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Síntesis de acetato de 2-retinilo 13C y preparación de dosis para pruebas de dilución de isótopos de retinol

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DOI:

10.3791/68535

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22 de agosto de 2025

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1Department of Nutritional Sciences, University of Wisconsin-Madison, 2Department of Otolaryngology - Head and Neck Surgery, University of Wisconsin-Madison

En este artículo

Resumen

El acetato de retinilo generalmente se marca con dos 13C cuando se usa la espectrometría de masas de cromatografía de gases-combustión-relación isotópica para el análisis de suero y leche materna. Este artículo describe la síntesis de acetato de 13C2-retinol y la preparación de dosis para las pruebas de dilución de isótopos de retinol que se administrarán mediante una pipeta de desplazamiento positivo o una jeringa de tuberculina.

Resumen

La prueba de dilución de isótopos de retinol (RID) es el método más sensible para evaluar el estado de la vitamina A mediante la estimación de las reservas hepáticas totales, considerado el estándar de referencia. Para la detección de espectrometría de masas de cromatografía de gases-combustión-relación isotópica, se agrega 13C a la fracción de retinol. El procedimiento sintético para el acetato de 13C-retinol comienza con la β-ionona natural. Brevemente, la cetona C18-tetraeno se sintetiza a partir de β-ionona y se purifica. Si se desea un acetato de 13C4-retinilo, el carbanión de trietilfosfonoacetato marcado con 13C2 se puede usar para agregar dos 13C a la fracción de β-ionona antes de agregar los tres carbonos de la acetona para sintetizar la cetona C18-tetraeno. Si se desea un acetato de 3-retinilo de 13C, los tres carbonos de la acetona podrían etiquetarse con 13C.

Para el acetato de 13C2-retinol más utilizado para análisis futuros mediante espectrometría de masas de relación de isótopos de cromatografía de gases y combustión, se utiliza un procedimiento de Wittig-Horner modificado y la cetona tetraeno C18 sin marcar se hace reaccionar con el carbanión de trietilfosfonoacetato marcado con 13C2 para agregar dos 13C a las posiciones 14 y 15 de la molécula de retinol. El éster etílico resultante se reduce al alcohol y se esterifica a acetato de2-retinol 13C con anhídrido acético. El isómero all-trans se purifica en alúmina desactivada en agua al 8% utilizando disolventes relativamente inocuos y altamente volátiles (hexanos y éter dietílico) que se eliminan mediante evaporación rotativa y sonificación de dosis de aceite. El producto se caracteriza por espectroscopia ultravioleta-visible (UV-Vis), cromatografía en capa fina (TLC) y cromatografía líquida de alta presión (HPLC) contra patrones analíticos. La dosis concentrada se almacena disuelta en aceite de soja a -80 °C. Las dosis finales se diluyen en aceite de soja (~200 μL/dosis) y se cuantifican mediante espectroscopia UV-Vis contra el aceite de soja del vehículo. Las dosis se miden para su administración a humanos con una pipeta de desplazamiento positivo o jeringas de tuberculina para la prueba RID. Utilizando supuestos apropiados, se calculan las reservas corporales totales y se estiman las reservas hepáticas totales.

Introducción

La dilución de isótopos de retinol (RID) es el único biomarcador del estado de la vitamina A que mide las reservas totales de vitamina A (TBS) en el cuerpo de forma cuantitativa y, con los supuestos apropiados, puede estimar las reservas hepáticas totales (TLR). Es la forma más sensible de medir el estado de vitamina A y el impacto de las intervenciones que contienen retinol preformado o carotenoides provitamina A. Aunque técnicamente desafiante, RID es preciso y mínimamente invasivo porque solo requiere muestras de sangre en lugar de biopsias de hígado1. La prueba RID implica la administración de acetato de retinol deuterado o marcado con 13C, según la plataforma del espectrómetro de masas. Antes de la administración de la dosis, se recolecta una muestra de sangre de referencia, lo cual es esencial cuando se usan 13etiquetas C, pero se puede hacer en un subgrupo seleccionado al azar. Se recolecta una segunda muestra después de que el acetato de retinol marcado con 13C se haya mezclado con TBS1.

Las intervenciones de vitamina A para prevenir la deficiencia incluyen el enriquecimiento de los alimentos, la biofortificación, la diversificación de la dieta y la suplementación. Sin embargo, en algunos países, ha habido intervenciones superpuestas dirigidas a las mismas personas, lo que ha llevado a la hipervitaminosis A2, lo que requiere un marco de monitoreo para evaluar los resultados del programa. Como tal, se necesitan métodos que midan cuantitativamente el estado de la vitamina A. En colaboración con los Estados miembros, el Organismo Internacional de Energía Atómica (OIEA) promueve el uso pacífico de isótopos en la investigación y las evaluaciones, lo que respalda la aplicación de la prueba RID. La prueba RID está ganando impulso y pronto se puede utilizar en grandes encuestas de población para evaluar el estado de la vitamina A desde la deficiencia hasta el exceso en los países que implementan intervenciones de vitamina A3.

Anteriormente, se sintetizó acetato de 10,11,14,15-13 C 4-retinilo utilizando modificaciones de Bergen et al. para acetato de retinilo deuterado 4,5. Este compuesto se utilizó en experimentos en ratas6 y humanos con cromatografía de gases-espectrometría de masas de relación de combustión-isótopos (GCCIRMS) adaptada para el análisis7. A partir de estos valiosos experimentos, determinamos que GCCIRMS era tan sensible que no se requerían cuatro 13C para la prueba RID usando GCCIRMS. Por lo tanto, el gasto del marcador se reduce al usar solo dos 13C en las posiciones 14 y 15 de la molécula de retinol (Figura 1). Esta modificación disminuye los costos asociados con la síntesis y conduce a un aumento de los rendimientos debido a la vía sintética. En este documento, se describe un protocolo ampliado para su síntesis.

GCCIRMS es más sensible que otros tipos de espectrometría de masas para la medición de isótopos estables8 y puede responder a cambios en la dieta y cambios naturales de enriquecimiento de 13C en el retinol sérico. Esto se describió en jerbos9 y humanos10que consumían maíz, y en humanos inscritos en una intervención vegetal11. De hecho, la abundancia natural de 13C varía entre diferentes poblaciones y debe determinarse en sujetos inscritos en evaluaciones de RID12. Sin embargo, se han utilizado pequeños subgrupos para medir el enriquecimiento natural con el RID en niños ghaneses y tailandeses13,14 y mujeres tailandesas15. Se debe determinar el enriquecimiento de 13C de referencia individual para la determinación más precisa de TBS a nivel individual12.

Protocolo

NOTA: Al inscribir sujetos humanos para investigaciones, intervenciones o estudios evaluativos, se debe buscar la aprobación de la Junta de Revisión Institucional (IRB) con los procedimientos de consentimiento informado apropiados.

1. Síntesis de acetato de 13C2 -retinol (Figura 2)

NOTA: Todos los procedimientos sintéticos y la cuantificación se realizan bajo iluminación fluorescente de oro para evitar la degradación e isomerización del compuesto.

  1. Sintetizar acetato de β-ionilo en un lote grande a partir de β-ionona disponible comercialmente. Por ejemplo, cubra el hidruro de sodio (NaH) (4 g, 0,16 mol) con 100 ml de éter. Agregue trietilfosfonoacetato sin etiquetar (36 g, 0,16 mol) en 100 ml de éter gota a gota y revuelva durante 2 h. Se libera H2 y la suspensión inicial se vuelve transparente y ámbar.
    PRECAUCIÓN: El hidruro de sodio (NaH) es un agente reductor fuerte que es útil en una amplia gama de reacciones químicas. Sin embargo, los incendios de laboratorio pueden ocurrir debido a su reacción altamente exotérmica con el agua en la atmósfera16,17. Se recomienda acceder a una hoja de datos de seguridad; se han publicado directrices adicionales para el manejo de sólidos moderadamente pirofóricos como el NaH18. Manténgalo suspendido en aceite o solvente no reactivo mientras manipula, enjuaga los recipientes de reacción y los recipientes de almacenamiento con gas inerte (como nitrógeno o argón), enfría el recipiente de reacción y almacena en recipientes sellados mantenidos en un ambiente seco. En nuestro laboratorio, el NaH se transfiere en pequeñas cantidades (~1 g) en un entorno de nitrógeno a viales y luego se almacena en un desecador sellado hasta su uso.
  2. Agregue β-ionona (21 g, 0,12 mol) en 40 ml de éter y reaccione durante la noche (~ 15 h a 20 ° C). El día 2, apague la reacción con agua y extraiga el acetato de etil-β-ionilideno en hexanos y lávelo repetidamente con agua en una serie de embudos separadores para maximizar la recuperación. Secar la capa orgánica (MgSOanhidro 4), filtrar y concentrar
    NOTA: La cromatografía en capa fina (TLC) generalmente detecta solo impurezas menores en esta etapa de la síntesis. Esto se puede almacenar durante un período prolongado a -80 °C antes de continuar con los siguientes pasos.
  3. Reaccione acetato de etil-β-ionilideno (28 g, 0,11 mol) con 120 ml de hidruro de litio y aluminio 1 molar (LiAlH4) en éter dietílico. Sumerja el recipiente de reacción en un baño de acetona de hielo seco y agite la solución continuamente para producir etanol de β-ionilideno.
    PRECAUCIÓN: El hidruro de litio y aluminio (LiAlH4) es un agente reductor fuerte. Acceda a una hoja de datos de seguridad y consulte las pautas adicionales para el manejo de sólidos moderadamente pirofóricos como LiAlH418,19. El objetivo principal de la mayoría de las precauciones de seguridad es minimizar el riesgo de exposición de LiAlH4 a la atmósfera y prevenir reacciones fuera de control. Esto generalmente implica mantener estos compuestos suspendidos en aceite o solvente no reactivo durante la manipulación, enjuagar los recipientes de reacción y los recipientes de almacenamiento con gas inerte (como nitrógeno o argón), enfriar el recipiente de reacción y almacenar LiAlH4 en recipientes sellados mantenidos en un ambiente seco. En nuestro laboratorio, el hidruro de litio y aluminio se compra en frascos sellados de 1 molar en lugar de en polvo, con los volúmenes requeridos eliminados con una jeringa y la atmósfera de la botella reemplazada por nitrógeno.
  4. Disuelva 28 g (0,12 moles) de etanol de β-ionilideno en 300 ml de hexanos. Agregue aproximadamente 50 g por día de MnO2 al 90% durante 3 días (51 g, 52 g y 54 g) y agite la mezcla de reacción durante más tiempo (a menudo 2 días a 20 ° C). Finalmente, agregue 35 g de MnO2 y deje reposar durante la noche durante aproximadamente 15 h; La reacción está completa en aproximadamente un 90%. Filtrar y lavar el acetaldehído de β-ionilideno del MnO2 con diclorometano.
  5. Disuelva el acetaldehído de β-ionilideno crudo (22 g, 0,10 mol) en 150 ml de acetona con agitación constante y agregue 10 ml de hidróxido de sodio 1 N gota a gota. Deje la reacción durante 6 h.
  6. Extraiga la cetona tetraeno C18 con hexanos y lave repetidamente con agua utilizando una serie de embudos separadores para maximizar la recuperación. Seque la solución resultante con un evaporador rotativo para producir cetona tetraeno cis-trans C18 cruda. Debido a que el isómero trans es más deseable para estudios en humanos, purifique la mezcla en gel de sílice desactivado con agua al 4% (300 g) utilizando un gradiente lento de 0-10% de acetato de etilo en hexano.
  7. Revuelva NaH (1,2 g, 0,05 mol) con 50 ml de éter. Añadir 13C de 2-trietilfosfonoacetato (11 g, 0,049 mol) disuelto en 50 ml de éter gota a gota y agitar durante 2 h. Disolver la cetona de tetraeno C18 (12 g, 0,044 mol) en 50 ml de éter y reaccionar durante la noche durante aproximadamente 15 h a 20 °C.
  8. Apagar la reacción con agua y extraer el éster etílico del ácido 2-retinoico 14,15-13 C con hexanos y lavar con agua en un embudo separador. Seque la capa orgánica con MgSO4 anhidro y concéntrese; Purifique con alúmina neutra desactivada en agua al 8% (400 g) con un éter dietílico lento de 0 a 3% en gradiente de hexano para producir isómeros cis / trans.
    NOTA: A menudo, la primera purificación tiene contaminantes según lo juzgado por TLC. Los contaminantes se visualizan haciendo reaccionar la placa TLC con vapor de yodo. Cuando hay contaminantes, es crucial repurificar en 400 g de alúmina neutra desactivada con agua al 8% con 100% de hexanos para dar como resultado un éster etílico puro de ácido 14,15-13 C 2-retinoico.
  9. Reducir el éster etílico de ácido 2-retinoico 14,15-13 C (3,7 g) con 15 mL de hidruro de litio y aluminio 1 molar en un baño de acetona de hielo seco mientras se agita para obtener 14,15-13 C 2-retinol (Figura 1).
  10. Disolver 14,15-13 C2-retinol (3,5 g) en 20 ml de trietilamina. Mientras agita la solución, mezcle 3,5 ml de anhídrido acético con 7 ml de trietilamina y agregue gota a gota al matraz. Deje el matraz durante la noche en el refrigerador para la formación del acetato de 2-retinilo 14,15-13 C (aproximadamente 15 h).
  11. Extraiga 3,9 g de acetato crudo de 14,15-13 C2-retinol en hexanos, seque, concéntrelo y purifique en 500 g de alúmina neutra desactivada en agua al 8% con un éter dietílico lento al 0-3% en gradiente de hexano. Monitoree las fracciones con un espectrofotómetro ultravioleta visible (UV-Vis) a 325 nm. Elimine todos los disolventes restantes con un rotoevaporador. Evalúe el producto final con HPLC y detección de fotodiodos para determinar la relación cis/trans. Un ejemplo de un sistema de gradiente avanzado para separar el perfil cis/trans mediante cromatografía líquida de ultrapresión está disponible en la Figura complementaria S1.
    NOTA: La relación cis/trans suele ser de >95% all-trans en esta etapa.
  12. Para su almacenamiento, disolver el acetato de 2-retinilo all-trans 14,15-13 C en aceite de soja de grado alimenticio sin otros aditivos y almacenar en vidrio ámbar enjuagado con nitrógeno a -80 °C y etiquetar como caldo concentrado.

2. Preparación de dosis de soluciones aceitosas de acetato de retinilo marcado con isótopos estables

NOTA: Se ha administrado acetato de retinilo marcado isotópicamente en cápsulas20 o en soluciones de aceite administradas con una pipeta de desplazamiento positivo21 de 250 μl o una jeringa médica22 (Figura 3). Hemos probado la estabilidad de las cápsulas (Figura 4), que se describe a continuación.

  1. Inmediatamente después de la síntesis, disuelva el acetato de retinilo etiquetado en ~ 15 ml de aceite vegetal no fortificado (por ejemplo, aceite de soja de grado alimenticio) antes de que comience a cristalizarse y almacene en un vial ámbar de 24 ml a -30 a -80 ° C hasta que esté listo para preparar las dosis finales.
    1. Si se ha comprado el acetato de retinilo etiquetado, retire con cuidado la parte superior de la ampolla sellada al vacío marcando con una lima o rompa el sello de una botella con tapa de rosca. Dependiendo de la masa necesaria, coloque una cantidad pesada en una botella de color ámbar marrón de 24 ml y agregue una pequeña cantidad de aceite vegetal (10 ml probablemente serán suficientes). Sonicar la mezcla hasta que se convierta en una solución clara.
  2. Calcule la cantidad de aceite final necesaria multiplicando el número de sujetos por 200 μL. Por ejemplo, si se van a inscribir 60 sujetos, prepare aproximadamente 70 dosis para tener suficiente desperdicio (aproximadamente 10-20%). Por lo tanto, 70 × 200 μL es 14 mL.
    NOTA: No confíe en la masa del aceite sintético o los cristales. Debe usar un espectrofotómetro para cuantificar las dosis. Toda la vitamina A sintética contiene disolventes residuales. Estos pueden disiparse por sonificación o bajo una suave corriente de nitrógeno, pero son la razón principal por la que la masa por sí sola no se puede usar para determinar las dosis de isótopos.
    Si las soluciones de acetato de retinilo etiquetadas se mantienen durante mucho tiempo en el congelador sin usarse, deben volver a analizarse para determinar si se ha producido una degradación sustancial.
  3. Para cuantificar el acetato de retinilo:
    1. Encienda el espectrofotómetro UV-Vis (preferiblemente espectrofotómetro de barrido de doble haz) y la computadora conectada, si corresponde. Ponga en marcha el espectrofotómetro UV-Vis siguiendo las instrucciones del fabricante. Deje que el espectrofotómetro se caliente durante al menos 30 minutos antes de la lectura.
    2. Coloque dos matraces y tapas aforados de 25 ml y llene cada uno con 25 ml de hexanos casi hasta la línea. Etiquete un matraz como "Aceite" o "En blanco" y el otro como "Vitamina A" o "Dosis"; luego, deje a un lado el matraz de vitamina A hasta después de que se hayan ejecutado los espacios en blanco.
    3. Vierta un poco de aceite de soja puro en un vaso de plástico desechable y agregue 20-40 μL al matraz de aceite para dejar en blanco el sistema.
      NOTA: A menudo usamos 20 μL, pero siempre que el volumen de dosis en blanco e isótopos sea el mismo, se pueden usar más.
    4. Invierta 4-5x para mezclar el aceite y los hexanos, luego enjuague ambas cubetas de cuarzo del espectrofotómetro con esta solución y llene ambas ~ 75% de su capacidad.
    5. Coloque ambas cubetas en el espectrofotómetro, teniendo cuidado de no tocar la parte delantera y trasera transparentes (asa solo por los lados esmerilados). Para obtener la mejor precisión, oriente la parte frontal numerada de cada cubeta coincidente hacia el usuario.
    6. Cierre la puerta que bloquea la luz sobre las muestras.
    7. Haga clic en la función En blanco o Línea de base y permita que el sistema mida la absorbancia de referencia de aceite y hexanos. Esto corrige la absorción de la solución de hexanos en blanco de aceite. Escanee de 260 a 400 nm; Confirme que la lectura es "cero" a 400 nm después de que este proceso haya finalizado. De lo contrario, presione el botón cero y vuelva a ejecutar el escaneo. Una vez completado, el sistema está listo para medir la absorbancia de la dosis de acetato de retinilo.
    8. Deseche el contenido de la cubeta de muestra y llénela con la solución de dosis de hexanos. Coloque la muestra en el lugar apropiado y escanee los espectros. Seleccione el pico y lea la absorbancia. El acetato de retinilo puro solo tiene un máximo lambda a 325 nm.
      NOTA: Si tiene más de un pico o tiene uno a 280 nm, el acetato de retinilo se ha degradado y no debe usarse para la dosificación.
  4. Cálculos para el paso 2.3
    NOTA: El E 1%, 1 cm para el retinol es 1.810 a 325 nm en hexanos. Cuantificará el acetato de retinilo en equivalentes de retinol.
    1. Divida la absorbancia por 0,181 para obtener los μg/ml de solución.
    2. Multiplique por 25 ml para obtener los μg en 20 microlitros de solución de aceite.
      NOTA: Ejemplo: La absorbancia de 20 μL de aceite en 25 mL de hexanos es 0,295.
      0,295/0,181 = 1,630 μg/ml × 25 ml = 40,75 μg en 20 μl de aceite
      Si necesita 286 μg para la dosis, es decir, 140,4 μL. Esto es 1 μmol, pero se producirán 288 μg de 13C2-retinol en el intestino debido a la etiqueta. Es posible que desee hacer una dilución para acercarse a la cantidad de dosis de 200 μL y volver a hacer la cuantificación anterior.
  5. Preparación de cápsulas para probar la estabilidad
    1. Separe las cápsulas en el fondo blanco más grande y las tapas azules más pequeñas.
    2. Coloque los fondos de las cápsulas blancas en las cajas de puntas de pipeta (96 cápsulas por caja) y ciérrelas para evitar que entre polvo en las cápsulas y coloque las tapas azules en una bolsa de plástico con cierre durante la noche. Deseche las cápsulas que estén agrietadas.
    3. Deje que la solución de aceite de acetato de retinilo alcance la temperatura ambiente. Vierta una pequeña cantidad (~ 5 ml) en un vaso de plástico pequeño sin usar.
    4. Prepare una pipeta de repetición cargando la jeringa de 5 ml (donde 1 = 100 μl) y ajustándola a "2" para dispensar 200 μl por pulsación de gatillo.
    5. Cargue el aceite de acetato de retinilo en la pipeta repetidora levantando el brazo de carga. Dispense al menos 4 alícuotas de 200 μL en la taza para eliminar las burbujas de aire de la punta.
    6. Dispense 1 alícuota de 200 μl por cada fondo de cápsula blanca tocando ligeramente la punta de la pipeta con la pared interior de la cápsula y presionando el gatillo.
    7. Una vez que la pipeta repetidora esté casi vacía, extraiga más aceite.
    8. Después de completar un juego completo de 96 cápsulas, dispense el aceite nuevamente en la taza y luego comience a deslizar ligeramente las tapas azules sobre cada fondo blanco, teniendo cuidado de no romper las tapas.
    9. Después de que todas las tapas estén en las cápsulas, levante cada cápsula, asegúrese ligeramente de que la tapa esté bien colocada y luego vuelva a colocarla en la caja de puntas.
    10. Almacene las cápsulas a las temperaturas y condiciones elegidas. La oscuridad se puede lograr almacenando las cápsulas en bastidores debajo de papel de aluminio. A continuación se muestran ejemplos:
      un.  en el congelador: -20 °C en la oscuridad
      b.  en el frigorífico: 4 °C en la oscuridad
      c. en el banco: 20 °C (temperatura ambiente) en la oscuridad
      d. en el banco pero dejado fuera: 20 °C (temperatura ambiente) expuesto a la iluminación fluorescente estándar
      e.  en un horno, replicando temperaturas ambiente más altas en otros lugares: 37 °C en la oscuridad

3. Administración de dosis

NOTA: La pipeta de desplazamiento positivo se ha comparado directamente con jeringas de tuberculina para determinar la exactitud y precisión entre los técnicos (Figura 5).

Las dosis se administran con pipetas de desplazamiento positivo Rainin de 250 μl o jeringas de tuberculina de 1 ml.

  1. Descongele las dosis congeladas o colóquelas en una hielera con bolsas de hielo si va al sitio de campo. Durante el transporte, las dosis generalmente se descongelan.
  2. Retire el frasco de vidrio ámbar de la hielera y ábralo. Mantenga el vial en una "taza" o vaso de precipitados para evitar que se vuelque.
  3. Inserte la punta de la pipeta o la jeringa de tuberculina en el aceite y extraiga una pequeña cantidad. Presione el émbolo rápidamente para desplazar las burbujas que se hayan formado. Extraiga lentamente la cantidad de volumen necesaria en la pipeta o jeringa. Asegúrate de que no haya burbujas.
  4. Limpie la parte exterior de la punta con un pañuelo de papel. No toque el extremo de la punta de la pipeta o la jeringa porque esto extraerá el líquido.
  5. Coloque la punta en la boca del participante, suelte el aceite en su boca e indique a la persona que cierre la boca y trague.
    NOTA: Es útil si los participantes pueden inclinar la cabeza ligeramente hacia atrás para la dosis.
  6. Después de la dosis, administrar un "chaser" o un refrigerio graso que proporcione al menos 10 g de grasa. Para niños pequeños, administre 1 ml de aceite no fortificado administrado en una cuchara de plástico como perseguidor. Para los niños mayores y los adultos, medio sándwich de mantequilla de maní, papa blanca frita o una baguette con chocolate para untar son buenos refrigerios de seguimiento.
    NOTA: Se debe realizar una investigación informativa para determinar qué refrigerio es aceptable localmente.

Resultados

A partir de la β-ionona disponible comercialmente, se sintetizaron 28 g de acetato de etil-β-ionilideno. Después de la reducción, se hicieron reaccionar 22 g de acetaldehído de β-ionilideno con acetona en condiciones básicas para producir cetona C18-tetraeno; Se obtuvieron 12 g de cetona C18-tetraeno purificada, que fue ~90% all-trans. Posteriormente, esto se reaccionó con el carbanión de 13C 2-trietilfosfonoacetato utilizando un procedimiento de Wittig-Horner modificado para agregar dos 13C en las posiciones 14, 15 de la molécula de retinol. El éster etílico resultante (rendimiento de 3,7 g) se redujo al alcohol y se esterificó a acetato de 2-retinol 13C con anhídrido acético disuelto en trietilamina. La vitamina sintética se purificó en alúmina desactivada en agua al 8% utilizando disolventes orgánicos altamente volátiles: hexanos y éter dietílico. La preparación resultante se caracterizó mediante espectroscopia UV-Vis, TLC y HPLC. Para el almacenamiento a largo plazo, el acetato de retinilo etiquetado se almacena disuelto en aceite de soja a -80 °C.

El esquema sintético exitoso para el acetato de 14,15-13 C2-retinol descrito anteriormente se muestra en la Figura 2. La vía total que comienza con β-ionona se compone de siete pasos. El primer rendimiento fue de 0,9 g de acetato de2-retinol 14,15-13 C all-trans. Las fracciones de isómeros cis/trans (1,2 g) se combinaron y repurificaron en 300 g de alúmina neutra desactivada en agua al 8% para dar como resultado 0,3 g adicionales de acetato de2-retinol 14,15-13 C all-trans.

Para determinar la estabilidad del acetato de retinilo en cápsulas, el acetato de retinilo (1 g) se disolvió en hexanos y se purificó mediante cromatografía de columna abierta utilizando 300 g de alúmina desactivada en agua al 8% con hexanos como disolvente. El acetato de retinilo se controló mediante TLC y espectroscopia UV-Vis, y solo se utilizaron las fracciones puras. Este proceso es idéntico al utilizado en la síntesis y purificación del acetato de 13C2-retinol en el laboratorio de Tanumihardjo para la prueba RID como se describió anteriormente. El acetato de retinilo purificado se disolvió en aceite de soja, el disolvente orgánico se eliminó mediante un evaporador rotatorio y se añadió más aceite hasta una concentración final de 7,5 μM (para producir 1,5 μmol por 200 μL, el punto medio entre la dosis para un adulto y un niño para la prueba RID cuando se utiliza GCCIRMS para el análisis). La concentración se determinó mediante espectroscopia UV-Vis como se describió anteriormente.

Se distribuyó una alícuota de 200 μL del aceite en cápsulas de celulosa tamaño 3 (volumen máximo 300 μL) para el estudio de estabilidad. Las cápsulas de cada dosis se almacenaron en cinco condiciones. La oscuridad se logró almacenando las cápsulas en bastidores debajo de papel de aluminio. Se prepararon cápsulas (150) para cada condición para un total de 750 cápsulas: i) en el congelador: -20 °C en la oscuridad; ii) en el frigorífico: 4 °C en la oscuridad; iii) en el banco: 20 °C (temperatura ambiente) en la oscuridad; iv) en el banco pero excluidos: 20 °C (temperatura ambiente) expuestos a la iluminación fluorescente estándar; v) en un horno, replicando temperaturas ambiente más altas en otros lugares: 37 °C en la oscuridad.

En el estudio de estabilidad de la cápsula, se midieron tres cápsulas de cada condición en cada punto de tiempo (-20 °C, 4 °C, temperatura ambiente oscura, temperatura ambiente clara, 37 °C). Se permitió que todas las cápsulas alcanzaran la temperatura ambiente (primero se analizaron las cápsulas a temperatura ambiente); La variación de temperatura provoca una variación de absorbancia. Las cápsulas se midieron hasta 480 días. Las cápsulas permanecieron estables durante nueve meses a -20 °C y 4 °C (Figura 4).

Se realizó una comparación de métodos para comparar jeringas de tuberculina de un solo uso con las pipetas de desplazamiento positivo de Rainin como estándar de referencia. La pipeta de desplazamiento positivo Rainin se calibró con agua, teniendo en cuenta la temperatura y la presión locales, y luego se probó con tres puntas por triplicado para determinar el volumen de aceite objetivo dispensado en la configuración de 200 μL en un bote de pesaje tarado. El protocolo de dispensación fue realizado por 10 técnicos de diferentes niveles de experiencia. Para cada técnico, se probaron ocho jeringas por triplicado y se compararon con la referencia de la pipeta. Los lados de la pipeta se limpiaron con un pañuelo de papel y el aceite se dispensó en el bote de pesaje en ángulo, asegurando que se liberara el máximo aceite. Los técnicos estaban cegados a los resultados de la misa dispensada durante todo el protocolo; La masa de aceite fue registrada por un técnico separado. El proceso se repitió con 200 μL de aceite de soja utilizando ocho jeringas de tuberculina (por ejemplo, Norm-Ject).

Se utilizó el software estadístico R para ajustar un modelo de componentes de varianza (FitVCA)22 (Figura 5). Los factores de variabilidad medidos incluyeron técnico, jeringa dentro del técnico y error de replicación. El valor medio (IC del 95%) normalizado de administración de jeringas en comparación con el volumen de administración de pipetas fue de 0,996 (0,912, 1,08). La varianza del error de replicación representó el 64,8% de la varianza total, lo que indica que la mayor fuente de variabilidad fue la repetición de mediciones dentro de la misma jeringa. La varianza porcentual del técnico y la jeringa dentro del técnico fue mucho menor, contribuyendo con un 22,9% y un 12,3%, respectivamente.

El análisis de subgrupos se realizó dividiendo a los técnicos en dos grupos (n = 5/grupo) según la experiencia. La administración media normalizada de jeringas fue similar entre ambos grupos, pero el IC del 95% fue más estrecho para los técnicos con más experiencia; 1,001 (0,939, 1,063) y 0,998 (0,900, 1,100), respectivamente. Dentro de los técnicos más experimentados, la mayor varianza provino de la jeringa dentro del técnico (57,0%) y el error de replicación (42,9%), mientras que para los técnicos menos experimentados, la mayor parte de la varianza provino del técnico (32,7%) y el error de replicación (67,2%).

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Figura 1: La estructura del retinol con los carbonos numerados. Las 13C generalmente se agregan en las posiciones 14 y 15 para su uso con cromatografía de gases-espectrometría de masas de combustión. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 2: El esquema sintético de acetato de 14,15-13 C 2-retinilo utilizado en las pruebas de dilución de isótopos de retinol cuando se utiliza la cromatografía de gases-combustión-espectrometría de masas de relación isotópica para el análisis de suero o leche materna. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 3: Una jeringa de tuberculina de 1 ml sin volumen muerto en la punta y la pipeta de desplazamiento positivo de 250 μl utilizada para la dosificación en estudios de trazadores. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 4: Curvas de degradación del acetato de retinilo almacenado en cápsulas en cinco condiciones diferentes. Las condiciones son -20 °C, 4 °C, 20 °C (temperatura ambiente) en la oscuridad, 20 °C (temperatura ambiente) bajo luz fluorescente estándar y 37 °C. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 5: Análisis del componente de varianza de la cantidad de administración de dosis comparando jeringas de tuberculina de 1 ml con una pipeta de desplazamiento positivo de 250 μl entre 10 técnicos cegados a los resultados durante la evaluación. Los valores se dispensan masa de aceite (200 μL) de jeringas normalizadas a la pipeta de desplazamiento positivo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura complementaria S1: Un ejemplo de la comprobación de pureza final del acetato de retinol 14,15-13C mediante cromatografía líquida de ultrapresión. Los espectros correspondientes son característicos de las formas cis/trans de la vitamina. Las condiciones de UPLC fueron Solvente A 70:25:5 (acetonitrilo:agua:isopropanol) con acetato de amonio 10 mM y Solvente B fue 75% acetonitrilo, 25% isopropanol. La columna utilizada fue una columna Acquity UPLC, BEH C18 1,7 μM, 2,1 x 100 mm. La columna se fijó a 29 °C y el caudal fue de 0,4 mL/min. El gradiente comenzó con 100% de disolvente A y se mantuvo durante 5,0 min, seguido de una transición al 98% de disolvente B a los 7 min y se mantuvo durante 8 min antes de volver a pasar al 100% de disolvente A durante 1 min y se mantuvo durante 4 min de equilibrio. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Discusión

Si bien existen fuentes comerciales de acetato de retinol deuterado y marcado con 13C, existen múltiples vías sintéticas para el retinol en la literatura para químicos orgánicos calificados. Elegimos un camino sintético para que siguiera el acetato de retinilo deuterado e hicimos los ajustes apropiados para agregar 13C a la columna vertebral de la fracción de retinol, que se describen anteriormente. La síntesis de acetato de 14,15-13 C2-retinol se logró mediante un procedimiento de siete pasos que comenzó con β-ionona disponible comercialmente. β-ionona es un componente vegetal natural y contribuye a las fragancias, como las de las rosas. El paso más crucial en la vía sintética es la formación de la cetona tetraeno C18. Este compuesto intermedio debe tener al menos un 90% de pureza para que los pasos posteriores produzcan buenos rendimientos.

El etiquetado se realizó mediante un procedimiento de Wittig-Homer modificado con 13C 2-trietilfosfonoacetato disponible comercialmente. Los compuestos marcados se utilizan en la prueba RID para determinar TBS y estimar TLR. El método utiliza GCCIRMS para el análisis del retinol purificado a partir de suero o leche materna de personas a las que se les han administrado niveles fisiológicos de los compuestos marcados. Las dosis más comunes son 1 μmol para niños y 2 μmol para adultos. Si bien el análisis GCCIRMS es sensible para el enriquecimiento de isótopos, el análisis de suero requiere un mínimo de 400 μL de suero para obtener suficiente masa de retinol para su introducción en el GC.

La prueba 13C-RID se ha utilizado en estudios clínicos23,24 y en grupos de niños africanos25 con planes futuros para hacerla accesible para el trabajo basado en la población. Realizamos los experimentos con cápsulas y jeringas para investigar si estas modificaciones son adecuadas para el trabajo poblacional. Las cápsulas debían estar en posición vertical o goteaban; Rápidamente descartamos la idea de que pudieran almacenarse en frascos de píldoras ámbar regulares para uso en el campo. Las cápsulas solo se mantuvieron estables durante ~ 9 meses a temperaturas de refrigerador y congelador. La producción de cápsulas selladas puede mejorar la estabilidad al reducir la exposición menor a la atmósfera durante el almacenamiento. El uso de cápsulas debe ser probado y validado por grupos de usuarios antes de la implementación.

Las soluciones de aceite finales son estables a temperatura ambiente durante ~ 2 meses, pero una vez que comienzan a degradarse, la degradación continúa rápidamente. No hay actividad parcial aceptable para las pruebas de RID ya que la cantidad dosificada se utiliza en el cálculo de TBS. Es mejor mantener las soluciones en bolsas de hielo en el campo durante el uso y volver a congelarlas lo antes posible después de completar la dosificación. Lo mejor es llevar solo unas pocas dosis más de las necesarias para el día y mantener el resto congelado. La congelación y descongelación no afectan estas soluciones porque el aceite en sí contiene antioxidantes. Las soluciones de aceite son más robustas que las muestras de sangre, pero aún deben mantenerse en la oscuridad en todo momento y congelarse cuando no estén en uso.

Las dosis se administran con pipetas de desplazamiento positivo Rainin de 250 μl o jeringas de tuberculina de 1 ml. Las pipetas de desplazamiento de aire no son adecuadas para dosis disueltas en aceite. Nuestro laboratorio ha comparado experimentalmente estos dos métodos (ver Resultados representativos). La administración con la pipeta o jeringa es similar con algunas desviaciones. Las pipetas de desplazamiento positivo Rainin se recomiendan para la investigación o los estudios clínicos, pero las jeringas pueden utilizarse para trabajos basados en la población. Se recomiendan jeringas con poco volumen muerto en la punta para maximizar la precisión de la dosis (por ejemplo, Norm-Ject).

Los cálculos para la prueba RID incluyen la cantidad de dosis administrada, y el error en la cantidad de dosis administrada es proporcional al error en la estimación resultante de TBS. Para el uso de jeringas de tuberculina versus pipetas de desplazamiento positivo, la administración media normalizada de jeringas fue cercana a 1, lo que indica que las jeringas pueden proporcionar una administración de dosis precisa para estudios de población. Los límites de confianza del 95% fueron aproximadamente ± 8% de la administración de la dosis objetivo. Los técnicos con más experiencia previa con las jeringas tuvieron un IC del 95% más estrecho (± 6%) y una menor contribución de la varianza del técnico en comparación con los técnicos con menos experiencia (± 10%). Esto sugiere que se debe realizar un protocolo de capacitación y validación con aceite de vehículo antes de la implementación en el campo. Estos resultados merecen una mayor validación en cada laboratorio que desee utilizar jeringas de tuberculina de un solo uso como un método de administración rentable y que ahorra tiempo para administrar las dosis en las pruebas de dosis-respuesta y RID en estudios poblacionales.

Hemos optado por la pipeta de desplazamiento positivo para investigación y estudios clínicos utilizando la prueba RID para maximizar la precisión a nivel individual, ya que su exactitud y precisión informadas son del ≤1%. En comparación, la prueba de respuesta a la dosis relativa modificada es cualitativa y no se basan cálculos en la cantidad de dosis administrada1. Por lo tanto, hemos recomendado el uso de jeringas para la prueba en encuestas poblacionales y que la dosis se disuelva en aproximadamente 0,7 ml de vehículo.

La prueba RID es un método sensible para cuantificar TBS y estimar TLR, que es el estándar de referencia para evaluar el estado de vitamina A. Se ha utilizado en muchas aplicaciones de investigación utilizando el etiquetado de deuterio o 13C. Las aplicaciones actuales y futuras utilizarán la prueba RID en entornos clínicos y subgrupos de población en encuestas. La simplificación de la dosificación será importante para estas aplicaciones.

Divulgaciones

Los autores no tienen conflictos de intereses con el contenido de este manuscrito.

Agradecimientos

Este trabajo fue financiado por NIH-R01 DC019357 y el Proyecto de Investigación Coordinada E43035 del OIEA. Agradecemos a Nicholas Keuler del grupo de Consultoría Estadística de la Universidad de Wisconsin-Madison por su ayuda en el análisis de la comparación del método de jeringa de un solo uso.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Anhídrido acéticoSigma Aldrich242845
acetonaSigma Aldrich179124
óxido de aluminioSigma Aldrich199974
VasosCualquierCualquier empresa de suministro de vidrio 
beta-iononaSigma AldrichW259500
éterSigma Aldrich673811
Pipetas Pasteur de vidrioCualquierCualquier empresa de suministro de vidrio 
hexanosSigma178918
Trietilfosfonoacetato marcadoSigma Aldrich293202
Solución de hidruro de litio y aluminioAcros orgánicos199511000
óxido de manganesoSidma Aldrich310700
pipetas de desplazamiento positivoRainin17008579
acetato de retiniloSigma AldrichReferencia R4632
embudos separadoresCualquierCualquier empresa de suministro de vidrio 
gel de síliceSigma Aldrich1.07734
hidruro de sodioAldrich223441
hidróxido sódicoFisher ScientificS318-100
espectrofotómetroCualquier escaneoSe prefiere doble haz
trietilaminaSigma Aldrich471283
trietilfosfonoacetatoAldrichReferencia T61301
jeringa de tuberculinaNorm-Ject19G334
aceite vegetalsojaAbacería
matraces aforados (25 ml)CualquierCualquier empresa de suministro de vidrio 

Referencias

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