Aquí, proporcionamos una metodología detallada para aislar la retina del ojo del ratón para una experimentación ex vivo extendida. Este protocolo hace hincapié en hacer que este enfoque técnicamente exigente sea accesible para los investigadores que deseen aprovechar las vías de investigación que ofrece mantener la glía de la retina in situ en tejido vivo.
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Artículo de método
Un modelo de explante ex vivo para estudiar las interacciones gliales en la retina del ratón
En este artículo
Resumen
Resumen
El papel de la glía en el glaucoma es un tema de investigación cada vez más prominente, pero aún se desconoce mucho sobre cómo las poblaciones de estas células de soporte, a saber, los astrocitos y la microglía, influyen en la supervivencia de las células ganglionares de la retina. Si bien los modelos in vivo e in vitro proporcionan cierto grado de conocimiento, ambos enfoques tienen limitaciones significativas, como el impacto de la respuesta inmunitaria periférica en el primero y los cambios en la función fisiológica inducidos por el aislamiento y el cultivo celular en el caso del segundo. Para minimizar estos factores de confusión, hemos desarrollado un sistema de explantes de retina ex vivo en el que los astrocitos, la microglía y otros tipos de células de la retina se pueden mantener in situ durante períodos de al menos 3 días, lo que permite una investigación dirigida a un rendimiento mayor de lo que normalmente es factible con modelos in vivo . Fundamentalmente, este enfoque es muy susceptible a metodologías que serían desafiantes o inviables en un animal vivo, pero que siguen siendo compatibles con los ensayos posteriores comunes de tejido nervioso intacto. Aquí, presentamos un protocolo adecuado para el aislamiento y cultivo de explantes de retina intactos, junto con resultados representativos de microscopía de inmunofluorescencia que documentan los cambios sufridos por las células gliales y ganglionares de la retina en la retina ex vivo .
Introducción
La retina sensible a la luz, una extensión del sistema nervioso central (SNC) ubicada en la parte posterior del ojo, es esencial para la vista, pero vulnerable tanto a lesiones agudas como a enfermedades crónicas. Al igual que con otras regiones del SNC, las neuronas en la retina adulta no se reemplazan cuando se pierden, y las células ganglionares de la retina (RGC) que agregan y transmiten información visual al cerebro son particularmente vulnerables a la disfunción y la muerte en el glaucoma, lo que resulta en una pérdida irreversible de la visión 1,2. El glaucoma es una de....
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Protocolo
Todos los procedimientos que involucran animales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) en el Instituto de Investigación Ocular Schepens (Protocolo # 2022N000030, aprobado el 3/4/2025). Los animales se manejaron de acuerdo con la Declaración de la Asociación para la Investigación de la Visión y la Oftalmología (ARVO) para el uso de animales en la investigación oftálmica y de la visión.
NOTA: La Figura 1 muestra los pasos clave en el aislamiento de la retina viva del ojo de ratón enucleado.
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Resultados
A escala macroscópica, las retinas explantadas permanecen esencialmente sin cambios en los puntos de tiempo de 1 y 3 días, aunque en este último momento se vuelven relativamente frágiles, lo que requiere un manejo cuidadoso antes de la fijación u otros puntos finales experimentales. Las retinas deben ser relativamente planas, sin pliegues (lo que puede resultar en una interrupción localizada de la difusión de oxígeno y nutrientes), y deben estar suspendidas en el medio entre la interfaz aire-líquido y el inserto de culti.......
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Discusión
Los enfoques de cultivo organotípico32 , como los explantes de retina, aprovechan la flexibilidad experimental y el rápido tiempo de respuesta del cultivo celular, al tiempo que preservan gran parte del contexto in situ de los estudios in vivo , lo que los convierte en una potente vía para investigar interacciones complejas entre tipos de células. Presentamos este protocolo como un punto de entrada para los investigadores que pueden tener una exp.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
M.A.M. contó con el apoyo de la R01EY035312 NIH/NEI, el Premio Catalyst for a Cure de la Fundación para la Investigación del Glaucoma, la Fundación Melza M. y Frank Theodore Barr, la Fundación Robert M. Sinskey, MD, la Fundación Benéfica de la Familia Ruettgers y la Fundación B.L. Manger. P.F.C. fue apoyado por NIH/NEI 2T32EY007145. Este trabajo también fue posible gracias a una subvención central de los NIH para la investigación de la visión P30 EY003176. La Figura 1 se generó con Biorender. Los autores desean agradecer al Dr. Nasir Uddin por sus comentarios sobre el manuscrito y al Dr. Qiurong Zhu por su asistencia y apoyo.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| #11 Cuchillas de bisturí | Bard-Parker | 3,71,311 | |
| Pipeta de 1 mL ('Pipetman P1000') | Gilson | F144059M | |
| Placa de Petri de 100 mm | Falcon | 351029 | |
| 16% Paraformaldehído | Ted Pella Inc | 18,505 | Diluido al 4% para fijación |
| Placa de 24 pocillos | Falcon 353047 | Para fijación, bloqueo y incubación de anticuerpos | |
| Petri de 35 mm | Falcon | 351008 | |
| placa de 6 pocillos y kit de inserción | Greiner bio-one | 657641 | |
| Alexa Fluor 488-Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc. | 711-545-152 | Dilución 1:800 |
| Alexa Fluor 594 Burro anti-rata IgG (H+L) Altamente adsorbido cruzado | Invitrogen | A-21209 | Dilución 1:800 |
| Alexa Fluor 594-F(ab')2 Burro Anti-ratón IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc. | 715-586-150 | Dilución 1:800 |
| Alexa Fluor 647-Donkey Anti-Guinea Pig IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc. | 706-605-148 | Dilución 1:800 |
| Alexa Fluor 647-F(ab')2 Donkey Anti-Chicken IgY (IgG) (H+L) | Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc. | 703-606-155 | Dilución 1:800 |
| Pinzas angulares ('5/45') | FST / Dumont | 11251-35 | |
| Anticuerpo anti-Brn3a (ratón) | Chemicon | MAB1585 | dilución 1:200 Anticuerpo |
| anti-CD206 (rata) | Biorad | MCA2235 | dilución 1:200 |
| Anticuerpo anti-GFAP (pollo) | Abcam | ab4674 | 1:1000 dilución |
| Anti-Iba1 anticuerpo (conejo) | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 019-19741 | dilución 1:500 |
| Anticuerpo anti-Tmem119 (conejillo de indias) | Synaptic Systems | 400 004 | dilución 1:500 |
| B-27, 50x | Gibco (Thermofisher) | 17504044 | |
| Pinzas curvas romas ('Extra Fine Graefe) | FST | 11152-10 | |
| Albúmina de suero bovino | Sigma-Aldrich | A9647 | Utilice 1% p/v para el bloqueo y la incubación de anticuerpos |
| Kit de filtro (0,2 µ Membrana de PES, filtro superior de botella de 150 ml) | FisherScientific | FB12566508 | |
| Pincel fino, tamaño 3/0 | Princeton Art & Brush Co. | 06435-1030 | |
| GlutaMax | Gibco (Thermofisher) | 35050061 | |
| Toallitas de laboratorio (toallitas Kim) | KIMTECH | 34155 | |
| N-2, 100x | Gibco (Thermofisher) | 17502048 | |
| Neurobasal-A Medium, menos rojo fenol | Gibco (Thermofisher) | 12349015 | |
| Suero de burro normal | Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc. | 017-000-121 | Uso al 10% para el bloqueo y la incubación de anticuerpos |
| Penicilina-Estreptomicina | Gibco (Thermofisher) | 15140122 | |
| Puntas de pipeta, 1000 µ L | TipOne | 1126-7810 | |
| Tijeras de resorte ('Cohan-Vannas') | FST | 15000-11 | |
| Agua estéril ('Dnase, Rnase free') | Invitrogen | 10977-015 | |
| Gibco | 10010-023 | Pinzas rectas con filtro | |
| ('mini') | FST / Dumont | 11200-14 | |
| Pipeta de transferencia, 5,8 ml | FisherScientific | 13-711-9AMMD | |
| Triton X-100 | Thermo Scientific Chemicals | A16046. Uso de AP | al 0,5% para el bloqueo y la incubación de anticuerpos |
Referencias
- Quigley, H. A. Understanding glaucomatous optic neuropathy: the synergy between clinical observation and investigation. Annu Rev Vis Sci. 2, 235-254 (2016).
- Alqawlaq, S., Flanagan, J. G., Sivak, J. M.
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Reimpresiones y permisos
