com/shop/products/propargyl-bromide-97-80-w-w-toluene-stab-magnesium-oxide-thermo-scientific/AAL1059514#?keyword=Propargyl%20bromide%2097%%20(80%20w/w%20in%20tolueno%20estabilizado%20con%20MgO)
Azida sódica	Millipore Sigma	S2002	https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sial/s2002
Hidruro de sodio 60% de dispersión en aceite mineral	Millipore Sigma	452912	https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/aldrich/452912?srsltid= AfmBOooZhbCm_qtgKU99922Y91zI qEOWONlEGxjZn0mdSJF2L5hW1uVn
Trifluoroacetato de sodio (NaTFA)	Oakwood	MFCD00013217	https://www.oakwoodchemical.com/ProductsList.aspx?CategoryID=-2&txt Buscar = 1549& ExtHyperLink=1
Kit de rango bajo SpheriCal Neat (250 - 7,500 Da)	Fábrica de polímeros	PFS-104	https://www.polymerfactory.com/product-page/spherical-low-range-kit-500-7-500-da
Tetrahidrofurano (THF)	Fisher Scientific	T427	https://www.fishersci.com/shop/products/tetrahydrofuran-optima-fisher-chemical-3/T4274#?keyword=tetrahydrofuran%20optima
trans-2-[3-(4-terc-Butilfenil)-2-metil-2-propenilideno]malononitrilo (DCTB)	TCI	B3635	https://www.tcichemicals.com/US/en/p/B3635
Ácido &alfa;-ciano-4-hidroxicinámico (CHCA)	TCI	C1768	https://www.tcichemicals.com/US/en/p/C1768