Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.

Artículo de método

Un modelo de explante ex vivo para estudiar las interacciones gliales en la retina del ratón

1.9K vistas

⸱

DOI:

10.3791/68482

⸱

15 de julio de 2025

 ,  , 
1Department of Ophthalmology, Schepens Eye Research Institute of Massachusetts Eye and Ear, Harvard Medical School

En este artículo

Resumen

Aquí, proporcionamos una metodología detallada para aislar la retina del ojo del ratón para una experimentación ex vivo extendida. Este protocolo hace hincapié en hacer que este enfoque técnicamente exigente sea accesible para los investigadores que deseen aprovechar las vías de investigación que ofrece mantener la glía de la retina in situ en tejido vivo.

Resumen

El papel de la glía en el glaucoma es un tema de investigación cada vez más prominente, pero aún se desconoce mucho sobre cómo las poblaciones de estas células de soporte, a saber, los astrocitos y la microglía, influyen en la supervivencia de las células ganglionares de la retina. Si bien los modelos in vivo e in vitro proporcionan cierto grado de conocimiento, ambos enfoques tienen limitaciones significativas, como el impacto de la respuesta inmunitaria periférica en el primero y los cambios en la función fisiológica inducidos por el aislamiento y el cultivo celular en el caso del segundo. Para minimizar estos factores de confusión, hemos desarrollado un sistema de explantes de retina ex vivo en el que los astrocitos, la microglía y otros tipos de células de la retina se pueden mantener in situ durante períodos de al menos 3 días, lo que permite una investigación dirigida a un rendimiento mayor de lo que normalmente es factible con modelos in vivo . Fundamentalmente, este enfoque es muy susceptible a metodologías que serían desafiantes o inviables en un animal vivo, pero que siguen siendo compatibles con los ensayos posteriores comunes de tejido nervioso intacto. Aquí, presentamos un protocolo adecuado para el aislamiento y cultivo de explantes de retina intactos, junto con resultados representativos de microscopía de inmunofluorescencia que documentan los cambios sufridos por las células gliales y ganglionares de la retina en la retina ex vivo .

Introducción

La retina sensible a la luz, una extensión del sistema nervioso central (SNC) ubicada en la parte posterior del ojo, es esencial para la vista, pero vulnerable tanto a lesiones agudas como a enfermedades crónicas. Al igual que con otras regiones del SNC, las neuronas en la retina adulta no se reemplazan cuando se pierden, y las células ganglionares de la retina (RGC) que agregan y transmiten información visual al cerebro son particularmente vulnerables a la disfunción y la muerte en el glaucoma, lo que resulta en una pérdida irreversible de la visión 1,2. El glaucoma es una de las principales causas de ceguera en todo el mundo3, sin embargo, a pesar del impacto devastador en las personas afectadas y los costos generales para la sociedad, aún se desconoce mucho sobre cómo las primeras etapas de la enfermedad contribuyen a la pérdida de RGC4. El papel de la glía es un área importante de investigación en la fisiopatología del glaucoma, ya que estas células de soporte no neuronales son esenciales para la supervivencia de la RGC5, pero experimentan cambios fenotípicos en la enfermedad que pueden disminuir el comportamiento beneficioso6 o incluso impulsar la adopción de fenotipos deletéreos7. Aunque el término glía abarca una gama de tipos de células especializadas en todo el SNC8, estas pueden dividirse ampliamente en dos categorías: aquellas que comparten un linaje de desarrollo con las neuronas y proporcionan apoyo trófico, energético y estructural9, y aquellas con un origen mieloide, que realizan tareas especializadas de vigilancia y respuesta inmune10. Los representantes de ambas categorías (astrocitos y células de Müller en el primero, microglía en el segundo) pueblan la retina5 y experimentan cambios importantes en el glaucoma que plantean preguntas significativas sobre su papel en la progresión de la enfermedad y la supervivencia del CGR11.

Los esfuerzos para responder a estas preguntas se ven obstaculizados en parte por las características intrínsecas de la glía de la retina que presentan desafíos para la investigación tanto in vivo como in vitro. A diferencia de las neuronas, son relativamente silenciosas eléctricamente, lo que hace que enfoques como el ERG, que permiten la evaluación funcional de las RGC y los fotorreceptores in vivo, no sean adecuados para investigar los cambios en la función y el comportamiento glial. Y aunque se dispone de modelos12 inducibles y13 espontáneos de glaucoma, aún se desconoce mucho sobre los cambios en la glía en los primeros momentos de la enfermedad, que pueden preceder a la pérdida detectable de RGC, un problema agravado por la penetrancia variable del estado de la enfermedad en muchos de estos modelos. Además, la evidencia del glaucoma, tanto clínico como experimental, sugiere contribuciones de las células inmunitarias periféricas que pueden ser difíciles de desambiguar de las de la microglía, a pesar de los indicadores de que pueden actuar en diferentes "direcciones" para influir en la progresión de la enfermedad14,15.

También abundan los desafíos en el estudio de la glía de la retina in vitro. Aunque el aislamiento y el cultivo de los astrocitos16,17 y la microglía18 del cerebro están bien establecidos, trabajos recientes destacan una amplia heterogeneidad glial entre las regiones del SNC, especialmente en los astrocitos19, y los fenotipos presentes en una región pueden no estar presentes en la glía de otra, como la retina20,21. Sin embargo, aislar directamente los astrocitos y la microglía de la retina para su estudio es particularmente desafiante, ya que ambos tipos de células son relativamente escasos, cada uno representa menos del 1% de los 6,5 millones de células estimadas en la retina del ratón 22,23,24. Además, a diferencia de las neuronas, las glías son altamente plásticas y se adaptan rápidamente a los cambios drásticos en su entorno 16,18,25; Como resultado, los comportamientos observados en estas células in vitro pueden representar adaptaciones específicas a su nuevo entorno en lugar de patrones fenotípicos que se verían típicamente en la salud o la enfermedad. Dadas las limitaciones tanto de la experimentación in vivo como del cultivo primario de la glía retiniana, hemos buscado un enfoque intermedio, los explantes de retina, en el que la glía, las RGC y otros elementos de la retina se conservan in situ en un contexto ex vivo. En relación con los modelos in vivo, este enfoque ofrece un curso de tiempo experimental abreviado26, permite la manipulación experimental directa de la glía retiniana27 y evita la influencia potencialmente confusa de la infiltración de células inmunitarias periféricas14. Por el contrario, a diferencia del cultivo celular primario, hay una alteración mínima del entorno extracelular, y la glía permanece intacta y morfológicamente reconocible, lo que evita los desafíos asociados con el recrecimiento y la identificación de estas células después de la interrupción enzimática y mecánica16,25.

En relación con las metodologías de explante de retina descritas anteriormente, este enfoque enfatiza un enfoque en la confiabilidad técnica, la reproducibilidad y la maximización de la "facilidad de uso" del enfoque para mejorar la accesibilidad26,28. En comunicaciones personales con otros investigadores, descubrimos que los desafíos técnicos asociados con el manejo de la retina viva presentan un obstáculo importante para muchos que buscan utilizar explantes, mientras que el mantenimiento de la retina explantada en cultivo fue relativamente sencillo para los grupos con instalaciones de cultivo celular adecuadas. Por lo tanto, este protocolo incluye una serie de innovaciones destinadas a reducir la curva de aprendizaje asociada con el aislamiento de la retina y permitir que los investigadores comiencen a recopilar datos experimentales más rápidamente. Finalmente, aunque hemos puesto especial énfasis en el potencial de este modelo de explante para investigar el comportamiento de la glía retiniana y caracterizarla principalmente con microscopía de inmunofluorescencia, otros tipos y estructuras de células de la retina también se conservan en gran medida, y las retinas explantadas siguen siendo susceptibles a una amplia gama de técnicas de investigación adicionales.

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Protocolo

Todos los procedimientos que involucran animales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) en el Instituto de Investigación Ocular Schepens (Protocolo # 2022N000030, aprobado el 3/4/2025). Los animales se manejaron de acuerdo con la Declaración de la Asociación para la Investigación de la Visión y la Oftalmología (ARVO) para el uso de animales en la investigación oftálmica y de la visión.

NOTA: La Figura 1 muestra los pasos clave en el aislamiento de la retina viva del ojo de ratón enucleado.

figure-protocol-1
Figura 1: Una representación esquemática de los pasos clave en el aislamiento de la retina viva del ojo de ratón enucleado. Los números de paso correspondientes de los pasos clave se proporcionan en círculos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

1. Preparación

  1. Desinfecte una pipeta de 1 ml y un par de pinzas angulares y colóquelas en el armario de bioseguridad. Estos serán necesarios en la sección 3 del protocolo.
  2. Modifique una pipeta de transferencia cortando perpendicularmente a través del eje aproximadamente 2 cm por debajo del depósito, donde el orificio es más ancho, para acortar la pipeta y ensanchar la abertura. Asegúrese de que el corte esté limpio y en el que la retina no se enganche.
    NOTA: Esta herramienta se puede conservar para su reutilización si está limpia y se enjuaga con agua estéril entre usos.
  3. Prepare 50 ml de medios explantes asépticamente en una cabina de bioseguridad suplementando 47,5 mL de medios Neurobasal con 500 μL de suplemento de N-2, 1 mL de suplemento de B-27, 500 μL de Glutamax y 500 μL de mezcla de penicilina-estreptomicina (concentración final de 100 U/mL de penicilina y 100 mg/mL de estreptomicina).
    NOTA: Prepare medios de explante frescos para cada serie de aislamientos; El exceso de medio puede mantenerse a 4 °C durante un máximo de 1 semana y utilizarse para cambiar el medio si es necesario. Después de abrir, reemplace el medio Neurobasal no utilizado después de 1 mes. N-2 y B-27 deben mantenerse congelados como alícuotas de un solo uso, evitando los ciclos de congelación y descongelación.
  4. En una cabina de bioseguridad, prepare asépticamente la(s) placa(s) de cultivo añadiendo un inserto en cada pocillo que se vaya a utilizar, manipulando a través de las "puntas" que emergen del borde del inserto para evitar tocar las superficies que entrarán en contacto con los medios de cultivo.
    1. Agregue 1 mL de medio de explante al inserto, seguido de 3 mL adicionales agregados al pocillo mismo. Agregue 2-3 mL de agua estéril a los pozos no utilizados para controlar la evaporación.
    2. Transfiera la(s) placa(s) a la incubadora a 37 °C con 5% de CO2 para equilibrar aproximadamente 30 min antes del aislamiento del tejido.
  5. Prepare los cuadrados de filtro para crear un sustrato para la estabilización y transferencia del tejido. Extraiga el filtro de un kit de filtración de tapa de botella cortando alrededor de la periferia del material con una navaja o un bisturí. Tenga cuidado de evitar lesiones o dañar el filtro al doblarlo o rasgarlo.
    NOTA: Quitar el depósito de plástico transparente con una navaja de afeitar resistente para cortar el plástico opaco más maleable donde el adaptador roscado se encuentra con el depósito simplifica el proceso de extracción, pero se debe tener cuidado adicional para evitar lesiones.
    1. Después de que el filtro se haya desprendido por corte, use pinzas para extraerlo. Tenga en cuenta la orientación del filtro durante y después de la extracción; El lado mate (que mira hacia el depósito) debe estar en posición vertical para montar la retina en el paso 2.16 para la transferencia.
    2. Corta el filtro en cuadrados pequeños de aproximadamente 7 mm × 7 mm; Cada explante de retina requerirá un cuadrado. Remoje previamente los cuadrados en agua estéril en una placa de Petri de 100 mm durante al menos 20 minutos.
      NOTA: Los cuadrados de filtro pueden permanecer sumergidos en agua estéril hasta 1 semana antes de su uso. Debido a la tendencia de los cuadrados del filtro a desarrollar altos niveles de carga estática antes de la inmersión, prepare solo tantos cuadrados como sea necesario. El material de filtro seco restante se puede mantener indefinidamente en una placa de Petri estéril de 100 mm para su uso posterior.

2. Aislamiento y montaje

  1. Sacrificar al ratón a través de un método aprobado antes de confirmar con un enfoque secundario; en este estudio se utilizó la asfixia por CO2 seguida de luxación cervical. Enuclear ambos ojos con pinzas curvas de punta roma y colóquelos en PBS estériles.
  2. Prepare el espacio de trabajo llenando una placa de Petri de 100 mm con PBS estéril y colocándola en la platina del visor de disección binocular.
    1. Corta una tira de toallita de laboratorio de 1 cm de ancho y sumérgela en el plato para que actúe como sustrato estabilizador.
    2. Transfiera un ojo a la placa de disección, deje el otro en PBS y colóquelo en hielo o en un refrigerador a 4 ° C.
      NOTA: Debido a la sensibilidad de la retina al intervalo postmortem prolongado, se recomienda la eutanasia de un ratón a la vez.
  3. Posicionar e inmovilizar el ojo. Use fórceps para maniobrar el ojo sobre la toallita de laboratorio sumergida, lo que ayudará a la estabilización.
    1. Identifique un punto de sujeción apropiado, sujételo con pinzas en ángulo y gire suavemente el ojo para que se sostenga desde un lado o, idealmente, desde abajo. Asegúrese de que el eje antero-posterior (es decir, desde la córnea hasta el nervio óptico) esté horizontal. Esta orientación mejora la visibilidad y minimiza la presión sobre el ojo durante la disección.
      NOTA: Si es posible, agarre el tejido extraorbitario para evitar perforar o apretar el ojo, favoreciendo el músculo o la conjuntiva sobre el nervio óptico o la grasa.
  4. Mientras mantiene una sujeción con las pinzas en ángulo, asegúrese de que el ojo esté completamente sumergido e inmovilizado de forma segura. Haga una incisión con la punta del bisturí #11 paralela y aproximadamente 0,5 mm posterior al limbo, donde la córnea pasa a la esclerótica.
    NOTA: Esta incisión debe ser lo suficientemente grande como para que quepa la punta de una hoja de las tijeras de resorte. Como el filo de la punta del bisturí es esencial para perforar el globo limpiamente, cambie la hoja después de cada dos retinas.
    1. Inserte una hoja de las tijeras de resorte dentro del globo y comience a cortar circunvocalmente alrededor del ojo, reposicionando suavemente el ojo según sea necesario con pinzas.
      NOTA: Este corte debe ser lo más recto y paralelo posible al limbo; Reposicionar el ojo puede requerir dejar las tijeras y usar un par de pinzas con cada mano. Una vez expuesta, mantén la retina sumergida durante toda la disección.
  5. Una vez que el corte haya circunscrito el ojo, retire con cuidado el segmento anterior y el cristalino, luego gire el ocular para que mire hacia arriba para facilitar la inspección visual y la extracción del vítreo. Si una pieza extendida del nervio óptico permanece unida, recórtela a una longitud más corta (1-2 mm) para facilitar esto.
  6. Inspeccione la retina en busca de daños visibles y la cámara vítrea en busca de desechos, como células pigmentadas del EPR o coroides que puedan haber ingresado durante la extirpación del segmento anterior. Utilice pinzas en ángulo para inmovilizar el ocular en esta posición.
    NOTA: Para obtener resultados óptimos, se deben eliminar los desechos en la cámara vítrea y se deben minimizar los restos vítreos y adherentes residuales del cuerpo ciliar en la periferia de la retina. Este puede ser un proceso desafiante, y se pueden encontrar notas adicionales en las secciones "Reconocimiento y solución de problemas de lesiones mecánicas" y "Lesiones metabólicas" de los Resultados representativos.
    1. Utilice la pipeta de transferencia modificada para enjuagar la cámara vítrea con PBS y eliminar los pequeños restos de partículas, evitando las burbujas de aire manteniendo la punta de la pipeta por debajo de la superficie del líquido y manteniendo una cantidad adecuada de PBS en el bulbo del depósito.
    2. Elimine los residuos más grandes con un pincel fino de acuarela, minimizando el contacto con la superficie de la retina. Si es necesario, elimine los residuos más persistentes con pinzas de punta fina; Sin embargo, evite el contacto directo de las puntas metálicas con la retina para evitar daños.
  7. Después de limpiar los residuos visibles, enjuague la cámara vítrea con PBS de la pipeta de transferencia repetidamente (3-5 veces), como se describe anteriormente. Esto eliminará el vítreo poco adherido que pueda quedar después de la eliminación de los desechos. Utilice el cepillo fino para sondear suavemente la cámara, especialmente cerca de la periferia si quedan elementos del cuerpo ciliar. Si bien el vítreo es ópticamente transparente, actuará como un lastre para las fibras del cepillo y se puede detectar de esta manera.
    NOTA: Una fina capa residual de vítreo en la retina no parece tener un impacto negativo en el aislamiento o en el mantenimiento de la retina ex vivo, pero la presencia de cantidades significativas en la periferia de la retina, a menudo asociadas con estructuras residuales del cuerpo ciliar, puede causar el plegamiento de la retina y la pérdida de muestras si no se elimina.
    1. Si quedan bolsas significativas de vítreo, use el cepillo para eliminarlo barriendo suavemente hacia afuera hacia la periferia, asegurándose de que si las fibras del cepillo entran en contacto con la retina, lo hagan desde un ángulo poco profundo y sigan al cepillo, tirando en lugar de empujar el vítreo fuera de la cámara.
      NOTA: La extracción del vítreo requiere un manejo particularmente cuidadoso para evitar daños en la retina que pueden no ser visibles macroscópicamente; Los consejos sobre cómo reconocer y evitar este daño se encuentran en las secciones "Reconocer y solucionar problemas de lesiones mecánicas" y "Lesiones metabólicas" de los Resultados representativos.
  8. Una vez que la cámara vítrea se haya limpiado de residuos y solo queden restos vítreos mínimos, separe suavemente la retina externa de la copa del ojo mientras continúa estabilizando la muestra con pinzas en ángulo. Evite dañar la cabeza del nervio óptico y deje esta estructura intacta para anclar la retina.
    1. Tome un par de pinzas, manteniéndolas en posición cerrada con las puntas tocándose, e insértelas suavemente entre la retina y la coroides, utilizando un espacio preexistente de la manipulación anterior si es posible. Use los brazos planos de las pinzas, en lugar de las puntas, para agrandar el bolsillo entre la retina y la coroides hasta que estas estructuras puedan separarse por completo.
      NOTA: Enfatice los movimientos laterales, en lugar de empujar las puntas, para expandir el espacio entre la retina y la coroides. Girar suavemente las pinzas durante estos movimientos puede mejorar la separación y reducir la tensión pura de la fricción entre las pinzas y el tejido.
  9. Después de separar la retina externa de la coroides, continúe estabilizando la muestra mientras usa un segundo par de pinzas para tirar de la copa del ojo (esclerótica, coroides, etc.) hacia abajo. Si la retina se ha separado con éxito, debe permanecer en su lugar, atada a la cabeza del nervio óptico, mientras que la copa del ojo se puede sostener con un solo par de pinzas. Si la retina presiona hacia abajo con el ocular, continúe sondeando suavemente y separando los puntos de conexión que no sean la cabeza del nervio óptico.
  10. Con la retina anclada en la cabeza del nervio óptico, continúe inmovilizando el tejido y use el segundo par de pinzas para agrupar la copa del ojo por debajo de la cabeza del nervio óptico.
    1. Verifique que ninguna parte de la periferia de la retina esté atascada en una posición doblada debido al exceso de vítreo en el ángulo entre la retina y cualquier cuerpo ciliar residual. Si es necesario, enjuague la cámara con PBS con la pipeta de transferencia para eliminar cualquier residuo adicional y use suavemente el cepillo para desenrollar el tejido y eliminar el exceso de vítreo, teniendo cuidado de no tirar demasiado del tejido.
  11. Con la retina expuesta por ambos lados, utilice las tijeras de resorte para hacer una serie de cortes de alivio, espaciados aproximadamente 90° entre sí, extendiéndose en línea recta desde la periferia hacia la cabeza del nervio óptico, deteniéndose aproximadamente a 1 mm del centro. Esto minimiza la transección de los axones de las células ganglionares de la retina en la retina, mejorando la calidad de los explantes cultivados.
  12. Mientras sostiene el tejido sumergido en su lugar, retire suavemente la toallita de laboratorio con pinzas para separarla del tejido lateralmente antes de sacarla del plato. Evite el contacto con la retina para evitar la adherencia a la toallita y la posible pérdida de muestra.
  13. A continuación, continúe sosteniendo el pañuelo y use las tijeras de resorte para cortar el nervio óptico directamente debajo de la retina, luego retire el resto del ocular del plato.
  14. Una vez que la retina esté aislada del resto del ojo, llene una placa de Petri de 35 mm con PBS y use pinzas para colocar un cuadrado de filtro en la parte inferior con el lado mate más áspero hacia arriba. Tenga cuidado de evitar arrugar el filtro, ya que puede impedir el uso del filtro como sustrato para mover la retina.
  15. Aspire suavemente la retina con la pipeta de transferencia y transfiérala con cuidado a la placa de 35 mm. Maniobra la retina con el cepillo para asegurarte de que la superficie interna de la retina esté erguida y que el tejido descanse directamente sobre el cuadrado del filtro.
  16. Aspire lentamente el PBS de la placa con la pipeta de transferencia para bajar la retina al filtro. Haga una pausa, si es necesario, para reajustar el tejido antes de continuar hasta que la retina se haya asentado en el filtro.
    NOTA: La aspiración rápida puede provocar un movimiento lateral repentino de la retina, lo que resulta en daño o pérdida de tejido. La totalidad de la retina debe descansar sobre el cuadrado para evitar daños; sin embargo, si la retina se asienta en una posición problemática, se puede volver a agregar PBS a la placa hasta que se vuelva a suspender la retina y se puede volver a intentar el montaje.
  17. Una vez que la retina se haya asentado en el filtro, use el pincel para desenrollar cualquier retina periférica que pueda haberse doblado. Equilibre cuidadosamente el nivel de PBS para que la retina no se mueva fácilmente del filtro, al tiempo que se asegura de que quede suficiente para que la muestra no se seque y el cepillo pueda moverse sin problemas sin dañar la retina interna.
  18. Una vez más, inspeccione la retina en busca de residuos. Para evitar daños, limpie la retina sin manipulación directa utilizando la pipeta de transferencia para gotear PBS en la retina desde aproximadamente 1 cm por encima del tejido. Esto debería eliminar cualquier residuo restante, pero si se agrega demasiado PBS a la placa, la retina puede volver a flotar. Si esto ocurre, vuelva a realizar la aspiración para volver a montar el tejido.
    NOTA: Se pueden generar muestras "simuladas" transfiriendo retinas a una placa de 24 pocillos para su fijación, bloqueo/permeabilización y tinción de anticuerpos, como se describe en otra parte21. Estos controles simulados son útiles para solucionar problemas de lesiones mecánicas en la retina que pueden ocurrir durante el aislamiento.

3. Transferencia a los medios de cultivo y mantenimiento

  1. Cierre la tapa de la antena de 35 mm para transportarla a la cabina de bioseguridad, manteniendo la antena nivelada para evitar el desplazamiento de la retina del filtro. Si esto ocurre, vuelva a montar como se indicó anteriormente.
  2. Coloque la placa cerrada de 35 mm que contiene la retina en el gabinete de bioseguridad, teniendo cuidado de no tocar ningún equipo o superficie dentro del gabinete antes de desinfectar o cambiar los guantes.
  3. Descontamine los guantes con etanol y/o reemplácelos, luego mueva la placa de 6 pocillos precargada con medios explantes de la incubadora al gabinete de bioseguridad. Realice los pasos 3.4 y 3.5 dentro de la cabina de bioseguridad, utilizando las herramientas colocadas allí durante el paso 1.1.
  4. Retire la tapa de la placa de 35 mm que contiene la retina y use pinzas en ángulo para levantar con cuidado el cuadrado del filtro sin tocar la retina directamente. Retire la tapa de la placa de 6 pocillos y coloque el filtro sobre el centro del inserto de un pocillo apropiado, luego bájelo lentamente en el medio. La retina se desprenderá del filtro durante este paso y flotará justo debajo de la interfaz aire-líquido.
  5. Una vez que la retina y el filtro se hayan separado, aleje lentamente el filtro de la retina y retírelo del medio. Con la pipeta de 1 mL, extraiga 500 μL de medio del inserto para asegurarse de que la retina quede plana atrapándola entre el suelo del inserto y la interfaz aire-líquido.
  6. Vuelva a colocar la tapa de la placa y devuélvala a la incubadora a 37 °C con 5% de CO2, teniendo cuidado de mantener la retina cerca del centro del pocillo. Se pueden mantener hasta 6 retinas en una sola placa.
    NOTA: Si se conservan los explantes durante 24 h o menos, se pueden dejar en la incubadora hasta el final del experimento. Si se mantiene durante más tiempo, se recomiendan cambios de medio del 50% después de 1 día in vitro y en días alternos a partir de entonces.

4. Fijación para inmunotinción (opcional)

  1. Si realiza inmunotinción, consulte los siguientes pasos para la fijación; Si bien la inmunotinción se puede realizar utilizando parámetros previamente detallados para las retinas de montaje plano21, la fijación de la retina explantada requiere consideraciones específicas.
  2. Retire los insertos de cultivo celular con explantes y medios de la placa de cultivo de 6 pocillos y colóquelos sobre una superficie no porosa (como la tapa de plástico de la placa de cultivo) que pueda desecharse correctamente después de la fijación, ya que los insertos son ligeramente porosos y pequeñas cantidades de fijador pasarán a través de esta superficie subyacente.
  3. Retire suavemente los medios de cultivo de los insertos, luego agregue 1 ml de paraformaldehído (PFA) al 4% a cada uno. Deje que las retinas se fijen durante 15 minutos en una campana extractora, luego retire el PFA y deséchelo de acuerdo con la política institucional.
    PRECAUCIÓN: El paraformaldehído es peligroso y un precursor del formaldehído, un carcinógeno conocido. Tenga cuidado y realice la fijación en una campana extractora con las precauciones adecuadas.
  4. Lave las retinas 3 veces (durante 5 minutos cada una) con PBS para eliminar el PFA, luego use una pipeta de transferencia modificada para transferir las retinas en PBS a pocillos individuales en una placa de 24 pocillos para el bloqueo, la permeabilización y la inmunotinción como se describe en otra parte21. Deseche los plásticos contaminados con PFA (puntas de pipeta, insertos y la superficie no porosa utilizada durante la fijación) de acuerdo con la política institucional.
    NOTA: La pipeta de transferencia se puede conservar para transferir retinas fijas y teñidas a un portaobjetos para su montaje e imagen. Aunque no debería haber tenido contacto directo con PFA, se recomienda el uso de diferentes pipetas de transferencia para la manipulación de tejido vivo y fijado.

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Resultados

A escala macroscópica, las retinas explantadas permanecen esencialmente sin cambios en los puntos de tiempo de 1 y 3 días, aunque en este último momento se vuelven relativamente frágiles, lo que requiere un manejo cuidadoso antes de la fijación u otros puntos finales experimentales. Las retinas deben ser relativamente planas, sin pliegues (lo que puede resultar en una interrupción localizada de la difusión de oxígeno y nutrientes), y deben estar suspendidas en el medio entre la interfaz aire-líquido y el inserto de culti...

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Discusión

Los enfoques de cultivo organotípico32 , como los explantes de retina, aprovechan la flexibilidad experimental y el rápido tiempo de respuesta del cultivo celular, al tiempo que preservan gran parte del contexto in situ de los estudios in vivo , lo que los convierte en una potente vía para investigar interacciones complejas entre tipos de células. Presentamos este protocolo como un punto de entrada para los investigadores que pueden tener una exp...

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

M.A.M. contó con el apoyo de la R01EY035312 NIH/NEI, el Premio Catalyst for a Cure de la Fundación para la Investigación del Glaucoma, la Fundación Melza M. y Frank Theodore Barr, la Fundación Robert M. Sinskey, MD, la Fundación Benéfica de la Familia Ruettgers y la Fundación B.L. Manger. P.F.C. fue apoyado por NIH/NEI 2T32EY007145. Este trabajo también fue posible gracias a una subvención central de los NIH para la investigación de la visión P30 EY003176.  La Figura 1 se generó con Biorender. Los autores desean agradecer al Dr. Nasir Uddin por sus comentarios sobre el manuscrito y al Dr. Qiurong Zhu por su asistencia y apoyo.

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
#11 Cuchillas de bisturíBard-Parker3,71,311
Pipeta de 1 mL ('Pipetman P1000')GilsonF144059M
Placa de Petri de 100 mmFalcon351029
16% ParaformaldehídoTed Pella Inc18,505Diluido al 4% para fijación
Placa de 24 pocillosFalcon 353047Para fijación, bloqueo y incubación de anticuerpos
Petri de 35 mmFalcon351008
placa de 6 pocillos y kit de inserciónGreiner bio-one657641
Alexa Fluor 488-Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.711-545-152Dilución 1:800
Alexa Fluor 594 Burro anti-rata IgG (H+L) Altamente adsorbido cruzadoInvitrogenA-21209Dilución 1:800
Alexa Fluor 594-F(ab')2 Burro Anti-ratón IgG (H+L) Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.715-586-150Dilución 1:800
Alexa Fluor 647-Donkey Anti-Guinea Pig IgG (H+L)Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc. 706-605-148Dilución 1:800
Alexa Fluor 647-F(ab')2 Donkey Anti-Chicken IgY (IgG) (H+L) Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.703-606-155Dilución 1:800
Pinzas angulares ('5/45')FST / Dumont11251-35
Anticuerpo anti-Brn3a (ratón)ChemiconMAB1585dilución 1:200 Anticuerpo
anti-CD206 (rata)BioradMCA2235dilución 1:200
Anticuerpo anti-GFAP (pollo)Abcamab46741:1000 dilución
Anti-Iba1 anticuerpo (conejo)FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation019-19741dilución 1:500
Anticuerpo anti-Tmem119 (conejillo de indias)Synaptic Systems400 004dilución 1:500
B-27, 50xGibco (Thermofisher)17504044
Pinzas curvas romas ('Extra Fine Graefe)FST11152-10
Albúmina de suero bovinoSigma-AldrichA9647Utilice 1% p/v para el bloqueo y la incubación de anticuerpos
Kit de filtro (0,2 µ Membrana de PES, filtro superior de botella de 150 ml) FisherScientificFB12566508
Pincel fino, tamaño 3/0Princeton Art & Brush Co.06435-1030
GlutaMaxGibco (Thermofisher)35050061
Toallitas de laboratorio (toallitas Kim) KIMTECH34155
N-2, 100xGibco (Thermofisher)17502048
Neurobasal-A Medium, menos rojo fenolGibco (Thermofisher)12349015
Suero de burro normalJackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.017-000-121Uso al 10% para el bloqueo y la incubación de anticuerpos
Penicilina-EstreptomicinaGibco (Thermofisher)15140122
Puntas de pipeta, 1000 µ LTipOne1126-7810
Tijeras de resorte ('Cohan-Vannas')FST15000-11
Agua estéril ('Dnase, Rnase free')Invitrogen10977-015
Gibco10010-023Pinzas rectas con filtro
('mini')FST / Dumont11200-14
Pipeta de transferencia, 5,8 mlFisherScientific13-711-9AMMD
Triton X-100Thermo Scientific ChemicalsA16046. Uso de APal 0,5% para el bloqueo y la incubación de anticuerpos
placa de PBS estéril

Referencias

  1. Quigley, H. A. Understanding glaucomatous optic neuropathy: the synergy between clinical observation and investigation. Annu Rev Vis Sci. 2, 235-254 (2016).
  2. Alqawlaq, S., Flanagan, J. G., Sivak, J. M. All roads lead to glaucoma: induced retinal injury cascades contribute to a common neurodegenerative outcome. Exp Eye Res. 183, 88-97 (2019).
  3. Tham, Y. C., et al. Global prevalence of glaucoma and projections of glaucoma burden through 2040: a systematic review and meta-analysis. Ophthalmology. 121 (11), 2081-2090 (2014).
  4. Margeta, M. A., et al. Apolipoprotein E4 impairs the response of neurodegenerative retinal microglia and prevents neuronal loss in glaucoma. Immunity. 55 (9), 1627-1644 (2022).
  5. Vecino, E., Rodriguez, F. D., Ruzafa, N., Pereiro, X., Sharma, S. C. Glia-neuron interactions in the mammalian retina. Prog Retin Eye Res. 51, 1-40 (2016).
  6. Livne-Bar, I., et al. Astrocyte-derived lipoxins A4 and B4 promote neuroprotection from acute and chronic injury. J Clin Invest. 127 (12), 4403-4414 (2017).
  7. Liddelow, S. A., et al. Neurotoxic reactive astrocytes are induced by activated microglia. Nature. 541 (7638), 481-487 (2017).
  8. Barres, B. A. The mystery and magic of glia: a perspective on their roles in health and disease. Neuron. 60 (3), 430-440 (2008).
  9. Verkhratsky, A., Nedergaard, M. Physiology of astroglia. Physiol Rev. 98 (1), 239-389 (2018).
  10. Colonna, M., Butovsky, O. Microglia function in the central nervous system during health and neurodegeneration. Annu Rev Immunol. 35, 441-468 (2017).
  11. Tezel, G. Molecular regulation of neuroinflammation in glaucoma: current knowledge and the ongoing search for new treatment targets. Prog Retin Eye Res. 87, 100998(2022).
  12. Sappington, R. M., Carlson, B. J., Crish, S. D., Calkins, D. J. The microbead occlusion model: a paradigm for induced ocular hypertension in rats and mice. Invest Ophthalmol Vis Sci. 51 (1), 207-216 (2010).
  13. Schlamp, C. L., Li, Y., Dietz, J. A., Janssen, K. T., Nickells, R. W. Progressive ganglion cell loss and optic nerve degeneration in DBA/2J mice is variable and asymmetric. BMC Neurosci. 7, 66(2006).
  14. Paschalis, E. I., et al. Permanent neuroglial remodeling of the retina following infiltration of CSF1R inhibition-resistant peripheral monocytes. Proc Natl Acad Sci U S A. 115 (48), E11359-E11368 (2018).
  15. Rutigliani, C., et al. Widespread retina and optic nerve neuroinflammation in enucleated eyes from glaucoma patients. Acta Neuropathol Commun. 10 (1), 118(2022).
  16. Foo, L. C., et al. Development of a method for the purification and culture of rodent astrocytes. Neuron. 71 (5), 799-811 (2011).
  17. Batiuk, M. Y., et al. An immunoaffinity-based method for isolating ultrapure adult astrocytes based on ATP1B2 targeting by the ACSA-2 antibody. J Biol Chem. 292 (21), 8874-8891 (2017).
  18. Timmerman, R., Burm, S. M., Bajramovic, J. J. An overview of in vitro methods to study microglia. Front Cell Neurosci. 12, 242(2018).
  19. Batiuk, M. Y., et al. Identification of region-specific astrocyte subtypes at single cell resolution. Nat Commun. 11 (1), 1220(2020).
  20. Cullen, P. F., Sun, D. Astrocytes of the eye and optic nerve: heterogeneous populations with unique functions mediate axonal resilience and vulnerability to glaucoma. Front Ophthalmol (Lausanne). 3, 1217137(2023).
  21. Cullen, P. F., Gammerdinger, W. J., Ho Sui, S. J., Mazumder, A. G., Sun, D. Transcriptional profiling of retinal astrocytes identifies a specific marker and points to functional specialization. Glia. 72 (9), 1604-1628 (2024).
  22. Cullen, P. F., Mazumder, A. G., Sun, D., Flanagan, J. G. Rapid isolation of intact retinal astrocytes: a novel approach. Acta Neuropathol Commun. 11 (1), 154(2023).
  23. Li, F., Jiang, D., Samuel, M. A. Microglia in the developing retina. Neural Dev. 14 (1), 12(2019).
  24. Jeon, C. J., Strettoi, E., Masland, R. H. The major cell populations of the mouse retina. J Neurosci. 18 (21), 8936-8946 (1998).
  25. Wolfes, A. C., et al. A novel method for culturing stellate astrocytes reveals spatially distinct Ca2+ signaling and vesicle recycling in astrocytic processes. J Gen Physiol. 149 (1), 149-170 (2017).
  26. Johnson, T. V., Martin, K. R. Development and characterization of an adult retinal explant organotypic tissue culture system as an in vitro intraocular stem cell transplantation model. Invest Ophthalmol Vis Sci. 49 (8), 3503-3512 (2008).
  27. Tao, C., Zhang, X. Retinal proteoglycans act as cellular receptors for basement membrane assembly to control astrocyte migration and angiogenesis. Cell Rep. 17 (7), 1832-1842 (2016).
  28. Schaeffer, J., Delpech, C., Albert, F., Belin, S., Nawabi, H. Adult mouse retina explants: from ex vivo to in vivo model of central nervous system injuries. Front Mol Neurosci. 13, 599948(2020).
  29. Vagaja, N. N., et al. Changes in murine hyalocytes are valuable early indicators of ocular disease. Invest Ophthalmol Vis Sci. 53 (3), 1445-1451 (2012).
  30. Alarautalahti, V., et al. Viability of mouse retinal explant cultures assessed by preservation of functionality and morphology. Invest Ophthalmol Vis Sci. 60 (6), 1914-1927 (2019).
  31. Rodrigues, E. B., et al. The use of vital dyes in ocular surgery. Surv Ophthalmol. 54 (5), 576-617 (2009).
  32. Shamir, E. R., Ewald, A. J. Three-dimensional organotypic culture: experimental models of mammalian biology and disease. Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (10), 647-664 (2014).
  33. Antonetti, D. A., Silva, P. S., Stitt, A. W. Current understanding of the molecular and cellular pathology of diabetic retinopathy. Nat Rev Endocrinol. 17 (4), 195-206 (2021).
  34. Kinuthia, U. M., Wolf, A., Langmann, T. Microglia and inflammatory responses in diabetic retinopathy. Front Immunol. 11, 564077(2020).
  35. Reboussin, E., et al. Evaluation of neuroprotective and immunomodulatory properties of mesenchymal stem cells in an ex vivo retinal explant model. J Neuroinflammation. 19 (1), 63(2022).
  36. Do, M. T. H. Melanopsin and the intrinsically photosensitive retinal ganglion cells: biophysics to behavior. Neuron. 104 (2), 205-226 (2019).
  37. Yu, A., et al. Microglia target synaptic sites early during excitatory circuit disassembly in neurodegeneration. iScience. 28 (4), 112201(2025).

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Reimpresiones y permisos

Etiquetas

Modelo de explante retinianoneuroinflamaci n del glaucomac lulas ganglionares de la retinaastrocitos y microgl amicroscop a de inmunofluorescenciaaislamiento de c lulas retinianasretina ex vivoexpresi n de GFAP
Un modelo de explante ex vivo para estudiar las interacciones gliales en la retina del ratón
Contáctenos
Recomendar a la biblioteca

Privacidad

Condiciones de uso

Políticas

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Todos los derechos reservados.