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In vitro Reconstitución de redes citoesqueléticas dentro de vesículas unilamelares gigantes (GUV) separadas en fase

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DOI:

10.3791/68530

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20 de junio de 2025

 ,  , 
1Department of Cellular and Molecular Biophysics, Max Planck Institute of Biochemistry

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

Este artículo presenta una reconstitución simple de redes de citoesqueletos dentro de vesículas gigantes separadas en fase. El método puede generalizarse y aplicarse a la encapsulación o confinamiento de una amplia gama de biomoléculas.

Resumen

Las membranas lipídicas biomiméticas en forma de vesículas unilaminares gigantes (GUV) se usan comúnmente para imitar el comportamiento de la membrana celular debido a la facilidad de reconstitución de proteínas dentro de GUV, visualización y comprensión de la dinámica de proteínas de la membrana celular. Sin embargo, las membranas celulares comprenden balsas lipídicas (o dominios) que surgen de la presencia de diferentes lípidos en la membrana celular. Esta mayor complejidad en los sistemas modelo puede incorporarse para dar lugar a GUV separados por fase, en los que se puede ajustar con precisión la composición lipídica. Si bien los métodos de encapsulación para la generación de GUV homogéneos son ampliamente conocidos, los métodos para encapsular proteínas dentro de GUV separados por fase son limitados. Aquí, este protocolo presenta una producción simplificada de GUV separados por fase, compuesta por dominios líquidos desordenados (Ld) y líquidos ordenados (Lo), encapsulando de manera eficiente diferentes proteínas del citoesqueleto, es decir, FtsZ y actina, lo que convierte al método en una herramienta versátil para una producción celular mínima. En concreto, este enfoque utiliza un protocolo de transferencia de emulsión para producir GUVs con una alta eficiencia de encapsulación. En este método, primero se genera una monocapa de lípidos emulsionando una solución de proteínas en una mezcla de lípidos / aceite, donde se eligen lípidos de diferentes temperaturas de transición de fase para producir la separación de fases en los GUV resultantes. Esta emulsión se transfiere suavemente sobre una solución de lípidos en aceite en otro tubo, lo que da como resultado la formación de una interfaz agua-aceite. A continuación, la solución se centrifuga a temperaturas elevadas (idealmente a 37 °C para retener la actividad de la proteína), tras lo cual se recogen los GUV para la obtención de imágenes. Este método simplifica la reconstitución in vitro de proteínas del citoesqueleto dentro de GUV separados por fase sin utilizar una configuración de laboratorio engorrosa y, por lo tanto, sirve como un método conveniente para estudiar la mecánica de las interacciones entre el citoesqueleto y la membrana en confinamiento.

Introducción

Las vesículas gigantes sirven como sistemas modelo para comprender las funciones celulares 1,2. Su facilidad de producción, visualización, sintonización y reconstitución in vitro de las biomoléculas hacen de estos modelos biomiméticos el sistema elegido para muchos estudios de investigación 3,4,5. Existen varios métodos conocidos para producir GUV, como la electroformación6, cDICE 7,8, la transferencia de emulsión y otros métodos basados en microfluidos 9,10. La producción de GUV con estos métodos se reporta en la literatura 3,11. Además, in vitro, la reconstitución de redes de citoesqueletos dentro de GUVs ha sido descrita previamente utilizando un método de transferencia de emulsión debido a la facilidad de este método de formación de un solo recipiente, que no requiere ninguna configuración compleja12. Sin embargo, dicha reconstitución se reporta muy comúnmente en GUVs homogéneos, un sistema que no imita completamente la complejidad de las membranas celulares.

Este protocolo describe la reconstitución in vitro de redes de citoesqueletos dentro de GUVs separados en fase, exhibiendo la complejidad de la membrana lipídica. Si bien se ha informado previamente que tales redes se unen en la superficie de la membrana (exterior) pero no se limitan dentro de las vesículas gigantes13,14, la técnica actual de transferencia de emulsión se centra en el protocolo para producir la separación de fases, así como retener la actividad de la formación de la red del citoesqueleto. Uno de los principales retos de esta técnica es la temperatura. Los métodos de producción estándar para generar GUV separados por fase requieren el uso de temperaturas elevadas, que varían en función de la temperatura de transición de fase de los lípidos constituyentes. Sin embargo, las proteínas del citoesqueleto son incapaces de polimerizar en estructuras de orden superior a temperaturas tan altas 15,16,17. Por lo tanto, este protocolo no solo emplea una composición lipídica para producir la separación de fases en GUV a temperatura ambiente, sino que también optimiza las condiciones para producir un buen rendimiento de GUV a temperaturas fisiológicas.

Otro aspecto a tener en cuenta a la hora de producir sistemas GUV reconstituidos es el volumen de las biomoléculas encapsuladas necesarias. Para la mayoría de las proteínas, producir volúmenes más altos puede ser costoso y llevar mucho tiempo, lo que implica varias rondas de purificación. Además, los experimentos de reconstitución in vitro generalmente requieren una fase exploratoria inicial en la que primero se prueban las concentraciones de biomoléculas, las composiciones de tampones, etc., para lograr un contenido de solución interna optimizado. Así, este protocolo optimiza el protocolo de producción de GUV para dos ensayos diferentes, que se adaptan a las premisas antes mencionadas. Por un lado, este protocolo describe un ensayo que optimiza el protocolo estándar de emulsión invertida, que involucra volúmenes relativamente más altos de proteínas y genera una producción de GUV de alto rendimiento en tubos, que luego se transfieren a placas de imagen de 96 pocillos. Por otro lado, el enfoque descrito aquí también optimiza el protocolo para la producción de GUV separados por fases directamente en placas de pocillos de imagen, que emplea volúmenes más bajos de biomoléculas (~ 1/4 de las cantidades requeridas para la producción en tubos) y permite la generación de GUV en serie, logrando muchas condiciones encapsuladas en un solo paso de centrifugación. Por lo tanto, el protocolo presentado aquí muestra un método de encapsulación, pero permite al usuario elegir cualquiera de las configuraciones en función de sus requisitos.

Además, este protocolo describe un método optimizado para la encapsulación de dos redes citoesqueléticas diferentes: FtsZ y actina. Dado que estas dos proteínas requieren diferentes condiciones de tampón y aglomeración, el protocolo aborda los cambios necesarios posteriores para lograr una reconstitución óptima de la red. Por lo tanto, el enfoque presentado aquí se puede utilizar y generalizar para encapsular cualquier biomolécula requerida dentro de GUV separados por fase.

Protocolo

Los reactivos y el equipo utilizado en este estudio se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Preparación de la mezcla lipídica

  1. Tome 0,5 mL de cloroformo en un vial de vidrio de 5 mL. Añadir 17,5 μL de DOPC, 7,4 μL de DOPG, 29,6 μL de DPPC (todos de 25 g/L de caldos lipídicos preparados en cloroformo), 32,2 μL de 10 g/L de DPPG y 20,6 μL de 18 g/L de colesterol. Añade 1,2 μL de 1 g/L de colorante Atto655-DOPE. Agite suavemente la mezcla de lípidos y evapore el cloroformo bajo el flujo de nitrógeno y vuelva a suspender la película delgada en un total de 400 μL de cloroformo.
  2. Para la encapsulación de FtsZ, la mezcla lipídica final preparada está en la proporción DOPC: DOPG: DPPC: DPPG: Chol (17.499: 7.5: 31.5: 13.5: 30 mol ratio) marcada con 0.001 mol% Atto655-DOPE. Para la producción de GUVs con actina agrupada encapsulada, la mezcla lipídica contiene lípidos biotinilados, y se prepara en la proporción DOPC: DOPG: DPPC: DPPG: Chol: Biotinyl CAP PE (17.499: 7.5: 30.5: 13.5: 30: 1) marcado con 0.001 mol% Atto655-DOPE.
  3. Disuelva la mezcla lipídica (32 mM, 50 μL) en cloroformo y seque en un vial de vidrio bajo un flujo de gas N2 durante ~ 15 min.
  4. A continuación, el vial de vidrio se almacena al vacío en un desecador durante ~30 minutos para eliminar cualquier rastro de cloroformo residual.
  5. Dispersar la película seca en una mezcla de decanos (20 μL) y aceite mineral (500 μL) en el vial de vidrio para obtener la concentración final de 3,2 mM y sonicar a temperaturas elevadas (~50 °C) durante ~30 min utilizando un sonicador de baño.
  6. Transfiera la mezcla de lípidos en aceite a un tubo e incube el tubo a 37 °C durante ~10 minutos antes de continuar con los siguientes pasos.
  7. Prepare la mezcla de encapsulación interna para las proteínas.

2. Preparación de soluciones internas para encapsulación

  1. Mezcla de filamentos FtsZ
    1. Prepare la mezcla de proteínas FtsZ en un volumen total de 10 μL en un microtubo. Para la red filamentosa FtsZ, agregue 0,87 μL de 23 μM de FtsZ-YFP-mts, 1,31 μL de 381 g/L de Ficoll70 de 381 g/L, 1,11 μL de 271 g/L de BSA y 1 μL de 25 mM de GTP a 5,71 μL de tampón de reacción (RB) de FtsZ. El volumen total de la solución es de 10 μL y contiene 2 μM de FtsZ-YFP-mts, 50 g/L de Ficoll70, 30 g/L de BSA y 2,5 mM de GTP en la solución final. Manténgalo en hielo antes de usarlo para encapsularlo dentro de GUV.
      NOTA: El tampón de reacción FtsZ (RB) contiene 50 mM de Tris-HCl, pH 7.5, 150 mM GluK, 5 mM GluMg.
  2. Mezcla de actina y haz
    1. Para la encapsulación de haces de actina, primero prepare una mezcla maestra de actina de 10 μL (A-Mix) que contenga 86% de G-actina, 10% de Atto488-actina y 4% de actina biotinilada en agua. Para este paso, prepare las soluciones de masa proteica de acuerdo con las instrucciones del fabricante. A continuación, para obtener una concentración final de 35,42 μM A-Mix, añadir 6,39 μ L de 2 g/L de G-actina, 1,48 μL de 1 g/L de Atto488-actina, 1,19 μL de 0,5 g/L de actina biotinilada y 0,9 μL deH2O. Mantener en hielo y cubrir de la luz.
    2. Para evitar la prepolimerización y la agrupación de la actina fuera de los GUV, prepare la solución final de actina minutos antes de la encapsulación. La solución final consta de 7% de yodixanol, 0,01 g/L de neutravidina, 2,4 μM de A-Mix, 0,6 μM de fascina, 10 g/L de BSA, 20 g/L de Ficoll70 y 5 mM de ATP en tampón de polimerización de actina.
      1. Para preparar esta solución final, que debe mantenerse en hielo en todo momento, agregue en el siguiente orden: 2,92 μL de Yodixanol al 60%, 10,25 μL H2O, 2,5 μL de 0,1 g/L de Neutravidina, 0,92 μL de 271 g/L de BSA, 1,31 μL de 381 g/L de Ficoll70, 2,5 μL de tampón de polimerización de actina 10x, 1,69 μL de A-Mix de 35,42 μM, 1,65 μL de 9 μM de Facina y 1,25 μL de 100 mM de ATP. Mezclar bien y tomar rápidamente los 5 μL necesarios para encapsular.
        NOTA: mida la osmolaridad de esta solución interna con un osmómetro (~430 mOsm/Kg). Se debe preparar una mezcla de solución externa adecuada con la misma osmolaridad diluyendo glucosa en agua hasta alcanzar el mismo valor de osmolaridad (ver paso 3.2). El tampón de polimerización de actina 10x contiene 100 mM de Tris-HCl, pH 7,5, 500 mM de KCl y 50 mM de MgCl2.

3. Producción de GUV y encapsulación in vitro

  1. Producción de GUV en tubos: encapsulación de FtsZ
    1. Para la encapsulación de FtsZ, agregue 500 μL de tampón de reacción FtsZ (RB) en un tubo de plástico de 1,5 mL y agregue suavemente 200 μL de mezcla de lípidos en aceite (preparada en el paso 1.6 anterior) para permitir la formación de una interfaz aceite-agua y la deposición de una monocapa lipídica en esta interfaz.
    2. Para formar la emulsión, primero tome otro tubo de 1,5 mL y agregue 200 μL de lípidos en aceite. Incubar este tubo a 37 °C durante ~10 min antes de formar la emulsión.
    3. Una vez incubado, añadir 5 μL de la mezcla de proteínas FtsZ (preparada en el punto 2.1.1) a este tubo. La proteína de 5 μL en medio acuoso se hunde hasta el fondo del tubo en forma de gota.
    4. Haga una emulsión golpeando suavemente el fondo del tubo 5-6 veces hasta que la solución se vuelva visiblemente turbia.
    5. Pipetear suavemente esta emulsión y colocarla encima de la interfaz aceite-agua (preparada en el paso 3.1.1 anterior).
    6. Centrifugar a 6000 x g durante 30 min a una temperatura precalentada de 37 °C y mantener esta temperatura hasta el final de la producción de vesículas.
    7. Deje que la muestra se enfríe a temperatura ambiente durante casi 30 minutos antes de tomar imágenes.
    8. Retire la capa superior de aceite pipeteando suavemente desde la parte superior del tubo, dejando casi 100-200 μL de solución para la obtención de imágenes.
    9. Corte la punta de una pipeta en un ángulo inclinado con unas tijeras y recoja suavemente 50-100 μL de la solución GUV del fondo del tubo. Esta solución se utilizará para la obtención de imágenes.
  2. Producción de GUV directamente en placas de 96 pocillos: encapsulación de actina
    1. Para la encapsulación de actina, primero prepare una mezcla de solución externa (glucosa en agua) con la misma osmolaridad que la mezcla de actina interna. Para que coincida con los ~430 mOsm/Kg de la mezcla interna, haga una mezcla de solución externa agregando 198 μL de glucosa 2 M en 802 μL H2O.
    2. Para hacer las vesículas directamente en una placa de pocillos, primero pasivar un pocillo de una placa de 96 pocillos. Añadir 100 μL de 10 g/L de BSA en el pocillo e incubar durante 10-15 min. A continuación, lave el pocillo con 100 μL de solución exterior cinco veces con cuidado de no tocar el fondo de vidrio pasivado con la punta de la pipeta. Deje 100 μL de la mezcla de solución exterior en el pocillo después de completar el lavado.
    3. Agregue suavemente 50 μL de mezcla de lípidos en aceite al pocillo para preparar la monocapa de lípidos sobre la solución exterior. Para asegurar una correcta deposición del petróleo en la parte superior de la fase acuosa, apoye la punta de la pipeta en un lado del pozo y deje que el petróleo se deslice desde la pared del pozo.
    4. Para formar la emulsión, primero tome un tubo de 1,5 mL y agregue 100 μL de lípidos en aceite. Incubar este tubo a 37 °C durante ~10 min antes de formar la emulsión.
    5. Añadir 2,5 μL de la solución final de actina (del paso 2.2.2) al tubo que contiene 100 μL de mezcla de lípidos en aceite (paso 1.6 anterior). La proteína de 2,5 μL en medio acuoso se hunde hasta el fondo del tubo en forma de gota.
    6. Haga una emulsión golpeando suavemente el fondo del tubo de 10 a 20 veces hasta que la solución se vuelva visiblemente turbia.
    7. Pipetear suavemente esta emulsión y colocarla encima de la interfaz aceite-agua (preparada en el paso 3.2.3 anterior). Sumerja la punta de la pipeta con cuidado en el centro de la monocapa de aceite y deposite la emulsión. La emulsión forma una nube turbia confinada en la fase monocapa de aceite.
    8. Centrifugar la placa de 96 pocillos a 200 x g durante 20 min a una temperatura precalentada de 37 °C y mantener esta temperatura hasta el final de la producción de vesículas.
      NOTA: Centrifugar a 400 x g durante 10 minutos para acortar el tiempo de producción de vesículas. Sin embargo, cíñete a estos parámetros de centrifugación para obtener mejores resultados. La centrifugación por encima de 400 x g da como resultado vesículas compactadas con agregados lipídicos que se acumulan en la parte inferior de la placa de imagen.
    9. Deje que la muestra se enfríe a temperatura ambiente durante casi 30 minutos antes de tomar imágenes.
      NOTA: Las imágenes directas se pueden realizar en un pozo sin la necesidad de quitar la capa superior de petróleo o transferir las vesículas a otra cámara/pozo.

4. Imagen y reconstrucción de imágenes en 3D

  1. Tome una placa de pocillo de imagen de 96 y passívela con BSA durante ~ 10 min antes de transferir la muestra a la placa de pocillo de imagen (consulte el paso 3.2.2).
  2. Transfiera la solución GUV a la placa de pocillo pasivada.
  3. Coloque la placa del pocillo en la platina de un microscopio confocal invertido en un objetivo de agua de 40x.
  4. Concéntrese en cualquier región de interés (ROI) y tome una secuencia de imágenes de pila z del ROI elegido con intervalos de pasos z fijos. El protocolo da como resultado GUV de 5-30 μm, por lo que el intervalo se puede fijar en 0,5-1 μm, según sea necesario.
  5. Guarde cada secuencia de imágenes de pila z en formato .tiff.
  6. Abra una secuencia de imágenes de interés en un software de procesamiento de imágenes (ImageJ/Fiji). Identifica la imagen con mayor intensidad. Mantenga presionadas las teclas Ctrl + Shift + c para abrir la ventana de Brillo y contraste y haga clic en Automático.
  7. En el menú ImageJ/Fiji, vaya a Analizar > establecer escala e introduzca la distancia física conocida y su unidad para cada píxel de la imagen.
  8. En el menú ImageJ/Fiji, vaya a Pilas de imágenes > > proyecto Z para reconstruir una imagen 3D a partir de la pila z. Establezca el Tipo de proyección como Desviación estándar. Las opciones predeterminadas se pueden utilizar para el resto de la configuración (Iniciar sector y Detener sector).
    NOTA: tenga cuidado con los artefactos de proyección de desviación estándar que surgen de la superposición de pilas z en la reconstrucción 3D. Para asegurarse de que no haya artefactos, elimine las pilas z en el hemisferio inferior de la esfera para observar solo la proyección de la mitad superior.

5. Análisis estadístico de la frecuencia GUV en función del tamaño

  1. Adquiera imágenes de pila Z de los GUV de interés, como se explica en los pasos 4.4 y 4.5. Para obtener imágenes de tantos GUV como sea posible en un campo de visión amplio, adquiera pilas confocales con un zoom de 1x o 2x.
  2. Abra las secuencias de la pila Z en un software de procesamiento de imágenes (en este caso, ImageJ/Fiji), como se explica en 4.6.
  3. Seleccione el canal de visualización donde se adquirió la señal de fluorescencia de membrana haciendo clic en la barra etiquetada como c debajo de la imagen. Ajuste el brillo y el contraste de la imagen como se explica en 4.6.
  4. Navegue a través de los diferentes planos adquiridos haciendo clic en la barra z debajo de la imagen abierta. Seleccione el plano en el que el diámetro de la vesícula a analizar sea mayor.
  5. Abra el administrador de ROI en ImageJ/Fiji haciendo clic en Analizar herramientas de > > Administrador de ROI.
  6. De las herramientas disponibles en el panel principal de ImageJ/Fiji, haga clic en la selección ovalada.
  7. Dibuje un círculo que se ajuste al GUV siguiendo la intensidad de fluorescencia de la membrana del GUV. Para dibujar una selección de círculo, presione la tecla Mayús y arrastre el mouse para expandir el círculo hasta el tamaño de la vesícula. La selección del círculo se puede mover haciendo clic simultáneamente con el botón izquierdo del ratón en el centro de la vesícula y arrastrando el ratón a la ubicación deseada.
  8. Guarde la selección de círculos dibujada en el Administrador de ROI haciendo clic en Agregar [t], ubicado en el panel de opciones del Administrador de ROI.
  9. Para obtener el tamaño de la vesícula en micras, haga clic en Medir ubicado en el panel del Administrador de ROI. Aparecerá una nueva ventana. Tome el valor que se muestra en la columna Mayor o Menor (ambas columnas deben tener el mismo valor, ya que se refieren a los ejes de la elipse) como la medida del diámetro de la vesícula.
  10. Utilice software de trazado (Excel, Origin, Prism) para crear un gráfico de barras en el que se especifique la fracción de GUV para diferentes rangos de tamaño.

Resultados

Como primer paso, se produjeron GUVs con separación de fases por membrana siguiendo un enfoque de emulsión invertida modificada (Figura 1A). Esto da como resultado un alto rendimiento de GUVs, que exhiben una membrana desmezclada en dominios Ld y Lo , como lo representa la etiqueta Atto 655-DOPE en el dominio Ld y las regiones oscuras correspondientes a los dominios Lo no marcados (Figura 1B). Este método produce GUV separados por fases de tamaños que oscilan entre 5 y 30 μm (Figura 1C) a temperaturas elevadas (todos los pasos se realizan a 37 °C y se obtienen imágenes en RT). Además, se ajustaron las velocidades de centrifugación para asegurar la incorporación de los lípidos componentes originales dentro de los GUV, así como para evitar una sobrepoblación excesiva.

Además, para demostrar la encapsulación exitosa de biomoléculas utilizando el método de emulsión descrito en el protocolo actual, tanto las redes de FtsZ como las de actina se reconstituyeron en experimentos individuales. Las redes FtsZ se recapitulan dentro de GUVs, que emergen como filamentos que se unen preferentemente a los dominios Ld a través de su secuencia de membrana dirigida (MTS) en presencia de 2,5 mM GTP y 50 g/L Ficoll70 (como se muestra en la Figura 2). Las redes se observaron aproximadamente 1 h después de la etapa de encapsulación. Sin embargo, las redes de actomiosina emergen como haces delgados (en contraste con las redes gruesas de FtsZ) después de la reconstitución dentro de los GUV (Figura 3). Hay que tener en cuenta que los lípidos biotinilados desempeñan un papel crucial en la unión de las redes de actomiosina a la membrana de los GUV. Sin lípidos biotinilados, los haces de actomiosina no pueden adoptar una configuración curva y permanecen como haces rectos, cortos y rígidos en la luz en lugar de adherirse a la membrana como una malla enredada de haces largos (Figura 4).

En el protocolo de emulsión modificada, la velocidad de centrifugación se ajusta para obtener GUV separados por fase, como se mencionó anteriormente. De hecho, las velocidades de centrifugación más altas con muestras que contienen redes de actomiosina (600 x g durante 15 min) dan como resultado la agregación de vesículas en una configuración similar a un tejido dentro del pocillo de producción. Por lo tanto, en todos los experimentos de reconstitución estándar de redes de actomiosina, la velocidad óptima de centrifugación se estableció en 200 x g para obtener GUV no agregados (Figura 5).

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Figura 1: Generación de GUV separados en fase en un solo recipiente empleando el método de transferencia de doble emulsión. (A) Esquema experimental de los pasos clave en la producción de vesículas separadas en fase mediante transferencia de doble emulsión. (B) Imagen confocal de proyección Z de los GUV resultantes generada siguiendo el método descrito en A. La barra de escala es de 50 μm. (C) Gráfico de barras con la fracción de GUV separadas en fase generadas según su diámetro. Experimentos realizados n = 3, el número total de GUVs analizados por experimento = 100. Los datos se muestran como valores medios, los puntos de datos individuales son los tres experimentos independientes. Las barras de error representan la desviación estándar de los tres experimentos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 2: Vesículas separadas en fase con redes FtsZ encapsuladas. (A) Imágenes de proyección 3D confocales realizadas en una pila z completamente adquirida de un GUV separado en fase que contiene una red FtsZ. (B) Imágenes de proyección Z confocal realizadas solo en la mitad superior de la vesícula. Debido a la formación heterogénea de dominios sobre la superficie del GUV, la reconstrucción 3D de los cortes confocales adquiridos muestra la superposición de dominios lipídicos de las áreas superior e inferior de la vesícula. Para evitar la superposición y facilitar la inspección visual de los dominios, la mitad inferior de las pilas z adquiridas se eliminan del archivo. La mitad superior resultante se utiliza para su proyección 3D a través de la desviación estándar. Las barras de escala son de 20 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 3: Vesículas separadas en fase con redes de actomiosina encapsuladas. (A) Imágenes de proyección Z confocal de una pila completa adquirida con una vista alejada del pocillo después de la producción de vesículas. El alto rendimiento de vesículas obtenido permite el estudio de diferentes estructuras de actomiosina dentro de las vesículas. La barra de escala es de 50 μm. (B) Imágenes confocales de proyección Z realizadas en la mitad superior de una vesícula. Para facilitar el análisis visual de los dominios lipídicos, solo se utiliza la mitad superior de los cortes de imagen para realizar una proyección 3D. La barra de escala es de 10 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 4: Importancia de los lípidos biotinilados para la generación de redes de actomiosina unidas a la membrana dentro de vesículas separadas en fase. Proyecciones confocales en 3D que representan vesículas separadas por fase con redes de actomiosina no unidas. Si los lípidos biotinilados no se incorporan a la mezcla, se forman estructuras de actomiosina en el lumen y no adquieren una configuración curva en la valva interna de las vesículas (panel derecho, actina marcada con Atto488). La barra de escala es de 50 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 5: Efecto de la velocidad de centrifugación en la producción de vesículas separadas en fase mediante transferencia de emulsión. Imágenes confocales en 2D que muestran una muestra de GUV generada empleando una fuerza de centrifugación de 600 x g durante 15 min. La velocidad de centrifugación empleada, superior a la optimizada de 200 x g, da como resultado la agregación de vesículas en una configuración similar a un tejido dentro del pocillo. La barra de escala es de 100 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discusión

Uno de los principales desafíos para la reconstitución in vitro de sistemas modelo basados en membranas es la encapsulación de proteínas dentro de GUV separados en fase debido a su preparación a altas temperaturas. De hecho, la generación de este tipo de vesículas separadas en fase a través de la síntesis en un solo recipiente puede dar lugar a dificultades derivadas de la degradación de proteínas a temperaturas elevadas. Así, este protocolo describe las condiciones optimizadas para observar la separación de fases de membrana siguiendo el método de doble emulsión para la producción de GUV a temperaturas fisiológicas, manteniendo simultáneamente la actividad de las proteínas encapsuladas. Este enfoque introduce una carga negativa en ambos dominios para facilitar la unión de cualquier proteína deseada cuando las interacciones electrostáticas son un requisito previo. En el caso de la encapsulación de FtsZ, a pesar de la presencia de carga negativa en ambos dominios, las redes del citoesqueleto se desarrollan y se unen preferentemente a los dominios Ld , lo que indica que, junto con la carga negativa, la fluidez de la membrana es un requisito esencial para la unión a proteínas18. Además, en el caso de la encapsulación de actina, las redes se desarrollan sobre regiones de membrana donde se incorporan lípidos biotinilados19.

Aunque el ensayo de transferencia de emulsión es ampliamente utilizado en la literatura, solo se ha aplicado a la producción de GUV homogéneos. Este protocolo, por lo tanto, consta de varios aspectos modificados del ensayo, que permiten la observación de la formación de dominios en la membrana. Uno de los aspectos más importantes en este sentido es la temperatura. Para observar dominios, así como para mantener la funcionalidad de las proteínas (específicamente la formación de redes de citoesqueletos), este protocolo emplea 37 °C para producir GUVs. Por un lado, cuando los GUV se producen a una temperatura más alta, las proteínas encapsuladas pierden su funcionalidad, residiendo en el lumen y no polimerizando en estructuras de orden superior. Por otro lado, si los GUV se producen a una temperatura más baja, no se observa separación de fases en la membrana. Por lo tanto, 37 °C se convierte en la temperatura óptima para la producción de GUV en los experimentos.

Es importante tener en cuenta que este protocolo proporciona dos posibles sistemas de ensayo para producir GUVs siguiendo el mismo principio de transferencia de emulsión: dentro de tubos y placas de pocillos. Ambos presentan ventajas y desventajas, que el usuario puede necesitar tener en cuenta durante la fase de planificación experimental para determinar qué sistema se adapta mejor a sus necesidades. De hecho, los tubos de plástico no requieren una centrífuga equipada con un rotor para placas de pocillos, son más fáciles de manejar y permiten controlar el factor de dilución de las vesículas después de la producción y antes de la obtención de imágenes. Sin embargo, requieren volúmenes más altos (tanto para la fase de aceite como para la acuosa) y la eliminación de la capa de aceite después de la producción para la extracción de GUV, lo que puede dejar restos de petróleo en el pozo de imágenes si este paso no se realiza con cuidado. Alternativamente, las placas de pocillos requieren el uso de menos volumen de muestra, permiten la encapsulación de diferentes condiciones internas en serie y a la vez, y no requieren extracción GUV, ya que las vesículas se pueden obtener imágenes inmediatamente después de la producción en el mismo pozo de producción. La principal desventaja de las placas de pocillos es la agregación de vesículas y la necesidad de ajustar los parámetros de centrifugación para alcanzar un rendimiento de producción de vesículas similar al observado en los tubos.

Independientemente del sistema de encapsulación empleado (tubos o placas de pocillos), este enfoque muestra que se requieren condiciones óptimas de apiñamiento para producir los GUV, así como para facilitar la polimerización de las proteínas encapsuladas. En particular, siguiendo este protocolo, se observó la mejor condición para los GUV con FtsZ encapsulado con 30 g/L de BSA y 50 g/L de Ficoll7018; mientras que para la actina se requirió una mezcla de 10 g/L de BSA, 7% de Yodixanol y 20 g/L de Ficoll7019.

Otro aspecto importante de la producción de GUV es la velocidad y el tiempo de centrifugación. Para la formación de redes FtsZ bajo las concentraciones de hacinamiento mencionadas anteriormente, la centrifugación a 6000 x g durante 30 min produce una población de GUV que están bien distribuidas y separadas sobre la placa del pocillo de imágenes. Por el contrario, para la actina, 200 x g durante 20 min permite la generación de un alto rendimiento de producción de GUV. Si la velocidad o el tiempo de centrifugación disminuyen, el rendimiento de los GUV se ve afectado, mientras que aumentarlo por encima de los valores mencionados conduce a la agregación de GUV. En las condiciones mencionadas, este protocolo genera GUV con la máxima eficiencia de encapsulación, así como GUV individuales que no se pegan entre sí.

Si bien este protocolo se puede generalizar a cualquier lípido y biomolécula encapsulada, la composición deseada de la membrana y el contenido de las vesículas dictan los parámetros de centrifugación, que permiten la generación de vesículas separadas por fase. Por lo tanto, este protocolo sirve como guía para permitir la producción de diversas vesículas con dominios de membrana.

Tales metodologías de reconstitución in vitro dentro de GUVs separadas en fase son cruciales para comprender la intrincada dinámica proteína-membrana mediada a través de dominios lipídicos, considerando la complejidad de las membranas celulares14. El pequeño tamaño y la naturaleza altamente dinámica de estos dominios lipídicos dificultan la caracterización de las interacciones interfaciales in vivo. Por lo tanto, los GUV sirven como una herramienta vital debido a su relativa facilidad de preparación y modulación físico-química, así como a su idoneidad para el análisis por microscopía óptica20.

Además, la encapsulación de moléculas funcionales dentro de biointerfaces heterogéneas presenta aplicaciones prometedoras en el campo de la nanomedicina. En particular, el desarrollo de sistemas funcionalizados de administración de fármacos con diferentes propiedades derivadas de la distribución asimétrica y la partición de biomoléculas en áreas confinadas en su superficie21. Las interacciones fármaco-lípido juegan un papel importante en las propiedades farmacocinéticas de los fármacos, como su transporte, distribución y acumulación, que en última instancia influyen en la eficacia de los fármacos utilizados22. Por lo tanto, comprender el papel de estas interacciones en las propiedades farmacocinéticas de los medicamentos es fundamental para desarrollar medicamentos efectivos. Las membranas lipídicas modelo pueden ser exploradas para comprender sus mecanismos de interacción con péptidos, polímeros y nanotransportadores23. Por lo tanto, los cambios en la composición lipídica de las células y los tejidos en ciertas condiciones de enfermedad pueden alterar las interacciones biofísicas, que podrían explorarse para desarrollar fármacos específicos y sistemas de administración de fármacos24.

En conclusión, el protocolo descrito aquí proporciona una estrategia fácil para generar GUVs separados en fase con proteínas encapsuladas ancladas a su valva lipídica interna. La generación de estos sistemas vesiculares tiene un uso prometedor en campos como la biotecnología y la biología sintética, donde los ensamblajes multicomponentes con funcionalidades complejas para imitar funciones similares a las células podrían aportar soluciones innovadoras y nuevas aplicaciones.

Divulgaciones

Los autores declaran no tener intereses contrapuestos.

Agradecimientos

Los autores desean agradecer al MPIB Core Facility por su asistencia en la purificación de proteínas, a Michaela Schaper por la clonación de plásmidos, a Kerstin Röhrl por la purificación de proteínas y a Sandra Ortmeier por las preparaciones lipídicas. Los autores también desean agradecer a Adrián Merino-Salomón y Shunshi Kohyama por sus útiles discusiones sobre las condiciones de aglomeración y la encapsulación de proteínas. M.R.-L. forma parte de IMPRS-ML y del proyecto ONE MUNICH apoyado por el Ministerio Federal de Educación e Investigación (BMBF), así como por el Estado Libre de Baviera en el marco de la Estrategia de Excelencia del Gobierno Federal y los Länder. Los autores también quieren agradecer el apoyo del Centro de Nanociencia (CeNS) de Múnich.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfo-(1'-rac-glicerol) (sal de sodio) (DOPG)Lípidos polares de Avanti840475en cloroformo
1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DOPC)Lípidos polares de Avanti850375en cloroformo
1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-(tapa biotinil) (sal de sodio) (18:1 Biotinyl Cap PE)Lípidos polares de Avanti870273en cloroformo
1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfo-(1'-rac-glicerol) (sal de sodio) (DPPG)Lípidos polares de Avanti840455En cloroformo
1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DPPC)Lípidos polares de Avanti850355En
microplaca de fondo plano de 96 pocillos de cloroformo (SensoPlate)
Actina (músculo esquelético alfa-actina, conejo)HYPERMOL8101-01
Atto488-Actin (músculo esquelético alfa-actina, conejo)HYPERMOL8153-01
Atto655-DOPEATTO-TECAD 655-16
Sonicador de bañoBranson 1510R-MTHLimpiador ultrasónico Bransonic
Biotina-Actina (alfa-actina músculo esquelético, conejo)HYPERMOL8109-01
BSASigma AldrichA6003
CentrífugaEppendorf5424R
CentrífugaEppendorf5804 R
CloroformoSigma Aldrich67-66-3
Colesterol (ovino)Avanti Lípidos polares700000En cloroformo
DecaneTCI Deutschland GmbHD0011
Fascina (humana, recombinante)Cytoskeleton Inc (Tebubio GmbH)CS-FSC01-A
Ficoll70Sigma AldrichF2878
Iodixanol (OptiPrep)Sigma AldrichD1556
LSM800 microscopio de barridoCarl ZeissC-Apochromat 40  &tiempos; Objetivo de inmersión en agua. Láseres de estado sólido bombeados por diodos: 488  nm y 640  Nm.
Aceite mineralSigma Aldrich8042-47-5
Miosina II (músculo esquelético de conejo)Cytoskeleton Inc (Tebubio GmbH)MY02-A
NeutravidinaThermo Fisher Scientific Inc.31000
Fiske AssociatesMicro-Osmómetro Fiske modelo 120
Greiner Bio-One  GmbH07-000-109
de polvo Láser confocal Osmómetro

Referencias

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