Artículo de método

Caracterización por imágenes en vivo de los movimientos del centrómero durante la profase meiótica masculina en Arabidopsis thaliana

DOI:

10.3791/68569

⸱

24 de octubre de 2025

 ,  ,  , 
1Université Paris-Saclay, INRAE, AgroParisTech, Institute Jean-Pierre Bourgin for Plant Sciences (IJPB), 78000, Versailles, France

En este artículo

Resumen

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El movimiento cromosómico durante la profase meiótica es un fenómeno poco conocido que es fundamental para la formación de esporas. Este protocolo describe un método para adquirir, analizar y cuantificar los movimientos del centrómero durante la profase meiótica en los meiocitos masculinos de Arabidopsis thaliana .

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La meiosis es una división celular, esencial para la reproducción sexual. Durante la profase meiótica, los cromosomas homólogos de origen materno y paterno se reconocen y se asocian, proceso que se ve facilitado por sus rápidos movimientos en el nucleoplasma. Los movimientos de profase meiótica se basan en la unión de los cromosomas a la envoltura nuclear y en las fuerzas citoplasmáticas transmitidas a los cromosomas a través de la envoltura nuclear. En las plantas, la accesibilidad limitada y la fragilidad de los meiocitos masculinos dentro de las anteras hacen que los enfoques de imágenes en vivo y el análisis del movimiento cromosómico sean técnicamente desafiantes. De hecho, estos movimientos son muy rápidos y analizarlos requiere encontrar las condiciones óptimas de adquisición. Aquí, se describe un método eficiente para capturar movimientos cromosómicos rápidos durante la profase meiótica masculina en Arabidopsis thaliana, en películas de lapso de tiempo, siguiendo los movimientos de centrómeros marcados con fluorescencia. Se basa en la disección de anteras y la adquisición de imágenes mediante microscopía de barrido láser confocal (CLSM), en 3D y a lo largo del tiempo. La adquisición de pilas z meióticas cada 7 s permite una resolución suficiente para reconstruir y analizar las trayectorias de los centrómeros etiquetados. Los datos extraídos se procesan posteriormente, lo que permite el análisis cuantitativo de estos movimientos cromosómicos. El desarrollo de modelos a partir de estos datos es esencial para comprender el mecanismo del movimiento cromosómico rápido, incluida la naturaleza y la intensidad de las fuerzas que impulsan este proceso.

Introducción

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La meiosis es un proceso biológico fundamental que asegura la transmisión fiel del material genético de una generación a la siguiente. El proceso de meiosis se divide en dos rondas sucesivas de división celular, meiosis I y meiosis II. La meiosis I está precedida por una larga profase durante la cual los cromosomas homólogos se reconocen entre sí y se emparejan. Durante esta profase prolongada, se producen numerosos procesos biológicos. Además del emparejamiento de cromosomas homólogos, estos cromosomas también experimentan un proceso llamado sinapsis. La sinapsis implica la formación de un complejo proteico conocido como complejo sinaptonémico, que conecta los cromosomas homólogos a lo largo de su longitud. El complejo sinaptonémico promueve la recombinación homóloga, seguida del intercambio de material genético entre cromosomas homólogos y la formación de cruces. Estos establecen una conexión física entre cromosomas homólogos, facilitando su correcta alineación y segregación equilibrada 1,2.

Durante el reconocimiento cromosómico homólogo, se sabe que los movimientos cromosómicos de profase rápida (RPM) juegan un papel crucial. Los estudios realizados en varias especies modelo han demostrado que durante el leptoteno, los cromosomas se unen a la envoltura nuclear (NE). Están conectados al citoesqueleto citoplasmático a través del NE, a través del complejo proteico 3 LINC (Linker of Nucleoskeleton and Cytoskeleton). Las fuerzas generadas en el citoplasma se transmiten a los cromosomas a través del complejo LINC, lo que permite el movimiento de los cromosomas.

El estudio de las RPM es esencial para comprender los mecanismos fundamentales de la meiosis, en particular los implicados en el reconocimiento de cromosomas homólogos. Sin embargo, el estudio de estos movimientos requiere experimentos específicos de imágenes en vivo. La mayoría de los estudios de imágenes en vivo en A. thaliana se centran en tejidos somáticos y órganos vegetativos. Estos estudios se han realizado para determinar cómo las células dan lugar a los órganos4. Dichos estudios se han realizado en los meristemos5y raíces6. Recientemente, algunos equipos han desarrollado técnicas para observar el desarrollo floral, incluida la meiosis, en tiempo real en A. thaliana durante períodos de varios días 7,8. Sin embargo, estos protocolos también pueden ser exigentes y difíciles de configurar para un gran número de muestras.

Este artículo presenta un protocolo detallado para la obtención de imágenes de células vivas y el análisis de la dinámica cromosómica durante la meiosis en A. thaliana. Mediante el uso de microscopía confocal, una técnica simple para la preparación de muestras, junto con el etiquetado fluorescente de los cromosomas, se capturó el movimiento cromosómico con alta resolución espacial y temporal en períodos cortos de tiempo. El protocolo describe la preparación del tejido vegetal para la obtención de imágenes, la optimización de los parámetros de imagen para minimizar la fototoxicidad y maximizar la calidad de la imagen, así como el procesamiento de imágenes y el análisis de datos. Este método permite una cuantificación precisa de la dinámica del centrómero durante la meiosis, lo cual es crucial para comprender el comportamiento cromosómico que subyace a la formación exitosa de gametos. Este conocimiento tiene implicaciones directas para la agricultura, particularmente en la mejora de los programas de mejoramiento de cultivos al facilitar el estudio de los procesos de emparejamiento y recombinación cromosómica que afectan la fertilidad y la diversidad genética.

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Protocolo

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Este protocolo utiliza plantas transgénicas de A. thaliana que expresan los transgenes GFP-CENH3 y NUP54-RFP 9,10. El marcador CENH3 permite rastrear el movimiento de los centrómeros. El marcador NUP54 marca los poros nucleares y, por lo tanto, ayuda a distinguir el núcleo. Se pueden usar otros marcadores, pero estos deben ser resistentes al fotoblanqueo ya que la muestra se ilumina continuamente. Para asegurarse de que el marcador no sufra fotoblanqueo, realice el experimento en las mismas condiciones de láser y parámetros de adquisición, y verifique que la señal permanezca estable durante la adquisición de la imagen. Los reactivos y el equipo utilizado se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Crecimiento y cultivo de plantas

  1. Siembre las semillas directamente en macetas en el invernadero.
  2. Coloque las macetas en un invernadero en las siguientes condiciones: 16 h día/8 h noche, 20 °C, 70% de humedad.
  3. Deje que las plantas se desarrollen en el invernadero durante aproximadamente 4 semanas. Las plantas deben alcanzar una etapa en la que tengan 5/6 tallos florales (ver Figura 1A).

2. Disección de anteras y preparación de portaobjetos

  1. Prepare un portaobjetos de vidrio, coloque un espaciador (adhesivo de doble cara con una perforación de 9 mm de diámetro, 0,12 mm de profundidad) en su centro, teniendo cuidado de quitar las películas protectoras de cada lado. Este espaciador sostendrá la muestra y creará espacio entre el portaobjetos y el cubreobjetos.
  2. Deposite 8 μL de agua del grifo en el centro del espaciador.
  3. Con fórceps, elija una inflorescencia de uno de los tallos principales (ver Figura 1B) (no use inflorescencias pequeñas de los tallos emergentes).
  4. Coloque la inflorescencia en un portaobjetos nuevo bajo un microscopio estereoscópico equipado con una regla. Seleccione botones florales de aproximadamente 0,5 mm de longitud (Figura 1C).
  5. Con agujas afiladas, abra suavemente los brotes, separando los sépalos y pétalos para mantener solo las anteras. Tenga cuidado de no dañar las anteras ni dejarlas secar.
  6. Transfiera delicadamente los racimos de anteras al agua en la cavidad espaciadora. Para evitar la deshidratación, hazlo inmediatamente después de quitar los sépalos y pétalos.
  7. Deposite varios racimos de anteras dentro de la cavidad espaciadora.
  8. Cubra el portaobjetos con un cubreobjetos, evitando burbujas de aire. Para ello, añade 8 μL de agua a un cubreobjetos y dale la vuelta con cuidado con la gota de agua en la cavidad espaciadora. Asegúrese de que los racimos de anteras estén sumergidos en un total de 16 μL de agua y que el cubreobjetos esté bien pegado al espaciador (ver Figura 1D; Figura 2).

3. Observación de lapso de tiempo de microscopía confocal - Configuración de imágenes

NOTA: La forma de configurar los parámetros de imagen depende del sistema confocal utilizado. Para obtener más información sobre los parámetros de imagen, consulte la sección Discusión . Las imágenes se adquirieron utilizando CLSM y una lente de inmersión en agua de 20x. El uso de un objetivo de inmersión en agua proporciona una mejor coincidencia del índice de refracción, ya que la muestra biológica se monta en agua.

  1. Configure el microscopio excitando GFP a 488 nm y detectándolo con un detector híbrido entre 494 nm y 547 nm.
    NOTA: La ganancia de compensación del detector híbrido se estableció en 100. RFP se excita a 561 nm y se detecta con un detector híbrido entre 584 y 629 nm. La ganancia de compensación del detector híbrido se estableció en 130. La velocidad de escaneo es de 400 Hz y el escaneo es bidireccional. Se aplica un promedio de línea de 2. Los dos canales se adquirieron simultáneamente para minimizar el tiempo de adquisición. La potencia del láser se estableció en 15% para el láser de 488 nm y 30% para el láser de 561 nm.
  2. Localice la antera usando iluminación de campo claro.
  3. Usando el canal de campo claro, determine la etapa meiótica en función de la forma de las células.
    NOTA: Se requieren etapas de cigoteno o paquiteno para observar las RPM. La variación del enfoque a lo largo del eje Z permite estimar la forma 3D de la célula. En la etapa de leptoteno, los meiocitos exhiben una forma claramente cuadrada y el nucléolo se coloca en el centro del núcleo, lo que los hace fácilmente identificables. Durante las etapas de cigoteno y paquiteno, los meiocitos comienzan a adoptar una forma trapezoidal y el nucléolo migra hacia la envoltura nuclear. En la etapa de diploteno, los meiocitos muestran una morfología completamente redondeada10.
  4. Visualiza la antera en el software. La señal RFP también es un buen indicador de la etapa meiótica de las células.
    NOTA: Los meiocitos en la etapa de cigoteno / paquiteno exhiben el marcado NUP54 en forma de media luna, correspondiente a una agrupación de poros nucleares en un territorio restringido del NE en estas etapas (Figura 3A). Si es necesario, gire la antera para que quede ubicada horizontalmente (ver Figura 3).
  5. Define un tamaño de imagen de 400 px por 150 px, con un zoom digital de 4, centrando la antera en la imagen.
  6. Defina el grosor de la muestra a fotografiar para obtener la mayor cantidad posible de meiocitos intactos. Sin embargo, es importante limitar el número de cortes z para minimizar el tiempo de adquisición. Para un grosor de 15 μm, se hacen 16 cortes z. Las pilas Z se adquirieron con un tamaño de paso de 1,04 μm.
  7. Para realizar adquisiciones continuas, establezca el intervalo de tiempo en cero en la sección de tiempo . Con el microscopio y los parámetros descritos anteriormente, el tiempo de adquisición de 16 cortes es de aproximadamente 6 a 8 s. La duración mínima de adquisición es de 2 min, pero puede llegar hasta 20 min.
  8. Inicie la adquisición.

4. Análisis de imágenes – Seguimiento del movimiento del centrómero

NOTA: La reconstrucción de los movimientos del centrómero requiere un software de análisis de imágenes que pueda rastrear el movimiento 3D. El software asignará un objeto a una señal fluorescente, en función de los parámetros definidos, en cada momento de adquisición. A continuación, la herramienta de seguimiento analiza automáticamente los objetos en movimiento y crea un gráfico de linaje.

  1. Preprocesamiento de imágenes
    1. Para facilitar el análisis de los movimientos, realice un procesamiento de imágenes posterior a la adquisición. Por ejemplo, se puede utilizar un proceso de extracción de información adaptativo (algoritmo de deconvolución) para revelar estructuras y detalles finos y mejorar la calidad de la imagen.
  2. Seguimiento global del centrómero
    1. Seguimiento de todos los centrómeros de la imagen: Utilice un módulo de puntos para realizar un seguimiento automático de los puntos (a lo largo del tiempo).
    2. Elija el canal de origen, verde en este caso. Indique el diámetro XY, 1 μm, para el centrómero marcado con GFP-CENH3. La detección de objetos identifica todos los objetos de la imagen (Figura 3B).
    3. Modifique la calidad de la detección en función de la intensidad de la señal utilizando el gráfico en la parte inferior de la ventana de control.
    4. Utilice un algoritmo de seguimiento de movimiento autorregresivo para rastrear las trayectorias (Figura 3C). La visualización de todas las trayectorias facilita la identificación de los meiocitos de los tejidos somáticos (Video 1).
  3. Seguimiento de centrómeros en un solo meiocito
    NOTA: Utilizando un software de visualización 3D, verifique los núcleos y las trayectorias, y analice solo los núcleos que están intactos y no han sido recortados en ningún momento durante la adquisición. El análisis de un meiocito recortado da como resultado datos erróneos.
    1. Seguimiento automático del centrómero
      NOTA: Cuando se analiza un solo núcleo, el proceso se reinicia desde el principio.
      1. Utilice el módulo de puntos para realizar un seguimiento de los puntos (a lo largo del tiempo) en el núcleo seleccionado, definiendo una región de interés (ROI) correspondiente mediante la opción Segmentar solo una región de interés y realizar un seguimiento de los puntos (a lo largo del tiempo).
      2. Seleccione un ROI que incluya adecuadamente el núcleo en las tres dimensiones y a lo largo del tiempo. (Figura 4A).
      3. Utilice los mismos parámetros que para toda la antera para la detección del centrómero (Figura 4B) y el seguimiento (Figura 4C).
      4. En un gráfico de linaje (Figura 4F), se indican todas las trayectorias. Las trayectorias fuera del meiocito analizado se pueden eliminar (Figura 4C). Seleccione las pistas y elimínelas con la tecla Supr del teclado. Estos se pueden identificar fácilmente utilizando el visor 3D del software.
    2. Corrección manual del seguimiento del centrómero
      NOTA: En la mayoría de los casos, las trayectorias deben corregirse manualmente porque el software de seguimiento no puede diferenciar entre centrómeros que están demasiado cerca unos de otros.
      1. Utilice el modo Editar para eliminar o agregar un objeto. Asegúrese de que el objeto se agrega en el plano correcto.
      2. Conecte manualmente los nuevos objetos en el modo Editar pistas usando el gráfico de linaje, después de un análisis personal cuidadoso y exhaustivo de la celda en 3D. La Figura 4E, G muestra las trayectorias corregidas en la imagen del meiocito y en el gráfico lineal, respectivamente. El video 2 muestra las trayectorias de un meiocito después de la corrección.
      3. Exportación de datos
        1. Exporte los datos de seguimiento a un formato de programa de hoja de cálculo para facilitar el procesamiento y análisis de datos. Estos archivos contienen tablas de medición resultantes del seguimiento realizado con el software.
        2. Asegúrese de que el archivo de hoja de cálculo exportado contenga las siguientes variables: Tiempo, que registra el punto de tiempo de cada medición; ID de pista, que identifica de forma única cada pista; Desplazamiento Delta X, Y, Z, que representa el cambio de posición en tres dimensiones en cada punto de tiempo; y Posición X, Y, Z, que almacena la posición absoluta de cada objeto en el espacio.

5. Análisis de datos

NOTA: En esta parte se describe el flujo de trabajo de análisis de datos mediante scripts de R11 ejecutados en RStudio12. Se pueden recuperar del repositorio de datos INRAE en: 10.57745/V1NNFI. Todas las cifras se generan utilizando ggplot213 para visualizar las métricas calculadas. Los scripts realizan secuencialmente los siguientes pasos: El meiomove-sub-config. El script de R se ejecuta primero para inicializar el entorno de R, cargar las bibliotecas necesarias y definir variables globales. El enlace al script es: https://doi.org/10.57745/V1NNFI

  1. Lectura y selección de datos
    NOTA: El script a utilizar se almacena como: meiomove-sub-loader.R."
    1. Reúna todos los archivos individuales de Excel que contienen datos de seguimiento y combínelos en un único archivo consolidado.
    2. Guarde el archivo combinado en formato TSV (valores separados por tabulaciones) para garantizar la compatibilidad con otros pasos de procesamiento de datos.
    3. Calcule las posiciones x, y, z acumulando los valores de desplazamiento a lo largo del tiempo, asegurando que la trayectoria espacial de cada objeto rastreado se reconstruya con precisión. Esto se hizo para compensar un error en el software que exportaba posiciones XYZ incorrectas.
  2. Limpieza de datos
    NOTA: El script a utilizar se almacena como: meiomove-sub-clean.R."
    1. Elimine las pistas cortas, definidas como aquellas con una duración mínima de 50 s. Estas pistas no contienen suficientes puntos de datos para un análisis significativo, ya que pueden introducir ruido o imprecisiones.
    2. Identifique y elimine pistas donde la posición (X, Y, Z) permanece constante a lo largo del tiempo, ya que indican artefactos o estructuras estáticas que no son relevantes para el análisis.
    3. Filtre los valores de desplazamiento que faltan (entradas NA) para garantizar la integridad de los datos y evitar errores de cálculo en pasos posteriores.
    4. Detecte y elimine pistas donde los valores de desplazamiento obtenidos del software de análisis de imágenes difieren significativamente de los recalculados, lo que garantiza la consistencia y confiabilidad en los datos de seguimiento.
  3. Corrección de la deriva de células meióticas
    NOTA: El script a utilizar también se almacena como: meiomove-sub-clean.R."
    1. Tenga en cuenta la posible deriva durante la adquisición distinguiendo entre centrómeros meióticos y somáticos. Este paso asegura que los movimientos observados correspondan a procesos biológicos en lugar de artefactos experimentales.
    2. Aplique la corrección de deriva ajustando las posiciones de las células meióticas en relación con las células somáticas, que sirven como referencia estable.
  4. Generación de salida
    NOTA: El script que se va a utilizar se almacena como: meiomove-sub-metrics.R."
    1. Calcule la velocidad instantánea en cada paso de tiempo para realizar un seguimiento de las variaciones en la velocidad de movimiento a lo largo del tiempo.
    2. Calcule el ángulo de giro, que representa el cambio en la dirección del movimiento entre pasos de tiempo consecutivos, lo que proporciona información sobre los patrones de trayectoria. El resultado se almacena como: results/dataframes/metrics-by-step.tsv (Salida 1).
    3. Calcule la relación de alcance utilizando celltrackR14, que cuantifica qué tan lejos se mueve un objeto rastreado en relación con su posición inicial, lo que proporciona una indicación del comportamiento exploratorio. El resultado se almacena como: results/dataframes/metrics-celltrackr.tsv (Salida 2).
    4. Calcule la velocidad promedio de cada pista individual para resumir las características del movimiento durante todo el período de observación. Calcule el ángulo de giro promedio por pista para analizar la direccionalidad general del movimiento y los patrones de comportamiento. El resultado se almacena como: results/dataframes/metrics-by-id.tsv (Salida 3).
    5. Determine la posición del centroide en cada paso de tiempo para cada pista de celda. El centroide es el promedio de las posiciones de los centrómeros en un meiocito dado.
    6. Calcule el tamaño del centroide en cada paso de tiempo, lo que proporciona una medida de la dispersión espacial de los centrómeros alrededor de su posición promedio. Las variaciones del tamaño del centroide a lo largo del tiempo brindan información sobre la consistencia global en las pistas del centrómero. El resultado se almacena como: results/dataframes/metrics-by-cell.tsv (Salida 4).
    7. Calcule la correlación cruzada de velocidad para analizar las relaciones entre la dinámica de movimiento de diferentes objetos rastreados, revelando posibles comportamientos coordinados. El resultado se almacena como: results/dataframes/metrics-correlations.tsv (Salida 5).
    8. Calcule el desplazamiento cuadrático medio (MSD) para cada pista, una métrica clave que cuantifica la distancia cuadrada promedio recorrida por los centrómeros en intervalos de tiempo dados (retrasos de tiempo) para caracterizar el tipo de movimiento.
      NOTA: Al examinar cómo evoluciona el MSD con un retraso de tiempo creciente, se puede inferir si el movimiento es predominantemente difusivo o confinado, lo que proporciona información sobre el comportamiento dinámico subyacente. El resultado se almacena como: results/dataframes/metrics-msd.tsv (Salida 6).

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Resultados

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Se desarrolló un protocolo rápido para visualizar los movimientos cromosómicos durante la profase de la meiosis en Arabidopsis thaliana, lo que permite múltiples adquisiciones de lapso de tiempo y, por lo tanto, el análisis de un gran conjunto de datos. Los meioocitos que expresan un marcador GFP, que permite la visualización de centrómeros, y un marcador RFP, que permite la visualización del núcleo, se visualizan durante 4 minutos siguiendo el p...

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Discusión

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El protocolo actual permite obtener imágenes in vivo y analizar el movimiento del centrómero durante la profase meiótica en Arabidopsis thaliana. Este protocolo se puede implementar con un microscopio confocal vertical o invertido, lo que lo hace accesible a la mayoría de los laboratorios equipados con tecnología confocal. Aunque los sistemas confocales varían en velocidad de escaneo, sensibilidad, detectores y la capacidad de separar longitudes de onda, es posible ajus...

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Divulgaciones

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este trabajo se ha beneficiado del apoyo de las plataformas tecnológicas del Observatorio de Plantas del Institut Jean-Pierre Bourgin PO-Plants y PO-Cyto. Esta investigación fue financiada por la ANR (MeioMove ANR-21CE12-0042: M.G., P.A., L.C., S.L. y DYSCORD ANR-23-CE20-0036-02, M.G., L.C.). El Instituto Jean-Pierre Bourgin se beneficia del apoyo de Saclay Plant Sciences (ANR-17-EUR0007).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Zona de críaTREF (Jimfy)101820/02227861
Microscopio confocalLeicaTCS SP8 AOBS (Divisor de haz acusto-óptico)
Software ConfocalLeicaSoftware LAS X 3.5.0.18371
CubiertasPaul Marienfeld GmbH10705222x22 Nº1,5H
PinzasIdeal-Tek4.SA.0Pinzas de alta precisión
GFP:CENH3Ravi et al. 2010Semillas de Arabidopsis thaliana utilizadas aquí
ggplot2  ggplot2: Gráficos elegantes para análisis de datos   Reference13https://ggplot2.tidyverse.org
Mango para agujasHammacherAsa para lazo, longitud 170 mm
ImarisInstrumentos de OxfordImaris 9.7.2Análisis de imágenes - módulo "Spot"
LenteLeicaHC PL APO CS2 20 y 0,75 IMM
RelámpagoLeicaDeconvolución adaptativaExtracción automatizada de información inteligente a partir de datos confocales
LucesVEGELEDApollo LL252-Gen2
AgujasWatkins & DoncasterPines E3 .0124"(.31mm) x 25mm
NUP54:RFPCromer et al. 2024Semillas de Arabidopsis thaliana utilizadas aquí
OllasTEKU (POPPELMANN)VDF 7x7x6,5 cm
REquipo RCoreR: Un lenguaje y entorno para estadística    informática. Fundación R para la Computación Estadística, Viena, Austria. & nbsp; Reference11https://www.R-project.org/  
RstudioEquipo Posit  RStudio: Entorno de Desarrollo Integrado para R. Posit Software, PBC, Boston, MA. Reference12http://www.posit.co/
DiapositivasVASO DE CRISTAL10000326x76x1,0mm
EspaciadoresThermo-fisherSeparador de sellado seguro, 8 pozos, 9 mm de diámetro, 0,12 mm de profundidadcorta cada separador individualmente
EstereomicroscopiosNikonSMZ800

Referencias

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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