Artículo de método

Grabaciones de ondas retinianas multielectrodos de alta densidad utilizando una plataforma de electrofisiología

DOI:

10.3791/68493

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24 de junio de 2025

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1Department of Biological Sciences, Vanderbilt University, 2Vanderbilt Brain Institute, Vanderbilt University, 3Department of Ophthalmology and Visual Sciences, Vanderbilt University

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

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Las matrices de electrodos múltiples de alta densidad (HD-MEA) se utilizan para estudiar las ondas retinianas espontáneas, que desempeñan un papel crucial en el desarrollo de circuitos neuronales. Este protocolo describe los pasos para preparar el tejido de la retina del ratón y realizar registros electrofisiológicos utilizando HD-MEA en una plataforma de electrofisiología.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Las ondas retinianas espontáneas son un sello distintivo de la actividad de la red retiniana durante el desarrollo, desempeñando un papel crucial en la formación del sistema visual al influir en el refinamiento de los axones, la permeabilidad de la vasculatura y la maduración general de los circuitos neuronales. Estas ondas se estudian comúnmente en preparaciones retinianas ex vivo utilizando matrices de electrodos múltiples (MEA), que permiten registros electrofisiológicos de grandes poblaciones de actividad de células ganglionares de la retina (RGC). La electrofisiología basada en MEA se ha convertido en una herramienta poderosa debido a su facilidad de uso para recopilar rápidamente datos de alto rendimiento, lo que la hace ideal para estudiar la actividad de la retina en una variedad de condiciones experimentales.

En este protocolo, describimos los pasos críticos para preparar el tejido de la retina para la adquisición de datos electrofisiológicos utilizando un MEA de alta densidad (HD-MEA) en una plataforma de electrofisiología. El proceso comienza con el aislamiento cuidadoso de las retinas intactas de los animales neonatos en condiciones fisiológicas. Una vez preparada, la retina se monta cuidadosamente en un chip HD-MEA, que consta de una red de 26.400 electrodos capaces de realizar grabaciones extracelulares simultáneas de al menos 1.000 RGC. Las grabaciones pueden durar hasta varias horas. En última instancia, este enfoque metodológico ofrece aplicaciones valiosas en la investigación del desarrollo de la retina, las enfermedades y, potencialmente, los estudios comparativos entre especies, lo que contribuye a avances más amplios en la neurociencia y la investigación de la visión.

Introducción

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Las ondas retinianas espontáneas son ráfagas periódicas de actividad correlacionada que se observan en la retina en desarrollo antes del inicio de la visión. En ratones, los circuitos que inician y propagan las ondas retinianas cambian rápidamente durante el desarrollo, comenzando embrionariamente y terminando con la apertura de los ojos (día postnatal 14)1. A medida que se desarrollan los circuitos retinianos, las propiedades espacio-temporales de las ondas retinianas cambian drásticamente 2,3. Varios estudios apoyan que esas propiedades espacio-temporales específicas instruyen el desarrollo del sistema visual: la actividad asincrónica entre los ojos instruye la segregación específica del ojo4, el tamaño del área de onda instruye el refinamiento de los axones retinotópicos en las regiones cerebrales binoculares 5,6, y la dirección de propagación de las ondas se ha implicado para instruir los circuitos de selectividad de dirección en el colículo superior3. Más allá de los circuitos neuronales, las ondas retinianas son responsables del desarrollo de la permeabilidad de la vasculatura sanguínea7. Además, se descubrió que las ondas retinianas en estadio II controlan el crecimiento de las áreas del campo receptivo y lo estabilizan en las células ganglionares de la retina (CGR)8. De manera crítica, las ondas retinianas aberrantes durante el desarrollo podrían ser la base de varios trastornos del neurodesarrollo y, de hecho, las ondas retinianas son anormales en un modelo de ratón de nistagmo congénito3. Dado su papel crítico en el desarrollo temprano del sistema visual y sus implicaciones para la enfermedad, existe la necesidad de registrar la dinámica espacio-temporal de las ondas retinianas a cualquier edad y en cualquier modelo animal.

Han surgido varios métodos para estudiar las ondas de la retina. Tanto la electrofisiología unicelular 9,10 como las imágenes de calcio 11,12,13,14,15 han conducido a hallazgos fundamentales sobre los circuitos y la función de las ondas retinianas. Aquí, nos centramos en los registros de matrices de electrodos múltiples (MEA), un método que se ha utilizado desde la investigación temprana de las ondas retinianas16 y que ha seguido mejorando como técnica2. Los MEA permiten el registro extracelular simultáneo de potenciales de acción de cientos a miles de RGC, lo que permite a los investigadores rastrear el inicio, la propagación y la terminación de las ondas de manera similar a lo que es posible con las imágenes de calcio. Dado que los MEA registran directamente el potencial de acción de los RGC, los MEA se pueden utilizar para estudiar varios modelos genéticos de ratón u organismos no modelo sin la complicación añadida de introducir un indicador de calcio. El tejido también se puede cultivar directamente en el MEA, lo que permite tiempos de registro muy largos. Los MEAs también son altamente escalables, y los productos actuales permiten hasta seis MEAs activos a la vez, lo que podría permitir una evaluación rápida de las retinas y catalizar el descubrimiento de fármacos. Quizás la mayor fortaleza de los MEA es su capacidad para muestrear muchas células a una alta velocidad de muestreo, lo que permite a los laboratorios de todo el mundo obtener rápidamente conjuntos de datos enriquecidos, pero requiere experiencia en el posprocesamiento.

El objetivo principal de este protocolo es proporcionar un protocolo detallado y reproducible para la preparación del tejido de la retina y la realización de registros electrofisiológicos utilizando un sistema MEA DE ALTA DENSIDAD (HD-MEA) de un solo pocillo para estudiar las ondas retinianas espontáneas ex vivo. Este método garantiza la adquisición de datos de alto rendimiento y larga duración, lo que lo hace adecuado para una amplia gama de estudios relacionados con el desarrollo y las enfermedades. El nuevo sistema avanzado HD-MEA basado en CMOS, que permite >1.000 sitios de electrodos a la vez, ofrece varias ventajas sobre los enfoques electrofisiológicos tradicionales. Su guía de electrodos de alta densidad (26.400 electrodos) permite registros extracelulares precisos y simultáneos de hasta 1.012 RGC, capturando patrones de actividad espacial a escala fina. El diseño de un solo pozo proporciona condiciones de registro uniformes17. Además, este sistema permite realizar grabaciones a largo plazo de varias horas, lo que permite estudiar la dinámica de las ondas en diversas condiciones fisiológicas y farmacológicas sin una degradación significativa de la señal18. Al proporcionar un protocolo, este estudio tiene como objetivo hacer que la tecnología HD-MEA sea accesible a una audiencia más amplia de investigadores en neurociencia, oftalmología y ciencia de la visión. Este método representa un importante paso adelante en el estudio de las ondas retinianas, ya que ofrece nuevas vías para estudiar el desarrollo temprano del sistema visual, los mecanismos de la enfermedad y las posibles intervenciones terapéuticas.

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Protocolo

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Este protocolo describe los pasos para aislar y preparar el tejido de la retina de ratones neonatos para las grabaciones de ondas retinianas de MEA utilizando la plataforma HD-MEA de Maxwell Biosystems. El procedimiento está diseñado para preservar las condiciones fisiológicas, asegurando que el tejido de la retina permanezca estructuralmente intacto, libre de daños y debidamente preparado para un contacto óptimo con los electrodos. Estos experimentos fueron aprobados por el Programa de Cuidado y Uso de Animales de Vanderbilt, bajo el número de protocolo M2200056-00. Los ratones (de 1-2 semanas de edad, ambos sexos) se alojaron en un vivero de ciclo día/noche de 12 horas y se les alimentó con una dieta regular de comida.

1. Preparación del tejido retiniano

  1. Aislamiento de la retina
    NOTA: Consulte la Tabla de materiales para obtener detalles sobre los materiales, equipos y reactivos utilizados en este protocolo (consulte también la Figura 1).
    1. Preparar el espacio de trabajo
      1. Prepare líquido cefalorraquídeo artificial (LCRa): 125 mM de NaCl, 2,5 mM de KCl, 1,25 mM de NaH2PO4, 26 mM de NaHCO3, 2 mM de CaCl2, 1 mM de MgCl2, 10 mM de glucosa, burbujeado con carbógeno: 95% O2/5% CO2 (pH 7,4, osmolaridad 290 ± 10 mOsm) y guárdelo a 5 °C. Mantenga el aCSF en hielo mientras se oxigena durante 10 minutos antes de la disección.
        NOTA: El CaCl2 debe agregarse al final, después de que la solución se haya burbujeado con carbógeno durante 10 minutos.
      2. Comience la oxigenación de aCSF fresco y helado (durante al menos 10 minutos).
      3. Instala herramientas de disección y microscopio.
    2. Eutanasia del animal de acuerdo con las directrices institucionales.
    3. Enuclear los ojos con tijeras de resorte curvas-
      1. Dado que los cachorros posnatales tienen los ojos cerrados hasta P11-13 (en ratón) y los párpados deben abrirse con cuidado, use micropinzas para agarrar los párpados y tijeras de resorte para quitarlos. Saque los ojos con cuidado con unas tijeras de resorte, evitando daños oculares.
      2. Cortar el nervio óptico y colocar los ojos en un líquido cefalorraquídeo oxigenado. Utilice una pipeta de transferencia para mover suavemente el ojo entre las placas de Petri.
        NOTA: Para el resto del protocolo de disección, refresque con aCSF oxigenado cada 10 min.
    4. Bajo un microscopio de disección,
      1. Haga una pequeña incisión en la córnea con una aguja mientras estabiliza el ojo con pinzas.
      2. Disecciona la córnea sin rodeos desgarrándola suavemente a lo largo del perímetro escleral.
      3. Retire el iris y la lente. Si la retina está unida al cristalino en animales jóvenes, sepárela suavemente con pinzas.
        NOTA: En los animales jóvenes, la retina a veces está unida al cristalino. Use las pinzas para extraer suavemente el cristalino de la retina, usando un par de pinzas para tirar del cristalino y el otro descansando en los bordes exteriores de la retina para mantener la retina en su lugar mientras se retira el cristalino.
    5. Orienta la retina.
      1. Identifique el lado ventral utilizando el tejido coroideo (ver Sondereker et al.19 para un protocolo detallado sobre la orientación) y colóquelo mirando hacia el investigador con la capa de RGC hacia arriba.
      2. Utilice un bisturí curvo para hacer un corte de referencia de 45° en sentido contrario a las agujas del reloj desde el eje ventral.
      3. Con pinzas finas, separe suavemente la retina del epitelio pigmentado de la retina (EPR) y la esclerótica.
        NOTA: En los ratones más jóvenes, el EPR se despega fácilmente de la retina. En los ratones mayores, el EPR está más adherido a la retina. Si, después de eliminar el EPR de la mayor parte de la retina, el EPR todavía está anclado a la retina a través del nervio óptico, use unas tijeras de resorte para cortar esa conexión. Esto evita el daño al tejido de la retina cerca del nervio óptico.
    6. Las retinas neonatales casi no tienen cuerpo vítreo, pero las retinas más viejas sí (aparecen como un filamento marrón a lo largo del borde de la retina, pero las fibras también se conectan entre sí dentro del humor vítreo). Con las pinzas finas, retire el tejido vítreo que se encuentra por encima de la capa de RGC.
      NOTA: Esta capa fibrosa a veces se desprende cuando se retira la lente. Si no lo hizo, es importante eliminar la mayor cantidad posible, o evitará el contacto adecuado de los RGC con los electrodos.
    7. Con un bisturí, haz cuatro cortes en relieve para ayudar a que la retina quede plana en el plato. Para conocer y mantener la orientación más adelante, recorte las dos esquinas del cuadrante ventral con un bisturí.

2. Montaje de la retina en el chip MEA

  1. Montaje de la retina-
    1. Transfiera suavemente la retina de la placa de Petri al chip MEA utilizando la pipeta de transferencia con la punta cortada. Asegúrese de que haya suficiente aCSF en el chip para cubrir el fondo del pozo.
    2. Utilice el cepillo de un solo pelo para maniobrar suavemente la retina y colocarla por encima de los electrodos, con la capa RGC frente a los electrodos.
    3. Con la pipeta de 10 μL, retire suavemente el exceso de líquido cefalorraquídeo alrededor del tejido de la retina. Incline el chip en ángulo para deshacerse de la CSF adicional.
      NOTA: Nunca toque los electrodos o amplificadores con la punta de la pipeta. A medida que se extirpa el líquido cefalorraquídeo, la retina se aplanará más. Si alguna parte de la retina está doblada debajo de sí misma, use el cepillo de un solo pelo para recoger suavemente debajo de la valva deseada para desplegarla. Para evitar que la retina se mueva mientras se despliega cualquier parte de las valvas, se puede usar un segundo cepillo de un solo cabello para aplicar una presión suave en el centro de la retina, donde se conecta el nervio óptico.
    4. Seque el pocillo tanto como sea posible inclinando la viruta en un ángulo de 45° y retirando lo último del aCSF que se acumula en la parte inclinada de la viruta.
      NOTA: Esto aumentará la conexión entre la retina y los electrodos.
    5. Usa papel de filtro para frotar y secar suavemente los bordes de la retina. Coloque el chip MEA en una cámara de grabación.
  2. Mejora del contacto de los electrodos-
    1. Utilice un inserto de soporte de tejido reemplazable para empujar suavemente la retina sobre los electrodos, lo que garantiza un contacto óptimo y mejora la relación señal-ruido.
      NOTA: El inserto del soporte de pañuelo debe dejar de bajarse tan pronto como entre en contacto con la retina (se verá una clara "mancha húmeda" en el punto de contacto). Si se baja aún más el soporte del electrodo, se corre el riesgo de dañar el tejido de la retina. Transición rápida del paso 2.1.4 al 2.2.1 para minimizar el tiempo que la retina permanece sin LCR oxigenado; Este paso es crítico y debe completarse lo más rápido posible. Es importante moverse rápido al aplanar la retina en el chip, sin embargo, también es importante que la mayor parte del aCSF de la disección se seque para que la retina haga un buen contacto con el electrodo. Ir demasiado rápido para oxigenar la retina corre el riesgo de no tener un buen contacto con los electrodos de registro, y si va demasiado lento se corre el riesgo de que las células de la retina se vuelvan hipóxicas y mueran. Descubrimos que entre 30 y 60 s conduce a un buen contacto y a unas retinas sanas (es decir, observamos las ondas retinianas típicas).
    2. Utilizando el sistema de perfusión de referencia, comience a llenar el pozo del chip MEA con aCSF oxigenado a un caudal de 2 mL/min.
      NOTA: Se recomienda un sistema de perfusión abierta, ya que el ruido eléctrico se mantiene bajo y proporciona aCSF fresco a la retina. Asegúrese de que haya un sistema de calentamiento en línea conectado a la configuración de perfusión para calentar el aCSF a las condiciones fisiológicas.
    3. Encienda el calentador en línea del sistema de perfusión para calentar el aCSF a 32-34 °C.

3. Registros electrofisiológicos

  1. Registros extracelulares-
    1. Encienda el sistema de grabación.
    2. En el equipo de adquisición, haga doble clic primero en el icono Servidor y, a continuación, en Ámbito para abrirlo.
    3. Haga clic en el icono Initialize en la interfaz de Scope e introduzca el ID del chip MEA para iniciar las grabaciones extracelulares utilizando el sistema MEA.
    4. Haga clic en el icono Desplazamiento en la interfaz de Alcance para configurar el desplazamiento.
    5. Ajuste la ganancia y la configuración del filtro para optimizar la detección de la señal. Utilice los ajustes predeterminados de 512 de ganancia y un paso alto de 300 Hz; ajuste la frecuencia de muestreo a 20 kHz.
    6. Seleccione la configuración de grabación adecuada. El área activa total que se puede muestrear es de 3,85 x 2,1 mm2. El software permite a los usuarios elegir cómo configurar el espaciado de los electrodos; Para seguir este protocolo, utilice la configuración predeterminada que distribuye uniformemente los electrodos de registro sobre el área activa máxima, ya que esto muestrea la mayor parte posible de la retina. Esto conduce a un espaciado de 87,5 μm por electrodo de registro.
    7. Deje que la retina se aclimate a la cámara de grabación durante 60 minutos.
    8. Comience a registrar la actividad espontánea de los RGC navegando a la pestaña Ensayo y seleccionando el icono Crear nuevo ensayo . Elija el tipo de ensayo de red , asigne un nombre de archivo adecuado y haga clic en Aceptar para guardar la configuración. Establezca la duración deseada para la grabación ajustando el parámetro Tiempo de grabación (s). Habilite la opción Solo pico para centrarse en los datos de pico y, a continuación, haga clic en el icono Ejecutar ensayo para comenzar la sesión de grabación.
      NOTA: Para grabaciones de ondas retinianas de 10 minutos o más, recomendamos usar la configuración de solo picos , que guarda solo las marcas de tiempo de los potenciales de acción utilizando una herramienta de detección de picos incorporada en lugar de la traza electrofisiológica bruta completa por canal. Esto se debe a que la grabación prolongada (>10 min) en 1.024 canales puede dar lugar fácilmente a archivos de datos del tamaño de TB que son técnicamente difíciles de analizar y ralentizan drásticamente el progreso de la investigación. Hemos confirmado que los datos brutos que utilizan tiempos de picos solo replican las propiedades espacio-temporales conocidas de las ondas retinianas: para las ondas de estadio II, observamos ondas grandes que cubren la mayor parte de la retina y ocurren a frecuencias que coinciden con informes anteriores (ver Figura 2). Observamos que si el proyecto de investigación requiere un análisis más profundo de las formas de onda de los picos, entonces es necesario registrar la traza electrofisiológica en bruto.
    9. Supervise periódicamente la grabación en curso para asegurarse de que la adquisición de datos se realiza según lo esperado y que el sistema funciona correctamente.

4. Procedimiento de limpieza

  1. Una vez que se haya completado la grabación y se hayan guardado los datos, apague el calentador en línea y luego apague el sistema de perfusión.
  2. Retire con cuidado el inserto del soporte de pañuelo y extraiga el chip MEA. Limpie el chip enjuagándolo primero con etanol al 70%, seguido de agua desionizada (DI).
  3. Para evitar la obstrucción de la tubería, enjuague el sistema de perfusión con agua desionizada durante 15 minutos.

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Resultados

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Grabaciones y análisis de ondas retinianas de alto rendimiento con HD-MEAs
Realizamos un registro HD-MEA de ondas retinianas espontáneas de una hora de duración (Figura 2). Un diagrama raster de la actividad neuronal muestra el patrón estructurado de las ondas de la retina, donde cada punto representa un potencial de acción detectado por un electrodo individual (Figura 2A, abajo). La suma de la actividad a través de los elect...

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Discusión

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El protocolo descrito aquí proporciona un método reproducible y de alto rendimiento para preparar el tejido de la retina y realizar grabaciones HD-MEA, lo que ofrece un método robusto para estudiar la actividad de la red de la retina. La tecnología HD-MEA ofrece ventajas significativas sobre las técnicas electrofisiológicas y de imagen tradicionales, especialmente en la captura de datos de alto rendimiento. HD-MEA ofrece grabaciones en tiempo real con una precisión de milisegundos de la ...

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Divulgaciones

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores no tienen conflictos de intereses que declarar.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Con el apoyo de subvenciones de los NIH R00EY030909 a A.T.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Pipeta de transferencia desechable de 3 mL (con el extremo cortado)Fisherbarnd13-711-9CMAyuda a mover la retina entre placas de Petri.
Líquido cefalorraquídeo artificial (LCRa)Mantiene las condiciones fisiológicas para el tejido de la retina; compuesto por NaCl, KCl, NaH2PO4, NaHCO3, CaCl2, MgCl2, glucosa y burbujeo con carbógeno.
CaCl2Fisher ChemicalsC79-500Para preparar líquido cefalorraquídeo artificial (aCSF)
Suministro de carbógeno (95% O2, 5% CO2)Utilizado para oxigenar el aCSF y mantener la viabilidad de los tejidos.
Bisturí de hoja curva (#10)Integra4-110Se utiliza para cortar tejido con precisión.
Microscopio de disección (estereoscopio)ZeissStemi 508Esencial para la visualización y el manejo del tejido de la retina.
glucosaFisher ChemicalsBP350-1Para preparar líquido cefalorraquídeo artificial (aCSF)
Calentador en líneaSistema multicanalTC02Calienta aCSF a 32-34 grados; C para condiciones óptimas.
Sistema de perfusiónIsmatec Ismatec ISM4208Mantiene el flujo continuo de líquido cefalorraquídeo oxigenado.
KClFisher ChemicalsP271-500Para preparar líquido cefalorraquídeo artificial (aCSF)
KH2PO4Sigma AldrichP5504-100gPara preparar líquido cefalorraquídeo artificial (aCSF)
Unidad de registroMaxOne Maxwell BiosystemsMX1-BRDInterfaz entre el chip MaxOne y el sistema
MaxOne SistemaMaxwell BiosystemsSistema MX1-SYSCore para recodificadores electrofisiológicos basados en MEA.
MaxOne Tissue Holder con un micromanipulador de 3 ejes e insertos reemplazablesMaxwell BiosystemsMX1-HLDGarantiza la colocación precisa de la retina en el chip MEA.
Chip MEA (MX1-S-CHP, MaxWell Biosystems)Maxwell BiosystemsMX1-S-CHPMatricial de microelectrodos de alta densidad para el registro de la actividad neuronal.
MgCl2Fisher ChemicalsM33-500Para preparar líquido cefalorraquídeo artificial (aCSF)
NaClFisher ChemicalsS271-1Para preparar líquido cefalorraquídeo artificial (aCSF)
NaHCO3Fisher ChemicalsS233-500Para preparar líquido cefalorraquídeo artificial (aCSF)
Aguja (30 G x ½)BD Biosciences305106Ayuda a realizar incisiones en la córnea.
Animales neonatos (P1-P14; ratón)Organismos modelo como ratones, ratas u otros utilizados para estudios de retina.
PC con el software MaxLab Live ScopeHPZ4Se utiliza para la adquisición de datos y el análisis de grabaciones.
Placa de Petri (35 mm o 60 mm)Pyrex3483E12Se utiliza como espacio de trabajo para la disección.
Pinzas Roboz micro Adson (RS-5232, 4,75" de largo, 1 x 2 dientes, punta de 0,5 mm)Pinzas RobozRS-5232especializadas para disección fina.
Tijeras de resorte Roboz (RS-5671, filo de corte de 10 mm, ancho de punta de 0,15 mm, 3¾ RobozRS-5671Tijeras de precisión para cortar tejidos delicados.
de un solo peloPincel pequeño modificado a un solo pelo para el manejo de tejidos delicados.
Dos pinzas de punta finaRobozRS-5060Se utilizan para la manipulación de tejidos delicados.
Papeles de filtro Whatman (#1), cortados en trozos pequeñosGE Healthcare1001-042Se utilizan para manipular y secar tejido de la retina.
Pincel

Referencias

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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