Modelado de la infección persistente por Pseudomonas aeruginosa en larvas de pez cebra heridas

Resumen

En la actualidad hay una falta de modelos in vivo susceptibles de cribado de fármacos contra infecciones bacterianas crónicas. En este trabajo se describe un protocolo para la infección de heridas por un aislado clínico de Pseudomonas aeruginosa para generar una infección persistente en larvas de pez cebra.

Resumen

Pseudomonas aeruginosa es un patógeno humano importante, particularmente en infecciones crónicas de heridas e infecciones pulmonares crónicas (especialmente en pacientes con fibrosis quística (FQ)). Las infecciones bacterianas crónicas son refractarias a los tratamientos con antibióticos y existe una necesidad urgente de modelos de infección crónica in vivo susceptibles de cribado de fármacos para desarrollar terapias eficaces. En este trabajo se describe un protocolo de infección por un aislado clínico de P. aeruginosa de un paciente con FQ, que expresa constitutivamente la Proteína Verde Fluorescente (GFP), para generar una infección persistente de la herida en larvas de pez cebra. Los embriones lesionados en la aleta caudal se sumergen en una suspensión bacteriana durante 1,5 h, se lavan y se monitorea la carga bacteriana durante 3 días. La carga bacteriana se cuantificó diariamente mediante el recuento de unidades formadoras de colonias fluorescentes (UFC) de larvas infectadas lisadas, lo que permitió una infección persistente. Además, la bacteria P. aeruginosa persistente fue refractaria al tratamiento antibiótico. Este novedoso modelo in vivo de infección persistente por P. aeruginosa ofrece oportunidades para evaluar la eficacia de tratamientos innovadores contra infecciones crónicas.

Introducción

Pseudomonas aeruginosa es una bacteria patógena gramnegativa responsable de la colonización crónica en pacientes con fibrosis quística (FQ) y heridas ^1,2. P. aeruginosa pertenece al grupo de los patógenos ESKAPEE y es reconocido por la Organización Mundial de la Salud como una prioridad crítica para nuevas terapias³. Las infecciones bacterianas crónicas son difíciles de tratar con antibióticos debido a la resistencia adaptativa a los medicamentos, que está relacionada con múltiples factores, incluido el estilo de vida de la biopelícula, la reducción del crecimiento, la baja actividad metabólica⁴, así como el ciclo de vida intracelular⁵. Los modelos in vivo son esenciales para comprender y tratar mejor la infección crónica por P. aeruginosa.

Si bien se han utilizado varios modelos in vivo para evaluar la virulencia de P. aeruginosa , muy pocos modelos permitieron imitar la colonización persistente y probar la eficacia de los tratamientos contra la infección crónica⁶. Los modelos animales para estudiar la patogenia crónica de P. aeruginosa se basan principalmente en la administración de las bacterias incrustadas en las perlas de agar en los pulmones⁷. También se ha desarrollado un modelo murino de infección cutánea crónica⁸. El pez cebra (Danio rerio), que presenta numerosas ventajas (cuestiones éticas moderadas, bajo costo, alta producción de huevos), es un atractivo modelo de vertebrados in vivo para pruebas de fármacos, que también permite la visualización en tiempo real de alta resolución de P. aeruginosa y células huésped gracias a la transparencia embrionaria⁹.

Como se informó en una revisión, en estudios previos las cepas de laboratorio de P. aeruginosa (PAO1, PA14 y PAK) se utilizaron principalmente en el modelo de infección por pez cebra, donde causaron una infección aguda⁹. Recientemente hemos desarrollado un protocolo de infección de heridas basado en la inmersión de embriones amputados con aletas caudales con cepa PAO1 de P. aeruginosa , que provocó una infección aguda¹⁰. La infección por inmersión de embriones lesionados, que refleja un modo de infección natural de P. aeruginosa, es un modo de infección reproducible y más fácil que la microinyección.

Nuestro objetivo fue establecer un protocolo de infección persistente por P. aeruginosa en pez cebra. Para ello, nuestra estrategia fue utilizar cepas clínicas de P. aeruginosa, que han sido raramente consideradas en el modelo de pez cebra^11,12, combinadas con la vía de infección de la herida. En este trabajo describimos el protocolo que hemos desarrollado para modelar la colonización persistente de embriones de pez cebra a partir de una infección de herida por aislados clínicos de P. aeruginosa CF. Este novedoso modelo in vivo cumple con nuestras expectativas y ofrece nuevas oportunidades para evaluar la eficacia de la terapéutica en el contexto de la colonización persistente, como se describe aquí y en un artículo complementario¹³.

Protocolo

Todos los experimentos con pez cebra descritos en el presente estudio se llevaron a cabo en la Universidad de Montpellier siguiendo los principios de las 3R -Reemplazo, Reducción y Refinamiento- de acuerdo con las directrices de la Unión Europea para el manejo de animales de laboratorio y fueron aprobados por la Dirección Sanitaria y Veterinaria del Hérault y el Comité d'Ethique pour l'utilisation d'animaux à des fins scientifiques bajo la referencia CEEA-LR-B4-172-37. Todos los experimentos de infección se llevaron a cabo en embriones hasta 5 días después de la fertilización. La cría de pez cebra adulto (Danio rerio) a partir de los peces AB o Golden Lines se adhirió a las directrices internacionales especificadas por la Directiva de Protección Animal de la UE 2010/63/UE. Instalación de pez cebra de la Universidad de Montpellier con condiciones estándar establecidas como un ciclo de luz: oscuridad de 12 h:12 h, tanque de policarbonato de 3,5 L (máximo 22 peces por tanque) conectado a un sistema de recirculación con 4% de salinidad/conductividad de 400 μS y temperatura del agua de 28 °C. Los peces fueron alimentados 2 veces al día con comida para peces.

1. Preparación de soluciones

1. Prepare una solución de trabajo 1x para agua de peces con o sin azul de metileno para el crecimiento de embriones de pez cebra (ver Tabla 1).
2. Prepare 20 veces el caldo (0,4%) y 1 solución anestésica de Tricaine que funcione, como se describe en la Tabla 1. Para evitar la congelación y descongelación repetidas de la solución madre, prepare 10 ml de alícuotas de 20x Tricaine y almacene a -20 °C.
3. Prepare una solución de Triton al 2% diluida en 1x solución salina tamponada con fosfato (PBS; Tabla 1).

2. Preparación de inóculo de  P. aeruginosa fluorescente que expresa GFP constitutivamente

NOTA: Todos los trabajos con P. aeruginosa se realizan con precauciones BSL-2 en una cabina de bioseguridad. Las cepas de P. aeruginosa deben modificarse genéticamente para que expresen constitutivamente un indicador fluorescente, como la GFP (como se usa aquí y se describe en¹³). Se recomienda encarecidamente el uso de cepas con un indicador fluorescente codificado cromosómicamente para evitar la pérdida de plásmido en el caso de un indicador fluorescente codificado por plásmido.

1. A los 2 días antes de la infección, se debe extraer a -80 °C una reserva de P. aeruginosa genéticamente modificada que expresa GFP en placas de agar LB (Tabla 1) e incubar durante la noche a 37 °C.
2. Comprobar la fluorescencia de las colonias utilizando un microscopio fluorescente (Aumento 6x) para inocular una colonia de GFP⁺P. aeruginosa en 1 mL de caldo LB (Tabla 1) y crecer durante la noche a 37 °C con agitación (180 rpm).
3. El día de la infección, diluir el cultivo nocturno de P. aeruginosa a 1:20 en 5 mL de caldo LB fresco. Cultive las bacterias a 37 °C con agitación (180 rpm) hasta que el cultivo alcance un diámetro exterior de₆₀₀ = 0,8. Esto debería tomar aproximadamente 2-3 h.
4. Centrifugar el cultivo bacteriano durante 10 min a temperatura ambiente (RT) a 3584 x g. Retire el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en 4 mL de agua de pescado sin azul de metileno.
5. Adaptar el volumen de cultivo con agua de peces para tener 7 x 10⁷ a 1 x 10⁸ UFC/mL. Esto corresponde a un DE₆₀₀ de aproximadamente 0,15 (a adaptar para cada cepa).
6. Para cuantificar el inóculo, se realiza una dilución en serie de la suspensión bacteriana, se colocan 20 μL de la dilución ^10-4 en una placa de agar LB y se incuba durante la noche a 37 °C.
7. Cuente las colonias de GFP⁺ bajo un microscopio fluorescente para determinar las UFC del inóculo.

3. Recolección y preparación de embriones de pez cebra

1. A los 3 días antes del experimento de inmersión bacteriana, configure parejas de cría de pez cebra. Coloque un macho y una hembra reproductores en un tanque de cruzamiento.
2. A la mañana siguiente, recoja los huevos después de la fertilización con un colador de malla fina. Coloque los huevos recolectados en una placa de Petri que contenga agua de pescado con azul de metileno.
3. Para evitar la contaminación, agregue 1 gota de lejía a la placa de Petri. Después de 5 minutos, cambie el agua de pescado con azul de metileno para eliminar la lejía.
4. Deseche los huevos con un desarrollo embrionario anormal (los óvulos no fertilizados son similares a una etapa de óvulo de 1 célula) o muertos (apariencia blanca).
5. En la mañana de la infección (a 2 dpf), descorionar los embriones con dos pinzas muy finas bajo el microscopio estereoscópico (aumento 11x). Desgarrar el corion con pinzas sin pellizcar el embrión para liberarlo.
6. Coloque los embriones decorionados en una placa de Petri que contenga pescado con azul de metileno. Incubar las placas a 28 °C hasta la infección.

4. Lesión embrionaria

1. Anestesiar embriones de pez cebra en agua de pescado sin azul de metileno, que contiene 0,02% de tricaína, aproximadamente 5 min antes de la lesión en una placa de cultivo celular (35 mm x 10 mm). Los embriones ya no se mueven y no responden a los estímulos.
2. Coloque agujas de 25G en la parte superior de dos palillos para facilitar el manejo de las agujas.
3. Bajo un microscopio estereoscópico, eliminar embriones con desarrollo anormal o muertos. Con un movimiento circular del plato, reúna todos los embriones en el centro.
4. Aísla los embriones uno a uno utilizando dos agujas en posición vertical (cabeza abajo - cola arriba) y coloca la aguja izquierda en la cola para mantenerla recta. Corta la aleta en el borde de la notocorda con la aguja derecha. Haz el corte de una sola vez. No exceda los 10 minutos entre el corte y la inmersión en la solución bacteriana.

5. Infección de embriones heridos

1. Bajo la cabina de seguridad biológica tipo II, vórtice y agregue la solución de P. aeruginosa a aproximadamente 1 x 10⁷ UFC/mL a una placa de 6 pocillos.
2. Recoja los embriones lesionados con una pipeta de vidrio Pasteur desechable y añádalos a la solución bacteriana debajo del puesto de seguridad microbiológica. Incubar la placa a 28 °C durante 1,5 h.
   NOTA: Si se necesita un gran número de larvas infectadas, haga grupos de unas 50 larvas, haga la herida, sumérjalas y repita para el siguiente grupo.
3. Después de la infección, lavar los embriones bajo el puesto de seguridad microbiológica como se describe a continuación.
   1. Transfiera los embriones con una pipeta de vidrio para un lavado a 10 mL de agua de pescado sin azul de metileno, agregando la menor cantidad de líquido posible, durante 30 min a temperatura ambiente.
   2. Transferir los embriones infectados de nuevo con una pipeta de vidrio para un segundo lavado a 4 mL de agua de pescado sin azul de metileno durante unos minutos.
   3. Transfiera 24 embriones infectados individualmente a una placa de pocillos múltiples con 1 mL de agua de pescado sin azul de metileno.
4. Coloque las placas en una caja de plástico en la incubadora a 28 °C. Humedece la caja (con toallas de papel húmedas, por ejemplo) para limitar la evaporación.

6. Supervivencia de los embriones infectados

1. Para los estudios de supervivencia embrionaria, se comprueba la viabilidad bajo un microscopio estereoscópico a las 18 h, 24 h y 48 h postinfección (hpi). Un embrión se considera muerto cuando el corazón y la circulación sanguínea se detienen.
2. Representar las tasas de mortalidad/supervivencia utilizando representaciones gráficas de la escalera de Kaplan-Meier (GraphPad Prism 8.3.0) y analizar los datos con un rango logarítmico u otras pruebas estadísticas apropiadas.

7. Recuento de la carga bacteriana en embriones infectados (Figura 1)

1. Realice la determinación de UFC de embriones infectados en cuatro puntos de tiempo diferentes: 1,5 hpi, es decir, directamente después de la infección, y después de cada lavado a 24, 48 y 72 hpi con 5 embriones/punto de tiempo. Realice todos los pasos debajo del puesto de seguridad microbiológica.
2. Prepare para cada larva infectada tubos de microcentrífuga de 1,5 mL que contengan 95 μL de 1x PBS. El volumen de las larvas es de alrededor de 5 μL.
3. Transfiera las larvas a una placa de 6 pocillos con 4 mL de agua de pescado sin azul de metileno para realizar un lavado y eliminar las bacterias planctónicas.
4. Coloque cada embrión en un tubo de microcentrífuga que contenga PBS, agregando la menor cantidad de líquido posible. Basta con tocar la pipeta de vidrio que contiene las larvas en la superficie del PBS para permitir que las larvas se hundan en el tubo de microcentrífuga sin añadir líquido.
5. Triture los embriones individualmente con un mortero en el costado del tubo de microcentrífuga. Mantenga el mortero dentro del tubo. Determinar el punto final cuando no queda ningún embrión intacto.
6. Levante el mortero y agregue 100 μL de PBS-Triton al 2% para enjuagar las bacterias residuales del mortero (la concentración final es del 1%). Vórtice y espere 10 min. No procese más de cinco embriones al mismo tiempo.
7. Deje caer 3 veces 10 μL de lisados no diluidos en placas de agar LB para cada embrión. Realice una dilución en serie de los lisados en una placa de 96 pocillos hasta alcanzar una dilución ^{de 10-3} utilizando una pipeta multicanal. Dejar caer 3 veces, 10 μL de dilución ^10-1, ^10-2 y ^10-3 junto a las no diluidas en placas de agar LB e incubar las placas durante la noche a 37 °C.
8. Cuente las colonias fluorescentes de cada dilución bajo el microscopio y calcule la UFC por embrión infectado.

Figura 1: Cronología experimental para evaluar la virulencia y persistencia bacteriana en embriones de pez cebra. Abreviaturas: UFC = Unidades formadoras de colonias, hpi = horas después de la infección. El dibujo fue creado con BioRender.com. La cifra ha sido modificada de¹³. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

8. Probar el tratamiento contra la infección persistente (Figura 2)

1. Preparar soluciones antibióticas a 40 veces la concentración inhibitoria mínima (CMI) para la cepa de P. aeruginosa . Antes del experimento, compruebe que la concentración elegida de antibiótico no es tóxica para el embrión.
2. Siga los pasos 7.1 y 7.2. Coloque 1 mL de agua de pescado con antibióticos en una placa de 24 pocillos y haga un control sin antibióticos.
3. Transfiera cinco embriones de la etapa de lavado por tratamiento a la placa de 24 pocillos, agregando la menor cantidad de líquido posible.
4. Incubar con los antibióticos durante 30 minutos a temperatura ambiente. Vuelva al paso 7.3. para cuantificar la carga bacteriana después del tratamiento.

Figura 2: Procedimiento experimental utilizado para evaluar la eficacia de los tratamientos antibióticos en embriones infectados. Abreviaturas: ATB 30' = tratamiento antibiótico durante 30 min, UFC = unidades formadoras de colonias, hpi = horas post infección. El dibujo fue creado con BioRender.com. La cifra ha sido modificada de¹³. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Resultados

El embrión de pez cebra es un modelo apropiado para monitorizar una infección persistente con aislados de CF de P. aeruginosa
Utilizamos el modo de inmersión de embriones lesionados para evaluar in vivo la virulencia de tres aislados de CF (A6520, B6513 y C6490)⁹. También evaluamos el comportamiento de un aislado de FQ tardía bien caracterizado, RP73, conocido por su colonización a largo plazo en las vías respiratorias de rat...

Discusión

El modelado de la infección crónica bacteriana in vivo es esencial para comprender la patogénesis y evaluar la eficacia del tratamiento. Aquí, establecimos un modelo de infección de herida persistente en pez cebra adecuado para probar fármacos contra P. aeruginosa. Esto llena el vacío de la metodología actual con la falta de modelos in vivo susceptibles de cribado de fármacos contra infecciones bacterianas crónicas. En particular, este modelo imita una caracter...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Metanosulfonato de etil-3-aminobenzoato	Sigma	E50521
Pellet de pistón	Eppendorf, Dutscher	33522
Sales marinas	Instant Ocean, Sistemas de acuarios	218035
Tritón	Euromedex	2000-B