Modelo tisular tridimensional de alto rendimiento para la cuantificación de umbrales de electroporación

Summary

Este protocolo utiliza modelos computacionales para cuantificar umbrales de electroporación reversibles e irreversibles utilizando la distribución espacial de células transfectadas dentro de un imitador de tejido tridimensional para el análisis de alto rendimiento de protocolos de electroporación.

Abstract

La electroporación es una tecnología prometedora que utiliza pulsos eléctricos para la administración de macromoléculas y la ablación de tejidos blandos, con aplicaciones que incluyen profilácticos de próxima generación y el tratamiento de enfermedades genéticas como el cáncer. Este estudio demuestra un modelo de cultivo de tejidos 3D con capacidad de alto rendimiento para la cuantificación de los umbrales de electroporación reversibles e irreversibles para un protocolo de electroporación determinado. Mediante el uso de un campo eléctrico no uniforme y el análisis de la distribución espacial de las células transfectadas, se pueden identificar umbrales reversibles e irreversibles dentro de una sola muestra, lo que aumenta la eficiencia con la que se pueden caracterizar los protocolos de electroporación, especialmente para la traducción in vivo . Para mostrar esta capacidad, se transfectaron imitadores de tejidos en 3D que contenían células HEK293 utilizando un electrodo de anillo y clavija para administrar un plásmido que codifica GFP. A continuación, se derivaron umbrales de electroporación basados en imágenes de microscopía fluorescente de las muestras transfectadas. Este modelo demuestra potencial para su uso como medio para la evaluación de alto rendimiento de protocolos de electroporación, una ventaja clave sobre los métodos actuales para evaluar estos umbrales, que tienden a requerir mucho tiempo y son menos representativos de las condiciones in vivo .

Introduction

La electroporación reversible (RE) es una metodología bien establecida para administrar una variedad de compuestos y moléculas normalmente impermeables a la membrana en las células ^1,2,3. Aquí, los campos eléctricos pulsados (PEF) se utilizan para lograr una intensidad de campo eléctrico crítica que induce nanoporos transitorios localizados a lo largo de partes de la membrana celular. RE se ha utilizado para administrar una variedad de moléculas y compuestos que van desde colorantes y ácidos nucleicos hasta quimioterapéuticos y otros medicame....

Protocol

Los reactivos y el equipo utilizado en este estudio se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Preparación celular

1. En un gabinete de bioseguridad, coloque 1 × 10⁵ células/ml de la línea celular HEK293 en un volumen de 10 ml por matraz T75 de cultivo de tejidos en el medio esencial mínimo de Eagle suplementado con 10% (v/v) de suero fetal bovino y 1% de penicilina-estreptomicina.
2. Incube las células HEK293 en una incubadora humidificada a 37 °C con un ambiente de 5% de CO₂ .
3. Coseche las células para experimentos 2 días desp....

Results

El electrodo de anillo y clavija administró con éxito un plásmido de ADN que codifica una proteína fluorescente verde (GFP) en imitadores de tejido de colágeno 3D incrustados con células HEK293. La cuantificación exitosa del umbral de RE se logró midiendo el radio exterior de la región transfectada y derivando la intensidad de campo correspondiente del modelo computacional de la configuración experimental, como se ve en la Figura 2. El umbral de IRE se cuanti.......

Discussion

Con este método, se pueden identificar umbrales de electroporación reversibles e irreversibles sin la necesidad de probar múltiples muestras a voltajes discretos. El uso de un campo eléctrico no uniforme permite la cuantificación basada en la distribución espacial de las células transfectadas en el modelo. Sin embargo, existen limitaciones asociadas con esta distribución no uniforme. En primer lugar, los umbrales de RE e IRE descritos en este documento son los umbrales para una transfecc.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0,25% tripsina-EDTA	Gibco	25200056
Puntas de pipeta de 1000 uL	Fisher Scientific	13-811-164
Tubo cónico de 15 ml	Fisher Scientific	14-959-70C
Puntas de pipeta de 200 uL	Fisher Scientific	13-811-139
Agujas de punta roma de acero inoxidable 304	McMaster Carr	75165A753
Tubería de acero inoxidable 316	McMaster Carr	89785K319
Acrílico	McMaster Carr	8505K754
Cabina de bioseguridad	Fisher Scientific	13-261-312
Software CAD	Sistemas Dassault	SolidWorks
Centrífuga	Nuaire	NU-C200R
Electroporador	Hbio	45-0662	En este estudio se utilizó un dispositivo personalizado y un sistema BTX ECM 830
EMEM	Fisher Scientific	MT10009CV	Esto puede variar  si se utiliza una línea celular distinta de HEK293
Placa de cultivo celular multipocillo tratada con TC de fondo plano transparente de 12 pocillos Falcon, con tapa	Corning	353043	Se puede usar cualquier placa de 12 pocillos, solo asegúrese de que se tengan en cuenta las dimensiones del pocillo al fabricar el soporte del electrodo.
FBS	Fisher Scientific	A5670701
Sonda de temperatura de fibra óptica	Micronor Inc.	TS5-20MM-02
GFP-plásmido	Aldeveron	gWiz-GFP
Celdas HEK293	ATCC	CRL-1573	Se pueden usar otras líneas celulares, solo asegúrese de usar el medio de cultivo correcto
Placa calefactora	Refrigeración termoeléctrica America Corporation	AHP-301CPV
Baño de hielo o perlas refrigeradas	Fisher Scientific	10-876-001
Software de análisis de imágenes	Leica	LAS X
Incubadora	Fisher Scientific	15-015-2633
Microscopio de fluorescencia invertida	Leica	DMi8
Cortadora láser	McMaster Carr	7344N11
Penicilina-estreptomicina	Fisher Scientific	15140122
Kit de pipetas	Fisher Scientific	14-388-100
Software de simulación	COMSOL	COMSOL Multifísica 6.2
Matraz T75	Fisher Scientific	156499
Solución de colágeno bovino tipo I	Biomatriz avanzada	5005	3 mg/ml