Artículo de método

Desarrollo de un innovador dispositivo de iluminación basado en LED para la aplicación in vitro de terapia fotodinámica con rosa de Bengala

DOI:

10.3791/68462

⸱

12 de septiembre de 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Inserm, CHU Lille, U1189-ONCO-THAI-Assisted Laser Therapy and Immunotherapy for Oncology, University of Lille, 2CNRS, Inserm, CHU Lille, UMR9020-U1277-CANTHER-Cancer Heterogeneity Plasticity and Resistance to Therapies, University of Lille

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este manuscrito presenta un novedoso e innovador dispositivo de iluminación impreso en 3D para estudiar la terapia fotodinámica mediada por la rosa de Bengala in vitro.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este artículo describe un nuevo dispositivo de terapia fotodinámica (PDT) para evaluar la eficacia de la PDT mediada por rosa de Bengala (RB) in vitro. El dispositivo, llamado CELL-LED-550/3, consta de dos partes impresas en 3D, una que genera una luz verde de 550 nm a partir de un solo LED (la parte de la fuente de luz) y la otra que distribuye esta luz a una placa de cultivo celular de 96 pocillos (la parte del distribuidor de luz). La parte de la fuente de luz está controlada por un controlador con tres modos diferentes, lo que permite que la parte del distribuidor de luz entregue tres niveles de irradiación diferentes a la superficie exterior inferior de los pocillos: 0,02 mW/cm2, 0,23 mW/cm2 o 0,62 mW/cm2. La parte del distribuidor de luz fue diseñada para iluminar los pozos de forma individual y simultánea. Para demostrar la relevancia del dispositivo CELL-LED-550/3, se evaluó su capacidad para inducir la muerte celular mediante PDT mediada por RB en células de carcinoma hepatocelular HepG2. En primer lugar, las células HepG2 se trataron durante 2 h con concentraciones crecientes de Rosa de Bengala, un fotosensibilizador con un pico de absorción (el más alto) de alrededor de 550 nm. A continuación, las células tratadas se iluminaron utilizando el dispositivo CELL-LED-550/3 ajustado a su nivel máximo de irradiancia a dosis de luz de 0,3 J/cm2, 0,6 J/cm2 y 1,2 J/cm2 (respectivamente, con tiempos de iluminación de 8 min y 4 s, 16 min y 8 s, y 32 min y 16 s). Finalmente, la viabilidad se midió utilizando Cell-Titer Glo a las 24 h después de la PDT. Los resultados experimentales muestran que la PDT mediada por RB utilizando el dispositivo CELL-LED-550/3 es capaz de inducir una disminución en la viabilidad de las células HepG2, de una manera que depende tanto de la concentración de Rosa de Bengala como de la dosis de luz administrada. Basado en la prueba de concepto presentada en este artículo, el dispositivo CELL-LED-550/3 agrega una herramienta adicional al estudio de la PDT mediada por RB.

Introducción

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Con más de 905.000 nuevos casos y 830.000 muertes en 2020, el cáncer primario de hígado es el séptimo cáncer más común y la segunda causa principal de muertes relacionadas con el cáncer en todo el mundo1. Entre los cánceres primarios de hígado, el carcinoma hepatocelular (CHC) es la forma más común, representando aproximadamente el 90% de los casos2. Debido a la enfermedad hepática crónica no detectada y al escaso cumplimiento de la vigilancia, solo el 25% de los pacientes con CHC son diagnosticados en la etapa temprana de la enfermedad3. Estos pacientes diagnosticados precozmente suelen ser tratados mediante resección hepática, trasplante hepático o terapias ablativas locales con intención curativa y demuestran un buen pronóstico con una tasa de supervivencia a cinco años superior al 70%4,5. Para el otro 75% de los pacientes (aquellos con CHC de diagnóstico intermedio o tardío), aunque las modalidades de tratamiento innovadoras que incluyen terapias dirigidas, inmunoterapias y regímenes combinados aportan beneficios de supervivencia6, el pronóstico sigue siendo muy malo: la tasa de supervivencia a cinco años de hecho no supera el 30% para este grupo de pacientes y cae al 2% para el subgrupo de pacientes metastásicos6. Por lo tanto, la exploración de opciones de tratamiento alternativas es crucial para mejorar los resultados del tratamiento y prolongar la supervivencia en pacientes con CHC en estadio intermedio o avanzado. La terapia fotodinámica (TFD), que es una terapia contra el cáncer ampliamente practicada en dermatología7, podría ser un candidato alternativo adecuado.

La TFD es un tratamiento fotoquímico que combina el uso de un agente fotosensibilizante (PS), una longitud de onda adecuada de luz visible y oxígeno molecular para generar especies reactivas de oxígeno (ROS) citotóxicas8. Los efectos anticancerígenos de la TFD se derivan de tres mecanismos inducidos por ROS9: primero, efectos citotóxicos directos sobre las células malignas10, luego daño a la vasculatura tumoral que induce hipoxia del tejido tumoral, privación y regresión de nutrientes11, y finalmente inducción de reacción inflamatoria a través de la liberación de señales de peligro y antígenos tumorales de células tumorales dañadas o moribundas12. Durante más de tres décadas, la TFD ha sido objeto de intensas investigaciones con el objetivo de evaluar su potencial para tratar diversos tipos y formas de cáncer 13,14,15,16,17,18. Con base en su eficacia probada a partir de estas investigaciones 19,20,21, la TFD se utiliza actualmente en dermatología para el tratamiento de cánceres de piel no melanoma 7. Para las demás indicaciones, el número de estudios clínicos ha aumentado en los últimos años, lo que demuestra los esfuerzos significativos para llevar la TFD, utilizada sola o en combinación con tratamientos estándar, a la práctica clínica 22,23,24.

Existe una variedad de agentes fotosensibilizantes utilizados para la TFD25. Entre ellos, se ha demostrado que la rosa de Bengala (RB) actúa como un agente fotodinámico eficiente contra las células tumorales de laringe26, las células de melanoma27, las células de cáncer de mama28 y los tejidos de cáncer de próstata29. El trabajo presentado en este artículo se basa en la necesidad de evaluar si la PDT mediada por RB también es eficiente para las células de HCC.

De hecho, dicha evaluación requirió el desarrollo previo de un dispositivo basado en LED verde dedicado a la iluminación de 550 nm de placas de cultivo celular de 96 pocillos. Para este dispositivo se implementó un diseño en dos partes30: una parte de fuente de luz genera una luz verde de 550 nm a partir de un solo LED, mientras que una parte distribuidora de luz distribuye esta luz, mediante el uso de un haz de fibra óptica, a los 96 pozos individualmente y lejos del LED. Este diseño de dos partes, en primer lugar, evita que las células sufran efectos térmicos nocivos que puedan surgir debido al calor incontrolado generado dentro del LED y, en segundo lugar, permite iluminar las células dentro de una incubadora de cultivo celular mientras se mantiene la parte de la fuente de luz con sus componentes electrónicos (incluido el LED) en el exterior. Estas características innovadoras confieren al llamado dispositivo CELL-LED-550/3 grandes ventajas sobre los sistemas basados en LED ya publicados que han sido diseñados específicamente para la iluminación de placas de pocillosmúltiples 31,32,33,34,35.

En este artículo, el dispositivo CELL-LED-550/3 se describe primero en detalle. Luego, como prueba de concepto, un estudio de viabilidad celular demuestra la eficacia de la PDT mediada por RB utilizando CELL-LED-550/3 en un modelo de cultivo celular de HCC 2D (HepG2)30. Además de ser económico y portátil, el dispositivo CELL-LED-550/3 también es una herramienta particularmente relevante para los experimentos de PDT mediados por RB.

Protocolo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los detalles de los reactivos y el equipo utilizado en este estudio se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Construcción del dispositivo

NOTA: Las dos partes del dispositivo CELL-LED-550/3 se fabrican por separado y, solo como último paso, se conectan juntas.

  1. Construcción de la parte de la fuente de luz
    1. Coloque un conjunto de disipador de calor del ventilador del tamaño adecuado en la parte posterior de la placa de circuito impreso (PCB) en la que está montado el LED de 550 nm y 3 W.
    2. Cubra el LED con una lente de colimación transparente de PMMA (polimetilmetacrilato) para homogeneizar primero el haz de luz y segundo para reducir el ángulo del haz de 120° a 10°. Tal reducción permite aumentar la cantidad de luz entregada a la parte distribuidora de luz.
    3. Conecte el LED al controlador actual con atenuación trimodo, lo que permite entregar diferentes niveles de irradiancia.
    4. Construya por separado la carcasa, el frente de la carcasa y el cierre de la carcasa en impresión 3D (recuadros rojos en la Figura 1).
    5. Instale el controlador y el LED equipados con el conjunto de la lente y el disipador de calor del ventilador en sus lugares dedicados en la carcasa (cuadros azules en la Figura 1).
    6. Instale el conector de alimentación y el interruptor basculante en sus lugares dedicados en el cierre de la carcasa (cuadros azules en la Figura 1).
    7. Conecte el controlador y el conjunto del disipador de calor del ventilador al conector de alimentación a través del interruptor basculante.
    8. Ensamble la carcasa, el cierre de la carcasa y el frente de la carcasa.
    9. Compruebe que el LED esté alineado con el eje de la abertura cilíndrica del frente de la carcasa.
      NOTA: La abertura cilíndrica del frente de la carcasa está destinada a la conexión óptica de la parte de la fuente de luz (conector hembra) con la parte del distribuidor de luz (conector macho).

figure-protocol-1
Figura 1: Vistas tridimensionales frontal (A), posterior (B) y explotada (C) de la parte de la fuente de luz. Adaptado de Lefebvre, A. et al.30. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. 

  1. Construcción de la parte del distribuidor de luz
    1. Construya por separado el cierre inferior de la carcasa, la carcasa y el cierre superior en impresión 3D (juntos forman una caja hueca) (cuadros rojos en la Figura 2).
    2. Construya el espaciador de 96 pocillos en impresión 3D blanca (cuadro rojo en la Figura 2) para que encaje exactamente en la caja hueca mencionada en 1.2.1. El color blanco tiene como objetivo maximizar la reflexión de la luz y, por lo tanto, optimizar la distribución de la luz.
      NOTA: El diámetro y el espaciado central de las aberturas circulares presentes en el espaciador de 96 pocillos deben ser iguales al diámetro y al espaciado central de los pocillos de la placa de 96 pocillos utilizada para ensayos biológicos.
    3. Taladre 96 pequeños orificios en el cierre superior de la caja hueca para que queden alineados con el centro de las 96 aberturas circulares en el espaciador de 96 pocillos, cuando este último se coloca en el cierre superior.
    4. Inserte una fibra óptica plástica de 0,5 mm de diámetro, de abajo hacia arriba, en cada uno de los 96 pequeños orificios del cierre superior.
    5. Aplique resina de poliéster en la parte inferior del cierre superior para unir las 96 fibras ópticas al cierre superior.
    6. Después de que la resina se seque, pula las extremidades distales de las fibras ópticas hasta que se ajusten a la parte superior del cierre superior.
    7. Reúna las fibras ópticas dentro de la caja hueca mencionada en el paso 1.2.1 en un solo paquete protegido por una funda, que se extiende unos dos metros fuera de la caja.
      NOTA: La altura de la caja debe ser suficiente para evitar la flexión de las fibras ópticas y la atenuación óptica que pueda causarse.
    8. Ensamble la caja hueca para que el haz de fibras pase a través de la abertura dedicada de la carcasa.
    9. Coloque las extremidades proximales de las fibras ópticas juntas en un conector macho impreso en 3D, lo que permite la conexión a la parte de la fuente de luz (conector hembra).
      NOTA: Este conector no debe requerir la necesidad de pegamento para evitar la atenuación ligera que este pegamento puede causar.
    10. Coloque el espaciador de 96 pocillos en la caja hueca.
    11. Cree una pantalla insertando un papel de calco entre una placa de PMMA transparente (cara inferior) y una hoja de mylar a prueba de arañazos (cara superior) para difundir el haz estrecho entregado en cada extremo distal de fibra óptica en un haz tan grande como el diámetro del pocillo de la placa de 96 pocillos utilizada para ensayos biológicos.
    12. Construya el marco de la pantalla en impresión 3D (cuadro rojo en la Figura 2) para que su abertura central encaje exactamente con el tamaño de la placa de 96 pocillos utilizada para los ensayos biológicos y, por lo tanto, los pocillos se alineen perfectamente con las aberturas circulares del espaciador de 96 pocillos.
    13. Fije la pantalla a la parte superior del espaciador de 96 pocillos con el marco de la pantalla.

figure-protocol-2
Figura 2: Vistas tridimensionales de la parte del distribuidor de luz. Adaptado de Lefebvre, A. et al.30. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. 

  1. Ensamblaje de la parte de la fuente de luz con la parte del distribuidor de luz
    1. Enchufe el conector macho de la parte del distribuidor de luz en el conector hembra de la parte de la fuente de luz.
      NOTA: Una vez que el conector macho está enchufado al hembra, el haz de luz entregado por la parte de la fuente de luz debe cubrir un poco más que el área de superficie del elemento receptor de luz de la parte distribuidora de luz, asegurando así el suministro de luz a las 96 fibras ópticas.

2. Ensayos biológicos

  1. Proceso de cultivo celular
    1. Cultivar la línea celular de hepatocarcinoma HepG2 en medio RPMI 1640 suplementado con un 10% de suero bovino inactivado por calor y un 1% de estreptomicina y penicilina.
    2. Mantener los matraces de cultivo que contienen células HepG2 en una incubadora de cultivo celular deCO2 al 5% a 37 °C.
    3. Cambiar el medio de cultivo cada 3 días aspirando el medio de cultivo de los matraces y sustituyéndolo por un medio de cultivo RPMI 1640 previamente calentado a 37 °C.
    4. Use un microscopio para verificar la confluencia de las células en los matraces de cultivo hasta que alcancen una confluencia del 80% al 90%.
  2. Proceso de siembra
    1. Retire las células de la incubadora y colóquelas debajo de la estación de seguridad microbiológica previamente limpiada.
    2. Retire el medio de cultivo de los matraces de cultivo.
    3. Lave los matraces de cultivo con una solución tampón de fosfato.
    4. Aplicar 3 ml de tripsina (0,25%, 0,53 mM) a las células y colocar los matraces de cultivo en la incubadora a 37 °C durante 5 min para separar las células.
    5. Después de 5 min, recupere la tripsina de los matraces de cultivo con 7 mL de medio de cultivo y recupere toda la solución de medio + tripsina + células en un tubo de 15 mL.
    6. Cuente las celdas usando un contador de celdas. Para hacer esto, tome 20 μL de la solución que contiene las células y colóquela en un tubo. Agregue 20 μL de solución azul de tripano y coloque la solución de celda + azul de tripano en el portaobjetos de recuento e insértelo en el contador de células.
    7. Una vez que se han contado las células, diluirlas en medio de cultivo para obtener una solución de 150,000 células/ml y sembrar las células en una placa blanca de 96 pocillos con un fondo plano transparente a una velocidad de 1.5x104 células/pocillo. El color blanco tiene como objetivo maximizar la reflexión y distribución de la luz dentro de los pozos.
      NOTA: El número de células por pocillo debe ajustarse de acuerdo con la línea celular utilizada. Es posible que se requiera una prueba de densidad previa para encontrar el número correcto de células para sembrar.
    8. Prepare dos platos para cada tiempo de lectura de viabilidad. Una placa se iluminará y otra permanecerá oscura.
    9. Incube las placas durante 24 h antes del tratamiento para permitir la adhesión celular.
  3. Tratamiento de rosa de Bengala
    1. Prepare una solución madre de Rosa de Bengala reconstituyendo el polvo de Rosa de Bengala en solución salina al 10%. Esta solución debe prepararse justo antes del tratamiento celular para evitar cualquier degradación de la rosa de Bengala debido a su estabilidad.
    2. Preparar soluciones de rosa de Bengala a concentraciones crecientes (0 μM, 5 μM, 10 μM, 25 μM, 50 μM, 75 μM, 100 μM) diluyendo la solución madre de rosa de Bengala previamente preparada en el medio de cultivo celular.
    3. Una vez preparadas las soluciones, retirar el medio de cultivo de las placas que contienen las células y añadir 100 μl de soluciones de tratamiento con Rosa de Bengala.
    4. Incubar las células con tratamiento con Rosa de Bengala durante 2 h para permitir la internalización de la Rosa de Bengala.
      NOTA: El tiempo de incubación de la solución de rosa de Bengala puede diferir según la línea celular utilizada. Es posible que sea necesario ajustar la cinética de la incorporación de Rose Bengal mediante la medición de fluorescencia para encontrar el tiempo de incubación adecuado para cada línea celular estudiada.
    5. Después de 2 h, retire las soluciones de Rosa de Bengala, lave las células dos veces con PBS y agregue 100 μL/pocillo de medio de cultivo sin Rosa de Bengala.
      NOTA: Es posible que se necesiten lavados adicionales con PBS para concentraciones más altas de rosa de Bengala. Se puede realizar una comprobación visual para asegurarse de que las células se han lavado correctamente. Una vez suficientemente enjuagado, el PBS no debe adquirir un color rosado debido a la rosa de Bengala presente fuera de las celdas.
    6. Cubra las microplacas con papel de aluminio para protegerlas de la exposición a la luz. Ilumine la mitad de las placas para el ensayo PDT (consulte el paso 2.4). Las placas no iluminadas proporcionarán datos de control para los resultados de PDT (condición de oscuridad). También proporcionarán datos sobre el impacto de la rosa de Bengala no fotoactivada en la viabilidad celular. Las otras microplacas se utilizarán para la exposición a la luz en el dispositivo (condición PDT).
  4. Procedimiento de funcionamiento del dispositivo CELL-LED-550/3
    1. Conecte el conector macho del distribuidor de luz al conector hembra de la fuente de luz. Luego enchufe la fuente de luz en un tomacorriente.
    2. Retire dos microplacas (PDT + condición oscura) de la incubadora, retire el aluminio para la condición PDT y coloque esta placa en el distribuidor de luz.
    3. Ajuste el atenuador del controlador a su nivel máximo para maximizar la potencia entregada por el LED y obtener una irradiancia promedio de 0.62 mW / cm2 en los 96 pocillos.
      NOTA: El atenuador del controlador debe ajustarse al valor más apropiado para los ensayos biológicos (entre los tres disponibles). Cualquiera que sea el atenuador del controlador, la baja irradiancia entregada no requiere el uso de gafas de seguridad.
    4. Ilumine la placa hasta alcanzar la dosis deseada de luz en las celdas. Para obtener la dosis de luz deseada, se pueden ajustar dos parámetros, Tiempo e Irradiancia, refiriéndose a la siguiente ecuación:
      Dosis de luz (J / cm2 ) = Irradiancia (W / cm2) × Tiempo (s) (ecuación 1).
      La irradiancia se puede modular ajustando el atenuador del controlador para obtener 0,02 mW / cm2, 0,23 mW / cm2 o 0,62 mW / cm2, respectivamente. A partir de la irradiancia elegida, la ecuación 1 se puede utilizar para calcular el tiempo de iluminación necesario para lograr la dosis de luz objetivo.
    5. Una vez alcanzada la dosis de luz deseada, apague el dispositivo. Sustituya la microplaca PDT en aluminio y devuélvala a la incubadora con la placa de control hasta que se realice la prueba de viabilidad.
    6. OPCIONAL: Ilumine las otras placas si es necesario, utilizando el mismo procedimiento descrito anteriormente.
  5. Ensayo de viabilidad celular
    1. Después del ensayo de TFD, deje la placa iluminada en la incubadora durante 24 h antes de medir el impacto de la TFD en las células iluminadas midiendo su viabilidad. El tiempo de incubación se puede variar para estudiar los efectos más o menos a largo plazo de la TFD en las células. Para cada tiempo de incubación posterior a la PDT, se debe incubar una placa no iluminada (condición oscura) durante el mismo período.
    2. Después del período de incubación, tome una placa iluminada y otra no iluminada y agregue 100 μL de reactivo del kit de ensayo de viabilidad celular en cada pocillo para medir la viabilidad celular en función del metabolismo mitocondrial y la producción de ATP por parte de las células.
    3. Incube la placa múltiple en la oscuridad durante 10 minutos antes de la medición de la viabilidad celular.
    4. Después de 10 minutos de incubación, lea la luminiscencia emitida en cada pocillo con un lector multimodal. La luminiscencia emitida es proporcional a la producción de ATP por las células vivas en el momento de la adición de la solución de ensayo de viabilidad celular.
    5. Considere el valor de luminiscencia de la condición no tratada (NT) como 100% de viabilidad y normalice los valores de luminiscencia de las condiciones tratadas a la condición NT para obtener el porcentaje de viabilidad inducido por cada tratamiento.
    6. Repita el mismo protocolo de lectura de viabilidad celular para cada tiempo de lectura posterior al tratamiento con PDT (p. ej., 24 h, 48 h y 72 h después del tratamiento).

Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Como se muestra en la Figura 3, el dispositivo CELL-LED-550/3 permite la iluminación homogénea, desde abajo, de una placa de 96 pocillos con luz verde de 550 nm.

figure-results-1
Figura 3: Imágenes del dispositivo CELL-LED-550/3 durante una iluminación ilustrativa de una placa de 96 pocillos cuando la luz de la habitación está encendida (A) o apagada (B). Adaptado de Lefebvre, A. et al.30. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. 

Cada pozo se ilumina individualmente y lejos del LED único (hasta dos metros) mediante el uso de un haz de fibras ópticas (Figura 4).

figure-results-2
Figura 4: El haz de fibra óptica permite la iluminación individual de los pocillos de una placa de 96 pocillos lejos del LED único. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. 

Para establecer la eficacia del dispositivo CELL-LED-550/3, se evaluó su capacidad para inducir TFD mediada por RB en la línea celular de hepatocarcinoma HepG2. Las células se trataron con concentraciones crecientes de rosa de Bengala, que oscilaban entre 0 y 100 μM durante 2 h antes de la iluminación. El uso de tal rango de concentraciones tenía como objetivo determinar la dosis efectiva (EC50) de Rosa de Bengala que mataría las células HepG2 cuando se exponen a la luz verde. También se estudió el impacto de la dosis de luz administrada por el dispositivo CELL-LED-550/3 en la inducción de la muerte celular en células HepG2. Para ello, las células se expusieron a la luz durante 8 min 9 s, 16 min 18 s o 32 min 36 s a una intensidad de 0,62 mW/cm2 para obtener dosis de luz de 0,30 J/cm2, 0,60 J/cm2 y 1,22 J/cm2, respectivamente.

En primer lugar, se observó que la iluminación por sí sola, en ausencia de rosa de Bengala (condición de luz, Figura 5), no tuvo ningún efecto sobre la viabilidad de las células HepG2, independientemente de la dosis de luz recibida. También se observó que la rosa de Bengala sola, en ausencia de luz (condición RB, Figura 5), no indujo ningún cambio en la viabilidad celular para ninguna de las condiciones probadas. Por el contrario, los resultados muestran que la PDT mediada por RB que usa CELL-LED-550/3 es capaz de matar las células HepG2. Además, se observó una mayor eficacia en correlación con el aumento de la dosis de luz, con una concentración máxima efectiva (CE50) de 34,3 μM para una dosis ligera de 0,30 J/cm2, 26,6 μM para una dosis de 0,60 J/cm2 y 6,8 μM para una dosis de 1,2 J/cm2.

Estos resultados confirmaron la efectividad de este nuevo dispositivo PDT para la PDT mediada por RB (Figura 5).

figure-results-3
Figura 5: Eficacia del dispositivo en relación con la viabilidad de la línea celular HepG2. Porcentaje de viabilidad 24 h después del tratamiento de HepG2. NT, no tratado; RB, solo fotosensibilizador (0 μM, 5 μM, 10 μM, 25 μM, 50 μM, 75 μM y 100 μM); luz, iluminación para 0,30 J/cm2, 0,60 J/cm2 y 1,22 J/cm2; PDT, iluminación con tratamiento RB. Los resultados se presentan como medias ± SEM de tres experimentos independientes, expresados como un porcentaje del NT. Se realizó una prueba ANOVA de dos vías, con p ≤ 0,01 (**); p ≤ 0,0001 (****) considerándose estadísticamente significativo, y p ≥ 0,05 considerado no significativo (NS). Adaptado de Lefebvre, A. et al.30. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. 

Discusión

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este artículo describe tanto el protocolo para desarrollar un dispositivo de iluminación innovador dedicado a la TFD mediada por RB in vitro como el protocolo para implementar una prueba de concepto para el dispositivo CELL-LED-550/3, así desarrollado30.

CELL-LED-550/3 consta de dos partes, cada una con una función específica. El objetivo de la primera parte, denominada parte de la fuente de luz, es generar, a partir de un solo LED, un haz de luz verde homogéneo con un diámetro superior al del haz de fibras ópticas de la segunda parte. Esta última, denominada parte distribuidora de luz, tiene como objetivo distribuir, a través del haz de fibras ópticas, la luz suministrada por la parte de la fuente de luz a los pocillos de una placa de 96 pocillos individualmente y lejos del LED. A una distancia del LED de hasta 2,5 m, las celdas se pueden iluminar todo el tiempo que sea necesario sin ningún riesgo de efectos térmicos nocivos que puedan surgir debido al calor incontrolado generado dentro del LED.

Esta característica ofrece una primera ventaja significativa de CELL-LED-550/3 sobre los otros sistemas basados en LED diseñados específicamente para la iluminación de placas de 96 pocillos 31,32,33,34,35,36. De hecho, todos los demás sistemas implican un posicionamiento de los LED a solo unos centímetros por debajo de las celdas (generalmente por debajo de 5 cm), lo que es insuficiente para eliminar el riesgo de efectos térmicos nocivos relacionados con el LED para las celdas. Para limitar este riesgo, la mayoría de estos otros sistemas (desafortunadamente, algunos no lo hacen) incluyen un sistema de enfriamiento LED 32,34,35 a veces colocado muy (demasiado) cerca de las celdas, que luego puede verse afectado de manera contraproducente por las fluctuaciones térmicas resultantes. El diseño del dispositivo CELL-LED-550/3 en dos partes proporciona otra ventaja significativa sobre la mayoría de los otros sistemas basados en LED existentes 31,32,33,35,36: esto permite iluminar las células dentro de una incubadora de cultivo celular sin ningún riesgo para el dispositivo. La parte del distribuidor de luz, que no incluye componentes electrónicos, se puede colocar dentro de la incubadora, mientras que la parte de la fuente de luz, que incluye componentes electrónicos sensibles a ambientes húmedos, se mantiene afuera para evitar el riesgo de corrosión o falla. Algunos sistemas existentes basados en LED, incluidos los componentes electrónicos, permiten una iluminación dentro de una incubadora, pero tal uso, en primer lugar, no es recomendado por los diseñadores / fabricantes y, en segundo lugar, requiere un secado "adecuado" después del uso33,34. La capacidad de iluminar las células dentro de una incubadora y, por lo tanto, mantener las células en las mismas condiciones fisiológicas (temperatura, humedad y concentración deCO2) durante el protocolo es crucial para evitar posibles sesgos en la evaluación de la viabilidad celular después de la TFD, especialmente para protocolos que requieren largos tiempos de iluminación. También hay que destacar que el dispositivo CELL-LED-550/3 incluye un único LED para iluminar los 96 pocillos de forma individual y simultánea. Esta característica original e innovadora no está disponible con ninguno de los otros sistemas basados en LED mencionados anteriormente 31,32,33,34,35,36. La mayoría de estos sistemas incluyen 96 LED, con un LED colocado debajo de cada pozo y, por lo tanto, entregan 96 haces individuales 31,33,34,36 mientras que los sistemas restantes entregan, de 6 a 25 LED colocados a unos pocos centímetros de la placa del pozo, un haz global que cubre todo o parte de los pozos 31,32,35. Según la literatura, nunca antes se había propuesto generar 96 haces individuales a partir de un solo LED, como lo hace CELL-LED-550/3 mediante el uso de un haz de fibra óptica.

La parte de la fuente de luz incluye un LED de 550 nm y 3 W seleccionado según dos criterios principales. En primer lugar, el espectro de emisión del LED (y, por lo tanto, su longitud de onda central) debe superponerse al espectro de absorción del fotosensibilizador RB. Tal superposición, que se logra perfectamente con el LED seleccionado (longitud de onda central: 554,4 nm; FWHM: 106,4 nm; ambos estimados siguiendo la metodología descrita en Lefebvre et al.30) (Figura 6), es esencial para la fotoactivación de RB y, por lo tanto, para la inducción de una TFD mediada por RB. En segundo lugar, la potencia óptica del LED debe ser inferior a 5 W. Esta limitación de potencia viene impuesta por la potencia admisible de la lente colimadora incluida en la parte de la fuente de luz y por la del haz de fibras ópticas incluido en la parte del distribuidor de luz.

figure-discussion-1
Figura 6: Espectro de absorción de la rosa de Bengala en agua. El espectro de absorción máximo normalizado de Rose Bengal en agua se traza de acuerdo con el eje izquierdo, y la irradiancia espectral media de CELL-LED-550/3 se escala de acuerdo con el eje derecho. El perfil de la irradiancia espectral media es consistente con el del LED disponible en el sitio web del fabricante. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. 

El acoplamiento óptico entre las dos partes del dispositivo es un factor crítico. Este acoplamiento tiene como objetivo, por un lado, recoger el máximo de la luz emitida por el LED de 3 W en un haz estrecho y, por otro lado, inyectar este haz en el haz de fibra óptica. En cuanto al primer objetivo, una lente de colimación asférica con una distancia focal corta, diseñada específicamente para LED montado en PCB (placa de circuito impreso), permite concentrar el haz LED de 120 grados en un haz estrecho de 10 grados con una distribución espacialmente uniforme. El haz resultante, además, proyecta imágenes del chip LED cuadrado, que exhiben una claridad mejorada y aberraciones ópticas reducidas en comparación con las obtenidas con el haz inicial. En cuanto a la inyección de este haz estrecho en el haz de fibras ópticas, es necesario abordar cuatro puntos importantes. Primero, las extremidades proximales de las 96 fibras ópticas de PMMA (polimetilmetacrilato) de 0,5 mm de diámetro (apertura numérica: 0,2) se juntan en un conector casero para formar una superficie cuadrada receptiva a la luz de lados de 5 mm (Figura 7). Se prefirió una forma cuadrada, en línea con las proyecciones cuadradas del chip LED por el haz, a la redonda habitual para el conector para limitar la pérdida de luz. En segundo lugar, el conector casero fue diseñado para no requerir pegamento e impreso en 3D con una resina cristalina para limitar la absorción de luz y, por lo tanto, evitar el sobrecalentamiento / carbonización del material. En tercer lugar, la superficie receptiva a la luz, así como la superficie final del conector, se pulieron con una rueda de pulido para que la máxima luz pase a través de ellos. En cuarto y último lugar, se determinó teóricamente la distancia entre la lente y la superficie cuadrada receptora de luz y luego se ajustó en un banco óptico para que la parte central más homogénea de la proyección LED cuadrada se superponga un poco más que la superficie receptora de luz.

Con dicho acoplamiento, se obtiene una potencia de 1,25 W para el haz estrecho de 10 grados, mientras que la potencia total transmitida por el haz de 96 fibras ópticas es de 0,12 W (se utilizó un sensor de fotodiodo adecuado para luz LED (OPHIR)).

figure-discussion-2
Figura 7: Superficie cuadrada receptiva a la luz obtenida al reunir las 96 fibras ópticas en un conector casero. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. 

CELL-LED-550/3 ofrece una irradiancia media de 0,62 mW/cm2 (desviación estándar: 0,09 mW/cm2) (Figura 8) en la superficie exterior inferior de los pocillos. Este valor medio, que tiene en cuenta la eficiencia de acoplamiento mencionada, se estimó y demostró ser estable en el tiempo (coeficiente de variación inferior al 0,6%) de acuerdo con las metodologías descritas en detalle en Lefebvre y al.30. Con una irradiancia tan baja (más baja que las proporcionadas por los otros sistemas basados en LED mencionados anteriormente diseñados específicamente para la iluminación de placas de 96 pocillos), se ha demostrado que la iluminación por sí sola no tiene ningún efecto sobre la viabilidad de la célula HepG2, mientras que se ha alcanzado una eficiencia muy alta para la PDT mediada por RB. Para los protocolos PDT que requieren irradiancias más altas para garantizar la eficiencia, se podrían usar múltiples LED y, por lo tanto, se podrían implementar múltiples partes de la fuente de luz, siempre que la potencia de luz inyectada en cada fibra óptica no exceda la potencia admisible de algunas docenas de milivatios.

figure-discussion-3
Figura 8: Histograma que representa la distribución de las irradiancias entregadas a los 96 pocillos de una placa. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. 

La sustitución de solo el LED en la parte de la fuente de luz por otro adecuado permite obtener otro dispositivo CELL-LED. Un LED se considerará adecuado si emite una potencia óptica inferior a 5 W (por las razones mencionadas anteriormente) en el rango visible (según las especificaciones del haz de fibras ópticas). Como existe un número significativo de estos LED, se podría desarrollar una amplia variedad de dispositivos CELL-LED y, por lo tanto, se podrían evaluar in vitro muchos protocolos PDT. Dado un protocolo PDT, el LED que proporciona la mejor superposición con el espectro de absorción del fotosensibilizador considerado obviamente debe ser preferido entre todos los LED adecuados. En el caso de un cambio de LED, se debe prestar especial atención al conjunto del disipador de calor del ventilador. De hecho, este conjunto debe tener el tamaño adecuado para evitar el sobrecalentamiento y la posterior degradación tanto del LED como del controlador. Además, se requerirá una nueva caracterización óptica y térmica para cualquier cambio de LED.

Tanto la posibilidad de fotoactivar la mayoría de los fotosensibilizadores mediante la simple sustitución de un solo LED, como la posibilidad de iluminar las células dentro de una incubadora proporcionan un valor añadido real a este dispositivo en comparación con los existentes.

Divulgaciones

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores desean agradecer al Hospital Central de Lille, Francia, y al INSERM por su apoyo a nuestro estudio.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
550  nm 3  W LED montado en una placa de circuito impreso OSRAMOSTAR KP CSLPM1. F1
Matraz de células de cultivo de 75 cm2Sarstedt3911002
Paquete de 100 fibras ópticas de plástico (0,5 mm de diámetro)ARCENCIEL LEDfibre05egmExtremo luminoso PMMA 0,5 dia - Lng  200 m       http://arcenciel-led.fr/accueil/193-fibre-optique-end-glow-05mm-prix-au-m.html
Contador de célulasThermoFisherAMQAF2000Opcional, puede contar con micrcoscopio
Incubadora de cultivos celularesPHCI (Dutscher)MCO-170AICUVD-PE
Título de celda GloPromegaG7571
Lente de colimación de PMMA transparenteTienda GleccLente de 14mm 10&grados;Aliexpress - Lente colimadora DEL con soporte de 14 mm
Colorfab Ngen NegroColorfab  020014 de SKUCumplimiento de contacto con alimentos de la FDA
Colorfab Ngen BlancoColorfab  020013 SKUCumplimiento de contacto con alimentos de la FDA
Controlador actual con atenuación de tres modos (controlador CDM)Controlador CDMBD392200 mA
Resina epoxiClé opatreDiamante de cristalDiamante Cristal 150 mL
Conjunto de disipador de calor del ventiladorBOYD
Células HepG2ATCCHB-8065
Lector multimodal (CLARIOstar Plus)BMG Labtech430-2927
Solución tampón de fosfatoThermoFisher20012-068
Fibras ópticas de PMMA (polimetilmetacrilato) (apertura numérica: 0,2)Guangzhou Mayki Lighting Limited
Conector de alimentaciónRSpro907-5680
RMPI 1640ThermoFisher21875-091
Interruptor basculante RSpro419-744
Rosa BengalaThermoFisher / MerckA17053.14 / 330000-1G
Lámina de mylar resistente a los arañazosRSproRS: 785-0802
VainaAUPROTECTØ 8,5 mm / Ø extensión 11 mmPP Polipropiloè ne Funda corrugada negra a prueba de rayos UV no dividida
SVFEurobioCVF SVF00-01
Papel de calcoCanson79368730
Placa de PMMA transparenteRSproRS: 284-6269
Azul de tripanoThermoFisher15250061
TripsinaThermoFisher25200-072
Ultimaker 2+Creador de ultisurf
placa blanca transparente de 96 pocillosDutscher655098

Referencias

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Sung, H., et al. Global Cancer Statistics 2020: GLOBOCAN Estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA Cancer J Clin. 71 (3), 209-249 (2021).
  2. Llovet, J. M., et al. Hepatocellular carcinoma. Nat Rev Dis Primer. 7 (1), 1-28 (2021).
  3. Erstad, D. J., Tanabe, K. K. Hepatocellular carcinoma: Early-stage management challenges. J Hepatocell Carcinoma. 4, 81-92 (2017).
  4. Tabori, N. E., Sivananthan, G. Treatment options for early-stage hepatocellular carcinoma. Semin Intervent Radiol. 37 (5), 448-455 (2020).
  5. Tsuchiya, N., et al. Biomarkers for the early diagnosis of hepatocellular carcinoma. World J Gastroenterol. 21 (37), 10573-10583 (2015).
  6. Puisieux, M. F., et al. Therapeutic management of advanced hepatocellular carcinoma: An updated review. Cancers. 14 (10), 2357(2022).
  7. Morton, C. A., et al. European dermatology forum guidelines on topical photodynamic therapy 2019 Part 1: treatment delivery and established indications - actinic keratoses, Bowen's disease and basal cell carcinomas. Eur Acad Dermatol Venereol. 33 (12), 2225-2238 (2019).
  8. Plaetzer, K., Krammer, B., Berlanda, J., Berr, F., Kiesslich, T. Photophysics and photochemistry of photodynamic therapy: Fundamental aspects. Lasers Med Sci. 24 (2), 259-268 (2009).
  9. Agostinis, P., et al. Photodynamic therapy of cancer: An update. CA Cancer J Clin. 61 (4), 250-281 (2011).
  10. Castano, A. P., Demidova, T. N., Hamblin, M. R. Mechanisms in photodynamic therapy: Part two-cellular signaling, cell metabolism and modes of cell death. Photodiagnosis Photodyn Ther. 2 (1), 1-23 (2005).
  11. Krammer, B. Vascular effects of photodynamic therapy. Anticancer Res. 21 (6B), 4271-4277 (2001).
  12. Falk-Mahapatra, R., Gollnick, S. O. Photodynamic therapy and immunity: An Update. Photochem Photobiol. 96 (3), 550-559 (2020).
  13. Mosaddad, S. A., et al. Photodynamic therapy in oral cancer: A narrative review. Photobiomodul Photomed Laser Surg. 41 (6), 248-264 (2023).
  14. Guidolin, K., et al. Photodynamic therapy for colorectal cancer: A systematic review of clinical research. Surg Innov. 29 (6), 788-803 (2022).
  15. Osuchowski, M., Bartusik-Aebisher, D., Osuchowski, F., Aebisher, D. Photodynamic therapy for prostate cancer - A narrative review. Photodiagnosis Photodyn Ther. 33, 102158(2021).
  16. Gustalik, J., Aebisher, D., Bartusik-Aebisher, D. Photodynamic therapy in breast cancer treatment. J Appl Biomed. 20 (3), 98-105 (2022).
  17. Domka, W., et al. Photodynamic therapy in brain cancer: mechanisms, clinical and preclinical studies and therapeutic challenges. Front Chem. 11, 1250621(2023).
  18. Crous, A., Abrahamse, H. Photodynamic therapy of lung cancer, where are we. Front Pharmacol. 13, 932098(2022).
  19. Calzavara-Pinton, P. G., et al. Methylaminolaevulinate-based photodynamic therapy of Bowen's disease and squamous cell carcinoma. Br J Dermato. 159 (1), 137-144 (2008).
  20. Basset-Seguin, N., et al. Topical methyl aminolaevulinate photodynamic therapy versus cryotherapy for superficial basal cell carcinoma: A 5 year randomized trial. Eur J Dermatol. 18 (5), 547-553 (2008).
  21. Szeimies, R. M., et al. A clinical study comparing methyl aminolevulinate photodynamic therapy and surgery in small superficial basal cell carcinoma (8-20 mm), with a 12-month follow-up. J Eur Acad Dermatol Venereol. 22 (11), 1302-1311 (2008).
  22. The IMmunotherapy Pleural 5-ALA PDT. , ClinicalTrials.gov. At https://clinicaltrials.gov/study/NCT04400539 (2025).
  23. Blue-Light Photodynamic Therapy and Sonidegib for Multiple Basal Cell Carcinomas. , ClinicalTrials.gov. At https://clinicaltrials.gov/study/NCT06623201 (2025).
  24. Neoadjuvant PDT in the Treatment of Cholangiocarcinoma. , ClinicalTrials.gov. At https://clinicaltrials.gov/study/NCT04824742 (2025).
  25. Correia, J. H., Rodrigues, J. A., Pimenta, S., Dong, T., Yang, Z. Photodynamic therapy review: principles, photosensitizers, applications, and future directions. Pharmaceutics. 13 (9), 1332(2021).
  26. Bartusik-Aebisher, D., Ożóg, Ł, Domka, W., Aebisher, D. Rose Bengal and future directions in larynx tumor photodynamic therapy. Photochem Photobiol. 97 (6), 1445-1452 (2021).
  27. Srivastav, A. K., et al. Photosensitized rose Bengal-induced phototoxicity on human melanoma cell line under natural sunlight exposure. J Photochem Photobiol. B, Biology. 156, 87-99 (2016).
  28. Uddin, M. M. N., et al. Encapsulated Rose Bengal enhances the photodynamic treatment of triple-negative breast cancer cells. Molecules (Basel, Switzerland). 29 (2), 546(2024).
  29. Osuchowski, M., et al. Photodynamic therapy-adjunctive therapy in the treatment of prostate cancer. Diagnostics (Basel, Switzerland. 12 (5), 1113(2022).
  30. Lefebvre, A., et al. Photodynamic therapy using a Rose-Bengal photosensitizer for hepatocellular carcinoma treatment: Proposition for a novel green LED-based device for in vitro investigation. Biomedicines. 12 (9), 2120(2024).
  31. Bounds, A. D., Bailey, R. D., Adams, C. T., Callaghan, D. C., Girkin, J. M. LightBox: A multi-well plate illumination system for photoactive molecule characterization. J Biophotonics. 14 (5), e202000481(2021).
  32. Zhang, K., Timilsina, S., Waguespack, M., Kercher, E. M., Spring, B. Q. An open-source LED array illumination system for automated multi-well plate cell culture photodynamic therapy experiments. Sci Rep. 12 (1), 1-10 (2022).
  33. optoWELL. , opto biolabs. at https://optobiolabs.com/products/optowell/ (2025).
  34. Repina, N. A., et al. Engineered illumination devices for optogenetic control of cellular signaling dynamics. Cell Rep. 31 (10), 107737(2020).
  35. Hopkins, S. L., et al. An in vitro cell irradiation protocol for testing photopharmaceuticals and the effect of blue, green, and red light on human cancer cell lines. Photochem Photobiol Sci. 15 (5), 644-653 (2016).
  36. Hadis, M. A., et al. Development and application of LED arrays for use in phototherapy research. J Biophotonics. 10 (11), 1514-1525 (2017).

Reimpresiones y permisos

Solicitar permiso para reutilizar el texto o las figuras de este artículo de JoVE

Solicitar permiso

Etiquetas

Photodynamic TherapyRose BengalLED Illumination DeviceIn Vitro PDTHepG2 CellsCell Viability Assay96 Well PlatePhotosensitizer ApplicationGreen Light IrradiationCancer Cell Treatment

Artículos relacionados