Cuantificación de violaceína en Chromobacterium violaceum y su inhibición por compuestos bioactivos

Resumen

El objetivo de este protocolo es cuantificar la producción de violaceína por Chromobacterium violaceum ATCC 12472 como un proxy para evaluar la inhibición de la detección de quórum por compuestos bioactivos.

Resumen

Las bacterias se comunican a través de un sistema conocido como detección de quórum (QS), que les permite coordinar su comportamiento en respuesta a los cambios en la densidad celular. Este proceso implica la producción, secreción y detección de pequeñas moléculas de señalización extracelular, generalmente llamadas autoinductores (IA). QS regula una amplia gama de genes y funciones, incluida la formación y dispersión de biopelículas, la motilidad del enjambre, la producción de factores de virulencia, la resistencia a los antibióticos y la bioluminiscencia, entre otros. La inhibición de QS se ha convertido en una estrategia antivirulencia prometedora contra bacterias resistentes a los antibióticos, ya que ejerce una presión selectiva más baja en comparación con los antibióticos tradicionales. En la bacteria Chromobacterium violaceum ATCC 12472, las proteínas QS CviI / CviR, que son homólogas a las proteínas QS de tipo LuxI / LuxR de Aliivibrio fisheri, controlan muchos genes, incluidos los responsables de producir el pigmento púrpura violaceína. C. violaceum se ha utilizado ampliamente como cepa biosensora en estudios de inhibición de QS, particularmente en la inhibición de la producción de violaceína. Muchos compuestos tienen el potencial de inhibir QS al unirse a proteínas QS, ya sean homólogas LuxI o LuxR, interrumpiendo los circuitos QS. Este protocolo describe el método para cuantificar la violaceína producida por C. violaceum ATCC 12472 y su inhibición por compuestos bioactivos a concentraciones que no afectan el crecimiento bacteriano. El ensayo descrito aquí demuestra una reducción significativa en la producción de violaceína por parte de los compuestos probados. Este estudio destaca el potencial de usar este protocolo para seleccionar candidatos prometedores en la investigación de inhibición de QS.

Introducción

Las bacterias pueden comunicarse a través de un sistema conocido como QS, que permite la modulación coordinada de su comportamiento en respuesta a cambios en la densidad celular. Este proceso implica la producción, secreción y detección de pequeñas moléculas de señalización extracelular, también llamadas autoinductores, que permiten la comunicación tanto entre diferentes especies como dentro de la misma especie ^1,2.

Esta comunicación es capaz de regular genes y funciones como la formación y dispersión de biopelículas, la motili....

Protocolo

1. Preparación del cultivo (Figura 2)

1. Cultivar en un tubo de ensayo un cultivo de 5 mL de C. violaceum ATCC 12472 en caldo Luria Bertani (LB: triptona 10 g/L, extracto de levadura 5 g/L, 5g/L NaCl) a 30 °C en una incubadora agitadora (220 rpm) durante 24 h.
2. Ajustar el cultivo a un DO₅₉₅ de 0,1 en caldo LB, correspondiente a aproximadamente 1 x 10⁸ UFC/mL.

2. Preparación del compuesto

1. En una placa de fondo plano de 96 pocillos, agregue el caldo LB y el compu....

Resultados

Para los resultados que aquí se muestran, se utilizaron tres compuestos bioactivos previamente estudiados por nuestro grupo^{de investigación 8}, resveratrol, farnesol y linalool. Cada compuesto fue probado por su capacidad para inhibir la producción de violaceína en C. violaceum ATCC 12472, un fenotipo regulado por el sistema QS sobre el operón vioABCDE ²³.

Los resultados validan la eficacia de nuestro protocolo para cuantificar l.......

Discusión

El primer método para extraer y caracterizar la violaceína de C. violaceum surgió en la década de 1990, centrándose en la identificación de fuentes de carbono adecuadas para la síntesis de pigmentos. En este proceso, la violaceína, junto con las células y el medio de cultivo, se secó, se resuspendió en etanol y luego se separó mediante extracción de sobrenadante. La violaceína, ahora disuelta en etanol, se secó posteriormente de nuevo, produciendo una forma pura y seca del pigme.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
DMSO	Sintetizador
Farnesol	Sigma-Aldrich	F203	95%
Linalool	Sigma-Aldrich	L2602	97%
Luria-Bertani Medio	Difco	244620
Película adhesiva óptica	Termo Fisher	4311971	Microamplificador
Resveratrol	Sigma-Aldrich	Referencia R5010	≥ 99% (HPLC)
Lector multimodo Synergy HTX	Biotek
Placas de cultivo de tejidos de 96 pocillos	Kasvi	K12-096