Artículo de método

Detección metabólica en tiempo real en células vivas mediante RMN hiperpolarizada de 13C

DOI:

10.3791/68539

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8 de julio de 2025

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1Institute for Quantum Life Science, National Institutes for Quantum Science and Technology, 2Institute of Pure and Applied Sciences, University of Tsukuba, 3Department of Applied Biological Chemistry, Graduate School of Agriculture, Osaka Metropolitan University, 4Center of Quantum Life Science for Structural Therapeutics (cQUEST), Chiba University

En este artículo

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este protocolo integra un sistema de biorreactor hecho a medida con espectroscopia de RMN de ¹³C hiperpolarizada para medir el metabolismo del piruvato en tiempo real en células vivas, lo que mejora la reproducibilidad y la precisión cinética para estudios metabólicos y aplicaciones de detección de fármacos.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El protocolo presenta un método para integrar un sistema de biorreactor construido internamente con espectroscopia de resonancia magnética nuclear (RMN) hiperpolarizada de 13C para medir el metabolismo del piruvato en células vivas en tiempo real. El protocolo describe la construcción de un sistema de biorreactor que permite una sincronización precisa de la inyección de sustrato hiperpolarizado y la adquisición de señales de RMN, al tiempo que mantiene un entorno de cultivo celular estable. El método detecta de forma fiable la conversión metabólica de piruvato en lactato dentro de una ventana de medición de 60 s, manteniendo una relación señal-ruido suficiente durante todo el proceso. La capacidad de mezcla in situ del sistema acelera la detección de señales de RMN y reduce las pérdidas de relajaciónT1. El protocolo también incluye instrucciones detalladas para la preparación de geles de alginato para encapsular células y colocarlas dentro del biorreactor. El método propuesto presenta una mayor reproducibilidad y precisión cinética en comparación con los métodos convencionales, lo que indica posibles aplicaciones en estudios del metabolismo del cáncer y detección de fármacos. Otros refinamientos del sistema, como la adopción de matrices de gel alternativas, pueden mejorar su versatilidad en diversos estudios biológicos.

Introducción

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La RMN hiperpolarizada, particularmente a través de la polarización nuclear dinámica (DNP), mejora significativamente la intensidad de la señal de RMN1 y permite el seguimiento en tiempo real de los cambios metabólicos con una sensibilidad muy mejorada 2,3. Esta técnica se ha aplicado con éxito en varios sistemas biológicos, incluyendo levaduras 4,5, modelos de células cancerosas 6,7,8 y microorganismos 9,10. También se ha utilizado para controlar vías metabólicas clave como la glucólisis11,12, la homeostasis redox13,14 y la regulación del pH15,16. Más allá de la investigación básica, la RMN hiperpolarizada se utiliza ahora en imágenes clínicas a través de la resonancia magnética, lo que permite la evaluación metabólica desde la escala celular hasta la de todo el cuerpo17. Estos desarrollos subrayan la creciente demanda de protocolos accesibles que faciliten el uso más amplio de la RMN hiperpolarizada en diversos contextos biológicos.

A pesar de su versatilidad, la implementación de mediciones metabólicas en tiempo real en células vivas mediante RMN hiperpolarizada sigue siendo un desafío técnico. Los sistemas convencionales a menudo se basan en configuraciones complejas y específicas del laboratorio que carecen de reproducibilidad y son difíciles de operar sin una amplia experiencia 8,18,19,20. Esto representa una barrera importante para los investigadores que pretenden adoptar esta tecnología para la investigación biológica o traslacional. En comparación con métodos alternativos como la imagen óptica o la espectrometría de masas, la RMN hiperpolarizada de 13C permite una monitorización no invasiva y resuelta en el tiempo de reacciones metabólicas específicas sin muestreo destructivo. Proporciona información bioquímica directa con precisión temporal, lo que lo hace muy adecuado para estudios dinámicos del metabolismo celular.

Para abordar estas limitaciones, este estudio presenta un protocolo práctico y reproducible diseñado específicamente para permitir a los investigadores realizar mediciones de RMN hiperpolarizada del metabolismo de células vivas con obstáculos técnicos mínimos. Se describe un método integral para la medición básica del metabolismo del piruvato en células vivas. Si bien este protocolo se puede aplicar a otras sondas marcadas con 13C, el piruvato es particularmente adecuado debido a su rápida absorción celular, vías metabólicas bien caracterizadas y su papel central en el metabolismo celular. El procedimiento consiste en: (i) preparación de muestras celulares, (ii) encapsulación en geles de alginato, (iii) hiperpolarización utilizando un polarizador DNP, y (iv) medición en tiempo real de RMN de 13C en un espectrómetro de 400 MHz (Figura 1). Además, se proporcionan parámetros clave para la construcción del sistema de biorreactor para garantizar la reproducibilidad y la compatibilidad con el hardware de RMN estándar. El protocolo está optimizado para facilitar la implementación utilizando componentes disponibles comercialmente y está destinado a ayudar a los investigadores, especialmente a aquellos nuevos en la técnica, a determinar su idoneidad para sus necesidades experimentales.

Protocolo

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1. Configuración del biorreactor (Figura 2A-B)

  1. Montaje del tubo de RMN
    1. Utilice un tubo de RMN con tapón de rosca (10 mm de diámetro, 178 mm de longitud) con tapón abierto para la inserción del tubo.
    2. Prepare un tabique de vial de silicona/PTFE (9 mm de diámetro) e inserte un tubo de PEEK a través de él para sellarlo herméticamente (Figura complementaria 1).
    3. Inserte el tabique con un tubo de PEEK resistente a los productos químicos (diámetro interior 1,0 mm, diámetro exterior 1,6 mm, espesor de pared 0,3 mm, longitud 1 m) en la abertura de la tapa modificada.
    4. Coloque el tabique entre el tubo de RMN y su tapa abierta y asegúrelo cerrando firmemente la tapa. Esta configuración mantiene el tabique en su lugar y proporciona un sello suficiente para evitar fugas durante la perfusión o la inyección.
  2. Configuración de la tubería de suministro de medio (Figura 2C)
    1. Conecte el tubo de PEEK a los puertos de entrada y salida del tubo de RMN para permitir la perfusión continua. Asegure las conexiones con un juego de accesorios sin brida para evitar fugas.
  3. Instalación de los componentes de calentamiento medio
    1. Conecte el tubo de PEEK a una bomba peristáltica ajustable a un caudal estable de aproximadamente 0,2 mL/min, asegurando una circulación continua del medio a través de un kit de circulación externo. Coloque el depósito de medio en un baño de agua ajustado a 37 °C para mantener la temperatura.
  4. Adición de un componente de prevención de fugas de gel
    1. Corta una esponja densa para que se ajuste al diámetro del tubo de RMN. Inserte la esponja en el fondo del tubo para evitar fugas de gel de alginato y permitir un flujo medio.
  5. Fabricación e inserción del componente de fijación de esponja impreso en 3D (Figura 2D-F)
    1. Imprime en 3D un soporte cilíndrico (diámetro exterior de 9,1 mm, longitud 20 mm, con un orificio central de 1,5 mm de diámetro) utilizando una resina fotopolimérica compatible con la impresión 3D estereolitográfica. Las especificaciones de diseño se proporcionan en el Archivo Complementario adjunto 1.
    2. Inserte un capilar de vidrio de borosilicato (diámetro exterior de 1,5 mm, diámetro interior de aproximadamente 0,9 mm, longitud de 90 mm) a través del orificio preformado del soporte impreso en 3D.
    3. Fije la esponja a la plataforma en el soporte con resina curable por UV con propiedad de resistencia al agua. Cura durante 30 s bajo luz ultravioleta para asegurar la solidificación.
    4. Inserte el soporte ensamblado con esponja en el tubo de RMN.

2. Preparación de la célula (inicio 2 semanas antes de la medición)

  1. Descongele rápidamente las existencias de células congeladas (SCCVII o HeLa) en un baño de agua a 37 °C. Transfiera aproximadamente 1 × 106 células a 10 mL de medio RPMI-1640 suplementado con 10% (v/v) de suero fetal bovino y 1% (v/v) de penicilina-estreptomicina.
  2. Cultivar células a 37 °C con 5% de CO2 y pasarlas cada 2-3 días una vez que se alcance la confluencia del 70%-80%. Continúe cultivando durante aproximadamente 2 semanas para obtener ~ 4 x 107 celdas, estimadas a partir de cinco placas de 10 cm cultivadas con aproximadamente un 90% de confluencia (cada una produce ~ 8 x 106 celdas).

3. Preparación del gel de alginato

  1. Preparación de la solución de alginato
    1. Disuelva el polvo de alginato de sodio de grado biológico de investigación en agua desionizada para preparar una solución al 2% (p/v). Incubar la solución durante la noche a 25 °C o más con una suave agitación de extremo a extremo. Utilice un rotador de tubos ajustado a aproximadamente 10-20 rpm para evitar burbujas y garantizar una disolución uniforme.
  2. Encapsulación de células en gel de alginato
    1. Añadir 2 mL de tripsina-EDTA al 0,25% (v/v) al plato de 10 cm. Incline el plato para cubrir toda la superficie y aspire el exceso de tripsina-EDTA.
    2. Incubar la placa a 37 °C durante 2 minutos.
    3. Agregue 10 ml de medio de cultivo al plato. Pipetear suavemente hacia arriba y hacia abajo para separar las células. Recoja toda la suspensión celular en un tubo cónico de 15 mL.
    4. Tome aproximadamente 10 μL de la suspensión y cuente el número de células con un contador de células. Por lo general, se requieren alrededor de 1 × 107 celdas para los procedimientos posteriores, pero el número real debe confirmarse mediante medición.
    5. Centrifugar la suspensión celular restante a 120 × g durante 5 min. Retire el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet celular en 4 mL de solución de alginato al 2% (p/v). Pipetear lentamente para minimizar la generación de burbujas.
  3. Formación de gel por reticulación de calcio (Figura 3)
    1. Agregue 10 mL de solución de CaCl2 de 50 mM a un tubo de centrífuga de 50 mL (Figura 3A).
    2. Tome 300 μL de la mezcla de celda y alginato en una jeringa de 0,5 mL provista de una aguja de 30 G y 10 mm, y asegúrela a la tapa del tubo de centrífuga (Figura 3B).
    3. Cierre bien el tapón del tubo de centrífuga con la jeringa fijada a él y centrifugue todo el conjunto suavemente a 200 × g durante 5 min. Retire la solución sobrenadante después de la centrifugación y vuelva a suspender el gel cargado con células en el medio (Figura 3C-D).
  4. Carga del gel en el tubo de RMN
    1. Transfiera el gel encapsulado en células al tubo de RMN con una pipeta Pasteur. Inserte el accesorio de esponja y asegúrese de que quede hermético.
    2. Precalentar el depósito de medio (que contiene 5% (v/v) D2O) preparado en el paso 1.3.2 en un baño de agua a 37 °C y hacerlo circular a una velocidad de aproximadamente 500 μL/h para estabilizar las condiciones.
    3. Asegúrese de que no haya fugas antes de insertar el tubo de RMN en el imán. Mientras mantiene el tubo de PEEK recto, inserte el tubo de RMN en el imán. Ajuste el tamaño del gel, el número de perlas y la velocidad de pipeteo de acuerdo con el tipo de célula y los requisitos experimentales.

4. Preparación de la sonda hiperpolarizada utilizando un polarizador DNP (Figura 4)

  1. Preparación del vial de muestra
    1. Añadir 18 μL de ácido pirúvico [1-13C] (14,2 M) dopado con 25 mM OX063 a un vial de muestra. Conecte el vial a la ruta de fluido del sistema polarizador DNP.
  2. Polarización de la muestra
    1. Inserte el vial en la unidad de orificio del polarizador DNP (6,7 T, 1,25 K, 1,2 mbar). Aplique irradiación de microondas a aproximadamente 188 GHz (22 mW) durante 60-80 min.
  3. Señal de monitoreo durante la polarización
    1. Utilice el espectrómetro de RMN de estado sólido integrado en el sistema DNP para monitorear la intensidad de la señal de 13C. Registre los datos de la señal cada 5 minutos utilizando el software de RMN (SPINit).
  4. Disolver y preparar la solución hiperpolarizada
    1. Disuelva rápidamente la muestra polarizada en 3,2 mL de tampón de disolución precalentado (40 mM de Tris, 50 mM de NaCl, 80 mM de NaOH, 100 mg/L de EDTA). Asegúrese de que la solución alcance la temperatura biológica (308-313 K, pH ~7) antes de transferirla para la medición de RMN.
      NOTA: Tenga cuidado al manipular componentes de alta presión. Precaliente el tampón de disolución a ~461 K para garantizar una transferencia eficiente y la integridad de la muestra.

5. Configuración de RMN

  1. Preparación del espectrómetro de RMN
    1. Cargue la muestra en el tubo de RMN e insértela en el espectrómetro.
    2. Realice el bloqueo, la sintonización, la adaptación y la calzada en la consola de RMN mediante el procedimiento automatizado con la muestra insertada, para optimizar la resolución espectral y la estabilidad de la señal.
  2. Configuración de los parámetros de adquisición
    1. Cargue una secuencia de adquisición de pulsos de 13C (p. ej., zg2d) con el desacoplamiento de protones habilitado (p. ej., 13-CPD).
    2. Ajuste el ángulo de giro a 90° utilizando un pulso de 1 μs (P1). Establezca el tiempo de adquisición en 1,376 s, el ancho espectral en 23.663 Hz y el número de puntos de adquisición (TD) en 65.536. Ajuste el retardo de relajación (D1) a 0 s.
    3. Establezca el número de incrementos de tiempo (TD1) en 150 para adquirir 150 espectros secuenciales en modo pseudo-2D. Ajuste la ganancia del receptor a un valor bajo (por ejemplo, ~1) para evitar la saturación de la señal de muestras hiperpolarizadas.
      NOTA: Debido a la alta intensidad de la señal de la RMN hiperpolarizada, ajuste la ganancia del receptor a un valor bajo (por ejemplo, ~1), que normalmente corresponde a menos del 1% de la ganancia máxima disponible. La ganancia del receptor es un parámetro interno sin unidades que controla la amplificación de la señal. Los valores excesivamente altos pueden provocar una saturación de la señal.

6. Medición de RMN

  1. Preparación para la medición
    1. Llene toda la ruta de la tubería de entrada desde la tubería de entrada hasta el tubo de RMN con tampón de disolución para evitar que el aire quede atrapado (Figura 2B). El tubo de entrada se utiliza tanto para la inyección de sonda de perfusión media como para la hiperpolarizada.
    2. Compruebe cuidadosamente que no haya burbujas de aire en el tubo de entrada o en el interior del tubo de RMN, ya que las burbujas en esta región pueden interferir con la adquisición de la señal durante las mediciones de RMN.
  2. Preparación para la inyección de solución hiperpolarizada
    1. Detenga la bomba peristáltica para detener temporalmente la circulación del medio antes de inyectar la solución hiperpolarizada a través del tubo de entrada.
    2. Inicie la adquisición espectral aproximadamente 10 s antes de disolver el sustrato hiperpolarizado para garantizar que la señal se capture inmediatamente después de su llegada al sitio de detección de RMN después de la inyección.
    3. Extraiga 1 ml de la solución con una jeringa cuando salga del polarizador DNP.
  3. Inyección de la solución hiperpolarizada y confirmación de la señal
    1. Cambie la válvula de tres vías en la entrada del biorreactor a la posición B para inyectar la solución hiperpolarizada en el tubo de RMN.
    2. Vuelva a colocar la válvula en la posición A después de la inyección para reanudar la circulación del medio y evitar el reflujo.
    3. Confirme el éxito de la inyección y la llegada del sustrato observando un aumento en la señal de decaimiento por inducción libre (FID) en el software de adquisición.

7. Procesamiento y análisis de datos

  1. Procesamiento de datos espectrales
    1. Cargue el espectro de RMN resuelto en el tiempo en el software de procesamiento de datos. Si los datos se almacenan en formato de archivo ser, localice y cargue el archivo adecuado.
  2. Análisis de los espectros
    1. Realice la transformación de Fourier (FT) para convertir el FID sin procesar en el dominio de la frecuencia. Aplique la corrección de fase de forma manual o automática. Realice la corrección de la línea de base para eliminar las distorsiones.
  3. Visualización de la conversión de metabolitos
    1. Traza las señales de curso temporal para el piruvato C1 (~171 ppm) y el lactato C1 (~183 ppm).
  4. Cuantificación de la conversión metabólica
    1. Calcule el área bajo la curva (AUC) para los picos de piruvato y lactato.
    2. Determine la relación [Lactato]/[Piruvato] dividiendo el AUC del lactato por el del piruvato.
      NOTA: Se utiliza AUC en lugar de la altura del pico para minimizar la influencia de los artefactos de timbre causados por la gran señal de piruvato hiperpolarizada [1-¹³C]. Los valores de AUC se obtienen mediante la simple suma de las intensidades de la señal dentro del rango de integración definido para cada pico.

Resultados

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En este estudio, se acopló un sistema fabricado a una espectroscopia de RMN hiperpolarizada de 13C para medir el metabolismo del piruvato en células vivas en tiempo real. Las principales señales detectadas en el espectro de RMN 1D 13C correspondieron al piruvato (aproximadamente 171 ppm) y al lactato (aproximadamente 183 ppm)21, lo que nos permite evaluar la conversión metabólica del piruvato a lactato en condiciones fisiológicas (Figura 4).

Calidad espectral y dinámica de la señal
En la Figura 5 se muestran los resultados representativos de mediciones repetidas en la misma muestra utilizando células SCCVII, una línea de carcinoma de células escamosas de ratón que se usa con frecuencia en estudios de resonancia magnética hiperpolarizada. La primera medición mostró un claro aumento en la señal de lactato, lo que indica una conversión metabólica activa. Sin embargo, las mediciones posteriores tomadas a intervalos de 1,5 h mostraron una disminución progresiva de la actividad metabólica. Esta reducción dependiente del tiempo probablemente refleja el estrés biológico o la adaptación inducida por la inyección inicial de piruvato. En particular, se ha descrito una modulación metabólica transitoria similar in vivo utilizando resonancia magnética hiperpolarizada y EPRI, donde la oxigenación tumoral disminuyó temporalmente después de la administración de piruvato22. Estos resultados demuestran que la repetibilidad de estas mediciones permite un seguimiento no destructivo de los cambios metabólicos dinámicos, una ventaja que es difícil de lograr con métodos destructivos23.

Para evaluar la aplicabilidad de este protocolo a otros tipos de células, se realizaron mediciones adicionales utilizando células HeLa, una línea celular de cáncer humano ampliamente utilizada. Como se muestra en la Figura 6, las células HeLa también mostraron una clara conversión de piruvato a lactato. Aunque la intensidad de la señal disminuyó gradualmente debido a la relajación de T1, la relación señal-ruido siguió siendo suficiente durante todo el período de adquisición de los 60 s. Estos hallazgos sugieren que el protocolo actual es ampliamente aplicable y puede servir como una herramienta versátil para el perfil metabólico en tiempo real en varios tipos de células.

Si bien el decaimiento rápido de la señal es una limitación inherente de la RMN basada en DNP, nuestro sistema de mezcla in situ minimiza el retraso entre la disolución y la medición, mejorando así la sensibilidad de detección. Otros refinamientos, como la optimización de la composición de la matriz de gel, pueden ampliar la aplicabilidad de este método a una gama más amplia de sistemas biológicos.

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Figura 1: Diagrama esquemático del flujo de trabajo general desde el cultivo celular hasta la medición de RMN hiperpolarizada. El proceso comienza con el cultivo celular (~ 2 semanas), seguido de la preparación del gel de alginato (~ 60 min) para encapsular las células para una medición estable. A continuación, la hiperpolarización se realiza utilizando un sistema polarizador DNP (~60 min), y la medición de RMN se realiza utilizando un espectrómetro de RMN de 400 MHz (~5 min). Las fotografías de la derecha muestran los instrumentos correspondientes utilizados en este flujo de trabajo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 2: Configuración del biorreactor para la medición de RMN hiperpolarizada. (A) Diagrama esquemático de la configuración del biorreactor. El medio de cultivo se introduce en el tubo de RMN a través de la entrada A y posteriormente se dirige a los residuos. Las perlas de alginato que contienen células vivas se colocan dentro del tubo de RMN. Durante las mediciones de RMN hiperpolarizada, la sonda hiperpolarizada se inyecta a través de la entrada B, etiquetada como entrada de la sonda hiperpolarizada. (B) Fotografía de toda la configuración del biorreactor, con los tubos de entrada y salida claramente etiquetados. (C) Vista de cerca del interruptor de tubería de entrada, que muestra la entrada A (perfusión media) y la entrada B (inyección de sonda hiperpolarizada). (D) Diseño CAD y (E) fotografía representativa del componente de fijación de esponja impreso en 3D colocado dentro del tubo de RMN. El componente incluye un orificio para guiar un capilar de vidrio que suministra la solución de sustrato hiperpolarizado y una plataforma para sostener una esponja. El componente en sí no encaja firmemente contra la pared interna del tubo de RMN; (F) en su lugar, se inserta una esponja a su alrededor para llenar el espacio. Esta estructura estabiliza el componente y permite que el medio residual fluya hacia arriba a través de la esponja, eliminando la necesidad de un orificio de salida adicional. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 3: Preparación del gel de alginato. (A) Ilustración esquemática y (B) fotografía del aparato de formación de bolas de gel de alginato. La imagen de la izquierda muestra toda la configuración, incluido el tubo de centrífuga con una jeringa fijada a su tapa modificada. La imagen superior derecha muestra una tapa con un pequeño orificio para la punta de la jeringa, mientras que la imagen inferior derecha muestra una tapa con una abertura cuadrada para un posicionamiento estable de la jeringa. El tubo de centrífuga está prellenado con 10 ml de solución de cloruro de calcio, lo que permite que la solución de alginato que sale de la punta de la jeringa se gelifique, formando bolas de gel de alginato. (C) Imagen microscópica representativa que muestra la morfología de las bolas de gel de alginato. (D) Imagen microscópica representativa que muestre la morfología de las bolas de gel de alginato que contienen células HeLa. Barra de escala = 200 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 4: Representación esquemática de los pasos de preparación para la medición de RMN e hiperpolarización. Durante el proceso de acumulación de DNP de ~ 60 minutos, la configuración de RMN se realiza en paralelo para minimizar los retrasos. La preparación implica la carga de perlas de alginato en el tubo de RMN, seguida de un ajuste de bloqueo de 1H, calzamiento y ajuste de la sonda para garantizar que el sistema esté listo para la medición inmediata. Después de la disolución y la mezcla in situ , la espectroscopia de RMN de 13C resuelta en el tiempo revela picos claros de piruvato y lactato. Los picos observados aproximadamente a 171 ppm, 179 ppm y 183 ppm corresponden a piruvato, hidrato de piruvato y lactato, respectivamente. Se utilizaron aproximadamente 4 × 107 células HeLa encapsuladas en gel de alginato para la medición de RMN. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 5: Detección resuelta en el tiempo de señales de piruvato y lactato en mediciones repetidas. Se adquirieron espectros de RMN hiperpolarizados de 13C de la misma muestra encapsulada en células SCCVII a intervalos de 1,5 h para evaluar la viabilidad de mediciones no destructivas repetidas. Las intensidades máximas de piruvato (círculos abiertos) y lactato (círculos llenos, escalados por 1000×) se trazan a lo largo del tiempo para cada adquisición. (A) Primera medición. (B) La segunda medición, después de 1,5 h, revela una marcada reducción en la producción de lactato. (C) La tercera medición, después de otras 1,5 h, confirmó una baja actividad metabólica sostenida. El análisis cuantitativo basado en el área bajo la curva (AUC) mostró que la relación [Lactato]/[Piruvato] disminuyó de 0,00134 (primera medición) a 0,00019 (segunda) y 0,00027 (tercera). La concentración final de células en el gel de alginato fue de aproximadamente 1,0 × 107 células/mL (4 × 107 células en 4 mL). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 6: Conversión de piruvato en lactato en células HeLa. Se midieron las señales de RMN hiperpolarizadas de 13C resueltas en el tiempo de piruvato y lactato en células HeLa vivas. La intensidad de la señal de piruvato se normaliza a su valor máximo en el tiempo cero. La intensidad de la señal de lactato se escala por un factor de 103 para la visibilidad. El análisis cuantitativo basado en el área bajo la curva (AUC) mostró una relación [Lactato]/[Piruvato] de 0,00121. La concentración final de células en el gel de alginato fue de aproximadamente 7,5 × 106 células/mL (3 × 107 células en 4 mL). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. 

Figura complementaria 1. Imágenes representativas del tabique vial utilizado en el sistema de biorreactor. (A) Tabique de silicona/PTFE (9 mm de diámetro) antes de su uso. (B) El mismo tabique en uso real, con tubos de PEEK insertados a través de orificios perforados. La elasticidad del material del tabique le permite volver a sellarse alrededor de la tubería, manteniendo las condiciones de hermeticidad durante la inyección de sustrato hiperpolarizado. Haga clic aquí para descargar esta figura

Figura suplementaria 2: Espectro de RMN de 13C hiperpolarizado resuelto en el tiempo adquirido después de la mezcla externa. Espectro representativo resuelto en el tiempo del metabolismo del piruvato [1-13C] medido utilizando un sistema de RMN de sobremesa después de la mezcla externa de piruvato hiperpolarizado y células fuera del tubo de RMN. Haga clic aquí para descargar esta figura

Archivo complementario 1: Diseño CAD del soporte cilíndrico. Haga clic aquí para descargar este archivo

Discusión

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Pasos críticos del protocolo
El éxito de este protocolo depende de varios pasos críticos. En primer lugar, es importante garantizar la disolución y transferencia adecuadas del piruvato 13C hiperpolarizado para mantener una alta relación señal-ruido. Para capturar la conversión metabólica temprana de piruvato en lactato, se debe sincronizar el momento de la inyección de la sonda hiperpolarizada y la adquisición de RMN. Además, es importante mantener la viabilidad celular durante todo el experimento. Las desviaciones de estos parámetros pueden dar lugar a una reducción de la actividad metabólica y a la pérdida de señal.

Modificaciones y solución de problemas del método
Si bien este protocolo proporciona un enfoque sólido para el monitoreo metabólico en tiempo real, ciertas modificaciones pueden mejorar su aplicabilidad. Por ejemplo, ajustar el ángulo de giro de la adquisición de RMN puede equilibrar la intensidad de la señal y la disminución de la polarización para optimizar la recopilación de datos. Además, aunque se introdujo un método para preparar de manera estable geles de alginato de cierto tamaño, el tamaño de los geles que se van a crear se puede ajustar fácilmente seleccionando una jeringa o una aguja. Esto puede contribuir a reproducir un ambiente hipóxico24 , además de evitar que las células escapen del tubo de RMN. Además, el gel de alginato se vuelve denso y viscoso dentro del tubo de RMN, especialmente en el área de medición de RMN. Si entra aire al inyectar el medio de cultivo o la sonda hiperpolarizada desde el tubo de PEEK, es probable que permanezca en el sitio de medición de RMN, lo que conducirá a una disminución en la calidad del espectro.

Limitaciones del método
Aunque las mediciones hiperpolarizadas tienen la ventaja de la alta sensibilidad de las señales de RMN, tienen limitaciones inherentes. Debido a la relajación T1 del piruvato 13C hiperpolarizado, la duración de las mediciones metabólicas se limita a aproximadamente 1 minuto, lo que limita la observación de cambios metabólicos a largo plazo. Además, es difícil medir una muestra de células varias horas después de haber sido medida una vez, lo que puede estar relacionado con el goteo de una gran cantidad de piruvato en una medición. Esto es lo mismo que el hecho de que los grupos relacionados han medido espectros un día después18, y el intervalo de medición debe ser así de largo.

Importancia del método en comparación con las técnicas existentes
En comparación con los ensayos metabólicos convencionales, nuestro método tiene una ventaja sobre las mediciones de punto final, como la espectrometría de masas y los ensayos bioquímicos, ya que proporciona información en tiempo real sobre el metabolismo celular. Aunque se pueden obtener espectros de RMN hiperpolarizados similares sin utilizar un biorreactor, la capacidad de iniciar las mediciones inmediatamente con la mezcla in situ es beneficiosa, dada la rapidez de la relajación. Además, las células se pueden preestablecer en un entorno estable antes de la inyección, lo que mejora la reproducibilidad y la precisión cinética del análisis metabólico. Esta ventaja está respaldada por un experimento complementario (Figura suplementaria 2), en el que se adquirieron espectros resueltos en el tiempo utilizando un sistema de RMN de sobremesa después de una mezcla externa. En esta configuración, un retraso de aproximadamente 30 s entre la mezcla y la adquisición de la señal condujo a una pérdida de polarización significativa, lo que afectó particularmente a la detección de lactato. Esto confirma que la mezcla in situ mejora la fidelidad de las mediciones cinéticas en condiciones de decaimiento rápido de T1 . Sin embargo, vale la pena señalar que la intensidad de la señal en esta configuración in situ fue menor, probablemente debido a la dilución causada por la perfusión del medio, un problema que aún no se ha optimizado.

Importancia y posibles aplicaciones
Este método puede allanar el camino para aplicaciones en la comprensión de las propiedades metabólicas de diversas formas de vida. La medición en tiempo real de los flujos metabólicos permite a los investigadores evaluar dinámicamente los efectos de los inhibidores metabólicos. La integración de este enfoque con otras técnicas de medición puede mejorar aún más la precisión del análisis del metabolismo intracelular.

Imaginamos un flujo de trabajo experimental práctico en el que se utiliza la metabolómica destructiva de alto rendimiento para identificar las vías candidatas, seguida de una validación en tiempo real utilizando RMN hiperpolarizada de 13C para evaluar la función de las enzimas y la dinámica del flujo en células vivas. Este enfoque permite la detección directa de respuestas metabólicas transitorias en condiciones fisiológicas, algo difícil de lograr utilizando inmunoensayos o sensores de fluorescencia, que generalmente miden los niveles de metabolitos estáticos o requieren sondas exógenas. Si bien las imágenes de fluorescencia y los inmunoensayos son indispensables para la localización espacial y el cribado de alto rendimiento, respectivamente, la RMN hiperpolarizada proporciona una lectura funcional complementaria que captura la cinética de la reacción de manera no destructiva. Esta estrategia no solo facilita los conocimientos mecanicistas a nivel celular, sino que también sirve como puente hacia aplicaciones diagnósticas a escala de tejido u organismo. En particular, la capacidad de capturar cambios metabólicos funcionales en tiempo real puede respaldar la detección temprana de trastornos metabólicos y respuestas terapéuticas en sistemas biológicos complejos.

También se ha avanzado en el desarrollo de sondas metabólicas dirigidas a diversas rutas metabólicas y sustratos sintéticos diseñados para enzimas específicas, ampliando las posibilidades para la investigación metabólica25,26. Además, los avances en las técnicas de hiperpolarización, como la entrega de sustratos hiperpolarizados directamente desde el polarizador a la RMN a través de un túnel magnético27- pueden mejorar la retención de la señal y ampliar las aplicaciones potenciales de este método en la investigación biomédica.

Divulgaciones

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Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.

Agradecimientos

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Este trabajo fue apoyado por JSPS KAKENHI Grant Number 23KJ2179 y 24K17833 (a T.U.), 23K27561 (a Y.T.); MEXT Q-LEAP [JPMXS0120330644 (a Y.T.)]; y MEXT Promoción del Desarrollo de un Proyecto de Sistema Conjunto de Uso/Investigación: Programa de Coalición de Universidades para la Excelencia en Investigación (CURE) Subvención Número JPMXP1323015488 (Programa Spin-L No. spin24XQ007).

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Ácido pirúvico [1-13C]Cambridge Isot ope Laboratories, Inc.CLM-8077
Impresora 3DElegooSaturno 2
Cloruro de calcioNacalai Tesque, Inc.06729-55
D2OSigma-Aldrich151882
Kit de circulación externa para bombaCOMO UNO1-4141-02
Suero fetal bovinoGibco10270106
Juego de accesorios sin bridasGL Sciences Inc.6010-46390
Capilar de vidrio con núcleoNarishigeGDC-1.5Diámetro interior ~0,9 mm, longitud 90 mm
Bomba de circulación magnéticaCOMO UNO1-4141-01
MestReNovaInvestigación MestrelabSoftware de procesamiento y análisis espectral de RMN
Mi jeringa de inyecciónCorporación Nipro82770,5 ml/100U, 30 G x 10 mm, 140 piezas
OX063  Oxford Instruments Co. Ltd. y Polarize IVS Co. Ltd.-
Tubo PEEKCOMO UNO3-780-05
penicilina-estreptomicinaNacalai Tesque, Inc.26252-94
Mini bomba peristáltica BioATTO1221200Tipo de caudal amplio y de alta precisión para un flujo medio estable
ResinaTecnología SirayaNegro ahumado
RPMI-1640 MedioNacalai Tesque, Inc.30264-85
Tabique vial de silicona/PTFEGL Sciences Inc.1030-50009
Alginato de sodio 80-120FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation194-13321
Software SPINitRS2DSoftware de RMN en el polarizador DNP
Esponja--Esponja disponible comercialmente cortada a medida para la estabilización del gel
Llave de paso de tres víasCOMO UNO3-6247-04
TopspinBrukerSoftware de adquisición y procesamiento de datos de RMN
Tripsina-EDTA (0,25%)Thermo Fisher Scientific07086-74
Resina curable UVBONDICBD-SKCJ
Baño de aguaCOMO UNO1-5832-41Robot térmico serie TR TR-1 y alfa; para mantener 37 ° Temperatura C
Wilmad Tubo de RMN con tapón de roscaSigmaZ271977Frecuencia 400 MHz, diámetro 10 mm, L 178 mm.

Referencias

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