Artículo de método

Ookluc: Una línea de Plasmodium berghei para la identificación de compuestos que bloquean la transmisión

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DOI:

10.3791/68466

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11 de julio de 2025

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1Department of Parasitology, Institute of Biomedical Sciences, University of São Paulo

En este artículo

Resumen

El desarrollo sexual del Plasmodium ocurre en el intestino medio del mosquito. Dirigirse a las etapas sexuales del parásito es una estrategia prometedora para bloquear la transmisión. Desarrollamos Ookluc, un P. berghei transgénico que expresa nanoluciferasa después de la formación del cigoto, lo que permite el cribado de alto rendimiento de compuestos que bloquean la transmisión. En este artículo se detallan los métodos de cribado con Ookluc.

Resumen

El paludismo sigue siendo un problema sanitario mundial; En 2023 se registraron 263 millones de casos y 597.000 muertes en todo el mundo. El ciclo de vida del parásito es complejo y se necesitan intervenciones específicas en etapas críticas del desarrollo para controlar eficazmente la enfermedad. Las estrategias de bloqueo de la transmisión (TB) tienen como objetivo interrumpir la transmisión de Plasmodium dirigiéndose al mosquito vector o a las etapas sexuales del parásito a través de vacunas y medicamentos. Las intervenciones contra la tuberculosis pueden centrarse en los gametocitos del huésped humano u otras formas del intestino medio del mosquito, como gametos, cigotos, ookinetes y ooquistes.

El desarrollo de nuevos enfoques contra la tuberculosis se enfrenta a importantes desafíos. El estudio de las etapas sexuales del parásito es inherentemente difícil, y el cribado de alto rendimiento (HTS) de los compuestos gametocitocidas se basa principalmente en cultivos de P. falciparum . Sin embargo, las herramientas in vitro sólidas para evaluar las intervenciones en las etapas sexuales posteriores siguen siendo limitadas. Para acelerar el descubrimiento de compuestos de la tuberculosis, nuestro grupo desarrolló un nuevo ensayo HTS para la activación y fertilización de gametocitos utilizando P. berghei, un modelo murino de infección por Plasmodium . El parásito transgénico, Ookluc, expresa nanoluciferasa exclusivamente después de la formación del cigoto, con máxima luminiscencia durante el desarrollo del ookinete. Este ensayo basado en luminiscencia proporciona una lectura cuantitativa de la diferenciación de gameto a cigoto y de cigoto a ookinete, donde el aumento de la luminiscencia se correlaciona directamente con la formación de ookinete. En este artículo de vídeo se presentan los métodos para el cribado de los compuestos de la tuberculosis palúdica mediante Ookluc.

Introducción

El paludismo es una enfermedad milenaria que ha marcado profundamente la historia de la humanidad. Solo en 2023, se notificaron 263 millones de casos en 85 países endémicos, lo que provocó 597.000 muertes1. La enfermedad es causada por parásitos protozoarios del género Plasmodium, pertenecientes al filo Apicomplexa. Entre las cinco especies que infectan a los seres humanos (P. falciparum, P. vivax, P. knowlesi, P. ovale y P. malariae), P. falciparum y P. vivax representan la mayoría de los casos. P. falciparum se asocia con malaria grave y es predominante en África, mientras que P. vivax tiene la distribución geográfica más amplia, siendo más prevalente en América del Sur y Asia2.

La complejidad del ciclo de vida de Plasmodium , que involucra múltiples etapas de desarrollo a través de dos huéspedes, facilita su transmisión y persistencia en regiones endémicas3. Un paso crítico en este ciclo es la transición de los humanos al mosquito vector, lo que lo convierte en un objetivo clave para la intervención. La transmisión comienza dentro del huésped humano, donde se desarrollan las etapas sexuales de Plasmodium a medida que los merozoítos se diferencian en gametocitos masculinos y femeninos. Al ser ingerido por un mosquito, las señales ambientales desencadenan la activación de los gametocitos y la formación de gametos, lo que conduce a la fertilización en la luz del intestino medio. El cigoto resultante se diferencia en un ookinete móvil, que invade activamente el epitelio del intestino medio y se convierte en un ooquiste dentro de la lámina basal. Dentro del ooquiste se generan miles de esporozoítos que posteriormente se liberan en la hemolinfa, lo que les permite migrar a las glándulas salivales. Allí, los esporozoítos invaden las células acinares y se desplazan a la luz de la glándula, donde permanecen hasta que el mosquito se alimenta de sangre y transmite el parásito a la piel humana4.

La búsqueda de nuevas estrategias de bloqueo de la transmisión (TB) es crítica dadas las limitaciones de los fármacos disponibles y la creciente resistencia a los antipalúdicos5. Los métodos tradicionales de cribado, como las infecciones por mosquitos, el análisis microscópico manual o la incorporación de hipoxantina radiactiva, requieren mucha mano de obra, son difíciles de estandarizar y no son adecuados para aplicaciones de alto rendimiento 6,7. Los enfoques más recientes que utilizan la detección basada en fluorescencia (por ejemplo, tinción de ADN o reporteros de GFP) han mejorado la eficiencia, sin embargo, aún persisten desafíos significativos en la evaluación de compuestos que se dirigen a las etapas sexuales del parásito 6,7,8.

Para hacer frente a estos desafíos, se desarrolló una línea transgénica de P. berghei que expresa nanoluciferasa (nLuc), denominada Ookluc 8. En este sistema, el gen nLuc se coloca bajo el control del promotor de la proteína relacionada con el circunsporozoíto y TRAP (CTRP) específico de P. berghei, que se activa en los cigotos, lo que lleva a que la producción de nLuc comience aproximadamente 6 h después de la activación de los gametos y alcance su punto máximo 24 h después del ensayo de conversión8. Este diseño permite la cuantificación automatizada y basada en la luminiscencia de la viabilidad del parásito poco después de la fertilización, eliminando la necesidad de manipulación directa del vector, y facilita el cribado de alto rendimiento de miles de compuestos.

Aunque la expresión de nLuc se produce independientemente de la viabilidad del ookinete, lo que limita la detección de compuestos que afectan específicamente a etapas posteriores, como la morfogénesis del ookinete, Ookluc sigue siendo muy eficaz para identificar los compuestos de la tuberculosis que se dirigen a la gametogénesis, la recombinación sexual o la supervivencia del parásito dentro del mosquito, incluidos los agentes que inducen la producción de especies reactivas de oxígeno. Estudios previos han validado este sistema mediante la identificación exitosa de compuestos conocidos por inhibir las etapas sexuales de Plasmodium 9,10,11,12,13,14,15. Por lo tanto, Ookluc representa una plataforma robusta e innovadora para el cribado de alto rendimiento de los estadios sexuales de Plasmodium, lo que facilita el descubrimiento de nuevos compuestos de tuberculosis y avanza en los esfuerzos hacia la eliminación de la malaria en los próximos años8. Este protocolo describe la aplicación del sistema Ookluc para el cribado de fármacos y la determinación de la concentración inhibitoria al 50% (IC50).

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Protocolo

Todos los experimentos con animales se realizaron en estricta conformidad con las directrices éticas y fueron aprobados por el Comité de Ética en Uso de Animales del Instituto de Ciencias Biomédicas de la Universidad de São Paulo (CEUA-ICB/USP). Los animales fueron alojados y mantenidos de acuerdo con las normas establecidas por este comité. Los experimentos con parásitos Plasmodium genéticamente modificados, así como su almacenamiento criopreservado a -80 °C, se realizaron de acuerdo con las normas establecidas por el Comité Institucional de Bioseguridad del Instituto de Ciencias Biomédicas de la Universidad de São Paulo (CIBio-ICB/USP). En este estudio se utilizaron un total de tres ratones hembra BALB/c, de 3 a 5 semanas de edad, dos infectados y uno no infectado.

1. Materiales y reactivos

  1. Prepare el medio ookinete suplementando RPMI 1640 con 0,025 M de HEPES, penicilina-estreptomicina-neomicina (PSN), 50 mg/L de hipoxantina y 100 μM de ácido xanturénico. Ajuste el pH a 8.3 8,16.
  2. Prepare la solución de trabajo para el ensayo de luminiscencia mezclando 1 volumen de sustrato con 50 volúmenes del tampón de lisis proporcionado en el sistema de ensayo de luciferasa.
  3. Ajuste una incubadora a 21 °C.

2. Infección y recolección de sangre parasitada

  1. Infectar a dos ratones hembra BALB/c (4-6 semanas de edad) con 150 μL de cepa Ookluc criopreservada mediante inyección intraperitoneal (IP) (Día 0).
    NOTA: En este protocolo, recomendamos el uso de ratones BALB/c debido a su fácil disponibilidad y uso generalizado en instalaciones de animales. Sin embargo, cualquier cepa de ratón de tipo salvaje que sea susceptible a la infección por P. berghei y que favorezca la gametocitogénesis debe ser adecuada para su uso.
  2. A partir del día 3, evalúe la parasitemia y la gametocitemia mediante el examen microscópico de los frotis de sangre teñidos con Giemsa.
  3. Cuando la parasitemia y la gametocitemia alcanzan aproximadamente el 5% y el 0,5%, respectivamente (generalmente en el día 4), se recolecta sangre mediante punción cardíaca con jeringas heparinizadas y se agrupa la sangre de ambos ratones infectados.
    NOTA: Aunque se trata de una línea transgénica de P. berghei, su perfil de crecimiento y gametocitemia son similares a los observados en la cepa ANKA. En este contexto, la proporción de gametocitos en relación con la parasitemia total es aproximadamente 10 veces menor.
    NOTA: Idealmente, la placa compuesta (ver más abajo) se prepara antes de la recolección de sangre parasitada, de modo que la sangre se pipetea a la placa inmediatamente después de la recolección. Si la sangre de ratón debe recogerse en una habitación diferente, o no puede pipetearse inmediatamente a la placa compuesta por cualquier otro motivo, la sangre recogida debe mantenerse a 37 °C durante no más de 30 minutos.

3. Ensayo de conversión: cribado en placas de 96 pocillos

NOTA: Para garantizar resultados consistentes, todo el experimento debe repetirse tres veces en días diferentes para confirmar los hallazgos.

  1. Preparar las muestras de compuestos utilizando medio ookinete como diluyente (una concentración final de 10 μM). Diluir el material compuesto a 1 mM y preparar las muestras de trabajo diluyendo el material de 1 mM 1:100 v:v en medio Ookinete. Para un ensayo por duplicado, prepare un volumen final de 200 μL de muestra de trabajo.
  2. Si el compuesto se diluye en un disolvente distinto del agua, se incluirá una muestra de control que contenga el disolvente diluido en medio ookinete en la misma proporción que en la muestra de ensayo para asegurarse de que cualquier inhibición observada es atribuible al compuesto y no al disolvente.
    NOTA: A modo de ejemplo, seleccionaremos 90 compuestos.
  3. Usando dos placas de 96 pocillos, coloque 80 μL de las muestras en cada pocillo, como se muestra a continuación y se ilustra en la Figura 1, por duplicado (dos placas): Control positivo: 80 μL de medio ookinete; Control negativo: 80 μL de medio ookinete; Control de solventes: 80 μL de medio ookinete con 1% de DMSO; Muestras: 80 μL de 10 μM de cada compuesto en medio ookinete.

figure-protocol-1
Figura 1: Representación esquemática de un diseño de placa de 96 pocillos diseñado para el cribado de compuestos. El diseño de la placa incluye control positivo (C+), control negativo (C-), control más solvente de dilución (C + S) y 90 compuestos de prueba (S1-S90). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

  1. Añada 4 μL de sangre de ratón parasitada a cada pocillo de la placa de 96 pocillos en una proporción de 1:20 v:v, excepto al control negativo (C-). Homogeneizar suavemente mediante pipeteo.
    NOTA: Teniendo en cuenta las pérdidas, calculamos la necesidad de ~400 μL de sangre parasitada por cada placa.
  2. Para el control negativo, agregue sangre de ratón no infectado en una proporción de 1:20 (v:v, sangre:muestra). Homogeneizar suavemente.
  3. Incubar a 21 °C durante 6 h o 24 h.
    NOTA: La actividad de nLuc es detectable a las 6 h de incubación y alcanza su punto máximo a las 24 h del ensayo8. El ensayo no es capaz de identificar compuestos con actividad después de la formación del cigoto, como los compuestos que inhiben la morfogénesis de los ookinetos, porque los cigotos formados acumularán nLuc independientemente de completar la morfogénesis. Por lo tanto, la incubación de 6 h es suficiente para detectar todos los compuestos que bloquearán la actividad de nLuc al inhibir la gametogénesis, la recombinación sexual o tener citotoxicidad temprana. Sin embargo, normalmente favorecemos las incubaciones de 24 h para tener señales más fuertes y una mejor relación señal-ruido.

4. Ensayo de luminiscencia

  1. Después del período de incubación, homogeneice las muestras pipeteando hacia arriba y hacia abajo para garantizar una mezcla completa de sangre y medio.
  2. Prepare la mezcla de tampón de lisis/sustrato de luciferasa inmediatamente antes de usarla en una proporción de 1:50 (v:v, sustrato:tampón de lisis).
  3. Mezcle la mezcla de sustrato con muestras en una proporción de 1:1 (v:v), asegurando una mezcla suave para evitar burbujas. Incubar a 37 °C durante 3-5 min.
    NOTA: En este ejemplo, añadimos 84 μL de tampón de sustrato:lisis a cada pocillo.
  4. Transfiera las muestras a una placa blanca de fondo plano de 96 pocillos. Mida la luminiscencia con un lector de placas. Utilice la siguiente configuración de parámetros: filtro de emisión: lente; tiempo de intervalo de medición: 1 s por pocillo.

5. Análisis de datos - cribado

  1. Después del ensayo de luminiscencia, tome nota de los datos brutos que aparecen (Figura 2).
    NOTA: Las Unidades Ligeras Relativas (RLU) obtenidas dependen del luminómetro utilizado. En nuestro caso, los valores de RLU para el control positivo oscilaron entre 10.000 y 500.000 en un ensayo de incubación de 24 h. Los tiempos de incubación más cortos (6 h) darán como resultado valores de RLU más bajos.

figure-protocol-2
Figura 2: Resultados obtenidos de una lectura simulada de un ensayo de conversión para el cribado de compuestos. La imagen muestra lecturas de luminiscencia simuladas de un ensayo realizado después de la conversión de ookinetes en presencia de un panel de 90 compuestos. Los valores más bajos de la unidad de luz relativa indican una formación reducida de ookinete. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

  1. Usando una hoja de cálculo, calcule la media de cada medición usando la siguiente fórmula. Sustitúyase XX por la dirección de la primera célula de medición e YY por la dirección de la segunda célula de medición. Repita la fórmula para todas las muestras.
    =(PROMEDIO(XX:AA)
  2. Convierta los datos en % de inhibición para un mejor análisis de los resultados. En la hoja de cálculo, usa la siguiente fórmula. Reemplace A por el valor de RLU de muestra y B por el valor de RLU de control. Repita la fórmula para todos los compuestos probados:
    = 1 - (A/B) x 100
    NOTA: Los datos aparecerán como se muestra en la Figura 3.

figure-protocol-3
Figura 3: Resultados obtenidos de una lectura simulada de un ensayo de conversión para el cribado de compuestos representados como % de inhibición para cada compuesto. Porcentaje de inhibición de la conversión para cada compuesto ensayado, calculado como se ha descrito anteriormente. Los cuadrados resaltados indican compuestos que promueven más del 95% de inhibición de la conversión. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

  1. Identificar los compuestos que muestran más del 95% de inhibición.
    NOTA: Estos compuestos exhiben una alta actividad contra las etapas sexuales a una concentración de 10 μM. En nuestro ejemplo, encontramos cinco compuestos con alta actividad frente a las etapas sexuales.
  2. Para los compuestos identificados, realice una determinación IC50 como se describe a continuación.

6. Ensayo de conversión: determinación de IC 50

  1. Infectar ratones con Ookluc y recolectar sangre parasitada, como se describe en la sección 2.
  2. Prepare las muestras utilizando medio ookinete como diluyente. Utilice una concentración inicial en la que se observe una inhibición del 100% de la conversión por el compuesto.
    NOTA: Dado que los compuestos activos se identificaron en una pantalla con una concentración de 10 μM, utilizamos 20 μM como concentración inicial para la primera curva dosis-respuesta. Para obtener una curva dosis-respuesta precisa, es importante que su ensayo incluya concentraciones iniciales que resulten en una inhibición del 100% de la conversión y concentraciones finales que conduzcan a una inhibición del 0%. Este enfoque garantiza un cálculo preciso de IC50 . La primera curva dosis-respuesta informará las concentraciones más bajas del compuesto con ~100% de inhibición. En este protocolo, usaremos como ejemplo PyAz90, recientemente identificado usando Ookluc13.
  3. En una placa de 96 pocillos, agregue por triplicado (ver Figura 4): Control positivo (C+): 80 μL de medio ookinete; Control negativo (C-): 80 μL de medio ookinete; Primera dilución de la muestra (Cpd D1): 160 μL de compuesto a una concentración inicial en medio ookinete que resulta en una inhibición del 100% de la conversión; Pocillos D2 a D12: 80 μL de medio ookinete.
  4. Realice diluciones en serie dobles pipeteando 80 μL del pocillo D1 en D2, homogeneice y pipetee 80 μL del pocillo D2 en D3 y así sucesivamente. Asegúrese de que todos los pocillos tengan 80 μL de volumen total, así que deseche los últimos 80 μL extraídos del pocillo D12.
    NOTA: Realice el experimento con al menos tres réplicas para todas las muestras, como se indica en la Figura 4. Para garantizar la fiabilidad y la reproducibilidad de los resultados, se debe repetir todo el experimento en tres días distintos utilizando animales recién infectados cada vez.
    NOTA: Si en la primera pantalla, los resultados no muestran ningún impacto del disolvente en la conversión, no es necesario incluir estos controles en diluciones seriadas. De lo contrario, también se deben incluir diluciones en serie del solvente.

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Figura 4: Diseño de placa de 96 pocillos diseñado para la determinación del compuesto IC50 . El diseño de la placa incluye diluciones de control positivo (C+), control negativo (C-) y compuesto (Cpd) (D1 a D12). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

  1. Agregue sangre de ratón parasitada a la placa de 96 pocillos a una velocidad de 1:20 v:v. Homogeneizar suavemente mediante pipeteo.
    NOTA: Se añadirá un total de 4 μL de sangre parasitada a cada pocillo, excepto al control negativo (C-). Teniendo en cuenta las pérdidas, calculamos la necesidad de ~200 μL de sangre parasitada para cada compuesto a analizar.
  2. En pocillos de control negativos, agregue sangre de ratón no infectada en una proporción de 1:20 (v:v, sangre:muestra). Homogeneizar suavemente.
  3. Incubar a 21 °C durante 6 h o 24 h.
  4. Realice el ensayo de luminiscencia, como se describe en la sección 4.

7. Análisis de datos - Determinación de IC 50

NOTA: IC50 se define como la concentración de un compuesto necesaria para inhibir el 50% de la actividad/inhibición biológica. En este ensayo, la inhibición se refiere a la reducción de la conversión de ookinete. Los datos se representan como una curva dosis-respuesta sigmoidal, donde el eje X representa la concentración del compuesto (log-transformado) y el eje Y representa el % de inhibición.

  1. Calcule el % de inhibición como se describe en la sección 5, paso 5.3.
  2. Abra el software y cree una tabla XY.
  3. Establezca las opciones del eje Y en Introducir 3 valores de réplica en subcolumnas en paralelo.
  4. Pegue los datos, donde X representa la concentración del compuesto e Y representa el % de inhibición (Figura 5A).
  5. En la barra de menú, haga clic en Analizar y seleccione Regresión no lineal (ajuste de curva) y luego Curvas de dosis-respuesta - Inhibición y [inhibidor] vs. respuesta normalizada -- pendiente variable; haga clic en Aceptar.
  6. En el panel izquierdo, observe la curva dosis-respuesta de los datos. Aplique la personalización deseada, como cambios de color y formatos de puntos.
  7. Localice la tabla de ajuste de Nonlin para encontrar el IC50 calculado y el intervalo de confianza del 95% (IC del 95%) (Figura 5B).

figure-protocol-5
Figura 5: Curva dosis-respuesta de PyAz90. El % de inhibición se midió en función de la concentración de PyAz90 (μM) en una escala logarítmica. La curva sigmoidal representa los datos ajustados utilizados para determinar el IC50, que fue de 0,013 μM (intervalo de confianza del 95%: 0,012-0,014 μM). Los puntos de datos representan la media ± el error estándar de la media de las réplicas experimentales. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Resultados

La generación de parásitos Ookluc permite evaluar nuevos candidatos a fármacos contra la tuberculosis desde una perspectiva que no ofrecen los ensayos existentes, en particular en la evaluación de los efectos de los compuestos sobre la activación de gametos, la fertilización y la formación de cigotos8. Las Figuras 2 y 3 ilustran la capacidad del método para evalua...

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Discusión

La mayoría de los métodos de HTS utilizados para desarrollar nuevos compuestos de TB se centran en la inhibición de la gametocitogénesis o la actividad gametocitocida. Hasta la fecha, solo se han desarrollado dos modelos de P. berghei que permiten evaluar la función de los gametocitos, la gametogénesis, la formación de cigotos y la morfogénesis de los ookinetos5.

Uno de estos modelos es similar a Ookluc, ya que utiliza...

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Divulgaciones

Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.

Agradecimientos

Este proyecto contó con el apoyo de subvenciones de la Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP 2021/06769-0) y del Instituto Serrapilheira (beca G-1709-16618).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Dimetilsulfóxido (DMSO)Sigma-AldrichD8418
GraphPad Prism versión 10.0.0 para WindowsSoftware GraphPad, Boston, Massachusetts, EE. UU.
Sal de heparina sódica de la mucosa intestinal porcinaSigma-AldrichH3393
HEPES (1 M)Thermo Scientific15630106
HipoxantinaSigma-AldrichH9636
Ratón------Ratones hembra BALB/c, de 3 a 5 semanas de edad
Sistema de ensayo de luciferasa Nano-GloPromegaN1110
Penicilina &menos; Estreptomicina &menos; Solución de neomicina estabilizadaSigma-AldrichP4083
Lector de microplacas POLARStar OmegaBMG Labtech----
RPMI 1640 Medium, Suplemento GlutaMAXThermo Scientific61870036
Ácido xanturénicoSigma-AldrichD120804

Referencias

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