Las matrices de electrodos múltiples de alta densidad (HD-MEA) se utilizan para estudiar las ondas retinianas espontáneas, que desempeñan un papel crucial en el desarrollo de circuitos neuronales. Este protocolo describe los pasos para preparar el tejido de la retina del ratón y realizar registros electrofisiológicos utilizando HD-MEA en una plataforma de electrofisiología.
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Artículo de método
Grabaciones de ondas retinianas multielectrodos de alta densidad utilizando una plataforma de electrofisiología
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En este artículo
Resumen
Resumen
Las ondas retinianas espontáneas son un sello distintivo de la actividad de la red retiniana durante el desarrollo, desempeñando un papel crucial en la formación del sistema visual al influir en el refinamiento de los axones, la permeabilidad de la vasculatura y la maduración general de los circuitos neuronales. Estas ondas se estudian comúnmente en preparaciones retinianas ex vivo utilizando matrices de electrodos múltiples (MEA), que permiten registros electrofisiológicos de grandes poblaciones de actividad de células ganglionares de la retina (RGC). La electrofisiología basada en MEA se ha convertido en una herramienta poderosa debido a su facilidad de uso para recopilar rápidamente datos de alto rendimiento, lo que la hace ideal para estudiar la actividad de la retina en una variedad de condiciones experimentales.
En este protocolo, describimos los pasos críticos para preparar el tejido de la retina para la adquisición de datos electrofisiológicos utilizando un MEA de alta densidad (HD-MEA) en una plataforma de electrofisiología. El proceso comienza con el aislamiento cuidadoso de las retinas intactas de los animales neonatos en condiciones fisiológicas. Una vez preparada, la retina se monta cuidadosamente en un chip HD-MEA, que consta de una red de 26.400 electrodos capaces de realizar grabaciones extracelulares simultáneas de al menos 1.000 RGC. Las grabaciones pueden durar hasta varias horas. En última instancia, este enfoque metodológico ofrece aplicaciones valiosas en la investigación del desarrollo de la retina, las enfermedades y, potencialmente, los estudios comparativos entre especies, lo que contribuye a avances más amplios en la neurociencia y la investigación de la visión.
Introducción
Las ondas retinianas espontáneas son ráfagas periódicas de actividad correlacionada que se observan en la retina en desarrollo antes del inicio de la visión. En ratones, los circuitos que inician y propagan las ondas retinianas cambian rápidamente durante el desarrollo, comenzando embrionariamente y terminando con la apertura de los ojos (día postnatal 14)1. A medida que se desarrollan los circuitos retinianos, las propiedades espacio-temporales de las ondas retinianas cambian drásticamente 2,3. Varios estudios apoyan que esas propiedades espacio-tempor....
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Protocolo
Este protocolo describe los pasos para aislar y preparar el tejido de la retina de ratones neonatos para las grabaciones de ondas retinianas de MEA utilizando la plataforma HD-MEA de Maxwell Biosystems. El procedimiento está diseñado para preservar las condiciones fisiológicas, asegurando que el tejido de la retina permanezca estructuralmente intacto, libre de daños y debidamente preparado para un contacto óptimo con los electrodos. Estos experimentos fueron aprobados por el Programa de Cuidado y Uso de Animales de Vanderbilt, bajo el número de protocolo M2200056-00. Los ratones (de 1-2 semanas de edad, ambos sexos) se alojaron en un ....
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Resultados
Grabaciones y análisis de ondas retinianas de alto rendimiento con HD-MEAs
Realizamos un registro HD-MEA de ondas retinianas espontáneas de una hora de duración (Figura 2). Un diagrama raster de la actividad neuronal muestra el patrón estructurado de las ondas de la retina, donde cada punto representa un potencial de acción detectado por un electrodo individual (Figura 2A, abajo). La suma de la actividad a través de los elect.......
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Discusión
El protocolo descrito aquí proporciona un método reproducible y de alto rendimiento para preparar el tejido de la retina y realizar grabaciones HD-MEA, lo que ofrece un método robusto para estudiar la actividad de la red de la retina. La tecnología HD-MEA ofrece ventajas significativas sobre las técnicas electrofisiológicas y de imagen tradicionales, especialmente en la captura de datos de alto rendimiento. HD-MEA ofrece grabaciones en tiempo real con una precisión de milisegundos de la .......
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Divulgaciones
Los autores no tienen conflictos de intereses que declarar.
Agradecimientos
Con el apoyo de subvenciones de los NIH R00EY030909 a A.T.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Pipeta de transferencia desechable de 3 mL (con el extremo cortado) | Fisherbarnd | 13-711-9CM | Ayuda a mover la retina entre placas de Petri. |
| Líquido cefalorraquídeo artificial (LCRa) | Mantiene las condiciones fisiológicas para el tejido de la retina; compuesto por NaCl, KCl, NaH2PO4, NaHCO3, CaCl2, MgCl2, glucosa y burbujeo con carbógeno. | ||
| CaCl2 | Fisher Chemicals | C79-500 | Para preparar líquido cefalorraquídeo artificial (aCSF) |
| Suministro de carbógeno (95% O2, 5% CO2) | Utilizado para oxigenar el aCSF y mantener la viabilidad de los tejidos. | ||
| Bisturí de hoja curva (#10) | Integra | 4-110 | Se utiliza para cortar tejido con precisión. |
| Microscopio de disección (estereoscopio) | Zeiss | Stemi 508 | Esencial para la visualización y el manejo del tejido de la retina. |
| glucosa | Fisher Chemicals | BP350-1 | Para preparar líquido cefalorraquídeo artificial (aCSF) |
| Calentador en línea | Sistema multicanal | TC02 | Calienta aCSF a 32-34 grados; C para condiciones óptimas. |
| Sistema de perfusión | Ismatec Ismatec ISM4208 | Mantiene el flujo continuo de líquido cefalorraquídeo oxigenado. | |
| KCl | Fisher Chemicals | P271-500 | Para preparar líquido cefalorraquídeo artificial (aCSF) |
| KH2PO4 | Sigma Aldrich | P5504-100g | Para preparar líquido cefalorraquídeo artificial (aCSF) |
| Unidad de registro | MaxOne Maxwell Biosystems | MX1-BRD | Interfaz entre el chip MaxOne y el sistema |
| MaxOne Sistema | Maxwell Biosystems | Sistema MX1-SYS | Core para recodificadores electrofisiológicos basados en MEA. |
| MaxOne Tissue Holder con un micromanipulador de 3 ejes e insertos reemplazables | Maxwell Biosystems | MX1-HLD | Garantiza la colocación precisa de la retina en el chip MEA. |
| Chip MEA (MX1-S-CHP, MaxWell Biosystems) | Maxwell Biosystems | MX1-S-CHP | Matricial de microelectrodos de alta densidad para el registro de la actividad neuronal. |
| MgCl2 | Fisher Chemicals | M33-500 | Para preparar líquido cefalorraquídeo artificial (aCSF) |
| NaCl | Fisher Chemicals | S271-1 | Para preparar líquido cefalorraquídeo artificial (aCSF) |
| NaHCO3 | Fisher Chemicals | S233-500 | Para preparar líquido cefalorraquídeo artificial (aCSF) |
| Aguja (30 G x ½) | BD Biosciences | 305106 | Ayuda a realizar incisiones en la córnea. |
| Animales neonatos (P1-P14; ratón) | Organismos modelo como ratones, ratas u otros utilizados para estudios de retina. | ||
| PC con el software MaxLab Live Scope | HP | Z4 | Se utiliza para la adquisición de datos y el análisis de grabaciones. |
| Placa de Petri (35 mm o 60 mm) | Pyrex | 3483E12 | Se utiliza como espacio de trabajo para la disección. |
| Pinzas Roboz micro Adson (RS-5232, 4,75" de largo, 1 x 2 dientes, punta de 0,5 mm) | Pinzas Roboz | RS-5232 | especializadas para disección fina. |
| Tijeras de resorte Roboz (RS-5671, filo de corte de 10 mm, ancho de punta de 0,15 mm, 3¾ Roboz | RS-5671 | Tijeras de precisión para cortar tejidos delicados. | |
| de un solo pelo | Pincel pequeño modificado a un solo pelo para el manejo de tejidos delicados. | ||
| Dos pinzas de punta fina | Roboz | RS-5060 | Se utilizan para la manipulación de tejidos delicados. |
| Papeles de filtro Whatman (#1), cortados en trozos pequeños | GE Healthcare | 1001-042 | Se utilizan para manipular y secar tejido de la retina. |
Referencias
- Ford, K. J., Feller, M. B. Assembly and disassembly of a retinal cholinergic network. Vis Neurosci. 29 (1), 61-71 (2012).
- Maccione, A., et al. Following the ontogeny of retinal waves: Pan-retinal recordings of population dynamics in the neonata....
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Reimpresiones y permisos
