Atenuación de la ferroptosis neuronal por inhibición de RKIP después de una hemorragia intracerebral espontánea a través de la activación de la vía NRF2 / HO-1

La hemorragia intracerebral espontánea (HIC) es una afección cerebrovascular caracterizada por sangrado debido a daño vascular intracraneal, necrosis y ruptura de vasos, que comúnmente afecta a los ganglios basales y representa un subtipo importante de accidente cerebrovascular hemorrágico¹. La tasa de mortalidad entre los pacientes diagnosticados con HIC es de aproximadamente el 50%, y una proporción significativa de los supervivientes experimentan una pérdida severa de independencia². Las opciones de tratamiento actuales para la HIC espontánea son limitadas, y no se ha demostrado que las terapias existentes reduzcan significativamente la mortalidad o mejoren notablemente los resultados neurológicos después de la HIC.

La ferroptosis, una forma de muerte celular programada dependiente del hierro, se define por la peroxidación lipídica, la acumulación de iones ferrosos y el agotamiento del glutatión, lo que la distingue de otras formas de muerte celular programada en términos genéticos, morfológicos y biológicos³. Cada vez hay más evidencia que destaca el papel de la ferroptosis neuronal en la patología de la HIC. La proteína inhibidora de la quinasa Raf (RKIP), también conocida como proteína de unión a fosfatidiletanolamina 1 (PEBP1), está involucrada en el desarrollo neural y forma el complejo 15LOX / PEBP1 a través de su unión con 15-lipoxigenasa (15LOX), un regulador clave de la ferroptosis⁴. Sin embargo, el papel específico y los mecanismos de RKIP en la ferroptosis relacionada con la progresión de la HIC espontánea siguen sin explorarse.

Este estudio examinó los efectos antiferroptosis de la inhibición de RKIP en las neuronas, demostrando que la inhibición de la expresión de RKIP podría suprimir la ferroptosis neuronal después de la HIC, potencialmente a través de la activación de la vía del factor nuclear E2 relacionado con el factor 2 / hemo oxigenasa-1 (NRF2 / HO-1). Estos hallazgos son significativos para el desarrollo de nuevas estrategias terapéuticas dirigidas a la patogénesis de la HIC.

Cultivo de células PC12
La línea celular PC12 se propagó en un medio de crecimiento Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI-1640) que contenía un 10% de suero fetal bovino (FBS) y un 1% de penicilina/estreptomicina, con mantenimiento de rutina en condiciones de cultivo estándar (37 °C, 5% de atmósfera humidificada de CO₂). Para los procedimientos experimentales, las células adherentes se colocaron en recipientes de cultivo y se dejaron proliferar hasta lograr monocapas casi confluentes (aproximadamente 90% de cobertura de superficie). La disociación celular se logró mediante un tratamiento enzimático con una solución de tripsina-EDTA al 0,25%, seguido de tres ciclos sucesivos de subcultivo para garantizar la estabilidad de la población. Posteriormente, las células procesadas se asignaron para aplicaciones experimentales posteriores y evaluaciones analíticas.

Ensayos de viabilidad celular
Se evaluó la viabilidad celular para evaluar la citotoxicidad de la hemina y la locosatina en células PC12, siguiendo las instrucciones proporcionadas por el fabricante del kit de ensayo. Las células PC12 se sembraron uniformemente en placas de 96 pocillos y se cultivaron con hemina o Locostatin durante 24 h. Después del lavado con solución salina tamponada con fosfato (PBS), las células se incubaron en medio RPMI-1640 que contenía una solución salina de tetrazolio al 10% durante 90 min a 37 °C. A continuación, se midieron los valores de densidad óptica (OD) a 450 nm utilizando un lector de microplacas.

Reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa cuantitativa (RT-qPCR)
El ARN total se extrajo de las células PC12 utilizando el reactivo de extracción de ARN. En primer lugar, la muestra se homogeneizó en el reactivo de extracción, asegurando una lisis completa. Se añadió cloroformo a la mezcla, se agitó vigorosamente y se centrifugó para separar las fases (12.000 × g, 15 min, 4 °C). Se recogió la fase acuosa que contenía el ARN y el ARN se precipitó mediante la adición de isopropanol (fase acuosa: iPrOH = 1:1) y la incubación a temperatura ambiente. Se realizó centrifugación para granular el ARN (12.000 × g, 10 min, 4 °C), se añadió 1 mL de etanol al 70% para eliminar las impurezas y, finalmente, el pellet de ARN se disolvió en agua libre de ARNasa para su almacenamiento a -80 °C. Las plantillas de ADN complementario (ADNc) se generaron mediante transcripción inversa con la mezcla maestra RT. Las plantillas resultantes se diluyeron en una proporción de 1:5 y se sometieron a PCR cuantitativa en tiempo real en un instrumento de PCR en tiempo real. Cada muestra se amplificó por triplicado y se promedió la cantidad relativa de producto de PCR. Los cebadores utilizados se enumeran en la Tabla 1, con β-actina que sirve como gen de limpieza. La concentración relativa de ARNm se determinó mediante la fórmula E = 2^−ΔΔCt, y se registró el valor del ciclo de umbral crítico (CT) para cada reacción.

Ensayos de especies reactivas de oxígeno (ROS) intracelulares e hidroperóxido lipídico (LPO)
Los niveles de ROS y LPO se midieron mediante citometría de flujo. Las células PC12 se trataron con hemina (80 μM), Locostatin (5 μM) y ML385 (5 μM) durante 24 h y se lavaron 3 veces con PBS en platos. Luego, las células se incubaron a 37 ° C con 5% de CO₂ durante 40 min en presencia de diacetato de 2',7'-diclorodihidrofluoresceína (DCFH-DA), una sonda ROS, y BODIPY 581/591 C11, una sonda LPO. Después de los lavados de PBS para eliminar el exceso de sondas, se midió la intensidad de la fluorescencia mediante citometría de flujo. Se aplicó una estrategia de compuerta consistente en todas las muestras: primero, las celdas se cerraron en FSC-A frente a SSC-A para excluir los desechos, luego, se seleccionaron células individuales mediante la compuerta FSC-A frente a FSC-H. Las células no teñidas y las células tratadas con hemina sola se utilizaron como controles negativos y positivos para establecer la compensación de fluorescencia y las puertas. Los datos se analizaron utilizando el software vinculado.

Extracción de proteínas y western blot
Extracción total de proteínas
Se descartó el sobrenadante de las células PC12 tratadas, seguido de tres lavados con PBS helado. Las células se recolectaron con tripsina y se centrifugaron a 200 × g durante 5 min. Después de eliminar el sobrenadante, el sedimento celular se homogeneizó en un tampón de lisis de ensayo de radioinmunoprecipitación (RIPA) frío que contenía un 10% de inhibidor de proteasa y un 10% de inhibidor de fosfatasa. Después de una incubación de 30 minutos en hielo, el lisado se centrifugó a 12.000 × g durante 15 minutos a 4 °C. El sobrenadante transparente se mezcló con tampón de carga (4:1) y se calentó a 95 °C durante 5 min para desnaturalizar las proteínas. Las muestras de proteínas se almacenaron a -80 °C para su uso posterior.

Análisis de Western blot
Las proteínas se separaron mediante SDS-PAGE utilizando un gel de apilamiento y un gel de resolución, con muestras cargadas en pocillos. La electroforesis se realizó a 80 V para el gel de apilamiento y 120 V para el gel de resolución. Las proteínas se transfirieron a una membrana de fluoruro de polivinilideno (PVDF) (preactivada en metanol durante 1 min) utilizando un sistema de transferencia a una corriente constante de 300 mA durante 1-2 h. La membrana se bloqueó con leche descremada al 5% en TBST durante 2 h a temperatura ambiente para evitar la unión inespecífica. Después de tres lavados con TBST (10 min cada uno), la membrana se incubó durante la noche a 4 °C con los siguientes anticuerpos primarios diluidos en TBST: Rabbit anti-ACSL4 (1:1.000), Rabbit anti-GPX4 (1:1.000), Rabbit anti-HO-1 (1:2.000), Rabbit anti-NRF2 (1:1.000), Rabbit anti-RKIP (1:1.500) y Mouse anti-β-actin (1:5.000). La membrana se lavó durante 3 x 10 min con TBST y se incubó con anticuerpos secundarios conjugados con HRP durante 2 h a temperatura ambiente: IgG anti-ratón de cabra marcada con HRP (1:1.000), IgG anti-conejo de cabra marcada con HRP (1:1.000). Después de lavados adicionales de TBST durante 3 x 5 min, las señales de proteínas se visualizaron utilizando un kit de Western Blot ECL y se cuantificaron utilizando el software ImageJ.

Tinción de inmunofluorescencia
Las células se sembraron en cubreobjetos colocados previamente en placas de cultivo y se dejaron adherir. Después de los tratamientos experimentales, se descartó el sobrenadante y las células se lavaron 3 veces con PBS. Las células se fijaron con paraformaldehído (PFA) al 4% durante 15 min a temperatura ambiente, seguido de tres lavados de PBS. Posteriormente, las células se permeabilizaron con Triton X-100 al 0,1% durante 10 min a temperatura ambiente y se lavaron 3 veces con PBS. La unión inespecífica se bloqueó incubando con albúmina sérica bovina (BSA) al 3% durante 30 min a temperatura ambiente. Los anticuerpos primarios se aplicaron durante la noche a 4 °C: Conejo anti-HO-1 (1:500), Conejo anti-NRF2 (1:500). Después de tres lavados de PBS al día siguiente, las células se incubaron con anticuerpos secundarios fluorescentes en la oscuridad durante 1 h a temperatura ambiente: IgG anti-conejo de cabra marcada con Alexa Fluor 488 (1: 500). Después de los lavados finales, las muestras se montaron con un medio de montaje que contenía 4',6-diamidino-2'-fenilindol (DAPI) para contratinción nuclear. Las imágenes se capturaron con un microscopio de barrido láser confocal.

Análisis estadístico
Los datos de medición se expresaron como media ± desviación estándar (DE). Se tomaron datos cuantitativos que representaban los resultados de tres ensayos replicados independientes para su análisis. Para las comparaciones entre dos grupos, se aplicó una prueba t, mientras que se utilizó un análisis de varianza de una vía (ANOVA) para las comparaciones entre múltiples grupos, seguido de la prueba post hoc de Tukey para comparaciones múltiples. Un valor de p < 0,05 se consideró estadísticamente significativo.

La hemina puede inducir daño en la membrana plasmática, por lo que se usa con frecuencia para la construcción de modelos celulares in vitro de ICH. Este estudio investigó los efectos del tratamiento con hemina en diferentes concentraciones y duraciones sobre la viabilidad celular de PC12, al tiempo que analizaba simultáneamente la dinámica de expresión de la proteína RKIP en las condiciones experimentales correspondientes a través del análisis de western blot (Figura 1A). La viabilidad celular se redujo significativamente a concentraciones de hemina de 60 μM o más (Figura 1B), y esta reducción se produjo de manera dependiente de la dosis con el aumento de las concentraciones. Además, la citotoxicidad de la hemina dependía del tiempo, alcanzando su punto máximo dentro de las primeras 24 h de exposición antes de disminuir gradualmente (Figura 1C). El análisis de Western blot indicó que la expresión de la proteína RKIP se elevó significativamente a 80 μM de hemina (Figura 1D, E) y alcanzó su punto máximo a las 24 h después de la estimulación (Figura 1F, G). Con base en estos hallazgos, elegimos 80 μM de hemina y un período de tratamiento de 24 h para experimentos posteriores para dilucidar los mecanismos subyacentes y las vías de señalización involucradas.

Para investigar el papel de RKIP en la ferroptosis neuronal después de la HIC, utilizamos Locostatin para inhibir la expresión de RKIP (Figura 2A). La locostatina se une a RKIP, interrumpe las interacciones entre RKIP y la quinasa Raf-1 y GRK2, atenuando así los efectos funcionales de RKIP para lograr el propósito inhibitorio. En este estudio, empleamos la locostatina como inhibidor de RKIP para investigar los mecanismos moleculares asociados 5,6. La citotoxicidad de Locostatin, se evaluó primero en un rango de concentración de 0-40 μM mediante el ensayo de viabilidad. Los resultados no mostraron citotoxicidad significativa a ≤5 μM, estableciendo un rango de concentración seguro para experimentos posteriores (Figura 2B). Además, confirmamos el efecto inhibidor de la locostatina 5 μM sobre la expresión de RKIP mediante análisis de western blot y RT-qPCR. El Western blot reveló una disminución significativa en los niveles de proteína RKIP (Figura 2C, D), mientras que la RT-qPCR mostró niveles disminuidos de ARNm de RKIP (Figura 2E). Estos hallazgos demuestran la eficacia de la locostatina 5 μM para inhibir la expresión de RKIP.

En este estudio, se desarrolló un modelo celular PC12 inducido por hemina de hemorragia intracerebral (HIC) para delinear la función reguladora de RKIP en la ferroptosis. Nuestros resultados indicaron que la estimulación con hemina aumentó significativamente la expresión de RKIP al tiempo que disminuyó la viabilidad celular. Con base en estudios existentes, especulamos que la muerte celular inducida por hemina podría estar estrechamente relacionada con la ferroptosis, un proceso de peroxidación lipídica catalizada por hierro marcado por la deposición patológica de hierro dentro de los compartimentos celulares y niveles elevados de especies reactivas de oxígeno (ROS).

Para explorar más a fondo la relación entre RKIP y ferroptosis, tratamos las células PC12 estimuladas con hemina con Locostatina. El análisis de Western blot reveló que la expresión de la familia 4 de cadena larga de acil-CoA sintetasa (ACSL4), un impulsor clave de la ferroptosis, aumentó significativamente en el grupo tratado con hemina (Figura 3A, B). ACSL4 es un gen crítico a favor de la muerte en la ferroptosis, que promueve la esterificación de ácidos grasos poliinsaturados (PUFA) y, por lo tanto, aumenta la sensibilidad celular a la ferroptosis. Además, la expresión de glutatión peroxidasa 4 (GPX4), un inhibidor de la ferroptosis, disminuyó significativamente en el grupo tratado con hemina (Figura 3A, C). GPX4 es un regulador clave de la ferroptosis que inhibe la peroxidación lipídica al eliminar los peróxidos lipídicos, protegiendo así las células del daño oxidativo. Estos resultados indican que la estimulación de la hemina aumenta la ferroptosis en las células PC12. Sin embargo, en comparación con el grupo de hemina, la inhibición farmacológica de RKIP con Locostatin revirtió estas alteraciones, lo que indica que la supresión de la expresión de RKIP inhibió la ferroptosis en las células PC12. También se observaron resultados consistentes a nivel de ARNm (Figura 3 F, G).

También investigamos la expresión de moléculas de la vía relacionadas con la ferroptosis. Se ha demostrado que la vía NRF2 / HO-1 juega un papel clave en la ferroptosis. Con base en esto, planteamos la hipótesis de que la inhibición de RKIP podría suprimir la ferroptosis neuronal al activar la vía NRF2 / HO-1 . Para probar esta hipótesis, primero estimulamos las células PC12 con hemina y descubrimos que la expresión de la proteína NRF2 aumentó significativamente (Figura 3A, D), junto con un aumento significativo en su producto aguas abajo HO-1 (Figura 3A, E). Estos hallazgos sugieren que la ferroptosis inducida por hemina activa la vía NRF2 / HO-1 , que ejerce un efecto protector sobre las células. Como importante regulador de las respuestas antioxidantes celulares, NRF2 mejora la capacidad antioxidante celular al regular la expresión de genes diana posteriores como HO-1, inhibiendo así la ferroptosis. Posteriormente, el tratamiento con Locostatin aumentó aún más la expresión de HO-1 y NRF2 en comparación con el grupo tratado con hemina (Figura 3A, D). También se observaron resultados consistentes a nivel de ARNm (Figura 3I, J), lo que confirma aún más que la inhibición de RKIP suprime la ferroptosis en células PC12 estimuladas por hemina al modular NRF2 y su molécula aguas abajo HO-1.

En particular, otro inhibidor de la ferroptosis, la ferritina de cadena pesada 1 (FTH1), mostró una mayor expresión tras la estimulación de la hemina, y su expresión se elevó aún más cuando se inhibió RKIP (Figura 3H). FTH1 es un componente importante de la ferritina, responsable del almacenamiento y la oxidación del hierro. Convierte los iones de hierro en una forma más estable, reduciendo el estrés oxidativo inducido por el hierro libre. La regulación positiva de FTH1 tras la estimulación de la hemina puede representar una respuesta compensatoria a la sobrecarga de hierro, ya que las células intentan almacenar el exceso de hierro para evitar el daño oxidativo. El aumento adicional en la expresión de FTH1 tras el tratamiento con Locostatin sugiere niveles reducidos de hierro libre y una mayor capacidad antioxidante, lo que refuerza la conclusión de que la inhibición de RKIP suprime la ferroptosis inducida por hemina en las células PC12.

Los niveles de ROS e hidroperóxido lipídico (LPO) en células PC12 se evaluaron mediante citometría de flujo. El tratamiento con hemina condujo a un aumento significativo en los niveles de ROS y LPO, que se revirtió después de la administración de Locostatin. Este hallazgo indica que la inhibición de RKIP puede ayudar a suprimir la ferroptosis en las neuronas (Figura 4A-D).

En resumen, la dosis inducida por hemina y las reducciones dependientes del tiempo en la viabilidad celular de PC12, concomitantes con un marcado aumento en los niveles de proteína RKIP . Este proceso se asoció con niveles elevados de ACSL4 y supresión de la expresión de GPX4. Al mismo tiempo, se observó una acumulación significativa de marcadores de daño oxidativo (ROS y LPO), y ambos sirvieron como impulsores centrales de la ferroptosis al mediar el estrés oxidativo y la alteración de la membrana lipídica. Además, la regulación positiva de la proteína de almacenamiento de hierro FTH1 sugirió una respuesta celular compensatoria a la sobrecarga de hierro. Críticamente, la inhibición farmacológica de RKIP por Locostatin revirtió estas alteraciones y anuló la ferroptosis inducida por hemina (Figura 1, Figura 2, Figura 3 y Figura 4).

Los resultados de los ensayos indicaron que la inhibición de RKIP suprimió eficazmente la ferroptosis neuronal y reguló la expresión de NRF2 / HO-1 . Dado que la vía NRF2 / HO-1 juega un papel clave en la ferroptosis, se planteó la hipótesis de que la supresión de la ferroptosis neuronal observada con la inhibición de RKIP podría estar mediada por la estimulación de esta vía. Para probar esta hipótesis, se realizaron más experimentos (Figura 5A).

Se utilizó ML385, un inhibidor selectivo de NRF2, y los resultados confirmaron que la expresión de NRF2 se redujo efectivamente tanto a nivel de proteína (Figura 5B, C) como de ARNm (Figura 5E). Además, se evaluó la expresión de HO-1, una molécula aguas abajo de NRF2. Los hallazgos indicaron que, si bien la inhibición de RKIP aumentó inicialmente la expresión de HO-1, este efecto se revirtió después de la inhibición de NRF2 (Figura 5B, D, F). Estos resultados sugieren que la inhibición de RKIP puede atenuar la ferroptosis neuronal al activar la vía NRF2 / HO-1. La tinción de inmunofluorescencia respaldó aún más estos hallazgos, ya que se observó una translocación nuclear de NRF2 después de la inhibición de RKIP (Figura 5G-J).

Posteriormente, evaluamos aún más los niveles de ROS y LPO en células PC12 mediante citometría de flujo. Encontramos que la inhibición de NRF2 con ML385 revirtió la reducción inducida por Locostatina en los niveles de ROS y LPO. Estos hallazgos sugieren que la supresión de RKIP puede inhibir la ferroptosis neuronal al activar la vía NRF2 / HO-1 (Figura 6A-D).

DISPONIBILIDAD DE DATOS:
Los conjuntos de datos generados durante el estudio actual se incluyen en el Archivo complementario 1.

Figura 1: Construcción de un modelo de enfermedad in vitro mediante células PC12 estimuladas con hemina. (A) Ilustración esquemática de la construcción del modelo celular PC12 estimulado con hemina. (B) Determinación de la concentración óptima de hemina para el establecimiento de modelos de hemorragia intracerebral in vitro utilizando el ensayo de viabilidad celular para evaluar la viabilidad celular. (C) Ensayo de viabilidad celular con células PC12 tratadas con hemina (80 μM) para varios puntos temporales. (D,E) Análisis representativo de Western blot y evaluación cuantitativa de los niveles de expresión de RKIP en células PC12 tratadas con diferentes concentraciones de hemina (24 h). (F, G) Análisis representativo de Western blot y evaluación cuantitativa de los niveles de expresión de RKIP en células PC12 expuestas a hemina (80 μM) durante diferentes duraciones. Todos los datos se presentan como media ± DE (n = 3). *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. Abreviaturas: CCK8 = Kit de recuento de células-8; WB = Western blot; RKIP = proteína inhibidora de la quinasa Raf. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Efecto de la locostatina sobre la expresión de RKIP en células PC12 estimuladas con hemina. (A) Ilustración esquemática del procedimiento experimental para el tratamiento con locostatina en células PC12. (B) La viabilidad celular de las células PC12 tratadas con diferentes concentraciones de locosatina se evaluó mediante el ensayo de viabilidad celular. (C, C) La expresión de RKIP en células PC12 tratadas con hemina (80 μM, 24 h) y/o locostatina (5 μM, 24 h) se analizó mediante western blot, con blots representativos y análisis estadístico mostrados. (E) La expresión de ARNm de RKIP en células PC12 tratadas con hemina (80 μM, 24 h) y/o locosatina (5 μM, 24 h) se midió mediante RT-qPCR. Todos los datos se presentan como media ± DE (n = 3). *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. Abreviaturas: CCK8 = Kit de recuento de células-8; WB = Western blot; RT-qPCR = reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa cuantitativa; ROS = Especies reactivas de oxígeno; LPO = peroxidación lipídica. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Efecto de la inhibición de RKIP sobre la ferroptosis en células PC12 después de la estimulación con hemina. (A-E) Análisis de Western blot de los cambios en la expresión de proteínas en ACSL4, GPX4, NRF2 y HO-1 en células PC12 tratadas con hemina (80 μM, 24 h) y / o Locostatin (5 μM, 24 h). (F-J) Análisis RT-qPCR de los niveles de expresión de ARNm de ACSL4, GPX4, NRF2, HO-1 y FTH1 en células PC12 tratadas con hemina (80 μM, 24 h) y/o Locostatina (5 μM, 24 h). Todos los datos se presentan como media ± DE (n = 3). *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. Abreviaturas: WB = western blot; RT-qPCR = reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa cuantitativa; RKIP = proteína inhibidora de la quinasa Raf; ACSL4 = Acil-CoA sintetasa de cadena larga familia 4; GPX4 = glutatión peroxidasa 4; NRF2 = factor nuclear 2 relacionado con el factor E2; HO-1 = hemo oxigenasa-1; FTH1 = Cadena pesada de ferritina 1. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Efecto de la inhibición de RKIP sobre el estrés oxidativo en células PC12 después de la estimulación con hemina. (A, C) Análisis de citometría de flujo de la producción de especies reactivas de oxígeno en células PC12 tratadas con hemina (80 μM, 24 h) y / o Locostatina (5 μM, 24 h). (D, C) Análisis por citometría de flujo de la peroxidación lipídica en células PC12 tratadas con hemina (80 μM, 24 h) y/o Locostatina (5 μM, 24 h). Todos los datos se presentan como media ± DE (n = 3). *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. Abreviaturas: ROS = Especies reactivas de oxígeno; LPO = peroxidación lipídica. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5: El papel de NRF2 en los efectos antiferroptóticos mediados por la inhibición de RKIP. (A) Ilustración esquemática del procedimiento experimental para tratar las células PC12 en diferentes condiciones. (D-C) Análisis de Western blot de los cambios en la expresión de proteínas en NRF2 y HO-1 en diferentes condiciones de tratamiento en células PC12 con hemina (80 μM, 24 h) y/o Locostatin (5 μM,24 h) y/o ML385 (5 μM, 24 h). (E, F) Análisis RT-qPCR de los niveles de expresión de ARNm de NRF2 y HO-1 en células PC12 tratadas con hemina (80 μM, 24 h) y/o Locostatin (5 μM, 24 h) y/o ML385 (5 μM, 24 h). (G-J) Análisis de inmunofluorescencia de la expresión de NRF2 y HO-1 y cuantificación de la intensidad media de fluorescencia en células PC12 tratadas con hemina (80 μM, 24 h) y/o loastatina (5 μM, 24 h) y/o ML385 (5 μM, 24 h). Barras de escala = 50 μm. Todos los datos se presentan como media ± DE (n = 3). *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. Abreviaturas: WB = western blot; RT-qPCR = reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa cuantitativa; Tinción de IF = tinción de inmunofluorescencia; NRF2 = factor nuclear 2 relacionado con el factor E2; HO-1 = hemooxigenasa-1. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 6: El papel de NRF2 en la supresión del estrés oxidativo mediado por la inhibición de RKIP.(A,C) Análisis por citometría de flujo de la producción de especies reactivas de oxígeno en células PC12 con hemina (80 μM, 24 h) y/o Locostatina (5 μM, 24 h) y/o ML385 (5 μM, 24 h). (D, C) Análisis por citometría de flujo de la peroxidación lipídica en células PC12 tratadas con hemina (80 μM, 24 h) y/o Locostatina (5 μM, 24 h) y/o ML385 (5 μM, 24 h). Todos los datos se presentan como media ± DE (n = 3). *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. Abreviaturas: ROS = Especies reactivas de oxígeno; LPO = peroxidación lipídica. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 7: Representación esquemática de la inhibición de RKIP que atenúa la ferroptosis neuronal después de la HIC espontánea mediante la activación de la vía NRF2 / HO-1. Nuestros hallazgos demuestran que la inhibición de RKIP promueve eficazmente la translocación nuclear de NRF2, suprime la acumulación de ROS lipídicas y, en consecuencia, protege contra la ferroptosis inducida por hemina y el estrés oxidativo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Tabla 1: Cebadores para transcripción inversa cuantitativa-PCR.

Archivo complementario 1: Datos cuantitativos brutos y procesados que respaldan las primeras seis cifras, incluidos los ensayos CCK-8, Western blot, RT-qPCR y análisis de citometría de flujo. Los datos están organizados por subpaneles de figuras e incluyen todos los valores replicados utilizados para los análisis estadísticos. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Los autores declaran que no tienen intereses financieros o relaciones personales que puedan haber influido en el trabajo reportado en este artículo.