Method Article

Modelo tisular tridimensional de alto rendimiento para la cuantificación de umbrales de electroporación

DOI:

10.3791/68494

⸱

August 19th, 2025

 ,  ,  , 
1North Carolina State University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este protocolo utiliza modelos computacionales para cuantificar umbrales de electroporación reversibles e irreversibles utilizando la distribución espacial de células transfectadas dentro de un imitador de tejido tridimensional para el análisis de alto rendimiento de protocolos de electroporación.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La electroporación es una tecnología prometedora que utiliza pulsos eléctricos para la administración de macromoléculas y la ablación de tejidos blandos, con aplicaciones que incluyen profilácticos de próxima generación y el tratamiento de enfermedades genéticas como el cáncer. Este estudio demuestra un modelo de cultivo de tejidos 3D con capacidad de alto rendimiento para la cuantificación de los umbrales de electroporación reversibles e irreversibles para un protocolo de electroporación determinado. Mediante el uso de un campo eléctrico no uniforme y el análisis de la distribución espacial de las células transfectadas, se pueden identificar umbrales reversibles e irreversibles dentro de una sola muestra, lo que aumenta la eficiencia con la que se pueden caracterizar los protocolos de electroporación, especialmente para la traducción in vivo . Para mostrar esta capacidad, se transfectaron imitadores de tejidos en 3D que contenían células HEK293 utilizando un electrodo de anillo y clavija para administrar un plásmido que codifica GFP. A continuación, se derivaron umbrales de electroporación basados en imágenes de microscopía fluorescente de las muestras transfectadas. Este modelo demuestra potencial para su uso como medio para la evaluación de alto rendimiento de protocolos de electroporación, una ventaja clave sobre los métodos actuales para evaluar estos umbrales, que tienden a requerir mucho tiempo y son menos representativos de las condiciones in vivo .

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La electroporación reversible (RE) es una metodología bien establecida para administrar una variedad de compuestos y moléculas normalmente impermeables a la membrana en las células 1,2,3. Aquí, los campos eléctricos pulsados (PEF) se utilizan para lograr una intensidad de campo eléctrico crítica que induce nanoporos transitorios localizados a lo largo de partes de la membrana celular. RE se ha utilizado para administrar una variedad de moléculas y compuestos que van desde colorantes y ácidos nucleicos hasta quimioterapéuticos y otros medicamentos 4,5,6,7,8,9,10. Sin embargo, si la intensidad del campo eléctrico aumenta lo suficiente, puede alcanzar un umbral crítico más alto, lo que resulta en una rápida disminución de la viabilidad celular 1,2,11,12. Este proceso se conoce como electroporación irreversible (IRE) y se ha estudiado para la ablación de tejidos blandos, incluso como tratamiento para tumores que de otro modo serían inoperables y arritmias cardíacas 11,12,13,14,15,16. Para comprender los resultados del tratamiento e informar tratamientos futuros, la cuantificación de estos umbrales de RE e IRE es una práctica común en la investigación de electroporación 12,17,18,19,20. Sin embargo, los umbrales de RE e IRE varían según muchos factores, incluido el tipo de celda, el voltaje aplicado, la duración del pulso, el número de pulsos y la velocidad de entrega de pulsos 1,17,18,21,22.

Los protocolos de electroporación tienen una serie de parámetros que dan como resultado umbrales variados de RE e IRE 1,17,18,21,22. Los voltajes de tratamiento y las formas de onda óptimos se han investigado durante mucho tiempo. La mayoría de las tecnologías de electroporación disponibles en el mercado utilizan protocolos con PEF monopolares del orden de 100 μs-10 ms23. Si bien estos protocolos logran resultados clínicamente relevantes, inducen contracciones musculares intensas in vivo 24,25,26. Debido a esto, los pulsos de microsegundos bipolares más cortos, que alivian esta estimulación, se han convertido en un tema de interés reciente 1,11,24. Sin embargo, estos impulsos introducen nuevos factores que afectan los umbrales de RE e IRE, incluida la simetría del pulso, la duración de la ráfaga y la dependencia de la temperatura 1,17,22,27. Además, también se ha demostrado que el tipo de célula y las propiedades de los tejidos afectan significativamente los resultados de RE e IRE 19,28,29. A medida que el campo continúa evolucionando, es necesario caracterizar aún más cómo estos factores y sus interacciones entre sí y otros posibles factores ambientales afectan los umbrales de RE e IRE, lo que hace cada vez más necesario mejorar la eficiencia experimental para permitir una experimentación de mayor rendimiento.

Los experimentos típicos de electroporación in vitro prueban protocolos mediante el tratamiento de células en una cubeta con placas conductoras paralelas, lo que da como resultado una distribución uniforme del campo eléctrico dentro de la cubeta durante el tratamiento 19,30,31,32,33,34. Como se mencionó anteriormente, es necesario identificar los umbrales de RE y/o IRE de un protocolo para identificar un voltaje aplicado óptimo para un tratamiento determinado. Para que esto se logre en los estudios de cubetas, se deben tratar múltiples cubetas, cada una con voltajes aplicados discretos. Esto requiere un número significativo de muestras que deben prepararse, tratarse y analizarse por separado, lo que limita el rendimiento experimental. Para mejorar este proceso, se han desarrollado modelos de cultivo 2D35,36 y 3D 13,20,27,37,38,39 para evaluar un continuo de intensidades de campo en una sola muestra mediante el uso de electrodos que crean distribuciones de campo no uniformes 13,20,27,37,38,39. Los umbrales RE e IRE se derivan de modelos computacionales de la distribución del campo eléctrico 13,20,27,37,38. Esto reduce en gran medida la cantidad de muestras necesarias, lo que permite un enfoque de mayor rendimiento para la cuantificación de umbral.

Este artículo tiene como objetivo demostrar este enfoque para la cuantificación de campos de RE e IRE en un modelo in vitro 3D para demostrar su potencial como medio para la evaluación eficiente de protocolos de electroporación en varios entornos (por ejemplo, tipos de células, parámetros de tratamiento, moléculas a administrar).

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los reactivos y el equipo utilizado en este estudio se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Preparación celular

  1. En un gabinete de bioseguridad, coloque 1 × 105 células/ml de la línea celular HEK293 en un volumen de 10 ml por matraz T75 de cultivo de tejidos en el medio esencial mínimo de Eagle suplementado con 10% (v/v) de suero fetal bovino y 1% de penicilina-estreptomicina.
  2. Incube las células HEK293 en una incubadora humidificada a 37 °C con un ambiente de 5% de CO2 .
  3. Coseche las células para experimentos 2 días después de la siembra retirando los medios de cultivo y tratando las células con 4 ml de tripsina-EDTA al 0,25%.
  4. Incubar las células y la tripsina durante 3-5 min en una incubadora humidificada a 37 °C con un ambiente de 5% de CO2 o hasta que las células se desprendan de la superficie de cultivo.
  5. Inactivar la actividad enzimática de la tripsina agregando 4 ml del medio de cultivo.
  6. Granular las células centrifugando durante 5 min a 180 × g y volver a suspender en medio de cultivo hasta una concentración final de 8 × 106 células/mL.

2. 3D creación de modelos de tejido

NOTA: Utilice el pipeteo inverso para estos pasos para evitar la introducción de burbujas de aire en la mezcla.

  1. En un gabinete de bioseguridad, mezcle bien la suspensión celular preparada de 8 × 106 células/ml con la solución de colágeno bovino tipo I (3 mg/ml) en una proporción de 1:1. Colóquelo en hielo o en un baño de perlas frías para evitar la polimerización prematura mientras trabaja con la mezcla.
  2. Pipetear 500 μL de la solución combinada para recubrir el fondo de cada pocillo de una placa de 12 pocillos. Asegúrese de que el gel cubra el fondo de manera uniforme comenzando a dispensar la solución en el centro del pocillo y luego girando suavemente en espiral hacia afuera.
  3. Gire suavemente la placa para asegurarse de que los bordes del gel entren en contacto con las paredes del pozo.
  4. Incube los geles en una incubadora humidificada a 37 °C con un ambiente de 5% deCO2 durante 6 h o hasta que los geles se vuelvan firmes y no se muevan al inclinar la placa.
  5. Incline la placa de pocillos y agregue suavemente 500 μL de medio de cultivo a cada pocillo dejando que se deslice por la pared de la placa al menos 1 h antes del tratamiento. Los geles deben tratarse dentro de las 48 h posteriores a la creación.

3. Fabricación de electrodos

  1. Retire la conexión Luer de plástico de dos agujas de jeringa de punta roma de acero inoxidable 304 de 1,64 mm. Deje una aguja a un lado para que sirva como electrodo de clavija. Para la otra aguja, aplana los últimos 5 mm de un extremo.
  2. Cree el electrodo de anillo cortando una sección de tubo de acero inoxidable 316 de 19 mm de diámetro exterior que sea lo suficientemente largo como para asentarse al ras contra la parte inferior de la placa del pocillo.
  3. Diseñe un portaelectrodos como se ve en la Figura 1 con software CAD. Asegúrese de que el soporte tenga un orificio central para el electrodo de pasador, una ranura para el electrodo de anillo y un orificio que se cruce con la ranura para que se pueda insertar la aguja aplanada para crear un ajuste a presión que mantenga el electrodo de anillo en su lugar.
    1. Además, asegúrese de que el soporte tenga un labio diseñado para encajar perfectamente en una placa de 12 pocillos y para centrar los electrodos de anillo y pasador en el pocillo de modo que los electrodos y el pocillo sean coaxiales38.
  4. Fabricar el portaelectrodos de acrílico utilizando técnicas establecidas de corte por láser40.
  5. Ensamble el electrodo colocando los electrodos de anillo y pasador en el soporte del electrodo.
  6. Asegure el electrodo anular ajustando a presión la aguja con un extremo aplanado en el soporte.

4. Tratamiento del modelo de tejido 3D con electroporación

  1. En un gabinete de bioseguridad, incline la placa y aspire 400 μL de medios de cultivo de cada pocillo. Tenga cuidado de no entrar en contacto con el gel. Se deben dejar 100 μL de medios en cada pocillo aspirado para mantener la hidratación del gel. Si hay menos de 400 μL de líquido para aspirar (la pipeta no deja líquido/extrae aire), agregue 100 μL de medio de cultivo.
  2. Agregue 20 μL de solución plásmida GFP de 5 μg/μL a estos pocillos aspirados (para un volumen total de 120 μL por pocillo) inclinando la placa y agregando el reactivo al fluido que se acumula contra la pared de cada pocillo. Gira suavemente para asegurarte de que se extienda uniformemente por la superficie del gel.
  3. Incubar los geles en una incubadora humidificada a 37 °C con un ambiente de 5% deCO2 durante 10 min.
  4. Inserte la sonda de temperatura de fibra óptica en el electrodo de clavija y comience a leer la temperatura.
  5. Conecte el cable positivo del electroporador al electrodo de clavija y el cable negativo a la aguja que asegura el electrodo de anillo.
  6. Encienda la placa caliente y caliente los geles para que mantengan una temperatura de 37 °C.
  7. Inserte el electrodo de anillo y pasador con sonda de temperatura de fibra óptica en el pasador en el pozo. Asegúrese de que el pin esté perpendicular a la placa y que ambos electrodos estén completamente en contacto con el gel.
  8. Asegúrese de que el gel esté a 37 °C.
  9. Administrar tratamiento de electroporación.
  10. Agregue 100 μL de medios a los geles que parezcan secos.
  11. Repita los pasos 4.7-4.10.
  12. Una vez finalizados todos los tratamientos, incubar los geles en una incubadora humidificada a 37 °C con un ambiente de 5% deCO2 durante 10 min.
  13. Incline la placa de pocillos y agregue suavemente 500 μL de medio de cultivo a cada pocillo dejando que se deslice por la pared de la placa.
  14. Incubar los geles en una incubadora humidificada a 37 °C con un ambiente de 5% deCO2 durante 24 h.

5. Lavado e imágenes

  1. Incline la placa y aspire los medios de cultivo de cada pocillo. Tenga cuidado de no entrar en contacto con el gel.
  2. Incline la placa y agregue suavemente 500 μL de solución salina tamponada con fosfato (PBS) a cada pocillo dejando que se deslice por la pared de la placa.
  3. Incubar los geles en una incubadora humidificada a 37 °C con un ambiente de 5% deCO2 durante 5 min.
  4. Incline la placa y aspire el PBS de cada pocillo. Tenga cuidado de no entrar en contacto con el gel.
  5. Incline la placa y agregue suavemente 500 μL de solución salina tamponada con fosfato (PBS) a cada pocillo dejando que se deslice por la pared de la placa.
  6. Gire suavemente la placa, inclínela y aspire el PBS de cada pocillo. Tenga cuidado de no entrar en contacto con el gel.
  7. Agregue 100 μL de PBS fresco para mantener los geles hidratados para la obtención de imágenes.
  8. Placa de imagen mediante técnicas estándar de microscopía fluorescente. Esto debería producir imágenes de geles con una región verde distintiva en forma de toroide donde los umbrales de campo eléctrico reversibles e irreversibles limitan los bordes exterior e interior de la región, respectivamente.
  9. Incline la placa de pocillos y agregue suavemente 500 μL de medio de cultivo a cada pocillo dejando que se deslice por la pared de la placa.
  10. Incubar los geles en una incubadora humidificada a 37 °C con un ambiente de 5% deCO2 durante 24 h.
  11. Repita los pasos 5.1 a 5.10 para cada punto de tiempo.

6. Creación de modelos computacionales

  1. Abra un software de simulación física y cree un nuevo modelo axisimétrico 2D que utilice las corrientes eléctricas, las transferencias de calor en sólidos y la física de calentamiento electromagnético.
  2. Cree parámetros para el voltaje, la temperatura ambiente, la temperatura de la placa caliente, el punto de ajuste de temperatura, la velocidad de suministro de pulsos, la dosis eléctrica integrada y las dimensiones de los electrodos de anillo y pasador, el gel y la placa de pocillos de la configuración experimental.
  3. Cree geometrías de dominio que representen una sección transversal radial de los electrodos de anillo y pasador, el gel y la placa de pocillos de la configuración experimental como se ve en la Figura 2A.
  4. Coloque un punto de sonda dentro del electrodo central a la mitad de la altura del gel para representar la sonda de temperatura de fibra óptica utilizada durante la experimentación in vitro.
  5. Cree una función por partes que use la temperatura como argumento de entrada.
  6. Defina la función de modo que su valor sea 1 cuando la temperatura sea menor que el parámetro de consigna de temperatura definido en el paso 6.2 y 0 en caso contrario.
  7. Aplique una condición de límite de voltaje a la superficie superior de la geometría del dominio que representa el electrodo de clavija y establezca el valor de voltaje en el parámetro de voltaje definido en el paso 6.2 multiplicado por la función por partes del paso 6.6 evaluado a la temperatura del punto de sonda creado en el paso 6.4.
  8. Aplique una condición de contorno de suelo a la superficie superior de la geometría de dominio que representa el electrodo de anillo.
  9. Aplique una condición de contorno de aislamiento eléctrico a todos los límites de dominio restantes.
  10. Cree una función continua que use la temperatura.
  11. Defina la función utilizando un modeloestablecido 27 de la conductividad dependiente de la temperatura del gel de colágeno como 0.8277 + 0.0323 * T.
  12. Defina un material personalizado y establezca la conductividad eléctrica en la función continua definida en el paso 6.11. Aplique este material al dominio del gel.
  13. Defina materiales o use valores predeterminados de software si están disponibles para asignar materiales de acero inoxidable 304 y 316 a los dominios de electrodos de pasador y anillo, respectivamente, y poliestireno a los dominios de placa de pocillos.
  14. Aplique una condición de contorno de temperatura a la base del modelo y establezca el valor de temperatura en 37 °C.
  15. Aplique una condición de contorno de radiación ambiental superficial a todos los demás bordes de dominio que no interactúen con otro dominio y establezca la emisividad en 0,97, 0,9 y 0,075, dependiendo de si el dominio formaba parte de la placa, el gel o el electrodo, respectivamente27.
  16. Agregue una malla triangular libre al modelo. Establezca el tamaño del elemento en Más fino.
  17. Si evalúa una variedad de niveles de parámetros, cree un barrido paramétrico que enumere todos los valores en los que se va a evaluar un parámetro.
  18. Ejecute la simulación haciendo clic en el botón Calcular .
  19. Al finalizar, cree un gráfico de línea de corte 2D del campo eléctrico en la sección Resultados.
  20. Defina la línea de corte que pasará del electrodo de clavija al electrodo de anillo a través del centro del dominio de gel. Esto debería resultar en una caída exponencial desde el borde del electrodo de clavija hasta el borde del electrodo de anillo.
  21. Exporte los datos de trazado como un archivo .csv o .xlsx para crear una tabla de búsqueda.

7. Derivación del umbral

  1. Con el software del microscopio, mida el diámetro de los bordes exterior e interior de la región en forma de toroide a lo largo de los ejes vertical y horizontal. Si el software no tiene esta capacidad, use ImageJ para hacerlo.
  2. Promedia los diámetros exterior e interior, respectivamente, y divídelos por dos para calcular los radios exterior e interior de la región en forma de toroide. El radio exterior delimita el umbral RE. El radio interior marca el umbral IRE.
  3. Usando la tabla de búsqueda creada en el paso 6.21, derive la intensidad del campo eléctrico en los radios medidos.

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El electrodo de anillo y clavija administró con éxito un plásmido de ADN que codifica una proteína fluorescente verde (GFP) en imitadores de tejido de colágeno 3D incrustados con células HEK293. La cuantificación exitosa del umbral de RE se logró midiendo el radio exterior de la región transfectada y derivando la intensidad de campo correspondiente del modelo computacional de la configuración experimental, como se ve en la Figura 2. El umbral de IRE se cuanti...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Con este método, se pueden identificar umbrales de electroporación reversibles e irreversibles sin la necesidad de probar múltiples muestras a voltajes discretos. El uso de un campo eléctrico no uniforme permite la cuantificación basada en la distribución espacial de las células transfectadas en el modelo. Sin embargo, existen limitaciones asociadas con esta distribución no uniforme. En primer lugar, los umbrales de RE e IRE descritos en este documento son los umbrales para una transfecc...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores no tienen divulgaciones.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este trabajo se realizó en la Universidad Estatal de Carolina del Norte y fue financiado por los Institutos Nacionales de Salud (R01CA272550).

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
0,25% tripsina-EDTAGibco25200056
Puntas de pipeta de 1000 uLFisher Scientific13-811-164
Tubo cónico de 15 mlFisher Scientific14-959-70C
Puntas de pipeta de 200 uLFisher Scientific13-811-139
Agujas de punta roma de acero inoxidable 304McMaster Carr75165A753
Tubería de acero inoxidable 316McMaster Carr89785K319
AcrílicoMcMaster Carr8505K754
Cabina de bioseguridadFisher Scientific13-261-312
Software CADSistemas DassaultSolidWorks
CentrífugaNuaireNU-C200R
ElectroporadorHbio45-0662En este estudio se utilizó un dispositivo personalizado y un sistema BTX ECM 830
EMEMFisher ScientificMT10009CVEsto puede variar  si se utiliza una línea celular distinta de HEK293
Placa de cultivo celular multipocillo tratada con TC de fondo plano transparente de 12 pocillos Falcon, con tapaCorning353043Se puede usar cualquier placa de 12 pocillos, solo asegúrese de que se tengan en cuenta las dimensiones del pocillo al fabricar el soporte del electrodo.
FBSFisher ScientificA5670701
Sonda de temperatura de fibra ópticaMicronor Inc.TS5-20MM-02
GFP-plásmidoAldeverongWiz-GFP
Celdas HEK293ATCCCRL-1573Se pueden usar otras líneas celulares, solo asegúrese de usar el medio de cultivo correcto
Placa calefactoraRefrigeración termoeléctrica America CorporationAHP-301CPV
Baño de hielo o perlas refrigeradasFisher Scientific10-876-001
Software de análisis de imágenesLeicaLAS X
IncubadoraFisher Scientific15-015-2633
Microscopio de fluorescencia invertidaLeicaDMi8
Cortadora láserMcMaster Carr7344N11
Penicilina-estreptomicinaFisher Scientific15140122
Kit de pipetasFisher Scientific14-388-100
Software de simulaciónCOMSOLCOMSOL Multifísica 6.2
Matraz T75Fisher Scientific156499
Solución de colágeno bovino tipo IBiomatriz avanzada50053 mg/ml

References

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