Flujo de trabajo optimizado para el aislamiento y el cultivo a largo plazo de células de glioma derivadas de pacientes que conservan las características tumorales originales

Resumen

En este estudio se presenta un protocolo estandarizado para el establecimiento de líneas celulares de glioma derivado de pacientes (PDGCs), asegurando su fidelidad genética y fenotípica. El sistema de cultivo adherente asistido por extracto de matriz de membrana basal mejora el crecimiento y la homogeneidad celular, lo que hace que estos modelos sean valiosos para el cribado de fármacos y la investigación de GBM.

Resumen

El glioblastoma (GBM) es el tumor cerebral primario más agresivo, caracterizado por una alta heterogeneidad y resistencia a las terapias estándar. Las líneas celulares de glioma tradicionales a menudo no conservan las características genéticas y fenotípicas específicas del paciente, lo que limita su relevancia traslacional. Para abordar esto, establecimos 50 líneas celulares de glioma derivadas de pacientes (PDGC) utilizando un sistema de cultivo de células madre neurales sin suero. Este protocolo describe la recolección, el procesamiento y el cultivo a largo plazo de muestras tumorales obtenidas de pacientes con GBM, lo que garantiza la preservación de las características moleculares clave. Nuestra metodología incluye la disociación de tejido enzimático, la lisis de glóbulos rojos y el cultivo de adherentes asistido por extracto de matriz de membrana basal, lo que mejora la viabilidad celular y facilita el cribado de fármacos de alto rendimiento. La caracterización de las PDGC mediante secuenciación transcriptómica y del genoma completo y tinción de inmunofluorescencia confirma su retención de alteraciones genéticas comunes de GBM y marcadores de células madre neurales y progenitores. Además, estas células exhiben potencial tumorigénico en modelos de xenoinjertos. Al optimizar las condiciones de cultivo, este protocolo proporciona un marco estandarizado para generar modelos de GBM biológicamente relevantes para respaldar el descubrimiento terapéutico y los estudios mecanicistas.

Introducción

El glioma, el tumor intracraneal primario más común, se origina a partir de células madre neurales o progenitoras que han sufrido mutaciones genéticas¹. La Organización Mundial de la Salud clasifica los gliomas en grados 1-4 según las características patológicas y moleculares, que van desde el grado bajo hasta el grado² alto. El glioblastoma (GBM), un glioma de grado 4, representa aproximadamente el 57% de todos los gliomas y el 48% de todos los tumores malignos primarios del sistema nervioso central³. Los pacientes con GBM se enfrentan a un mal pronóstico, con una mediana de supervivencia de menos de 2 años y una tasa de supervivencia a 5 años de solo el 5,4%⁴. El tratamiento estándar consiste en una resección de máxima seguridad seguida de radioterapia y quimioterapia con temozolomida⁵. A pesar de estas intervenciones, el GBM sigue siendo incurable debido a su naturaleza infiltrativa y a su resistencia inherente a las terapias, lo que crea una necesidad urgente de nuevos enfoques de tratamiento.

Los investigadores suelen utilizar líneas celulares tumorales de origen humano como modelos para estudiar el desarrollo del cáncer y los mecanismos terapéuticos. Sin embargo, las líneas celulares de glioma clásicas mantenidas en un medio que contiene suero y expulsadas extensamente in vitro exhiben alteraciones significativas en las características fenotípicas y los perfiles genéticos en comparación con los tumores de los pacientes ^6,7,8. En consecuencia, los modelos de cribado preclínico basados en estas líneas celulares a menudo no logran identificar dianas terapéuticas y moléculas que se traduzcan eficazmente en los entornos clínicos. El éxito del tratamiento con GBM se complica aún más por la heterogeneidad y plasticidad tumoral⁹. Esta heterogeneidad se manifiesta no solo en los subtipos transcriptómicos (por ejemplo, proneurales, mesenquimales), sino también en los diversos estados de desarrollo de las células constituyentes¹⁰. El GBM emplea mecanismos del neurodesarrollo y contiene subpoblaciones de células madre de glioblastoma (GSC) que impulsan la proliferación tumoral y exhiben una mayor resistencia a la radioterapia y la quimioterapia^11,12. El cultivo de células de glioma derivadas de pacientes en un medio de células madre neurales sin suero preserva eficazmente el espectro de mutaciones y los patrones de expresión génica del tumor original, al tiempo que mantiene las características parciales de GSC⁸.

En comparación con los modelos de cultivo de neurosfera, el cultivo adherente asistido por extracto de matriz de membrana basal promueve un crecimiento celular más estable y rápido, lo que lo hace más adecuado para el cribado químico y genético¹³. Con este enfoque, establecimos 50 líneas celulares de GBM derivadas de pacientes y las caracterizamos a través de la secuenciación del genoma completo, la secuenciación transcriptómica y el cribado de la biblioteca de medicamentos de la FDA para explorar posibles estrategias terapéuticas. Este recurso avanza en la investigación del glioma, con resultados detallados publicados en nuestros estudios anteriores¹⁴. En este artículo, describimos la metodología utilizada para desarrollar líneas celulares de glioma derivadas de pacientes (PDGC).

Protocolo

Este protocolo utiliza muestras de sangre y tejido de glioma derivadas del paciente obtenidas a través de colaboraciones hospitalarias. Todos los procedimientos de muestreo y protocolos experimentales han recibido la aprobación del Comité de Ética del Hospital Tiantan de Pekín, Universidad Médica de la Capital (KY 2020-093-02 y KY 2014-021-02). Los pacientes dan su consentimiento informado firmado antes de la cirugía, y toda la información de identidad se anonimiza antes de que las muestras se transfieran al laboratorio. Los investigadores deben obtener la aprobación de su comité de ética institucional y obtener el consentimiento del paciente antes de implementar este protocolo.

1. Preparación antes del procesamiento de la muestra

1. Esterilice las tijeras, pinzas y otros instrumentos mediante autoclave.
2. Prepare el medio de cultivo PDGC combinando 47,5 mL de DMEM/F12, 500 μL de N2, 1 mL de B27, 500 μL de 100x Penicilina/Estreptomicina, 250 μL de sustituto de glutamina 100x, 100 μL de 2,5 M HEPES, 100 μL de 30% de glucosa, 50 μL de 50 mM de β-mercaptoetanol, 1,5 mL de 1 μg/mL de factor de crecimiento epidérmico (EGF), y 1,5 mL de factor de crecimiento básico de fibroblastos (bFGF) de 1 μg/mL.
3. Prepare 1x tampón de lisis de glóbulos rojos (ACK) disolviendo 8,29 g de cloruro de amonio, 1 g de bicarbonato de potasio y 37 mg de EDTA en agua, y luego diluyendo a 1 L.
4. Coloque los instrumentos esterilizados, el tampón PBS, los contenedores de residuos, los tubos de centrífuga y otros suministros en un gabinete de bioseguridad y realice la desinfección UV durante 30 minutos.
5. Coloque el nitrógeno líquido en un recipiente aislado.

2. Recogida de muestras de pacientes

NOTA: Realice todos los procedimientos de recolección de tejidos bajo estrictas condiciones estériles para evitar la contaminación bacteriana de los cultivos celulares posteriores. Mantener la técnica aséptica a lo largo de todo el flujo de trabajo.

1. Recolectar muestras de sangre antes de la operación y extirpar tejido tumoral del cerebro del paciente. En el caso de los tumores grandes y altamente infiltrantes en los que es difícil distinguir el tumor del tejido normal circundante, se debe maximizar la resección del tejido peritumoral mientras se preservan las áreas funcionales críticas del cerebro. Separe aproximadamente 500-2,000^mm3 de tejido del núcleo tumoral y colóquelo en tubos de centrífuga de 15 mL que contengan 10 mL de medio de preservación hipotérmica.
2. Selle los tubos de muestra, colóquelos en una caja de hielo y transpórtelos rápidamente al laboratorio para su procesamiento.
   NOTA: Asegúrese de que el intervalo entre la recogida de la muestra y el procesamiento no supere las 6 h a 4 °C. Durante la recolección de la muestra, excluya cuidadosamente el tejido quemado y las áreas de necrosis tumoral. La superficie de las incisiones de tejido a menudo se quema con el bisturí eléctrico utilizado durante la cirugía, lo que puede comprometer la viabilidad celular en cultivo.

3. Procesamiento de muestras de sangre

1. Centrifugar los tubos de muestra de sangre a 1.000 × g durante 10 minutos y desechar la capa superior de plasma.
2. Transfiera el resto de la capa de glóbulos blancos y glóbulos rojos a un tubo centrífugo de 50 ml. Agregue 10 ml de 1x ACK e incube a temperatura ambiente durante 5 minutos para lisar los glóbulos rojos.
3. Añadir 40 mL de PBS para finalizar la lisis, mezclar suavemente y centrifugar a 1.000 × g durante 10 min.
4. Deseche el sobrenadante, agregue 3 mL de 1x ACK e incube a temperatura ambiente durante 5 minutos para un segundo paso de lisis de glóbulos rojos.
5. Agregue 12 mL de PBS para terminar la lisis, mezcle suavemente y centrifugue a 1,000 × g durante 10 min.
6. Deseche el sobrenadante, vuelva a suspender el gránulo de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) en 1 mL de PBS, transfiéralo a un tubo de centrífuga de 1,5 mL y centrifugue a 510 × g durante 10 min.
7. Deseche el sobrenadante, congele el pellet de PBMC en nitrógeno líquido y almacene a -80 °C.

4. Procesamiento de tejido tumoral

1. Retire la solución de preservación de tejido del tubo de muestra y lave el tejido con PBS para eliminar los coágulos de sangre visibles y el tejido necrótico. Realice un segundo lavado con PBS en el tejido restante.
2. Cortar la porción de tejido más intacta y fijar durante la noche en paraformaldehído (PFA) al 4% a 4 °C.
   NOTA: El tamaño del tejido fijado es de aproximadamente 10 mm. Omita este paso si la muestra es pequeña.
3. Corte de 2 a 4 piezas pequeñas de tejido, transfiéralas a un tubo de centrífuga de 1,5 ml, congélelas en nitrógeno líquido y guárdelas a -80 °C.
   NOTA: El tamaño de las pequeñas piezas de tejido suele oscilar entre 5 y 10 mm, dependiendo de la cantidad de ADN y ARN necesarios para la secuenciación.
4. Coloque el tejido tumoral restante en un tubo de centrífuga de 1,5 ml y pique hasta obtener una pasta fina con unas tijeras mientras mantiene el hielo.
5. Agregue 1-3 mL de solución de desprendimiento de células y transfiera el tejido picado al tubo de digestión. Digiera el tejido con un disociador de tejidos a 37 °C durante 16 min.
6. Agregue 3 veces el volumen de PBS para detener la digestión y transfiera la suspensión celular a un tubo de centrífuga con un filtro celular de 70 μm. Muele suavemente el tejido a través del colador con una varilla pequeña para maximizar la recolección de células. Centrifugar a 510 × g durante 10 min y retirar el sobrenadante.
7. Agregue 1-3 mL de 1x ACK e incube a temperatura ambiente durante 5 minutos para lisar los glóbulos rojos. Agregue 4 veces el volumen de PBS para detener la lisis, mezcle suavemente y centrifugue a 510 × g durante 10 minutos para eliminar el sobrenadante.
8. Resuspender las células en medio PDGC y sembrar parte de la suspensión celular en placas de cultivo. Coloque las placas en una incubadora hipóxica a 37 °C. Congele las células restantes en un medio de cultivo que contenga un 10% de DMSO.
   NOTA: Por lo general, para muestras de tejido que miden aproximadamente 10-20 mm, sembramos alrededor de 1/3 a 1/10 de la suspensión celular en un plato de 6 cm con 3 mL de medio de cultivo, y las células restantes se criopreservan en 2-4 viales, dependiendo del rendimiento celular.
9. Cubra las placas añadiendo extracto de matriz de membrana basal al PBS helado en una proporción de 1:100 e incube las placas a temperatura ambiente en una incubadora agitadora durante 2 h. Deseche el PBS antes de agregar el medio de cultivo PDGC.
   NOTA: Realice todo el paso y cultivo celular posterior utilizando placas recubiertas de extracto de matriz de membrana basal.
10. Después de 2 días, transfiera las células cultivadas a placas recubiertas de extracto de matriz de membrana basal para permitir la adhesión y el crecimiento celular.

5. Cultivo y paso celular

1. Una vez que las células se adhieran a las placas de cultivo, retire las células no adherentes y reemplace o complemente el medio de cultivo cada 2-3 días.
   NOTA: La capacidad de adhesión varía entre las diferentes celdas. Incluso en presencia de extracto de matriz de membrana basal, una pequeña fracción de células puede permanecer no adherente, como BNI7-11, que requiere un cultivo continuo en suspensión. Además, algunas células exhiben un patrón de crecimiento semiadherente, como BNI20. Por lo tanto, es esencial una observación cuidadosa del estado de la célula. En el caso de las células no adherentes, se puede observar un aumento de las células en suspensión. Si los agregados celulares aparecen como estructuras oscuras, parecidas al algodón, y no muestran cambios significativos con el tiempo, generalmente son incapaces de expandirse a largo plazo.
2. Cuando las células alcancen la confluencia, agregue una solución de disociación celular para separar las células. Termine la disociación con 3x PBS y centrifugue a 250 × g durante 3 min. Pase las celdas en una proporción de 1:2 a 1:4. Congele las células restantes en un medio de cultivo que contenga un 10% de DMSO.
3. Continúe pasando durante al menos 10-20 generaciones para establecer una línea celular estable.
   1. Documente la morfología de las células con imágenes durante cada paso y registre los números de paso. Etiquete claramente la congelación inicial de la célula con información detallada (p. ej., números de paso).
   2. Una vez que la línea celular se estabilice, recoja 2-3 tubos de gránulos de celdas (300.000-1.000.000 de células/tubo) y guárdelos a -80 °C.

6. Operaciones experimentales posteriores

1. Para muestras fijadas con PFA, después de la fijación durante la noche, deshidratar las muestras a través de una serie graduada de soluciones de etanol por inmersión secuencial en etanol al 60%, etanol al 70%, etanol al 80%, etanol al 90%, etanol al 95% y dos cambios de etanol al 100%, cada uno durante 40 min. Posteriormente, limpie las muestras en dos cambios de xileno, cada uno durante 40 minutos, y luego infílverse con dos cambios de solución de parafina, cada uno durante 40 minutos. Finalmente, incrustar las muestras deshidratadas e infiltradas en bloques de parafina para su posterior seccionamiento y tinción¹⁵.
2. En el caso de los gránulos de PBMC, el tejido tumoral o las muestras de células tumorales almacenadas a -80 °C, extraiga el ADN y el ARN para diversos estudios ómicos, incluida la secuenciación del genoma completo, la secuenciación del exoma, la secuenciación masiva de ARN y la secuenciación de ARN de una sola célula, según sea necesario.
3. Utilice líneas celulares PDGC estables para el establecimiento de modelos de xenoinjertos de ratón, la detección de fármacos de alto rendimiento, la investigación de mecanismos y otros experimentos relacionados.
   1. Para establecer el modelo de xenoinjerto ortotópico intracraneal de PDGC, disocie y cuente las células, luego resuspenda en una mezcla 1:1 de extracto de matriz de membrana basal y PBS frío como hielo hasta una concentración final de 100.000 células/μL. Inyecte 5 μL de la suspensión celular estereotácticamente en el cuerpo estriado izquierdo de ratones inmunodeficientes de 6-8 semanas de edad utilizando una microjeringa y un instrumento estereotáxico estándar. Ajuste las coordenadas de inyección en relación con el bregma de la siguiente manera: +0,5 mm anteroposterior (AP), -1,9 mm medial-lateral (ML) y -3,6 mm dorsal-ventral (DV).
   2. Generar PDGC que expresan luciferasa y establecer xenoinjertos intracraneales para la obtención de imágenes de bioluminiscencia del crecimiento tumoral.
      1. Empaquetar el gen reportero de luciferasa-tdTomato en partículas lentivirales, luego infectar las PDGC con el lentivirus empaquetado para establecer una expresión estable¹⁶.
      2. Después de la infección, clasifique las células tdTomato-positivas mediante citometría de flujo para obtener una población celular estable que exprese luciferasa.
      3. Antes de la toma de imágenes, inyecte D-luciferina por vía intraperitoneal a una dosis de 10 μL/g de peso corporal utilizando una solución de D-luciferina de 15 mg/mL. Anestesiar a los ratones con isoflurano y esperar 10 minutos después de la inyección de D-luciferina. Coloque los ratones en el sistema de imágenes de bioluminiscencia. Ajuste el tiempo de exposición en modo automático durante la toma de imágenes¹⁷.

Resultados

La Figura 1 proporciona una descripción general completa del flujo de trabajo del protocolo. Las muestras de los pacientes incluyen sangre periférica y tejido central tumoral. Las muestras de sangre se someten a una centrifugación para eliminar el plasma, seguida de dos rondas de lisis ACK para obtener PBMC que sirven como controles para los análisis de secuenciación. Las muestras tumorales se lavan con PBS para eliminar los coágulos de sangre y las áreas necróticas antes de procesarlas en f...

Discusión

La heterogeneidad de GBM presenta importantes desafíos de tratamiento. Las líneas celulares convencionales de GBM a menudo desarrollan antecedentes genéticos homogéneos y pierden las características tumorales del paciente después de un cultivo prolongado en un medio que contiene suero, lo que limita su valor de traducción. La optimización de las condiciones del cultivo de GBM y la estandarización de los flujos de trabajo de procesamiento de muestras de pacientes son esenciales para maxim...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
70 μ colador de células m	Falcon	352350
Solución de desprendimiento de células de accutasa	BioLegend	423201
Cloruro de amonio	Aladdin	60-92-4
Anticuerpo anti-Sox2	Merckmillipore	AB5603
Medio de montaje antidecoloración con DAPI	Beyotime	P0131
Anticuerpo anti-nestina	NOVUS	NB100-1604
B27 sin suplemento vitamínico	Gibco	12587010
BD FACSAria Fusion Flow Cytometer	BD Biosciences	/
Plato de cultivo celular	NEST	705001
D-Luciferina, Sal de Potasio	Invitrogen	L2916
DMEM/F12	Gibco	C11330500BT
DMSO	Sinopharm	30072418
EDTA	BBI Life Sciences	A600107-0500
Glucosa	Sangon Biotech	A50991-0500
GlutaMAX	Gibco	35050-061	sustituto de glutamina
Kit de tinción de hematoxilina-eosina	Solarbio	G1120
HEPES	Beyotime	ST090
bFGF humano	Origene	TP750002
EGF humano	Novoproteína	C029-500μ g
HypoThermosol FRS	Biolife Solutions		101104 medio de conservación hipotérmico
Isoflurano	RWD Life Science	R510-22-10
IVIS Lumina XR III	PerkinElmer	/	bioluminiscencia
Matrigel	Corning	356231	extracto de matriz de membrana basal
Microjeringa Suplemento	Hamilton	80300
N2 Gibco		17502048
Placa de 6 pocillos Nunclon Sphera	Thermo Scientific	174932	placas de fijación ultrabaja
Paraformaldehído	Sangon Biotech	A500684-0500
Tampón PBS	Solarbio	P1010-100 * 2L
Penicilina / Estreptomicina	Solarbio	P8420 / S8290
Bicarbonato de potasio	Sangon Biotech	A501195-0500
Disociador de tejidos RWD RWD	Life Science	DSC-410
Instrumento estereotáxico estándar	RWD Life Science	68801
Tubo de procesamiento de muestras de tejido	RWD Life Science	SCT-100
β-mercaptoetanol	Sigma	M3148-100mL