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Artículo de método

Enfoque escalable paso a paso de la producción sostenible de bioplásticos a partir de residuos alimentarios

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DOI:

10.3791/68499

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18 de julio de 2025

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biological Systems Engineering, Virginia Polytechnic Institute and State University, 2Quasar Energy Group, 3Department of Environmental Science and Technology, University of Maryland

En este artículo

Resumen

Este protocolo presenta un método escalable para convertir los residuos de alimentos en bioplásticos biodegradables de polihidroxialcanoato (PHA). Utiliza la digestión anaeróbica detenida para el pretratamiento de residuos de alimentos, la fermentación microbiana halófila para la biosíntesis de PHA y un proceso posterior libre de químicos para la recuperación de PHA.

Resumen

La crisis mundial de los microplásticos, junto con los crecientes desafíos de la eliminación de residuos alimentarios, requiere soluciones innovadoras para abordar juntos estos problemas ambientales. Los polihidroxialcanoatos (PHA) son bioplásticos únicos que son totalmente biodegradables en todos los entornos, incluidos los ecosistemas marinos, lo que ofrece una alternativa sostenible a los plásticos derivados del petróleo. Al mismo tiempo, la utilización de los residuos alimentarios como materia prima para la producción de PHA proporciona una estrategia eficaz para mitigar los retos de la eliminación de los residuos alimentarios al tiempo que se producen plásticos biodegradables de alto valor. Este estudio proporciona un protocolo paso a paso para producir PHA a partir de residuos de alimentos, haciendo hincapié en el cuidado crítico requerido para garantizar un alto contenido y calidad de PHA celular. El proceso comienza con la digestión anaeróbica detenida, que convierte los residuos de alimentos en ácidos grasos volátiles (AGV) asimilables microbianamente manteniendo un entorno anaeróbico y optimizando los parámetros, como el tiempo de retención de sólidos, para maximizar la producción de AGV, un precursor clave para la síntesis de PHA. El digestato rico en AGV se utiliza para cultivar Haloflex mediterranei, un microorganismo halófilo capaz de acumular PHA hasta el 66% ± el 5% de su peso de células secas. El ambiente de cultivo de alta salinidad de H. mediterranei evitó la contaminación del cultivo, asegurando una producción óptima de PHA. El crecimiento celular se monitorea midiendo la densidad óptica para determinar el momento ideal para la recolección de PHA. Las células se lisan utilizando un método a base de agua libre de químicos que aprovecha un gradiente de presión osmótica, logrando una recuperación de PHA del 93% ± 3%, seguida de una purificación de PHA a base de solventes para obtener una pureza de PHA del 96% ± 2%. Cada paso es vital para garantizar la producción de plásticos biodegradables de alta calidad. Este documento proporciona métodos detallados para la digestión anaeróbica detenida, la fermentación de cultivos puros, la lisis celular sin productos químicos y la purificación de PHA a base de solventes, ofreciendo un enfoque escalable y sostenible para convertir los desechos de alimentos en bioplásticos biodegradables adecuados para aplicaciones piloto y a gran escala.

Introducción

La contaminación por plásticos y la eliminación de residuos de alimentos son preocupaciones medioambientales crecientes, lo que pone de manifiesto la necesidad de enfoques innovadores que aborden ambos retos mediante la gestión sostenible de los residuos y el desarrollo de materiales1. Los plásticos convencionales derivados del petróleo son los principales contribuyentes a la contaminación ambiental y a la contaminación por microplásticos, y persisten en los vertederos y los ecosistemas acuáticos durante siglos2. Los polihidroxialcanoatos (PHA), una clase de bioplásticos microbianos, ofrecen una alternativa totalmente biodegradable con propiedades mecánicas comparables a las de los plásticos convencionales, al tiempo que garantizan una degradación completa en entornos naturales3. Sin embargo, los altos costos de producción de los PHA siguen siendo un obstáculo importante para la adopción comercial generalizada4. Un enfoque prometedor para superar esta limitación es aprovechar los residuos orgánicos como una fuente de carbono rentable para la biosíntesis microbiana de PHA, ya que la materia prima representa aproximadamente el 50% de los gastos totales de producción en los procesos industriales actuales que dependen de fuentes de carbono puro como el almidón de maíz o la glucosa5. Al valorizar los residuos, este enfoque no solo desvía el material orgánico de los vertederos, sino que también lo transforma en una alternativa sostenible a los plásticos derivados del petróleo, abordando simultáneamente los problemas de acumulación de residuos y contaminación plástica.

H. mediterranei, un microorganismo halófilo, demuestra un gran potencial para utilizar materias primas derivadas de residuos para la producción de PHA debido a su capacidad para prosperar en condiciones de alta salinidad (2-5 M de NaCl), lo que naturalmente evita la contaminación al inhibir el crecimiento de microbios no halófilos6. Este entorno de alta salinidad elimina la necesidad de una esterilización estricta en la fermentación industrial, lo que reduce los costos operativos. A diferencia de los productores tradicionales de PHA bacteriano, H. mediterranei metaboliza de manera eficiente una amplia gama de fuentes de carbono derivadas de desechos y se ha informado que acumula PHA hasta el 70% de su peso de celda seca (DCW) como mecanismo de respuesta al estrés 7,8. Además, su entorno de alta salinidad permite un procesamiento posterior sencillo, ya que el choque osmótico inducido por la inmersión en agua interrumpe eficazmente las células, lo que permite la liberación de PHA sin necesidadde tratamientos enzimáticos o químicos. Estas ventajas posicionan a H. mediterranei como un candidato ideal para la producción escalable de bioplásticos a partir de residuos.

Los estudios existentes han explorado varios materiales de desecho, incluido el suero de queso, las aguas residuales de los molinos de aceitunas y los residuos agroindustriales, para la fermentación de PHA por H. mediterranei 6,10,11,12,13,14,15,16,17,18 . La alta variabilidad de la composición de los residuos presenta un desafío significativo, que requiere diferentes estrategias de pretratamiento, como la hidrólisis enzimática, la hidrólisis ácida o el procesamiento térmico, antes de la asimilación microbiana 11,17,19,20. En este caso, la digestión anaeróbica detenida (aAD) proporciona una solución escalable al convertir diversos residuos de alimentos en un digestato homogéneo rico en ácidos grasos volátiles (AGV), que sirve como precursor directo para la síntesis de PHA por H. mediterranei21,22. Este proceso mejora la consistencia de la materia prima y mitiga la variabilidad del sustrato, al tiempo que mejora la eficiencia de la fermentación microbiana.

A pesar de su potencial, solo unos pocos estudios han demostrado con éxito este proceso de dos etapas que integra la fermentación de aAD y PHA microbiano para la conversión general de residuos de alimentos en bioplástico por H. mediterranei 23,24,25. Este estudio proporciona un protocolo detallado paso a paso que cubre el pretratamiento de residuos alimentarios, la producción de AGV por ADA semicontinuo y la fermentación de cultivo puro de H. mediterranei para la producción de PHA. Además, mientras que estudios previos han validado la extracción de PHA a base de agua de H. mediterranei, ninguno ha cuantificado la eficiencia y pureza de la recuperación de PHA utilizando este método11,18. Este estudio aborda esta brecha demostrando el método de recuperación de PHA libre de químicos que utiliza la lisis osmótica con agua y cuantificando su eficiencia de recuperación en comparación con los métodos tradicionales de recuperación de PHA basados en hipoclorito de sodio (NaClO)26. Además, este estudio evalúa la pureza del PHA recuperado con agua, proporcionando una evaluación exhaustiva de su eficacia para la producción escalable de bioplásticos.

Para cerrar la brecha entre la viabilidad a escala de laboratorio y la implementación industrial, este protocolo está diseñado para la escalabilidad en aplicaciones industriales, incorporando la fermentación aAD y PHA a escala piloto, junto con la centrifugación de disco para la separación celular, una técnica ampliamente utilizada en bioprocesamiento y fermentación microbiana a gran escala27. Al optimizar la conversión de residuos alimentarios en bioplásticos, este método apoya la industrialización de la valorización de residuos a gran escala, avanzando en las iniciativas de bioeconomía circular. La integración de materias primas derivadas de residuos, fermentación halófila y una estrategia de recuperación de PHA respetuosa con el medio ambiente permite una conversión eficiente de residuos en biopolímeros, reduciendo la dependencia de los plásticos basados en combustibles fósiles y promoviendo la producción sostenible de bioplásticos.

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Protocolo

1. Recogida y preparación de residuos alimentarios

  1. Recoja los desechos de alimentos de los restaurantes locales, como se muestra en la Figura 1A. Evaluar visualmente los residuos obtenidos. Las observaciones revelaron que los residuos consistían principalmente en cáscaras de verduras, carne cruda desechada y componentes ricos en carbohidratos como arroz y fideos. Es posible que sea necesario medir la relación carbono/nitrógeno (C:N) como se detalla en los pasos 5.1 y 5.2, y ajustarla si el desperdicio de alimentos es predominantemente rico en carbono, con una relación C:N óptima cercana a 20:128.
  2. Coloque 10 kg de desechos de alimentos en un balde de 5 galones y agregue 2.5 L de agua. Conecte la licuadora a una fuente de alimentación. Sumerja la cuchilla en la mezcla de desperdicios de alimentos y agua, luego presione el botón Inicio para comenzar a mezclar. Mezcle durante al menos 30 min hasta que esté completamente homogeneizado (Figura 1B). Mueva la cuchilla hacia arriba y hacia abajo para garantizar una mezcla completa de los desechos de alimentos.
    PRECAUCIÓN: Para evitar el sobrecalentamiento, es posible que sea necesario soltar el botón de inicio de la licuadora durante 1 minuto después de cada 2 minutos de funcionamiento.
  3. Después de licuar, retira la licuadora y límpiala con agua caliente y jabón para platos. Cubra el cubo con una tapa, etiquete el cubo con el nombre de la muestra y la fecha de preparación, y guárdelo a 4 °C, si no se utiliza inmediatamente.
    NOTA: Debido a las variaciones en las propiedades de los residuos de alimentos recolectados de diferentes fuentes y momentos, los parámetros básicos de la suspensión preparada, como los sólidos totales (TS) y los sólidos volátiles (VS), deben medirse en función del paso 5.1 después de cada preparación para garantizar entradas precisas de TS y VS para su uso posterior. En este protocolo, 4 °C es para el almacenamiento a corto plazo (menos de 7 días) y -20 °C se utiliza para el almacenamiento a largo plazo.

figure-protocol-1
Figura 1: Comparación visual de los residuos de alimentos de restaurantes antes y después de la homogeneización. Las fotografías muestran (A) desperdicio de alimentos crudos y (B) lodo de desperdicio de alimentos homogeneizado. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

2. Producción de VFA a través de aAD

  1. Funcionamiento de un digestor aAD a escala piloto (100 L) (Figura 2A) para la conversión de residuos alimentarios en AGV.
    1. Compruebe la conexión de alimentación y la hermeticidad del digestor piloto aAD. Ajuste la temperatura del digestor a 35 °C y la velocidad de agitación a 150 rpm.
    2. Presione el botón Raise para levantar la tapa del digestor. Deténgase una vez que la tapa se eleve unos 40 cm presionando el botón Stop .
    3. Añadir el cultivo recogido de un digestor de semillas aAD en el digestor piloto aAD hasta que alcance un volumen de trabajo de 80 L. La información detallada sobre el digestor de semillas se puede encontrar en un estudio previo25.
    4. Presione el botón inferior hasta que la tapa esté completamente cerrada, luego asegúrela con las abrazaderas. Esto asegura que el digestor mantenga las condiciones anaeróbicas.
    5. En este estudio se mantuvo un tiempo de retención sólido (TRS) de 9 días en el digestor aAD. Alimente y descargue 1/3 del volumen de trabajo del digestor (aproximadamente 26,7 L) cada 3 días como se describe a continuación.
      NOTA: La digestión anaerobia tradicional se opera con una SRT de 14-30 días para la producción de metano29,30. Aquí se emplea un SRT corto de 9 días para inhibir la metanogénesis, promoviendo la acumulación de AGV para el éxito de la EA.
    6. Descarga de una parte del contenido de aAD antes de la alimentación. Para facilitar la descarga y evitar obstrucciones, aumente temporalmente la velocidad de agitación del digestor de 150 rpm a 200 rpm y mantenga esta velocidad durante 20 minutos antes de descargar.
      NOTA: El aumento de la velocidad de agitación asegura una distribución uniforme de las partículas sólidas en el digestato, lo que facilita la descarga y el muestreo homogéneo.
    7. Abra la válvula de descarga en la parte inferior del digestor piloto aAD y descargue 1/3 del volumen de trabajo de digestato. Recoja el digestato descargado en cubos y guárdelos a 4 °C para el análisis de AGV y la posterior separación sólido-líquido en el paso 2.2.
    8. Utilice una tasa de carga orgánica (OLR) de 2,5 g VS/L-día, y el VS de la lechada de residuos de alimentos promedió ~14,5% (Tabla 1). Para ello, se requieren 4,1 kg de peso húmedo de la lechada de residuos alimentarios según la Ecuación 1 para lograr el OLR diseñado. Tome una muestra de este purín de 4,1 kg y colóquelo en un cubo separado para alimentarlo más tarde.
      Peso húmedo de los purines alimentarios a alimentar = figure-protocol-2 (1)
      en el que el OLR es de 2,5 g VS/L-día, el intervalo de alimentación es de 3 días, el volumen de trabajo es de 80 L y el VS es del 14,5%.
    9. Agregue agua a un balde separado que contenga los 4,1 kg de estiércol de residuos de alimentos de peso húmedo antes mencionados hasta alcanzar el volumen calculado a partir de la Ecuación 2, que es de 26,7 L en este ejemplo.
      figure-protocol-3(2)
      Donde el intervalo de alimentación es de 3 días, el volumen de trabajo es de 80 L y el SRT es de 9 días.
    10. Utilice una bomba peristáltica para alimentar esta lechada de residuos de alimentos de 26,7 L en el digestor aAD de la Figura 2A. Asegúrese de que el tubo de entrada de la bomba peristáltica permanezca sumergido en el líquido del cubo de alimentación hasta que se transfiera todo el líquido.
      NOTA: Durante el proceso de admisión, el tubo puede vibrar ligeramente, lo cual es normal.
    11. Apague la bomba y desconecte la alimentación. Restablezca la velocidad de agitación del digestor piloto a 150 rpm durante 30 min para homogeneizar el nuevo alimento con el digestato existente.
    12. Descargue 3 L de digestato homogeneizado en un cubo para ajustar el pH. Dispense 100 mL del digestato homogeneizado de 3 L en un vaso de precipitados y mida el pH.
    13. Agregue gradualmente gránulos de NaOH en el digestato de 100 mL hasta que su pH alcance 5.5. Para calcular el peso de los gránulos de NaOH agregados, calcule la pérdida de peso del contenedor de gránulos de NaOH antes y después del ajuste del pH.
    14. Agregue gránulos de NaOH en proporción al volumen del digestato en el digestor piloto en la Figura 2A para ajustar el pH a 5.5. Por ejemplo, si se necesitan 0,09 g de gránulos de NaOH para ajustar 100 mL de digestato homogeneizado a un pH de 5,5, es necesario cargar 72 g de gránulos de NaOH en el digestor piloto aAD porque su volumen de trabajo es de 80 L, es decir, 80 L / 0,1 L × 0,09 g = 72 g.
      NOTA: Debido a que el rango de pH ideal para aAD es 5-5.531, después de cada alimentación, el pH debe ajustarse a 5.5. Durante el aAD, el pH siempre bajará debido a la reacción de acidificación. Por lo tanto, se recomienda encarecidamente seguir los pasos 2.1.13 a 2.1.16 para verificar y ajustar el pH diariamente, si es necesario.
    15. Revise el digestor piloto para asegurarse de que todas las válvulas estén cerradas y ajuste la velocidad de agitación a 150 rpm para proporcionar una mezcla intermitente para el próximo ciclo de operación aAD.
      NOTA: El digestor piloto aAD en este estudio funciona en modo semicontinuo para imitar los procesos industriales32.
  2. Separación de sobrenadante para la recuperación de AGV para la fermentación de PHA
    1. Encienda el interruptor de alimentación principal de la centrífuga de disco.
    2. Espere hasta que aparezca el texto STANDSTILL en la pantalla del sistema de interfaz hombre-máquina (HMI). Verifique que el nivel de aceite lubricante esté por encima del umbral mínimo.
    3. Abra la válvula de la línea de suministro de agua y ajuste la presión a 45 psi. Abra la válvula de la línea de servicio aéreo y ajuste la presión a 90 psi.
    4. Presione el botón verde en la pantalla del sistema HMI para iniciar el proceso de producción de la centrífuga de disco. Espere a que el sistema complete sus comprobaciones.
    5. Supervise hasta que el sistema alcance la velocidad máxima establecida, que se indica mediante STANDBY en la pantalla del sistema HMI.
      NOTA: La velocidad de la centrífuga de disco se establece en su capacidad máxima para una separación de alta eficiencia.
    6. Asegúrese de que la manguera de entrada esté sumergida en el contenedor de digestato descargado. Conecte el tubo de salida del sobrenadante de la centrífuga de disco a un balde vacío de 5 galones para recolectar el sobrenadante, que se utilizará para la fermentación posterior de PHA. Conecte la salida de sólidos a un balde vacío separado para recolectar los sólidos residuales del digestato (Figura 2B).
    7. Utilice la bomba peristáltica para alimentar el digestato a la entrada de la centrífuga de disco. Mientras tanto, haga clic en el botón PROD en la pantalla del sistema HMI. PROD son las siglas en inglés de Producción.
    8. Ajuste la válvula de entrada para mantener un caudal entre 0,2-0,5 m3/h y una contrapresión entre 0,5-1 bar.
      NOTA: El sobrenadante circula para obtener una mayor relación de separación durante el proceso de producción, que se refiere a la etapa de separación sólido-líquido de la centrífuga de disco, mientras que los sólidos se acumulan en la centrífuga de disco.
    9. Después de 30 minutos del proceso de producción, presione el botón Descarga en la pantalla del sistema HMI para descargar los sólidos y el sobrenadante en el cubo respectivo (Figura 2B).
      NOTA: Este paso se basa en una comprobación visual, ya que la eficiencia de la separación en términos de TS no se puede medir instantáneamente. Por lo general, 30 minutos de operación son suficientes para lograr la separación deseada de sobrenadante y residuo sólido.
    10. Almacenar el sobrenadante recogido a 4 °C para su posterior fermentación con PHA. Deseche los sólidos residuales de acuerdo con las regulaciones de eliminación de biorresiduos o recircuélvalos de regreso al digestor aAD para su posterior digestión.
    11. Inicie el ciclo de limpieza in situ (CIP) seleccionando el botón CIP en la pantalla HMI. Lave la centrífuga de disco siguiendo los pasos especificados en la Tabla 2.
      NOTA: Se utiliza una bomba peristáltica para alimentar y descargar los medios de lavado. Este paso de lavado es importante para el mantenimiento del equipo.
    12. Después de completar el lavado, apague y desconecte la bomba peristáltica, y luego presione el botón PROD para asegurarse de que la centrífuga de disco descargue todo del tanque de separación. Reduzca la velocidad de rotación gradualmente.
    13. Presione el botón rojo en la pantalla del sistema HMI para detener las operaciones. Gire las válvulas de la línea de servicios de agua y aire a la posición OFF . Apague la alimentación principal.

figure-protocol-4
Figura 2: Equipo utilizado para la producción de AGV y la separación sólido-líquido. (A) Digestor aAD a escala piloto de 100 L. (B) descarga de sobrenadante y sólidos en los cubos respectivos desde el tanque de separación de la centrífuga de disco. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

ParámetrosDesperdicio de alimentos
TS (%)~16.5
VS (%)~14.5
C:N~17:1

Tabla 1: Características del desperdicio de alimentos.

PasoMedioTemperaturaPropósitoPeríodo de tiempo (min)Volumen de descarga (L)Notas
1AguaFríoPara el lavado primario51El agua usada suele pasar al desagüe.
2AguaCaliente (70 °C)Para la termólisis de levaduras, si procede51El agua usada normalmente pasa al desagüe o circula.
3Solución de NaOH al 2%Caliente (70 °C)Para disolver los depósitos de proteínas, si procede201La solución circula normalmente.
4AguaCaliente (70 °C)Para enjuagar51El agua usada normalmente pasa al desagüe o circula.
5Solución de ácido nítrico al 1%Caliente (70 °C)Para disolver depósitos inorgánicos101Si se usa agua blanda, solo se requiere un lavado con ácido unas pocas veces al año. En este caso, el retorno puede pasar al desagüe. Si se utiliza agua dura, es posible que se requiera un lavado con ácido en cada CIP. En este caso, se debe utilizar un sistema de circulación.
6AguaCaliente (80–95 °C)Para enjuagar y esterilizar51Si la turbidez de la descarga de este paso es alta, repita desde el paso 2.

Tabla 2: Instrucciones de lavado de la centrífuga de disco.

3. Fermentación PHA con sobrenadante de digestato rico en AGV

  1. Fermentación PHA a escala de banco para determinar las condiciones óptimas para el escalado.
    1. Añadir agua para diluir el sobrenadante de digestato recogido en el paso 2.2.9 a un gradiente de concentraciones para identificar el tiempo de dilución óptimo que minimice los efectos inhibitorios de los compuestos tóxicos potenciales presentes en el sobrenadante de digestato de residuos alimentarios, al tiempo que garantiza un compromiso mínimo para el crecimiento celular23.
      NOTA: Por lo general, se requiere un mínimo de dilución de 2 veces para mitigar estos efectos inhibidores25.
    2. Complemente el sobrenadante de digestato diluido con sal y nutrientes, en concreto, 156 g/L de NaCl, 5 g/L de extracto de levadura, 13 g/L de MgCl26H2O, 20 g/L de MgSO47H2O, 1 g/L de CaCl22H2O, 4 g/L de KCl, 0,2 g/L de NaHCO3 y 0,5 g/L de NaBr, y NH4Cl según sea necesario33.
    3. Mida la salinidad del sobrenadante del digestato con una sonda de conductividad antes de agregar NaCl. El digestato de residuos alimentarios suele tener una salinidad insignificante; sin embargo, si hay alta salinidad, ajuste la dosis de NaCl en función de la Ecuación 3.
      Adición de NaCl (g) = 156 g/L de NaCl × volumen total del medio preparado - figure-protocol-5 × volumen de sobrenadante de digestato añadido (3)
    4. Mantenga la relación C:N del medio hecho de sobrenadante de digestato en 15. Determine la adición de NH4Cl sobre la base de la relación C:N autóctona del sobrenadante del digestato medido en términos de carbono orgánico total (COT) y nitrógeno total (TN) como se especifica en los pasos 5.2 y 5.3.
    5. Agite el medio con una placa de agitación magnética a 200 rpm hasta que todos los suplementos se disuelvan por completo. Ajuste el pH del medio a 7,0 ± 0,05 utilizando 1 N NaOH o 1 N H2SO4.
    6. Asigne el medio preparado en matraces Erlenmeyer estériles, llenando solo 1/5 del volumen para mantener un gran espacio libre para una transferencia de aire adecuada durante el cultivo (Figura 3A). Cubrir el matraz con algodón o cualquier tipo de material transpirable con suficiente porosidad para permitir el intercambio de gases durante el cultivo.
    7. Descongele el cultivo de semillas de H. mediterranei (activado a partir de la Colección de Cultivos Tipo Americanos (ATCC) 33500 comercial que se almacena a -80 °C) mediante agitación suave en un baño de agua que se ajusta a una temperatura de crecimiento normal de la cepa de H. mediterranei (por ejemplo, 37 °C). La descongelación debe ser rápida, es decir, aproximadamente 2 minutos o hasta que todos los cristales de hielo se hayan derretido.
    8. Inocular 0,2% (v/v) de cultivo de semillas de H. mediterranei con DO600nm de ~0,5 en el medio preparado. Prepare un matraz de control positivo con inoculación y un matraz de control negativo sin inoculación con medio ATCC 117633.
      NOTA: El medio ATCC tiene la misma composición de nutrientes que se detalla en el Paso 3.1.2, excepto que el sobrenadante de digestato se reemplaza con 1 g / L de glucosa y no se agrega ninguna fuente de nitrógeno adicional.
    9. Incubar todos los matraces a 37 °C con agitación a 150 rpm en un agitador orbital. Mida la densidad óptica (OD600 nm) diariamente hasta que se estabilice en la fase estacionaria, luego detenga el cultivo. Recoja el caldo rosado (Figura 3B) para la recuperación de PHA aguas abajo.
  2. Fermentación PHA a escala piloto en fermentador de vidrio de 50 L.
    1. Conecte el fermentador piloto PHA (Figura 4) y el calentador de circulación de agua a la fuente de alimentación.
    2. Encienda el interruptor de calentamiento del baño de agua. Ajuste la temperatura a 37 °C. Encienda el agitador y ajústelo a 150 rpm.
    3. Añadir el sobrenadante de digestato para residuos alimentarios, preparado con el factor de dilución óptimo, junto con los suplementos de sal y nutrientes identificados en el paso 3.1.2, para conseguir un volumen de trabajo de 40 L.
    4. Ajuste el valor de pH a 7. Inocular el 10% (v/v) de cultivo de semillas de H. mediterranei conDO 600nm de ~0,5 en el medio preparado.
    5. Encienda la bomba de aire del fermentador piloto y ajuste la tasa de aireación a 110 m3/h. Recoja la muestra y mida OD600 nm a diario. Cuando el diámetro exterior de600 nm alcance la fase estacionaria, detenga la fermentación y almacene el caldo de fermentación a 4 °C para la recuperación posterior de PHA.
    6. Lave el fermentador con agua del grifo y etanol al 70%.

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Figura 3: Matraces pre y post-fermentativos, de producción de PHA por H. mediterranei. (A) Medio en matraces hechos de supernadante de digestato de residuos de alimentos antes de la incubación/fermentación. (B) Cultivo rosáceo de H. mediterranei rico en PHA después de la fermentación. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 4: Fermentador PHA a escala piloto de 50 L. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

4. Recuperación descendente de PHA

  1. Alimente el caldo de fermentación de H. mediterranei en la centrífuga de disco para separar el sobrenadante salado y las células de H. mediterranei . Recoja la célula recolectada (parte Solid Out en la Figura 5) para su posterior lisis celular. Deseche la fracción Liquid Out de acuerdo con las normas de eliminación de biorresiduos.
    NOTA: El funcionamiento de la centrífuga de disco aquí es el mismo que el de los pasos de 2.2.
  2. Vuelva a suspender las células recolectadas en agua a 100 mL/g de células húmedas y mezcle a 150 rpm durante 2 h a temperatura ambiente para permitir la lisis celular por choque de presión osmótica.
  3. Vuelva a suspender una pequeña porción (50 ml) de las células recolectadas en el paso 4.1 en una solución de NaClO al 4% (2 ml de solución de NaClO al 4% por g de células húmedas) y mezcle durante 5 minutos.
    NOTA: El tratamiento con NaClO se utiliza para proporcionar una línea de base que presumiblemente puede recuperar el 100% de PHA de las células de H. mediterranei . Esta suposición se basa en el hecho de que este tratamiento con NaClO es el método más ampliamente adaptado para la recuperación de PHA34. Este tratamiento con NaClO generalmente se considera lo suficientemente agresivo para la lisis celular completa y la recuperación de PHA, independientemente de la especie celular.
    PRECAUCIÓN: El NaClO es un fuerte agente oxidante. Puede causar quemaduras graves en la piel, daño ocular e irritación respiratoria. Manipule siempre el NaClO en un área bien ventilada o debajo de una campana extractora, mientras usa el equipo de protección personal (EPP) adecuado, incluidos guantes, gafas de seguridad y una bata de laboratorio. En caso de contacto con la piel, enjuague inmediatamente el área afectada con abundante agua y busque atención médica si la irritación persiste. Deseche los desechos que contengan NaClO de acuerdo con las regulaciones locales de desechos peligrosos para evitar la contaminación ambiental.
  4. Centrifugar la suspensión lisada a 10.000 x g durante 30 minutos para recoger los gránulos de PHA. Deseche el sobrenadante de acuerdo con las regulaciones de eliminación de biorresiduos en el laboratorio.
  5. Liofilizar los gránulos de PHA a -50 °C durante ~48 h hasta alcanzar un peso constante para obtener polvo de PHA crudo (Figura 6A).
  6. Agregue etanol al polvo crudo de PHA a 10 mL/g para eliminar las impurezas residuales. Centrifugar a 10.000 x g durante 30 min para recoger los gránulos de PHA purificados. Deseche el sobrenadante de acuerdo con las normas de eliminación de desechos químicos.
  7. Liofilizar el pellet de PHA a -50 °C durante ~48 h hasta que se logre un peso constante para obtener polvo de PHA purificado (Figura 6B).

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Figura 5: Supernadante salado separado (izquierda) y células (derecha). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 6: Polvo de PHA. (A) Polvo de PHA crudo y (B) Polvo de PHA purificado. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

5. Métodos analíticos

  1. Mida TS y VS siguiendo los métodos estándar35. Determine TN mediante los kits de prueba de Hach siguiendo el método estándar utilizando un espectrofotómetro35.
  2. Medición de TOC por un analizador de TOC siguiendo los métodos descritos en un estudio previo25. Mida el pH con un medidor de pH de sobremesa.
  3. Determine la cuantificación de AGV mediante el uso de un kit36. Monitoree el diámetro exterior de600 nm mediante un lector de microplacas.
  4. Estimación de DCW a partir de los sólidos suspendidos volátiles (VSS) del caldo celular medido siguiendo el método de medición estándar VSS25,35. Brevemente, centrifugar 50 mL de caldo celular a 8.000 x g durante 15 min y transferir el pellet a un crisol para el análisis VSS.
    NOTA: Utilice VSS para estimar el DCW, ya que refleja la biomasa orgánica y evita la sobreestimación debido al contenido de sal en H. mediterranei23.
  5. Realizar la cuantificación de PHA por cromatografía de gases (GC) siguiendo los métodos de un estudio previo25, en el que la biomasa liofilizada se metanoliza en cloroformo y metanol acidificado a 105 °C durante 2 h, y los monómeros resultantes se cuantifican utilizando GC con benzoato de metilo como patrón interno. Calcule la recuperación de PHA usando la Ecuación 4 y la pureza de PHA usando la Ecuación 5. Determine toda la masa de PHA a partir de GC.
    Recuperación de PHA (%) = figure-protocol-10 (4)
    Pureza del PHA (%) = figure-protocol-11 (5)
    PRECAUCIÓN: El cloroformo y el ácido sulfúrico utilizados en la cuantificación de PHA son peligrosos y deben manipularse con extremo cuidado. El cloroformo es un disolvente orgánico volátil que presenta riesgos de toxicidad por inhalación y puede causar daño hepático y renal tras una exposición prolongada. El ácido sulfúrico es un químico corrosivo fuerte que puede causar quemaduras graves al contacto con la piel o los ojos. Siempre manipule estos productos químicos dentro de una campana extractora para evitar la exposición por inhalación. Asegúrese de usar el EPP adecuado, incluidos guantes resistentes a productos químicos, gafas de seguridad y una bata de laboratorio. Deseche adecuadamente todos los desechos de cloroformo y ácido sulfúrico de acuerdo con las regulaciones locales de desechos peligrosos para mantener prácticas de laboratorio seguras.

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Resultados

Características del desperdicio de alimentos y producción de AGV a partir de aAD
En la Tabla 1 se muestra un ejemplo de la relación TS, VS y C:N en los purines de residuos de alimentos preparados. Debido a la variabilidad inherente en la composición de los residuos alimentarios en las diferentes fuentes de muestreo y en el tiempo, se esperan fluctuaciones en los valores de la relación TS, VS y C:N. Si bien la variabilidad es aceptable, las mediciones periódicas de la relación TS, VS y...

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Discusión

Producción de VFA a partir de aAD
El AGV desempeña un papel crucial como precursor clave de H. mediterranei en la conversión de los residuos alimentarios en PHA. Por lo tanto, es esencial mantener una alta concentración de AGV durante la DAa. Se pueden emplear varias estrategias para mejorar la producción de AGV en aAD25. Un enfoque eficaz es la optimización de la TRS, con una duración ideal de 8 días o menos, que promueve el lavado de...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Este estudio contó con el apoyo del Departamento de Energía-Oficina de Eficiencia Energética y Energía Renovable (Premio Prime No. DEEE0009268) y el Instituto Nacional de Alimentación y Agricultura del Departamento de Agricultura de los Estados Unidos (Laudo No. 2023-79000-38973).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
AireAirgasAI UZ300Se utiliza para el funcionamiento de GC
Bomba de aireCloudrayHailea ACO-009D
Cloruro de amonioAcros OrganicsA0396560
AutoclaveSTERISLaboratorio AMSCO 250Utilizado en la preparación del medio ATCC
EquilibrarMETTLER TOLEDOME204TE/00
BatidoraVEVORIB750LV + BLD300 + WB-1
BaldeLowe'sModelo 50640Cubo general de plástico libre de BPA de 5 galones
Cloruro de calcio dihidratoAcros OrganicsA0362932
CloroformoMillipore SigmaC2432
DesecadorCualquier tipo que se pueda utilizar en la medición de TS, VS, VSS
Tubos de digestión, tapón de rosca con revestimiento de PTFEMillipore SigmaCLS982613
Bloque de reactor digitalEmpresa HachDRB200Utilizado en los métodos de cuantificación de AGV de Hach
Agitador digitalSCILOGEXSCI550-Pro
Centrífuga de discoAlfa Laval Inc.Clara 20
Matraces ErlenmeyerAmazonaB07V3JPQMM
EtanolAmazonaB09DGVL4ML
LiofilizadorLabconco10030133, 1027319 y 0109621Sistemas de liofilización FreeZone de 2,5 litros
Campana extractoraCorporación Científica KewauneeAire Supremo LV
HornoThermo ScientificModelo F30428C
Cromatografía de gases (GC)AgilentModelo 8890 
Haloferax mediterraneiATCC33500
HidrógenoAirgasHY UHP300Se utiliza para el funcionamiento de GC
CuchilloCualquier tipo utilizado para reducir el desperdicio de alimentos
Aceite lubricanteCompañía científica FisherNC9844626
Cloruro de magnesio hexahidratadoCompañía científica FisherBP214-500
Sulfato de magnesio heptahidratadoMillipore SigmaM1880
MetonalMillipore Sigma34860
Benzoato de metiloMillipore Sigma93583Se utiliza como estándar interno en la cuantificación de PHA
Lector de microplacas Sinergia BioTekSinergia H1
NitrógenoAirgasNI UHP300Se utiliza para el funcionamiento de GC
HornoThermo ScientificOMH750
Bomba peristálticaSimplemente bombea Inc.PM6000 CABomba autocebante de alto flujo con excelente capacidad de funcionamiento en seco, capaz de manejar lodos con alto contenido de partículas y diseñada para tubos de pared de 1/8 de pulgada.
Medidor de pHCompañía científica FisherAE150
Estándar PHAMillipore Sigma403105
Digestor piloto de aADGrupo energético Quasar, Independence, Ohio, EE. UU.Fermentador de acero inoxidable con un volumen total de 100 L y un volumen de trabajo de 80 L
Fermentador piloto PHAárbol de manukaSF-50l ISO 9001 CEReactor de vidrio encamisado de doble capa
Cloruro de potasioG-BIOCIENCIAS162006
Tubería de bombaCualquier marca de tubos de silicona con un diámetro interior de 1/8 '' y un diámetro exterior de 3/8 ''
Bicarbonato de sodioFisher Chemical241787
Bromuro de sodioCarolina21139-45
Cloruro de sodioAmazon B0787CFHF3
Hidróxido de sodio, PelletsBiorreactivos Fisher236088
Hipoclorito de sodioMillipore Sigma425044
Centrífuga Sorvall LYNX 4000 SuperspeedThermo Scientific75006580Se utiliza para la recolección de gránulos de PHA en la recuperación posterior de PHA
Espectrofotómetro Empresa HachDR3900Utilizado en los métodos de cuantificación de AGV de Hach
Ácido sulfúricoMillipore Sigma258105
Filtro de jeringaAmazonaB06X6GTKVY
Analizador de TOCShimadzuModelo TOC-LCSN
Prueba de viales de ácidos volátiles TNTplusEmpresa HachTNT 872Capaz de medir AGV en el rango de 50 a 2.500 mg/L de ácido acético.
Calentador de aguaBosch Inc.Tronic 3000 T de 7 galones (ES8)
Extracto de levaduraCompañía científica FisherAAJ6028736

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