Atenuación de la ferroptosis neuronal por inhibición de RKIP después de una hemorragia intracerebral espontánea a través de la activación de la vía NRF2 / HO-1

Resumen

Al realizar estudios basados en organismos y cultivos celulares, se demostró que la inhibición de la proteína inhibidora de la quinasa Raf (RKIP) puede mitigar la ferroptosis neuronal después de una hemorragia intracerebral espontánea, reduciendo así la lesión cerebral. La citoprotección observada surge a través de la modulación del eje de señalización NRF2 / HO-1 .

Resumen

La proteína inhibidora de la quinasa Raf (RKIP), un miembro primario de la familia de proteínas de unión a fosfatidiletanolamina, es reconocida por su participación en varios procesos fisiológicos, incluida la diferenciación celular, la migración, el ciclo celular y la apoptosis. Este estudio exploró su función en la ferroptosis neuronal después de una hemorragia intracerebral espontánea (HIC) y los mecanismos asociados. Se desarrolló un modelo celular de HIC espontáneo utilizando células de feocromocitoma de rata cultivadas (PC12) estimuladas con hemina. Se evaluó la viabilidad celular, la expresión de ARN, los niveles de especies reactivas de oxígeno (ROS) y el hidroperóxido lipídico (LPO). Además, se midieron los niveles de expresión de proteínas. Este estudio confirmó que la inhibición de RKIP es neuroprotectora in vitro después de la HIC. Este efecto se asoció con una mayor expresión de glutatión peroxidasa 4 (GPX4) y una disminución de la expresión de la familia 4 de cadena larga de acil-CoA sintetasa (ACSL4), junto con los niveles de ROS y LPO en las neuronas. La inhibición de RKIP demostró un papel protector contra la ferroptosis neuronal in vitro después de la HIC, potencialmente a través de la activación de la vía del factor nuclear 2/hemo oxigenasa-1 (NRF2/HO-1). Este mecanismo puede ofrecer información sobre estrategias terapéuticas dirigidas a la ferroptosis neuronal en la HIC.

Introducción

La hemorragia intracerebral espontánea (HIC) es una afección cerebrovascular caracterizada por sangrado debido a daño vascular intracraneal, necrosis y ruptura de vasos, que comúnmente afecta a los ganglios basales y representa un subtipo importante de accidente cerebrovascular hemorrágico¹. La tasa de mortalidad entre los pacientes diagnosticados con HIC es de aproximadamente el 50%, y una proporción significativa de los supervivientes experimentan una pérdida severa de independencia². Las opciones de tratamiento actuales para la HIC espontánea son limitadas, y no se ha demostrado que las terapias existentes reduzcan significativamente la mortalidad o mejoren notablemente los resultados neurológicos después de la HIC.

La ferroptosis, una forma de muerte celular programada dependiente del hierro, se define por la peroxidación lipídica, la acumulación de iones ferrosos y el agotamiento del glutatión, lo que la distingue de otras formas de muerte celular programada en términos genéticos, morfológicos y biológicos³. Cada vez hay más evidencia que destaca el papel de la ferroptosis neuronal en la patología de la HIC. La proteína inhibidora de la quinasa Raf (RKIP), también conocida como proteína de unión a fosfatidiletanolamina 1 (PEBP1), está involucrada en el desarrollo neural y forma el complejo 15LOX / PEBP1 a través de su unión con 15-lipoxigenasa (15LOX), un regulador clave de la ferroptosis⁴. Sin embargo, el papel específico y los mecanismos de RKIP en la ferroptosis relacionada con la progresión de la HIC espontánea siguen sin explorarse.

Este estudio examinó los efectos antiferroptosis de la inhibición de RKIP en las neuronas, demostrando que la inhibición de la expresión de RKIP podría suprimir la ferroptosis neuronal después de la HIC, potencialmente a través de la activación de la vía del factor nuclear E2 relacionado con el factor 2 / hemo oxigenasa-1 (NRF2 / HO-1). Estos hallazgos son significativos para el desarrollo de nuevas estrategias terapéuticas dirigidas a la patogénesis de la HIC.

Protocolo

Cultivo de células PC12
La línea celular PC12 se propagó en un medio de crecimiento Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI-1640) que contenía un 10% de suero fetal bovino (FBS) y un 1% de penicilina/estreptomicina, con mantenimiento de rutina en condiciones de cultivo estándar (37 °C, 5% de atmósfera humidificada de CO₂). Para los procedimientos experimentales, las células adherentes se colocaron en recipientes de cultivo y se dejaron proliferar hasta lograr monocapas casi confluentes (aproximadamente 90% de cobertura de superficie). La disociación celular se logró mediante un tratamiento enzimático con una solución de tripsina-EDTA al 0,25%, seguido de tres ciclos sucesivos de subcultivo para garantizar la estabilidad de la población. Posteriormente, las células procesadas se asignaron para aplicaciones experimentales posteriores y evaluaciones analíticas.

Ensayos de viabilidad celular
Se evaluó la viabilidad celular para evaluar la citotoxicidad de la hemina y la locosatina en células PC12, siguiendo las instrucciones proporcionadas por el fabricante del kit de ensayo. Las células PC12 se sembraron uniformemente en placas de 96 pocillos y se cultivaron con hemina o Locostatin durante 24 h. Después del lavado con solución salina tamponada con fosfato (PBS), las células se incubaron en medio RPMI-1640 que contenía una solución salina de tetrazolio al 10% durante 90 min a 37 °C. A continuación, se midieron los valores de densidad óptica (OD) a 450 nm utilizando un lector de microplacas.

Reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa cuantitativa (RT-qPCR)
El ARN total se extrajo de las células PC12 utilizando el reactivo de extracción de ARN. En primer lugar, la muestra se homogeneizó en el reactivo de extracción, asegurando una lisis completa. Se añadió cloroformo a la mezcla, se agitó vigorosamente y se centrifugó para separar las fases (12.000 × g, 15 min, 4 °C). Se recogió la fase acuosa que contenía el ARN y el ARN se precipitó mediante la adición de isopropanol (fase acuosa: iPrOH = 1:1) y la incubación a temperatura ambiente. Se realizó centrifugación para granular el ARN (12.000 × g, 10 min, 4 °C), se añadió 1 mL de etanol al 70% para eliminar las impurezas y, finalmente, el pellet de ARN se disolvió en agua libre de ARNasa para su almacenamiento a -80 °C. Las plantillas de ADN complementario (ADNc) se generaron mediante transcripción inversa con la mezcla maestra RT. Las plantillas resultantes se diluyeron en una proporción de 1:5 y se sometieron a PCR cuantitativa en tiempo real en un instrumento de PCR en tiempo real. Cada muestra se amplificó por triplicado y se promedió la cantidad relativa de producto de PCR. Los cebadores utilizados se enumeran en la Tabla 1, con β-actina que sirve como gen de limpieza. La concentración relativa de ARNm se determinó mediante la fórmula E = 2^−ΔΔCt, y se registró el valor del ciclo de umbral crítico (CT) para cada reacción.

Ensayos de especies reactivas de oxígeno (ROS) intracelulares e hidroperóxido lipídico (LPO)
Los niveles de ROS y LPO se midieron mediante citometría de flujo. Las células PC12 se trataron con hemina (80 μM), Locostatin (5 μM) y ML385 (5 μM) durante 24 h y se lavaron 3 veces con PBS en platos. Luego, las células se incubaron a 37 ° C con 5% de CO₂ durante 40 min en presencia de diacetato de 2',7'-diclorodihidrofluoresceína (DCFH-DA), una sonda ROS, y BODIPY 581/591 C11, una sonda LPO. Después de los lavados de PBS para eliminar el exceso de sondas, se midió la intensidad de la fluorescencia mediante citometría de flujo. Se aplicó una estrategia de compuerta consistente en todas las muestras: primero, las celdas se cerraron en FSC-A frente a SSC-A para excluir los desechos, luego, se seleccionaron células individuales mediante la compuerta FSC-A frente a FSC-H. Las células no teñidas y las células tratadas con hemina sola se utilizaron como controles negativos y positivos para establecer la compensación de fluorescencia y las puertas. Los datos se analizaron utilizando el software vinculado.

Extracción de proteínas y western blot
Extracción total de proteínas
Se descartó el sobrenadante de las células PC12 tratadas, seguido de tres lavados con PBS helado. Las células se recolectaron con tripsina y se centrifugaron a 200 × g durante 5 min. Después de eliminar el sobrenadante, el sedimento celular se homogeneizó en un tampón de lisis de ensayo de radioinmunoprecipitación (RIPA) frío que contenía un 10% de inhibidor de proteasa y un 10% de inhibidor de fosfatasa. Después de una incubación de 30 minutos en hielo, el lisado se centrifugó a 12.000 × g durante 15 minutos a 4 °C. El sobrenadante transparente se mezcló con tampón de carga (4:1) y se calentó a 95 °C durante 5 min para desnaturalizar las proteínas. Las muestras de proteínas se almacenaron a -80 °C para su uso posterior.

Análisis de Western blot
Las proteínas se separaron mediante SDS-PAGE utilizando un gel de apilamiento y un gel de resolución, con muestras cargadas en pocillos. La electroforesis se realizó a 80 V para el gel de apilamiento y 120 V para el gel de resolución. Las proteínas se transfirieron a una membrana de fluoruro de polivinilideno (PVDF) (preactivada en metanol durante 1 min) utilizando un sistema de transferencia a una corriente constante de 300 mA durante 1-2 h. La membrana se bloqueó con leche descremada al 5% en TBST durante 2 h a temperatura ambiente para evitar la unión inespecífica. Después de tres lavados con TBST (10 min cada uno), la membrana se incubó durante la noche a 4 °C con los siguientes anticuerpos primarios diluidos en TBST: Rabbit anti-ACSL4 (1:1.000), Rabbit anti-GPX4 (1:1.000), Rabbit anti-HO-1 (1:2.000), Rabbit anti-NRF2 (1:1.000), Rabbit anti-RKIP (1:1.500) y Mouse anti-β-actin (1:5.000). La membrana se lavó durante 3 x 10 min con TBST y se incubó con anticuerpos secundarios conjugados con HRP durante 2 h a temperatura ambiente: IgG anti-ratón de cabra marcada con HRP (1:1.000), IgG anti-conejo de cabra marcada con HRP (1:1.000). Después de lavados adicionales de TBST durante 3 x 5 min, las señales de proteínas se visualizaron utilizando un kit de Western Blot ECL y se cuantificaron utilizando el software ImageJ.

Tinción de inmunofluorescencia
Las células se sembraron en cubreobjetos colocados previamente en placas de cultivo y se dejaron adherir. Después de los tratamientos experimentales, se descartó el sobrenadante y las células se lavaron 3 veces con PBS. Las células se fijaron con paraformaldehído (PFA) al 4% durante 15 min a temperatura ambiente, seguido de tres lavados de PBS. Posteriormente, las células se permeabilizaron con Triton X-100 al 0,1% durante 10 min a temperatura ambiente y se lavaron 3 veces con PBS. La unión inespecífica se bloqueó incubando con albúmina sérica bovina (BSA) al 3% durante 30 min a temperatura ambiente. Los anticuerpos primarios se aplicaron durante la noche a 4 °C: Conejo anti-HO-1 (1:500), Conejo anti-NRF2 (1:500). Después de tres lavados de PBS al día siguiente, las células se incubaron con anticuerpos secundarios fluorescentes en la oscuridad durante 1 h a temperatura ambiente: IgG anti-conejo de cabra marcada con Alexa Fluor 488 (1: 500). Después de los lavados finales, las muestras se montaron con un medio de montaje que contenía 4',6-diamidino-2'-fenilindol (DAPI) para contratinción nuclear. Las imágenes se capturaron con un microscopio de barrido láser confocal.

Análisis estadístico
Los datos de medición se expresaron como media ± desviación estándar (DE). Se tomaron datos cuantitativos que representaban los resultados de tres ensayos replicados independientes para su análisis. Para las comparaciones entre dos grupos, se aplicó una prueba t, mientras que se utilizó un análisis de varianza de una vía (ANOVA) para las comparaciones entre múltiples grupos, seguido de la prueba post hoc de Tukey para comparaciones múltiples. Un valor de p < 0,05 se consideró estadísticamente significativo.

Resultados

La hemina puede inducir daño en la membrana plasmática, por lo que se usa con frecuencia para la construcción de modelos celulares in vitro de ICH. Este estudio investigó los efectos del tratamiento con hemina en diferentes concentraciones y duraciones sobre la viabilidad celular de PC12, al tiempo que analizaba simultáneamente la dinámica de expresión de la proteína RKIP en las condiciones experimentales correspondientes a través del análisis de western blot (Figura 1A). La viabili...

Discusión

Este estudio investigó los efectos y los mecanismos subyacentes de la caída de RKIP sobre la ferroptosis inducida por ICH en un entorno in vitro . La estimulación de las células con hemina desencadena el estrés oxidativo, acompañado de una generación excesiva de ROS y LPO, promoviendo así la ferroptosis. La inhibición de la expresión endógena de RKIP acelera el NRF2 liberado para translocarse al núcleo y unirse al elemento de respuesta antioxidante (AR...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
IgG anticonejo con etiqueta Alexa Fluor 488	Beyotime Biotech	A0423
Anticuerpo anti-ACSL4	Señalización celular	38493T
Anticuerpo anti-GPX4	Señalización celular	59735S
Anticuerpo anti-HO-1	MedChemExpress	HY-P80499
Anticuerpo anti-NRF2	Señalización celular	12721T
Anticuerpo anti-RKIP	Abcam	ab76582
Anticuerpo anti-β-actina	Abcam	abut 179467
BeyoECL Plus	Beyotime Biotech	P0018M
BSA	NCM Biotecnología	WB6504-100g
Kit de Conteo de Células-8	Beyotime Biotech	C0037
SALVACIÓN DE CELDAS	NCM Biotecnología	C40050
ChamQ SYBR Color qPCR Master Mix	Vazyme	P411-02
DMSO	Beyotime Biotech	ST038
Suero fetal bovino	Gibco	A5670801
GraphPad Prism
Hemina	MedChemExpress	HY-19424
HiScript Q RT SuperMix para qPCR (+limpiador de ADNa)	Vazyme	R123-01
IgG antiratón marcado con HRP	Termo	C31430100
IgG Anti-Conejo marcado como HRP	Termo	C31460100
Kit de ensayo de contenido de peróxido lipídico (LPO)	Solarbio	BC5245
Locostatina	MedChemExpress	HY-W013411A
ML385	MedChemExpress	HY-100523
¿Montaje medio? Antidesvanecimiento (con DAPI)	Solarbio	S2110
LECHE en polvo desnatada	Solarbio	D8340
PBS (¿polvo? pH7.2-7.4)	Solarbio	P1010
PC-12Adh	Biotecnología BioChannel de Nankín	BC-C-RA-005
Líquido de penicilina-estreptomicina	Solarbio	P1400
PRMI-1640	Gibco	A1049101
Cóctel de proteasas e inhibidores de fosfatasa para uso general, 50x	Beyotime Biotech	P1045
Marcador de proteínas	Termo	26617
PVDF	Millipore	RIKB43638
Kit de ensayo de especies reactivas de oxígeno	Solarbio	CA1410
Amortiguador RIPA (alto)	Solarbio	R0010
Kit de preparación rápida en gel SDS-PAGE	Epizima	PG110
Búfer de carga de ejemplo SDS-PAGE, 5x	Beyotime Biotech	P0015
TritonX-100	Solarbio	IT9100
TRIzol	Termo	15596018CN
¿Solución de tripsina-EDTA? 0,25% (sin fenol rojo)	Solarbio	T1300