Grabaciones de ondas retinianas multielectrodos de alta densidad utilizando una plataforma de electrofisiología

Summary

Las matrices de electrodos múltiples de alta densidad (HD-MEA) se utilizan para estudiar las ondas retinianas espontáneas, que desempeñan un papel crucial en el desarrollo de circuitos neuronales. Este protocolo describe los pasos para preparar el tejido de la retina del ratón y realizar registros electrofisiológicos utilizando HD-MEA en una plataforma de electrofisiología.

Abstract

Las ondas retinianas espontáneas son un sello distintivo de la actividad de la red retiniana durante el desarrollo, desempeñando un papel crucial en la formación del sistema visual al influir en el refinamiento de los axones, la permeabilidad de la vasculatura y la maduración general de los circuitos neuronales. Estas ondas se estudian comúnmente en preparaciones retinianas ex vivo utilizando matrices de electrodos múltiples (MEA), que permiten registros electrofisiológicos de grandes poblaciones de actividad de células ganglionares de la retina (RGC). La electrofisiología basada en MEA se ha convertido en una herramienta poderosa debido a su facilidad de uso para recopilar rápidamente datos de alto rendimiento, lo que la hace ideal para estudiar la actividad de la retina en una variedad de condiciones experimentales.

En este protocolo, describimos los pasos críticos para preparar el tejido de la retina para la adquisición de datos electrofisiológicos utilizando un MEA de alta densidad (HD-MEA) en una plataforma de electrofisiología. El proceso comienza con el aislamiento cuidadoso de las retinas intactas de los animales neonatos en condiciones fisiológicas. Una vez preparada, la retina se monta cuidadosamente en un chip HD-MEA, que consta de una red de 26.400 electrodos capaces de realizar grabaciones extracelulares simultáneas de al menos 1.000 RGC. Las grabaciones pueden durar hasta varias horas. En última instancia, este enfoque metodológico ofrece aplicaciones valiosas en la investigación del desarrollo de la retina, las enfermedades y, potencialmente, los estudios comparativos entre especies, lo que contribuye a avances más amplios en la neurociencia y la investigación de la visión.

Introduction

Las ondas retinianas espontáneas son ráfagas periódicas de actividad correlacionada que se observan en la retina en desarrollo antes del inicio de la visión. En ratones, los circuitos que inician y propagan las ondas retinianas cambian rápidamente durante el desarrollo, comenzando embrionariamente y terminando con la apertura de los ojos (día postnatal 14)¹. A medida que se desarrollan los circuitos retinianos, las propiedades espacio-temporales de las ondas retinianas cambian drásticamente ^2,3. Varios estudios apoyan que esas propiedades espacio-tempor....

Protocol

Este protocolo describe los pasos para aislar y preparar el tejido de la retina de ratones neonatos para las grabaciones de ondas retinianas de MEA utilizando la plataforma HD-MEA de Maxwell Biosystems. El procedimiento está diseñado para preservar las condiciones fisiológicas, asegurando que el tejido de la retina permanezca estructuralmente intacto, libre de daños y debidamente preparado para un contacto óptimo con los electrodos. Estos experimentos fueron aprobados por el Programa de Cuidado y Uso de Animales de Vanderbilt, bajo el número de protocolo M2200056-00. Los ratones (de 1-2 semanas de edad, ambos sexos) se alojaron en un ....

Results

Grabaciones y análisis de ondas retinianas de alto rendimiento con HD-MEAs
Realizamos un registro HD-MEA de ondas retinianas espontáneas de una hora de duración (Figura 2). Un diagrama raster de la actividad neuronal muestra el patrón estructurado de las ondas de la retina, donde cada punto representa un potencial de acción detectado por un electrodo individual (Figura 2A, abajo). La suma de la actividad a través de los elect.......

Discussion

El protocolo descrito aquí proporciona un método reproducible y de alto rendimiento para preparar el tejido de la retina y realizar grabaciones HD-MEA, lo que ofrece un método robusto para estudiar la actividad de la red de la retina. La tecnología HD-MEA ofrece ventajas significativas sobre las técnicas electrofisiológicas y de imagen tradicionales, especialmente en la captura de datos de alto rendimiento. HD-MEA ofrece grabaciones en tiempo real con una precisión de milisegundos de la .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Pipeta de transferencia desechable de 3 mL (con el extremo cortado)	Fisherbarnd	13-711-9CM	Ayuda a mover la retina entre placas de Petri.
Líquido cefalorraquídeo artificial (LCRa)			Mantiene las condiciones fisiológicas para el tejido de la retina; compuesto por NaCl, KCl, NaH2PO4, NaHCO3, CaCl2, MgCl2, glucosa y burbujeo con carbógeno.
CaCl2	Fisher Chemicals	C79-500	Para preparar líquido cefalorraquídeo artificial (aCSF)
Suministro de carbógeno (95% O2, 5% CO2)			Utilizado para oxigenar el aCSF y mantener la viabilidad de los tejidos.
Bisturí de hoja curva (#10)	Integra	4-110	Se utiliza para cortar tejido con precisión.
Microscopio de disección (estereoscopio)	Zeiss	Stemi 508	Esencial para la visualización y el manejo del tejido de la retina.
glucosa	Fisher Chemicals	BP350-1	Para preparar líquido cefalorraquídeo artificial (aCSF)
Calentador en línea	Sistema multicanal	TC02	Calienta aCSF a 32-34 grados; C para condiciones óptimas.
Sistema de perfusión	Ismatec Ismatec ISM4208		Mantiene el flujo continuo de líquido cefalorraquídeo oxigenado.
KCl	Fisher Chemicals	P271-500	Para preparar líquido cefalorraquídeo artificial (aCSF)
KH2PO4	Sigma Aldrich	P5504-100g	Para preparar líquido cefalorraquídeo artificial (aCSF)
Unidad de registro	MaxOne Maxwell Biosystems	MX1-BRD	Interfaz entre el chip MaxOne y el sistema
MaxOne Sistema	Maxwell Biosystems	Sistema MX1-SYS	Core para recodificadores electrofisiológicos basados en MEA.
MaxOne Tissue Holder con un micromanipulador de 3 ejes e insertos reemplazables	Maxwell Biosystems	MX1-HLD	Garantiza la colocación precisa de la retina en el chip MEA.
Chip MEA (MX1-S-CHP, MaxWell Biosystems)	Maxwell Biosystems	MX1-S-CHP	Matricial de microelectrodos de alta densidad para el registro de la actividad neuronal.
MgCl2	Fisher Chemicals	M33-500	Para preparar líquido cefalorraquídeo artificial (aCSF)
NaCl	Fisher Chemicals	S271-1	Para preparar líquido cefalorraquídeo artificial (aCSF)
NaHCO3	Fisher Chemicals	S233-500	Para preparar líquido cefalorraquídeo artificial (aCSF)
Aguja (30 G x ½)	BD Biosciences	305106	Ayuda a realizar incisiones en la córnea.
Animales neonatos (P1-P14; ratón)			Organismos modelo como ratones, ratas u otros utilizados para estudios de retina.
PC con el software MaxLab Live Scope	HP	Z4	Se utiliza para la adquisición de datos y el análisis de grabaciones.
Placa de Petri (35 mm o 60 mm)	Pyrex	3483E12	Se utiliza como espacio de trabajo para la disección.
Pinzas Roboz micro Adson (RS-5232, 4,75" de largo, 1 x 2 dientes, punta de 0,5 mm)	Pinzas Roboz	RS-5232	especializadas para disección fina.
Tijeras de resorte Roboz (RS-5671, filo de corte de 10 mm, ancho de punta de 0,15 mm, 3¾ Roboz		RS-5671	Tijeras de precisión para cortar tejidos delicados.
		de un solo pelo	Pincel pequeño modificado a un solo pelo para el manejo de tejidos delicados.
Dos pinzas de punta fina	Roboz	RS-5060	Se utilizan para la manipulación de tejidos delicados.
Papeles de filtro Whatman (#1), cortados en trozos pequeños	GE Healthcare	1001-042	Se utilizan para manipular y secar tejido de la retina.