Un microscopio Raman multimodal de transformada de Fourier de campo amplio

Resumen

Un microscopio de transformada de Fourier de campo amplio, basado en un interferómetro birrefringente compacto y ultraestable, permite la adquisición paralela de espectros para todos los píxeles de un detector 2D. El enfoque en el dominio del tiempo permite el desenredo de señales fotoluminiscentes y Raman, y permite un mapeo Raman rápido (~5 ms/píxel) con resolución espacial de ~1 μm y espectral de 23 ^cm-1 .

Resumen

La microscopía Raman es una técnica poderosa para determinar la composición química de una muestra. El principal desafío de los microscopios Raman espontáneos de última generación, basados en la detección en el dominio de la frecuencia de barrido puntual, es la adquisición de mapas Raman de grandes áreas debido a tiempos de permanencia típicamente largos en píxeles (0,1-1 s). El microscopio de transformada de Fourier (FT) de campo amplio presentado aquí permite la medición rápida de muestras extendidas con resolución espacial de ~1 μm y espectral de ~23 ^cm-1 . Se basa en un interferómetro birrefringente de trayectoria común ultraestable y compacto, añadido a lo largo de la trayectoria de detección de un microscopio comercial, que permite la adquisición paralela de espectros para todos los píxeles de un detector 2D, reduciendo significativamente el tiempo de medición (10-100 veces más rápido). El enfoque en el dominio del tiempo aborda eficazmente otra limitación de la técnica en el dominio de la frecuencia, que es desenredar la señal Raman del fondo de fotoluminiscencia, en el que la señal Raman puede estar enterrada. Este protocolo describe cómo realizar mediciones hiperespectrales con un microscopio comercial mejorado: la alineación del esquema de iluminación, los criterios para elegir los parámetros de medición y el análisis de datos para recuperar e investigar espectros.

Introducción

La imagen espectral es una técnica que proporciona tanto información espectral como espacial y se ha aplicado a diversos campos, desde la microscopía¹ hasta^{la teledetección 2}. La imagen multiespectral e hiperespectral se distingue según si se registran unas pocas bandas espectrales discretas o un espectro continuo para cada píxel de un sensor 2D. La imagen Raman es una implementación particular de la imagen espectral.

La microscopía de dispersión Raman es una técnica poderosa para medir las frecuencias vibracionales ν_R de un sistema. Los modos vibracionales están asociados con los enlaces químicos, por lo que la espectroscopía^{Raman 3} permite investigar la composición química de las muestras en ciencias^{biológicas 4} y^{ciencias de materiales 5}. En la espectroscopía Raman espontánea, la muestra se ilumina con radiación monocromática a la frecuencia _ν0, llamada bomba. Una fracción de la luz de la bomba, que interactúa con los modos vibracionales, puede sufrir dispersión inelástica, resultando en fotones a frecuencias ν_S (ν_AS)=ν₀-(+)_{ν R}, donde ν_R es la frecuencia vibracional molecular dentro de la muestra. La luz dispersada de menor energía (ν_S) se llama radiación Stokes, mientras que la de mayor energía (ν_AS) es la radiación anti-Stokes. En equilibrio térmico, la mayoría de las moléculas ocupan estados de energía más bajos, por lo que los componentes anti-Stokes son significativamente más débiles que los de Stokes. Por esta razón, la microscopía de dispersión Raman suele detectar fotones de Stokes. Como las moléculas y sólidos tienen múltiples modos vibracionales, el espectro Raman se caracteriza por bandas distintas que forman colectivamente una firma química única, permitiendo la identificación y el análisis del material. El principal desafío de este enfoque es la sección transversal extremadamente baja de la dispersión Raman espontánea, con solo uno de cada más de 10 ^{9-10 12} fotones que experimenta este proceso.

En una configuración estándar de un microscopio de dispersión Raman, la luz de excitación se enfoca firmemente en un punto de la muestra. Tras rechazar los fotones de bomba dispersados elásticamente (normalmente con filtros espectrales), la luz restante se recoge y se caracteriza con un espectrómetro en dominio de frecuencia (por ejemplo, rejilla dispersiva); La resolución espectral de estos dispositivos puede alcanzar ~0,5-1 ^cm-1. La medición se repite para cada punto (x,y) en el campo de visión (FOV) de una muestra mediante un método llamado escaneo puntual ^{o raster 6}. Hay dos problemas principales en este enfoque: (1) la baja sección eficaz de la dispersión Raman espontánea suele requerir tiempos de integración largos (0,1-1 s) para recoger suficientes fotones para cada píxel del espectrómetro, por lo que el mapa Raman de una muestra extendida puede requerir tiempos de medición largos; (2) la excitación por la luz de la bomba también da lugar a la fotoluminiscencia (PL), que se solapa con la señal Raman espontánea y a menudo puede abrumarla.

Para aumentar la velocidad de adquisición, es posible adoptar el enfoque de barrido lineal⁷ , en el que la bomba se enfoca a lo largo de una línea del FOV (por ejemplo, en la coordenada x) y la señal recogida (dispersión PL o Raman) se dispersa mediante un espectrómetro con un sensor 2D, produciendo para la coordenada x dada un conjunto de datos 2D en el que un eje corresponde al espectro y el otro a una coordenada espacial y. No obstante, esta implementación sigue sufriendo las pérdidas significativas introducidas por la rendija de entrada del espectrómetro, cuyo ancho estrecho proporciona una mejor resolución espectral, pero también limita la cantidad de luz recogida.

Una configuración de campo amplio puede ser más adecuada para reducir el tiempo de medición: con este método, se ilumina una gran parte de la muestra y se adquiere el espectro para todos los píxeles de un sensor 2D simultáneamente. En este caso, la información espectral puede recopilarse utilizando un conjunto de filtros pasa^{banda 8} o un filtro espectral^{sintonizable 9} delante de una cámara de imagen monocroma. Además, este método se basa en un enfoque en el dominio de la frecuencia, y adquiere solo un número discreto de bandas espectrales.

Un método alternativo para medir un espectro es el enfoque de la transformada de Fourier (FT). Es una técnica en el dominio del tiempo basada en el teorema¹⁰ de Wiener-Kintchin, que establece que la densidad espectral de potencia de una señal es la transformada de Fourier de su autocorrelación temporal. En óptica, esto se consigue en la práctica generando dos réplicas retardadas de la forma de onda con un interferómetro. Su interferencia se mide mediante un detector en función del retardo relativo, dando lugar al llamado interferograma¹¹. El enfoque FT se utiliza ampliamente para medir espectros en la región espectral infrarroja, donde se denomina espectroscopía infrarroja por transformada de Fourier (FTIR⁾¹². La FTIR se utiliza habitualmente para medir el espectro de absorción de transiciones vibracionales en el rango espectral del infrarrojo medio (~2,5−25 μm de longitud de onda).

El enfoque de FT en el dominio temporal ofrece algunos beneficios en comparación con los espectrómetros dispersivos convencionales: logra un mayor rendimiento debido a la ausencia de rendijas (ventaja etendue de Jacquinot¹²); Proporciona una resolución espectral flexible, que solo depende del rango de barrido. Además, es muy adecuado para configuraciones de campo amplio: de hecho, al usar un detector 2D, el método mide un interferograma por cada píxel en paralelo, permitiendo la grabación simultánea de espectros continuos en todos los píxeles. Por otro lado, un sistema de imagen de FT debe cumplir dos requisitos desafiantes: (1) el retardo relativo entre las dos réplicas de luz debe controlarse hasta una pequeña fracción del ciclo óptico; (2) el desplazamiento de fase entre rayos que interfieren en un solo píxel debe limitarse para garantizar una buena coherencia y, por tanto, un alto contraste. Se han propuesto algunas soluciones basadas en interferómetros de camino^{común 13, 14} o casi¹⁵, pero son bastante engorrosas o tienen una resolución espectral superior a 100 ^cm-1.

En este trabajo se describe un nuevo microscopio de campo amplio que permite la adquisición de imágenes de fotoluminiscencia y dispersión Raman. El bloque innovador de este sistema es un interferómetro birrefringente de camino común compacto y ultraestable, llamado Sistema de Codificación de Pulsos Idénticos basado en Cuña Traductora (TWINS)¹⁶. Proporciona escaneos de retardo de cientos de ciclos ópticos con una precisión de fase de una pequeña fracción del propio ciclo óptico y alta estabilidad. Las dos réplicas de luz tienen polarizaciones ortogonales y viajan colinariamente a través del mismo camino común, por lo que no se ven afectadas por fluctuaciones de longitud de camino, típicas de un interferómetro de doble haz. El esquema, mostrado en el recuadro de la Figura 1, consiste en dos bloques de cristal birrefringente con ejes ópticos ortogonales: uno (B₂) con longitud fija y el otro (B₁) dividido en dos cuñas que pueden moverse en la dirección común de hipotenusa. La luz incidente se polariza por_{P 1} a 45° respecto al eje óptico del cristal birrefringente, de modo que la mitad de la energía está a lo largo de la polarización ordinaria y la otra mitad a lo largo de la extraordinaria. Mientras viajan a lo largo de los bloques birrefringentes, los dos componentes ortogonales acumulan un retardo relativo que se ajusta finamente variando el grosor total del bloque B₁ cambiando la inserción de la cuña. El segundo polarizador_P2 proyecta los componentes del campo a una polarización lineal común para que interfieran. El retardo τ entre réplicas depende del desplazamiento de cuña x a lo largo de la hipotenusa común como (Ecuación 1), con c velocidad de la luz, α ángulo de vértice de las cuñas, Δn= n_{e-n o} diferencia en los índices de refracción ordinario y extraordinario (birrefringencia). Dado que la resolución espectral Δv es inversamente proporcional al rango de barrido T=|T_{2-T 1}|, con T₁, T₂ como retardo inicial y final del interferograma, la alta resolución espectral requerida por la espectroscopía Raman exige una alta birrefringencia y traducciones en cuña larga. Entre los cristales birrefringentes más comunes, YVO₄ (ortovanato de itrio) es especialmente adecuado por su alto rango de Δn y transparencia en el infrarrojo visible-cercano. Las cuñas están diseñadas con un ángulo de ápice de 10°, por lo que, con una longitud de barrido de 15,3 mm, el interferómetro puede transmitir un retardo de 2500 fs a 600 nm, obteniendo una resolución espectral de 23 ^cm-1, en todo el rango espectral de interés (la sensibilidad de la cámara de silicio representa el límite superior). Este trabajo presentará la estrategia para un ajuste adecuado del muestreo interferográfico (es decir, rango escalonado y de barrido) para alcanzar la resolución espectral deseada y para tratar el fondo de banda ancha, separando la señal Raman de la fotoluminiscencia.

Como describen Candeo et ^al.17, este espectrómetro birrefringente puede acoplarse a un microscopio óptico comercial para realizar mediciones hiperespectrales. Los requisitos son los siguientes: un cuerpo de microscopio óptico reconfigurable, un interferómetro birrefringente TWINS, una cámara monocroma de bajo ruido (por ejemplo, CCD o sCMOS) y una fuente láser de banda estrecha. Para esta última, las longitudes de onda típicas de excitación para Raman y espectroscopía de fluorescencia son 355 nm, 488 nm, 514 nm, 532 nm, 633 nm y 785 nm. A pesar de que los láseres de alta pureza espectral, como el que aparece en la Tabla de Materiales, son la mejor opción, también se puede usar un láser con un ancho de línea más amplio, por ejemplo, ~0,1 nm, dada la limitada resolución espectral del instrumento. El microscopio se mejora colocando el TWINS en la trayectoria de detección, entre la lente tubular y el detector monocromo. Esta configuración proporciona un retardo uniforme en el camino a lo largo del campo visual y un contraste medio del 55%. El camino de excitación está diseñado para obtener una iluminación uniforme de la muestra: en la práctica, la punta de salida de una fibra multimodo de gran núcleo se visualiza en el plano de la muestra. Mediante el uso de un enrevador mecánico, los modos están fuertemente acoplados en el núcleo de la fibra, produciendo un perfil plano en el plano de la muestra. Además, una bobina móvil vibrante promedia el patrón de motas típico de la radiación monocromática. Una caracterización de esta iluminación de sombrero de copa se muestra en la Figura Suplementaria 1. El haz se enfoca en la muestra mediante un objetivo corregido al infinito, que también recoge Raman retrodispersada y luz de luminiscencia hacia la trayectoria de detección. Los filtros necesarios para rechazar la iluminación serán detallados.

Para mostrar cómo medir características espectrales de banda ancha y estrecha con este microscopio hiperespectral, se miden tanto la luminiscencia como la dispersión Raman para una muestra de prueba seleccionada específicamente con fines ilustrativos. La muestra consiste en una mezcla de tres pigmentos en polvo con los conocidos espectros Raman: dos polimorfos de blanco de titanio (_{TiO 2}), a saber, rutilo y anatasa, y amarillo sulfuro de cadmio (CdS). Sin embargo, el mismo procedimiento puede emplearse para una gama más amplia de aplicaciones, desde la ciencia de materiales hasta la biología.

El alcance de este artículo es ilustrar los pasos para realizar una medición hiperespectral, mientras que el ensamblaje y alineación del interferómetro TWINS son detallados por Candeo et ^al.17. Por lo tanto, un experimentador interesado debería partir de un interferómetro preensamblado basado en esta tecnología.

El protocolo comienza con la preparación de la muestra y cómo preparar el microscopio para excitar y recoger los fotones de dispersión Raman y PL. Luego, los parámetros de escaneo (longitud de escaneo, paso de muestreo) y los parámetros de adquisición (tiempo de exposición, binning por hardware) se establecen según los requisitos de la señal investigada. Finalmente, se presentará la cadena de postprocesamiento, detallando el procedimiento para recuperar el espectro en cada píxel (hipercubo espectral, Figura 2B) del conjunto de datos temporal adquirido (hipercubo temporal, Figura 2A), y detallando los algoritmos para la reducción de ruido y el análisis espectral avanzado. El flujo de trabajo completo se muestra en la Figura 3.

Protocolo

Los reactivos y el equipo utilizado en este estudio se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Preparación de muestras

PRECAUCIÓN: Usa guantes de látex durante esta preparación, ya que el pigmento CdS es tóxico, especialmente al inhalarlo.

1. Utiliza un raspador para depositar 20 mg de cada polvo pigmentario sobre una balanza de precisión, obteniendo una proporción de peso 1:1:1.
   NOTA: Limpia cuidadosamente la punta del raspador de cada muestra para evitar contaminación cruzada.
2. Mezcla los polvos con un mortero para eliminar grumos.
3. Vierte la mezcla resultante sobre una lámina de microscopio; Utiliza la punta del raspador para presionarla suavemente y obtener un grosor casi uniforme de la capa.
4. Aplica esmalte de uñas en los bordes de una funda de microscopio. Colócalo sobre la mezcla, con el esmalte de uñas hacia abajo, y aplica suficiente presión para sellarlo. Déjalo secar unos segundos para endurecer el pulido.

2. Montaje del microscopio

PRECAUCIÓN: Lleva gafas de seguridad cuando el láser está encendido, ya que la potencia máxima alcanzable en el plano de muestra es de 300 mW.

NOTA: El rendimiento del láser de bombeo no se ve afectado por variaciones de temperatura, siempre que funcione dentro del rango de temperatura especificado en la hoja técnica (por ejemplo, 10-40 °C para el láser indicado en la Tabla de Materiales).

1. Alinea el interferómetro TWINS a lo largo de la trayectoria de detección del microscopio.
   NOTA: Como detallan Candeo et ^al.17, debe añadirse el módulo interferómetro entre la lente del tubo y el detector, asegurando una distancia adecuada entre ambos. Para el microscopio utilizado en este trabajo, esto solo está garantizado cuando se retira el módulo ocular.
2. Para adaptar el esquema de iluminación de Koehler a una excitación láser, se retira la lámpara de excitación incorporada del microscopio y se utiliza un objetivo de microscopio para recoger la luz a la salida de una fibra multimodo de gran núcleo.
   NOTA: La ampliación objetivo determina el tamaño del patrón de iluminación cuando la punta de la fibra se conjuga con el plano de la muestra. Una posible opción es un objetivo de 10x/0,25-0,30.
3. Elige la longitud de onda de excitación y enfoca el láser de excitación en la entrada de la fibra multimodo de gran núcleo. Enciende la cámara y ejecuta un software de visualización.
   1. Une una sección central de la fibra a la membrana vibrante de una bobina móvil, lo que eliminará la mancha. Encogerse mecánicamente la fibra doblándola fuertemente para fusionar todos sus modos espaciales. Enciende el láser.
   2. Prepara una muestra de prueba para la alineación, por ejemplo, franjas fluorescentes rojas en un cubrecubrimiento de microscopio.
   3. Ajusta la posición de la punta de la fibra respecto al sistema óptico de iluminación moviendo la fibra con una etapa de traslación de precisión para obtener un punto con intensidad uniforme y bordes bien definidos en el plano de la muestra.
      NOTA: Se utiliza un láser de 532 nm para todas las mediciones reportadas. Con una fibra del tamaño de un núcleo de 400 μm, el diámetro del punto cubre el 82% del ancho de campo de visión de la cámara.
4. Emplear un conjunto de filtros para los caminos de excitación y detección, adoptando los siguientes criterios (Figura suplementaria 2):
   1. Utiliza un filtro paso banda estrecho a 532 nm (ancho de banda de 2,0 nm) para limpiar la línea láser y rechaza cualquier banda lateral de la bomba que surja del ensanchamiento no lineal debido a la propagación en la fibra.
   2. Utilizar un espejo dicróico (DM en la Figura 1) para reflejar la luz láser hacia la muestra y transmitir la radiación retrodispersada y desplazada al rojo recogida por el objetivo.
   3. Utiliza un filtro pasa largo (LPF en la Figura 1) a 532 nm para rechazar la luz residual de iluminación.
   4. Durante la medición de dispersión Raman, se utiliza un filtro pasa-corto (SPF en la Figura 1) a 600 nm para suprimir la fluorescencia de fondo.
5. Mide la potencia en el plano de muestra con un medidor de potencia. Atenuar el haz de bombeo para obtener una intensidad en la muestra que no cause daño (del orden de 2 W/cm², como se indica en la Tabla 1). Usa un obturador para el láser mientras ajustas los otros parámetros de medición.
   NOTA: Debido a la baja sección eficaz de la dispersión Raman espontánea, se necesita una alta densidad de potencia para mejorar la recogida de señales. Sin embargo, debe considerarse el umbral de daño de la muestra. A diferencia de los sistemas de escaneo puntual, una configuración de campo amplio ilumina una gran área, lo que hace que la disipación de energía sea menos eficiente y requiere una gestión cuidadosa de la energía para evitar daños en la muestra.
6. Coloca la muestra en el escenario del microscopio y ajusta el enfoque.
   NOTA: Para encontrar el enfoque fácilmente, primero ilumina la muestra con una lámpara blanca en transmisión o reflexión. En este último caso, se podía usar una bombilla situada junto al microscopio. El enfoque de la muestra se optimizará posteriormente con la luz láser de bombeo.

3. Parámetros de medición

1. Enciende el driver del motor que realiza la traducción en cuña. Controla los componentes de hardware (cámara y motor) simultáneamente para realizar mediciones hiperespectrales (ejemplo de interfaz de usuario mostrado en la Figura Suplementaria 3).
2. Configura los parámetros de adquisición de la cámara, el tiempo de exposición y el binning por hardware para optimizar la intensidad de la señal, adoptando las siguientes instrucciones:
   1. Dado que una alta relación señal-ruido (SNR) en la señal temporal conduce a una SNR alta en los espectros recuperados, se privilegia un tiempo de exposición largo, que llena mejor el rango dinámico del sensor.
      NOTA: Para señales bajas, como para la dispersión Raman, hay que encontrar un compromiso entre el nivel de señal y el tiempo total de medición: el tiempo de exposición más largo puede no ser factible.
   2. Elige binning hardware para recoger carga de más píxeles antes de la lectura.
      NOTA: Sumar la carga y hacer una sola lectura ofrece mejor rendimiento de ruido que leer varios píxeles y luego sumar su señal en postprocesado. La elección del binning también está impulsada por la reducción aceptable de la resolución espacial.
3. Elige parámetros de escaneo, longitud total de escaneo y paso de muestreo según los siguientes criterios:
   1. Para lograr una alta resolución espectral para picos Raman, se establece una translación asimétrica de cuña larga (-2526 fs→ -36 fs). Por otro lado, realiza un escaneo simétrico alrededor de la posición de retardo cero (-65 fs → 65 fs) para obtener más características espectrales de banda ancha de la señal PL.
   2. Usando la Ecuación 1 para el retardo τ como función de la traslación de cuña x, elige el paso de muestreo para cumplir el límite de Nyquist para el ancho de banda espectral de interés.
      NOTA: Dada la longitud mínima de onda del espectro λ_min, imponer (Ecuación 2).
      
      donde la birrefringencia Δn depende de la longitud de onda (véase las ecuaciones de Sellemeier).
4. Abre el obturador para enfocar la muestra con el láser. Si se observa una disminución en la intensidad de la señal, espere hasta que la muestra haya alcanzado una condición estacionaria (normalmente unos segundos).
   NOTA: Para compensar la disminución de la intensidad de la señal, ajusta el binning y el tiempo de exposición para mantener una buena señal de respuesta rápida.
5. Comienza la adquisición de una imagen monocroma para cada posición de cuña, es decir, el retardo temporal entre réplicas desde cada punto del sensor 2D.
   NOTA: El software de adquisición debería guardar dos variables: el hipercubo temporal (conjunto de imágenes 2D) y el vector de posiciones motoras registrado por el codificador durante el escaneo.
6. Una vez finalizada la medición, apaga el láser y procede al análisis de datos.

4. Procesamiento del datacubo adquirido

1. Genera el hipercubo espectral a partir del conjunto de datos adquirido, siguiendo estas instrucciones:
   1. Carga el archivo de corrección de posiciones de los motores para el motor paso a paso específico (véase la discusión).
   2. Carga el archivo de calibración de frecuencia del interferómetro específico para asociar frecuencias espaciales medidas (pseudofrecuencias) con frecuencias ópticas reales (véase la sección de discusión).
   3. Elige el rango de frecuencias para los espectros que se calculará transformando Fourier los interferogramas de todos los píxeles.
   4. Entre las funciones de apodización^{disponibles, 12} para ventanas en el interferograma medido, selecciona la que ofrezca un buen equilibrio entre el ensanchamiento espectral y la reducción de artefactos en los espectros recuperados, como la ventana Happ-Genzel (Hamming).
   5. Genera el hipercubo espectral transformando Fourier los interferogramas apodizados para todos los píxeles. Guárdalo en valores complejos.
      NOTA: El espectro complejo de FT contiene información adicional, que será útil para eliminar el ruido del conjunto de datos y extraer el espectro medio de un conjunto de píxeles seleccionados.
2. Una vez calculado el hipercubo espectral, realizar diversas investigaciones, por ejemplo, obtener el espectro medio en áreas seleccionadas; generar una imagen RGB de falso color; cartografiar picos espectrales; Resta el fondo.
3. Para reducir el ruido espectral, que puede superar picos significativos, especialmente en espectros Raman, implementa la Descomposición de Valores Singulares (SVD)¹⁸ siguiendo estos pasos:
   1. Remodelar el hipercubo temporal en una matriz A con interferogramas a lo largo de sus filas.
   2. Realizar el SVD de la matriz, obteniendo matrices U, S y V de modo que A = USV^T.
      NOTA: Las columnas U son las distribuciones espaciales de los vectores propios de V (columnas), mientras que S es una matriz diagonal con valores singulares (SVs) en orden descendente.
   3. Remodelar cada columna de U en una matriz de píxeles y realizar su FT 2D para obtener sus frecuencias espaciales.
   4. Dado que las frecuencias altas se asocian con cambios muy abruptos en el mapa, considéralos como ruido; definir una región cuadrada centrada en el espacio de Fourier calculado que separa las frecuencias bajas (principalmente señal) y altas (principalmente ruido).
      NOTA: Una posible elección para esta zona es con un lado de 1/4 respecto al tamaño del espacio de Fourier.
   5. Calcular la razón de señal espacial (SSR) para cada SV dividiendo la suma de las intensidades de píxeles (módulo complejo) dentro del límite por la suma de las intensidades fuera del límite. Grafica SSR en función del número SV.
   6. Define un umbral para SSR, es decir, el número de SVs significativos a mantener para reducir la contribución de ruido en el conjunto de datos, evitando artefactos.
      NOTA: La SSR suele mostrar una tendencia decreciente que se estabiliza hasta convertirse en una meseta a medida que aumenta el número de valores singulares. Una regla general es conservar los valores singulares hasta el punto en que comienza la meseta.
   7. Poner todos los SV inferiores a cero en la matriz diagonal S, obteniendo_{S sin ruido,} y calcular un hipercubo temporal denoisezado como V_{T deruidizado} por EE. UU.
      NOTA: SVD es una factorización matricial que también puede aplicarse al hipercubo espectral remodelado (con filas que contienen espectros en lugar de interferogramas).
4. Repite los pasos 4.1-4.2 con el hipercubo temporal denoidado para recuperar los espectros.
5. Descargue el programa desde el enlace en la Referencia¹⁹ para realizar un análisis más profundo del conjunto de datos con el algoritmo Multivariate Curve Resolution-Alternating Least Squares (MCR-ALS).
   NOTA: Los desarrolladores de software proporcionan una descripción detallada del^{algoritmo 20}. Es un método iterativo para resolver el problema del análisis de mezclas: cada espectro se expresa como la combinación lineal de perfiles espectrales puros. Con una representación matricial: B = C R^T+E, donde B es el conjunto de datos, C contiene las concentraciones para cada espectro, las columnas de R son los espectros de referencia de los constituyentes y E expresa el error.
   1. Remodelar el hipercubo espectral en una matriz de N_pix x_{N frecuencias} , con N_pix número total de píxeles_{y N} frecuencias de longitud vectorial de frecuencia.
   2. Selecciona el número de especies esperadas en la muestra y carga sus espectros de referencia.
      NOTA: Los espectros de referencia pueden medirse para cada pigmento por separado. De lo contrario, el programa hará un SVD del conjunto de datos y utilizará tantos componentes principales como los constituyentes seleccionados para las suposiciones iniciales.
   3. Seleccionar restricciones: los perfiles espectrales recuperados deben ser no negativos y lo más similares posible a los espectros de referencia.
   4. Grafica el mapa de concentración (columnas remodeladas de C) y los espectros (columnas de R) para cada especie.
   5. Exporta estos mapas y úsalos para producir una imagen en falso color (Figura 4A), concluyendo el análisis.
      NOTA: Los programas utilizados para obtener los resultados aquí presentados no están disponibles públicamente, pero pueden obtenerse a los autores bajo solicitud.

Resultados

La figura 4A muestra el mapa Raman para una región seleccionada de la mezcla en polvo. Es una representación en falso color de los mapas de abundancia recuperados con MCR-ALS, como se describe en el paso 4.5. Proporciona información sobre la composición de la muestra, ya que las tres especies pueden distinguirse claramente dentro del campo de visión. La Figura 4B muestra los espectros medios en las regiones seleccionadas del map...

Discusión

Se ha introducido un microscopio multimodal de campo completo de campo amplio para la adquisición de imágenes espontáneas de dispersión Raman y luminiscencia, y es aplicable a la ciencia de materiales. La aplicabilidad a muestras biológicas está demostrada por Candeo et ^al.17, que presentan una imagen de fluorescencia hiperespectral de células humanas teñidas. El principal desafío para las mediciones de dispersión Raman en este campo es prevenir el daño fotográfic...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Anatase	Kronos	1200	Polimorfismo de pigmento blanco TiO2
Polvo de sulfuro de cadmio	Kremer Pigmente GmbH & Co.	21060	Amarillo de cadmio, índice de color oscuro/PY35
Cámara	Andor	Luca R	Cámara CCD de multiplicación de electrones con píxeles de 8 y micro de 1004x1002 píxeles de 8 y micro; m x 8 y micro; m
Filtro de limpieza	Semrock	LL01-532-12.5	& Oslash; 1/2" 2,0 nm - Filtro láser FWHM a 532 nm
Cubiertas	BRAND GmbH & Co	4700 55	Cubiertas de microscopio de vidrio borosilicato 22x22x0,15 mm
Espejo dicróico	Semrock	Di02-R532-25x36	Divisor de haz láser de un solo borde de 25,2x35,6 mm a 532 nm
Fibra	Thorlabs	M74L05	400 y micro; Tamaño m-core, fibra multimodo NA 0,39
Láser	Fotónica Hubner	Cobolt Samba 1000	Láser bombeado por diodo CW a 532 nm, potencia máxima 1000 mW
Filtro paso largo	Semrock	LP03-532RU-25	Filtro de borde pasa largo ultra empinado a 532 nm
Microscopio	Leica	DMRBE	Microscopio de investigación trinocular
Objetivo	Leica	PL-FLUOTAR, 10x/0,30	Objetivo de excitación y recogida con aumento de 10x, 0,3 NA
Objetivo	Newport	M-10X	Lente objetivo en el camino de iluminación, con aumento de 10x, 0,25 NA
Rutilo	Kronos	2900	Polimorfismo de pigmento blanco TiO2
Filtro pasa-corto	Thorlabs	FESH600	& Oslash; Filtro pasacorto de 25,0 mm con longitud de onda de corte 600
Diapositivas	Marienfeld	1000612	Portaobjetos de microscopio de 76x26x1 mm