Disección y disociación rápidas del epitelio olfativo de ratón para suspensiones de un solo núcleo

Resumen

Este artículo proporciona un protocolo simplificado para la disección y disociación del epitelio olfativo murino con el fin de secuenciar el ARN de un solo núcleo.

Resumen

El epitelio olfatorio murino es el punto de entrada inicial del sistema olfativo, que alberga varios tipos de células que incluyen neuronas sensoriales olfativas, sus progenitores regeneradores y células de soporte. Las neuronas sensoriales olfativas transducen olores químicos en señales neuronales, sin embargo, los mecanismos subyacentes a cómo estas células se desarrollan y renuevan, crean sinapsis con el bulbo olfatorio y regulan sus receptores de olores siguen siendo áreas de intenso estudio. Ubicado en la cara dorsal de la cavidad nasal, el epitelio olfativo se adhiere a intrincadas estructuras óseas conocidas como cornetes. Esta anatomía plantea desafíos únicos para su extracción y disociación, especialmente en el contexto de la preparación de suspensiones unicelulares viables. Debido a que los protocolos de suspensión de células individuales a menudo implican pasos preparatorios (p. ej., disociación de papaína, FACS) que pueden estresar la viabilidad celular y / o retrasar la preparación de la biblioteca, minimizar el tiempo de extracción de tejido es crucial. Este artículo presenta un método simplificado para la disección rápida del epitelio olfativo y un protocolo para generar suspensiones de un solo núcleo de alta calidad.

Introducción

El epitelio olfativo murino (OE) es un componente esencial del sistema olfativo y es responsable de detectar y transducir señales odorantes al sistema nervioso central. Su capa más superficial contiene los cilios detectores de olores de las neuronas sensoriales olfativas, que están cubiertos por una capa de moco y rodeados por las células sustentaculares y microvillares de soporte ^1,2. Las OSN son bipolares, extendiendo sus cilios apicalmente para formar una red dentro de la capa de moco y sus axones basalmente a través de la placa cribiforme ósea para fusionarse en glomérulos dentro del bulbo olfatorio. Estos glomérulos son el sitio de las sinapsis entre las OSN y las neuronas aguas abajo. Las OSN subyacentes, las células progenitoras neuronales llamadas células basales globosas reponen constantemente las OSN a medida que mueren³ después de la exposición directa a agresiones ambientales como toxinas en el aire, patógenos y traumatismos físicos. Las células basales globosas se derivan de un grupo de reserva de células basales horizontales multipotentes ^4,5, ubicadas más basalmente y adheridas a la lámina basal de protuberancias óseas llamadas cornetes nasales. Los cornetes nasales son tortuosos, lo que dificulta la separación y homogeneización de los OE. Además, el OE está rodeado por huesos del cráneo, lo que dificulta el acceso al área y tradicionalmente requiere un procedimiento que requiere mucho tiempo.

Estudios anteriores se han basado en una incubación prolongada de papaína para liberar el epitelio olfativo del hueso 6,7,8,9,10, lo que puede retrasar aún más el procesamiento posterior de la suspensión unicelular. Debido a que el cizallamiento de los axones de OSN desencadena la apoptosis¹¹, es imperativo minimizar la cantidad de tiempo desde la extracción del tejido hasta la preparación de la biblioteca de ADNc. Además, la arquitectura del OE y sus proyecciones al bulbo olfatorio complican la extracción de células intactas para una secuenciación exitosa de ARN unicelular. Afortunadamente, la secuenciación de ARN de un solo núcleo (snRNA-seq) se ha convertido en una herramienta poderosa para perfilar células al tiempo que preserva la distribución del tipo de células, particularmente en tejidos donde la disociación de una sola célula es difícil o poco práctica^12,13.

Si bien varios estudios 6,7,8,10,14,15 han realizado la secuenciación unicelular del OE de ratón, ninguno ofrece un procedimiento de disección detallado optimizado para una recolección de tejido consistente y conveniente, lo cual es necesario dada la fragilidad del OE y el encapsulamiento por varios huesos del cráneo. Además, las guías de disección^{existentes 16} se centran en preservar la estructura anatómica en lugar de la velocidad, lo que lleva a tiempos de disección potencialmente largos. Debido a que la preparación oportuna del tejido es esencial para minimizar la degradación del ARN y maximizar la calidad de los núcleos preparados^17,18, se justifica un protocolo optimizado para la rápida disección y homogeneización del OE murino en una suspensión de un solo núcleo para su uso en diversas aplicaciones posteriores.

Este protocolo (Figura 1) presenta un método simplificado diseñado para superar estos desafíos, lo que permite la disección rápida del OE murino y la disociación eficiente del tejido con el fin de aislar los núcleos. Este enfoque facilita la secuenciación de un solo núcleo de alta calidad¹⁹, proporcionando una técnica confiable para investigar los fundamentos moleculares de la biología olfativa.

Figura 1: Anatomía de las suturas y huesos relevantes del cráneo de ratón C57BL / 6 y sección transversal representativa del epitelio olfativo. (A) Las suturas del cráneo están codificadas por colores. Las suturas están codificadas por colores en un lado del cráneo, mientras que el otro lado se deja sin marcar como referencia (izquierda). Los nombres de las suturas están codificados por colores en consecuencia (derecha). (B) Huesos del cráneo codificados por colores. Los huesos están codificados por colores en un lado del cráneo, mientras que el otro lado se deja sin marcar como referencia (izquierda). Los nombres de los huesos están codificados por colores en consecuencia (derecha). (C) Sección transversal de la parte central del OE (diseccionada usando el método descrito en este artículo) con cornetes codificados por colores en un lado y la parte superior izquierda sin marcar como referencia (izquierda). Nombres de los cornetes visualizados (derecha). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Protocolo

Todos los experimentos con animales en este estudio fueron aprobados y realizados de conformidad con el Baylor College of Medicine IACUC. Se utilizaron ratones hembra C57BL/6J (JAX:000664). Los detalles de los reactivos y equipos se enumeran en la Tabla de materiales.

1. Disección del epitelio olfatorio

1. Comience anestesiando profundamente al ratón utilizando cualquier método preferido (siguiendo protocolos aprobados institucionalmente). Confirme el plano quirúrgico de la anestesia mediante un pellizco firme en el dedo del pie y proceda con la perfusión transcardíaca de al menos 10 ml de PBS 1x helado. Retire la piel para exponer el cráneo (Figura 2A).
   NOTA: La extracción de la cabeza del cuerpo es opcional. Si uno decide quitar la cabeza, se recomienda quitar la piel y otros tejidos blandos alrededor del cráneo antes de la decapitación.
2. Con unas tijeras finas y de punta afilada, haga dos incisiones para romper los arcos cigomáticos del hueso escamoso bilateralmente colocando una punta de tijera en la órbita posterior y la otra adyacente al canal auditivo (líneas verdes en la Figura 2B).
3. Hacer una incisión poco profunda de órbita a órbita a lo largo de la cara más anterior del hueso frontal. Haga una incisión solo en la superficie dorsal del hueso frontal (~ 1-2 mm de profundidad), teniendo cuidado de no cortar ninguna estructura subyacente o hueso que comprenda la órbita (línea azul en la Figura 2B).
   NOTA: Para lograr una incisión poco profunda entre las órbitas, sostenga las tijeras perpendiculares al cráneo y use solo las puntas afiladas para cortar.
4. Cortar a lo largo de la línea media del cráneo desde el foramen magno, a través de las suturas sagital e interfrontal, hasta llegar a la incisión interorbitaria realizada en el hueso frontal en el paso 1.3 (línea roja en la Figura 2B).
5. Inserte un par de fórceps en la incisión realizada a lo largo de la línea media del cráneo y tire firmemente de un hemisferio de la bóveda craneal lateralmente. Esta acción también eliminará los huesos de la órbita (frontal, maxilar y lagrimal), exponiendo los aspectos laterales de los cornetes olfativos (Figura 2D).
   NOTA: Tenga cuidado de no dañar inadvertidamente el equipo original a partir de este momento.
6. Sosteniendo el hueso nasal y los dientes incisivos, rompa la bóveda craneal contralateral con fórceps. Permita que el cerebro (incluidos los bulbos olfatorios) se extirpe con el hemisferio del hueso a medida que se arranca (Figura 1E). Las únicas estructuras óseas visibles que deben permanecer después de este paso son la base del cráneo y los huesos que rodean el OE (Figura 2F).
7. Con un par de pinzas para huesos o rongeurs, retire cualquier resto de hueso frontal y hueso premaxilar (incisivo) hasta la base de los dientes incisivos (Figura 2G).
8. Use pinzas óseas para cortar a lo largo de la sutura frontonasal para liberar el hueso nasal de la placa cribiforme, teniendo mucho cuidado de no dañar el OE expuesto subyacente ni fracturar la placa cribiforme.
9. Levante el hueso nasal de la placa cribiforme con fórceps para exponer el OE (Figura 2H). Si el hueso premaxilar residual oscurece el OE dorsal, retírelo antes de continuar (círculos negros en la Figura 1I).
10. Con pinzas de punta fina, asegure suavemente la cara dorsal del tabique nasal en su unión con la placa cribiforme y tire hacia atrás (Figura 2J, K). Con una resistencia mínima, el epitelio olfativo principal se liberará como una estructura totalmente intacta (Figura 2L).
11. Proceda inmediatamente con la disociación OE o congele rápidamente el tejido para su posterior procesamiento.

Figura 2: Técnica para la disección rápida del epitelio olfatorio. (A) La cabeza del ratón después de la eliminación del tejido blando circundante. (B) Guías codificadas por colores para incisiones de la bóveda craneal. (C) Apariencia después de incisiones en la bóveda craneal. (D) Extirpación del primer hemisferio de la bóveda craneal junto con la porción de la órbita adyacente al epitelio olfativo. (E) Extirpación de la porción contralateral de la bóveda craneal junto con el cerebro. (F) La cabeza después de la extirpación del cerebro y la bóveda craneal. (G) Extirpación del hueso frontal más anterior y el premaxilar posterior, después de la incisión en la sutura frontomaxilar. (H) Extirpación de los huesos nasales. (I) Los círculos negros resaltan áreas de hueso premaxilar residual que se pueden extirpar opcionalmente. (J) Colocación de fórceps para la extirpación del epitelio olfativo intacto. (K) Tire hacia atrás para liberar el epitelio olfatorio. (L) Liberación total del epitelio olfativo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

2. Disociación del epitelio olfatorio y aislamiento de un solo núcleo

1. Coloque un tubo C y dos tubos cónicos de 15 ml por muestra en hielo.
2. Prepare el tampón de lisis agregando un inhibidor de ARNasa (hasta una concentración final de 0,2 U/μL) al tampón de extracción de núcleos prefabricados.
3. Agregue 4 ml de BSA al 1% a cada tubo cónico de 15 ml, agite brevemente y deseche el exceso. Esto recubre cada uno de los tubos cónicos de 15 ml con BSA para minimizar la adhesión de los núcleos al tubo.
4. Para un OE completo, agregue 2 ml de tampón de lisis helada a cada tubo C.
5. Agregue muestras de equipo original a los tubos en C. Con las pinzas # 2, sostenga cada muestra sobre su respectivo tubo en C y córtela en trozos pequeños con unas tijeras de punta fina.
6. Coloque los tubos C que contienen cada muestra boca abajo sobre los bloques disociadores de tejidos automatizados. En la pantalla del disociador, el cuadrado correspondiente a cada bloque cambiará de Libre a Seleccionado.
7. Presione el icono de la carpeta para ir a la carpeta Miltenyi . Usando las flechas, desplácese hasta el programa 4C_nuclei_1 (un programa precargado dentro del disociador). Presione OK para aplicar el programa a cada bloque y luego presione Start para comenzar el ciclo. Retire los tubos C del disociador inmediatamente después de completar el ciclo.
   NOTA: Si es posible, mantenga los tubos C helados durante el ciclo de disociación. Es importante retirar las muestras del disociador inmediatamente después de completar el ciclo y continuar con los siguientes pasos del protocolo para evitar la sobrelisis de los núcleos.
8. Con una pipeta, aspire la suspensión homogeneizada del tubo C y fíltrela a través de un filtro de 70 μm en el primer tubo cónico recubierto de BSA. Evite aspirar los fragmentos óseos que se han acumulado en la parte inferior del tubo C.
9. Enjuague el colador con 1 ml de PBS 1x helado para garantizar una filtración completa.
10. Centrifugar la suspensión filtrada a 500 × g durante 5 min a 4 °C en una centrífuga de cubo oscilante.
11. Aspire suavemente y deseche el sobrenadante, teniendo cuidado de no perturbar el sedimento. Vuelva a suspender completamente el pellet del núcleo en 1 ml de PBS 1x helado mediante un pipeteo suave.
12. Pasar los núcleos resuspendidos a través de un filtro de 30 μm en el segundo tubo cónico recubierto de BSA. La concentración de núcleos se puede cuantificar utilizando un hemocitómetro o un contador celular automatizado.
13. Proceda inmediatamente con el protocolo descendente elegido (con o sin FACS) para preservar la integridad de la muestra y evitar la degradación (Figura 3).
    NOTA: Se recomienda encarecidamente que los usuarios realicen ejecuciones de práctica de todo este protocolo para garantizar una finalización fluida y oportuna.

Figura 3: Disociación del epitelio olfatorio y flujo de trabajo de aislamiento de un solo núcleo. Después de la disección, el epitelio olfativo se disocia mecánica y químicamente. A continuación, el lisado se filtra a través de un colador de 70 μm, se enjuaga con 1x PBS y se centrifuga a 500 × g durante 5 min. El pellet se resuspende en 1x PBS antes de ser filtrado a través de un filtro de 30 μm. La suspensión de núcleos resultante está disponible para diversas aplicaciones de secuenciación posteriores. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Resultados

Para proporcionar un contexto anatómico para la disección y el análisis, se visualizaron y codificaron por colores las suturas y los huesos del cráneo del ratón C57BL/6, así como la porción central del epitelio olfatorio (OE) (Figura 1). Un lado de cada imagen se anotó para resaltar las suturas, huesos y cornetes relevantes, mientras que el otro lado se dejó sin marcar como referencia. La sección transversal de OE se preparó siguiendo los protocolos establecidos²⁰, y ...

Discusión

El procedimiento descrito aquí permite la extracción consistente de un OE intacto después de la perfusión intracardíaca 1x PBS. Esto representa una mejora notable en la velocidad en comparación con los métodos anteriores¹⁶ y es de particular importancia dado que las OSN comienzan a degenerar después de la axotomía², que ocurre durante la extirpación del cerebro.

La extracción cuidadosa de los huesos frontal, prem...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Tubo de centrífuga de 15 ml	Celltreat	229411
Pinza para huesos	Herramientas de ciencia fina	16102-11
Tijeras de iris miniatura Bonn	Miltex	18-1392
Solución de albúmina de suero bovino	Sigma-Aldrich	A1595
Fórceps Dumont #3	Herramientas de ciencia fina	11231-30
Ratones hembra C57BL/6J	El laboratorio Jackson	JAX:000664
Tubos en C de gentleMACS	Miltenyi Biotec	130-093-237
disociador de octo gentleMACS	Miltenyi Biotec	130-096-427
Filtros inteligentes MACS 30 mmm	Miltenyi Biotec	130-098-458
Filtros inteligentes MACS 70 mmm	Miltenyi Biotec	130-098-462
Micro Friedman-Pearson Rongeurs	Herramientas de ciencia fina	16220-14
Tampón de extracción de núcleos	Miltenyi Biotec	130-128-024
Solución salina tamponada con fosfato (PBS), 1x sin calcio ni magnesio, PH 7,4 ± 0.1	Corning	21-040-CV
Inhibidor protector de la ARNasa	Millipore Sigma	3335402001
Centrífuga refrigerada Sorvall Legend XTR	Thermo Scientific	50119927-5