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Análisis del enriquecimiento de 13C de vitamina A en muestras biológicas mediante cromatografía de gases-espectrometría de masas de relación de combustión-isótopos

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DOI:

10.3791/68571

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14 de noviembre de 2025

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1Department of Nutritional Sciences, University of Wisconsin-Madison

En este artículo

Resumen

Este artículo describe el análisis de muestras de suero, leche materna e hígado para el enriquecimiento con 13C de retinol y ésteres de retinilo para aplicaciones de trazadores. La cromatografía líquida de alta resolución se utiliza para purificar y cuantificar las concentraciones de retinol, y la cromatografía de gases-combustión-espectrometría de masas de relación isotópica (GC-C-IRMS) se utiliza para analizar los extractos purificados.

Resumen

La vitamina A es fundamental para la salud, pero la evaluación del estado de la vitamina A es un desafío. La vitamina A que circula en la sangre está controlada homeostáticamente y, a menudo, no refleja la deficiencia o el exceso de vitamina A. El uso de 13vitamina C A permite rastrear y cuantificar las reservas totales de vitamina A del cuerpo e información adicional sobre farmacocinética y metabolismo. Este protocolo describe la extracción, purificación y determinación del enriquecimiento isotópico de 13C de vitamina A en muestras de suero, leche materna y tejido mediante cromatografía de gases, combustión, espectrometría de masas de relación isotópica (GC-C-IRMS). El análisis mediante GC-C-IRMS proporciona valores de enriquecimiento sensibles y precisos, particularmente para muestras con enriquecimientos de 13C cerca de los niveles de abundancia natural. Esto permite flexibilidad en los diseños de estudio para utilizar dosis de trazador más pequeñas y muestreo farmacocinético a más largo plazo. Brevemente, a 0,4 a 1 ml de suero, se agrega etanol a las proteínas precipitadas, se agrega C-23 β-apo-carotenol como estándar interno y se usa hexano para extraer retinoides. Posteriormente, el extracto se resuspende en metanol y se purifica mediante HPLC. Luego, la fracción de retinol se resuspende en hexano y se inyecta en el sistema GC-C-IRMS. El % atómico (At%) se calcula directamente en referencia al dióxido de carbono, que se calibra contra un patrón de sacarosa utilizando un analizador elemental. Otros tipos de tejidos que han sido analizados por GC-C-IRMS incluyen la leche materna y el hígado después de la saponificación. Las técnicas de extracción en fase sólida se pueden utilizar para ayudar en la purificación de estas u otras matrices complejas. Además, se puede conectar un analizador elemental al IRMS para analizar muestras de alimentos para un contenido total de 13C.

Introducción

La vitamina A (VA) es un micronutriente esencial necesario para la visión, la función inmunológica, la diferenciación celular y la regulación metabólica. Optimizar el estado de VA sigue siendo un desafío de salud global, ya que la deficiencia o el exceso pueden afectar los resultados de salud. La evaluación precisa del estado de VA es fundamental para los estudios clínicos o poblacionales que guían las intervenciones adecuadas. Sin embargo, la concentración sérica de retinol por sí sola es un biomarcador y una herramienta de diagnóstico deficientes porque está regulada homeostáticamente en una amplia gama de reservas corporales totales (TBS) y se ve afectada por la inflamación y otras deficiencias de nutrientes 1,2.

Los trazadores marcados isotópicamente han transformado drásticamente la investigación de VA al permitir la evaluación cuantitativa de TBS mediante la prueba de dilución de isótopos de retinol (RID) 3,4,5. Para RID, se administra un marcador VA enriquecido en 13C o 2H, se equilibra con las reservas corporales y la relación trazador/traza de retinol (TTR) sérica (o plasmática) se mide utilizando MS. Se aplica una ecuación de dilución de isótopos con supuestos específicos relacionados con el metabolismo de VA para calcular TBS 5,6.

Se pueden utilizar numerosas combinaciones de cromatografía y EM para determinar el TTR de retinol sérico (p. ej., GC-MS, LC-MS, LC-MS/MS). La precisión analítica es fundamental para las estimaciones precisas de RID porque los TBS son inversamente proporcionales a TTR. LC-MS/MS es adecuado para aplicaciones de alto rendimiento cuando se utilizan trazadores muy marcados y dosis de trazadores relativamente altas. Los métodos típicos de LC-MS/MS informan de desviaciones estándar relativas (RSD) del retinol del 3-6% para el intraensayo y del <8% para el interensayo7, pero hay datos limitados sobre la exactitud y precisión de los TTR. Por el contrario, la cromatografía de gases-combustión-espectrometría de masas de relación isotópica (GCCIRMS) ofrece una precisión excepcional para el enriquecimiento de 13C-retinol, con una abundancia típica de isótopos de 13C/12C RSD de ~0,02-0,05 8,9. Esto permite una determinación precisa de las concentraciones de trazadores en muestras donde los enriquecimientos son bajos. El uso de IRMS para aplicaciones RID permite una señal analítica adecuada utilizando menos masa de trazador y menos átomos marcados en el trazador, lo que ahorra costos asociados con las dosis de trazador.

Este manuscrito describe un análisis de 13C-retinol de sangre, leche materna y tejidos utilizando GC-C-IRMS. Dependiendo de la muestra biológica que se esté analizando, el análisis del retinol marcado con 13C utilizando GC-C-IRMS comienza con uno de varios métodos de extracción potenciales para aislar los compuestos no polares que incluyen el retinol marcado. Para las muestras de suero, esto implica una extracción líquido-líquido mediante la adición de etanol y hexano y la recolección de la fracción de hexano. Si se analiza la leche materna, las muestras se saponifican primero con hidróxido de potasio, seguido de una extracción líquido-líquido similar al suero. Estas muestras de leche materna también se purifican utilizando cartuchos de extracción en fase sólida para reducir la cantidad de otros lípidos restantes. Si se extrae de un tejido (por ejemplo, hígado), la muestra se muele con sulfato de sodio anhidro para eliminar el agua, se extrae con cloruro de metileno y se filtra en un matraz volumétrico o de fondo redondo para la evaporación rotatoria. Una alícuota se seca, se resuspende en etanol, se saponifica y se extrae utilizando el mismo método que la leche materna. Estas soluciones no polares de cada muestra se secan bajo nitrógeno y se reconstituyen en metanol para su purificación y cuantificación en cromatografía líquida de alta resolución (HPLC).

La sensibilidad de IRMS permite la determinación del enriquecimiento en muestras con bajo enriquecimiento de muestras, como muestras farmacocinéticas para aplicaciones de modelado matemático a largo plazo o muestras de tejido extrahepático para un rastreo preciso del metabolismo de VA. Se han propuesto pruebas de RID pareadas de dosis única para evaluar el estado de VA antes y después de la intervención para determinar la eficacia en sujetos teóricos10, lo que podría ser un enfoque prometedor si se valida en humanos. IRMS puede detectar trazadores de VA cerca de los valores de enriquecimiento natural, lo que permitiría largas ventanas de seguimiento y flexibilidad en los protocolos de muestreo.

Se ha demostrado que la leche materna es un enfoque de muestreo alternativo menos invasivo para la evaluación del estado de VA1. El retinol de la leche materna se puede utilizar como fuente de muestreo para la prueba de RID y ha mostrado una fuerte correlación con los valores de RID derivados del suero en mujeres en Zambia con bajas reservas de AV11. Para tejidos y muestras de leche materna, las técnicas de extracción en fase sólida pueden ayudar en la purificación de estas muestras en matrices complejas. IRMS también se ha utilizado para discriminar fuentes alimentarias de VA y determinar las contribuciones dietéticas relativas utilizando cambios en la abundancia natural de 13C de retinol sérico 9,12,13. También se puede usar un analizador elemental con IRMS para analizar muestras de alimentos para un contenido total de 13C y compararlo con el enriquecimiento de VA.

Cuando se utilizan etiquetas de 13C, es fundamental comprender el enriquecimiento de retinol de 13C de referencia, debido a que el 13C se produce de forma natural (~ 1,1% del carbono total), que puede variar con las fuentes de VA consumidas tanto por individuos como por poblaciones. Por lo tanto, para obtener la mejor precisión a nivel individual, se recomienda una muestra de sangre de referencia. Para las evaluaciones poblacionales, se puede generar una estimación poblacional utilizando un subgrupo seleccionado al azar o individuos separados del mismo grupo poblacional14.

Protocolo

1. Extracción de retinol de muestras biológicas

NOTA: Todos los procedimientos de manipulación y extracción de muestras se llevan a cabo bajo luz amarilla o filtrada por UV para minimizar la degradación.

  1. Extracción del suero
    1. Pipetee 1 ml de suero (o tanto como esté disponible) en un tubo de ensayo de vidrio de 13 x 100 mm (o tamaño similar). Registre el volumen de suero utilizado.
      NOTA: Se recomienda el uso de una pipeta de desplazamiento positivo.
    2. Agregue 1,5 veces el volumen de etanol de 200 grados.
    3. Agregue 25 μL del estándar interno, como C-23 β-apo-carotenol (sintetizado a partir de all-trans retinal, abs = 0.9)9. Tape la muestra y mezcle por vórtice durante 15 s.
    4. Agregue 1 ml de hexano, mezcle por vórtice durante 15 s y centrifugue durante 2 min (~ 1,300 × g) a temperatura ambiente.
    5. Con una pipeta Pasteur, pipetee con cuidado la capa superior de hexano en un nuevo tubo de ensayo de vidrio (12 x 75 mm o 13 x 100 mm).
    6. Repita los pasos 1.1.4 y 1.1.5 2x, agrupando los tres extractos de hexano en el segundo tubo. Coloque el extracto de hexano acumulado bajo un chorro suave de nitrógeno hasta que se seque.
    7. Agregue 100 μL de metanol a la muestra seca y tápela inmediatamente. Agite la solución hacia arriba y hacia abajo por los lados del tubo y luego mezcle la muestra por vórtice durante 15 s.
    8. Coloque las muestras en un congelador a -80 °C durante al menos 5 min.
      NOTA: Las muestras pueden permanecer almacenadas en este paso a -80 °C hasta el día siguiente.
  2. Extracción de muestras de leche materna
    1. Descongele las muestras de leche por completo e inviértalas suavemente varias veces para asegurarse de que las muestras sean uniformes. En un tubo de centrífuga de vidrio con tapa de rosca de 10 ml, mida una alícuota de leche de 0,5 a 1,5 ml (estándar de 1,0 ml) y registre el volumen utilizado.
    2. Agregue 1,5 veces el volumen de etanol de 200 grados (que contiene 0,1% de hidroxitolueno butilado (w: v)), mezcle con un vórtice durante 15 s.
    3. Agregue 25 μL del estándar interno, como C-23 β-apo-carotenol (sintetizado a partir de retinal trans, abs = 0,9)15. Tape la muestra y mezcle por vórtice.
    4. Añadir 0,8 veces el volumen de la muestra de leche de hidróxido de potasio 50:50 en agua (preparado como w:v, por ejemplo, 50 g de KOH disuelto en 50 ml de agua), mezclar por vórtice durante 15 s.
      NOTA: El agua debe estar compuesta en recipientes de plástico (por ejemplo, HDPE).
    5. Saponificar las muestras durante 1 h en un baño de agua a 45 °C y mezclar brevemente con un vórtice cada 15 min.
    6. Agregue agua fría desionizada o de ósmosis inversa al mismo volumen que el volumen inicial de leche.
    7. Agregue 1 ml de hexano, mezcle por vórtice durante 15 s y centrifugue durante 2 min (~ 1,300 × g) a temperatura ambiente.
    8. Con una pipeta Pasteur, pipetee con cuidado la capa superior de hexano a un nuevo tubo de ensayo de vidrio (12 x 75 mm o 13 x 100 mm).
    9. Repita los pasos 1.2.7 y 1.2.8 dos veces más, acumulando hexano en el segundo tubo.
    10. Tome cada muestra mediante extracción en fase sólida (SPE); comience conectando los cartuchos de SPE necesarios (PE 500 mg / 3 ml de -NH2) al colector de vacío.
    11. Acondicione cada cartucho pasando 3 x 2 ml de hexano a través de cada cartucho, sin permitir que el nivel de disolvente caiga por debajo de la parte superior del material de relleno. Recoja el hexano en un tubo de vidrio de 16 x 75 mm y deséchelo adecuadamente.
    12. Cargue las muestras en cartuchos y tire con el vacío hasta que el disolvente esté justo por encima del nivel del material de embalaje. Enjuague cada cartucho con 3 x 2 ml de hexano de la misma manera que en el paso 1.2.11. Deseche el disolvente residual y sustituya los tubos de recogida de vidrio por otros nuevos del mismo tamaño, etiquetados con el ID de la muestra.
    13. Lave el retinol con 3 x 2 ml de cloruro de metileno, recolectando esta fracción.
    14. Seque el eluido bajo nitrógeno y vuelva a constituir en 100 μL de metanol (grado MS). Mezcle la muestra por vórtice y agite el disolvente por todos los lados del tubo. Centrífuga durante 20-30 s.
    15. Coloque las muestras en un congelador a -80 °C durante al menos 5 min.
      NOTA: Las muestras pueden permanecer almacenadas en este paso a -80 °C hasta el día siguiente.
  3. Extracción de muestras de hígado
    1. En un embudo de vidrio de 8 cm de diámetro, dobla y coloca un papel de filtro Whatman #1 de 15 cm en forma de cono. Coloque un matraz abombado de 50 ml debajo del embudo.
    2. Descongele el tejido y pese 0,5 g, o la cantidad de muestra disponible. Registre el peso del tejido utilizado.
    3. Transfiera las muestras a un mortero y muela con aproximadamente 5 g de sulfato de sodio.
    4. Agregue 250 μL de un estándar interno como C-2315.
      NOTA: No se deben usar formas esterificadas de vitamina A (es decir, acetato de retinilo, butirato de retinilo) porque la muestra eventualmente se saponificará, lo que hará que el estándar sea indistinguible del retinol endógeno.
    5. En una campana extractora, vierta 10-15 ml de cloruro de metileno en el mortero con la muestra de hígado molida y mezcle suavemente con el mortero.
    6. Vierta cloruro de metileno a través del papel de filtro en el matraz aforado.
    7. Repita los pasos 1.3.5 y 1.3.6 dos veces más, asegurándose de que el disolvente total en el matraz aforado permanezca por debajo de la línea.
    8. Utilice una pipeta Pasteur para enjuagar el contenido restante del mortero en el embudo con cloruro de metileno. Continúe agregando cloruro de metileno al embudo con la pipeta Pasteur hasta que el solvente en el matraz aforado llegue a la línea. Tape el matraz aforado y, mientras asegura la tapa en su lugar, invierta el matraz varias veces.
    9. Vierta aproximadamente 10 ml del extracto de cloruro de metileno en un matraz Erlenmeyer de 25 ml. Transfiera 5 ml de la solución a un tubo de centrífuga de vidrio de 10 ml con tapón de rosca. Seque la muestra bajo una suave corriente de gas nitrógeno.
    10. Reconstituir la muestra en 2 mL de etanol + hidroxitolueno butilado al 0,1% y vórtice para mezclar la muestra.
    11. Agregue 0,8 ml de hidróxido de potasio 50:50 (w:v) en agua y mezcle por vórtice durante 15 s.
    12. Saponificar las muestras durante 1 h en un baño de agua a 45 °C y mezclar brevemente con un vórtice cada 15 min.
    13. Agregue 0,1 ml de agua fría desionizada o de ósmosis inversa.
    14. Agregue 1 ml de hexano, mezcle por vórtice durante 15 s y centrifugue durante 2 min (~ 1,300 × g).
    15. Con una pipeta Pasteur, pipetee con cuidado la capa superior de hexano a un nuevo tubo de ensayo de vidrio (12 x 75 mm o 13 x 100 mm).
    16. Repita los pasos 1.3.14 y 1.3.15 dos veces más, acumulando hexano en el segundo tubo.
    17. Seque el hexano acumulado bajo nitrógeno y vuelva a constituir en 100 μL de metanol (grado MS). Mezcle la muestra por vórtice y agite el disolvente por todos los lados del tubo. Centrifugar durante 20-30 s y colocar las muestras en un congelador a -80 °C durante al menos 5 min.
      NOTA: Las muestras pueden permanecer almacenadas en este paso a -80 °C hasta el día siguiente.

2. Purificación y cuantificación de muestras mediante cromatografía líquida de alta resolución

  1. Prepare el sistema de HPLC 1 con una columna C18 (5 μm, 4,6 x 250 mm) y un detector UV-Vis ajustado a 325 nm.
  2. Prepare la fase móvil de acetonitrilo: agua 92: 8 midiendo los volúmenes de acetonitrilo y agua por separado y luego vertiendo el agua en el acetonitrilo. Filtrar al vacío la solución mezclada para eliminar el gas disuelto.
  3. Encienda el sistema de HPLC 1, realice una purga de disolvente en la HPLC si es necesario, luego configure el caudal en 1 ml / min durante al menos 15 min para equilibrar completamente el sistema.
  4. Inyecte estándares en el sistema de HPLC.
    1. Para cuantificar las concentraciones de retinol, inyecte 25 μL de solución patrón interna de C-23 y registre el resultado 3 veces para compararlo con las muestras.
    2. Inyecte un estándar de retinol para determinar el tiempo de retención exacto del sistema utilizado para guiar la recolección de fracciones y la cuantificación de retinol.
  5. Prepare el sistema de HPLC 2 (los componentes son los mismos que los del sistema 1). Si utiliza un sistema de HPLC para ambos pasos, reemplace la columna utilizada para la purificación primaria con una segunda columna idéntica para minimizar el posible arrastre de compuestos de las muestras.
  6. Para el sistema 2, filtro de vacío metanol, purgue la fase móvil de HPLC y luego deje funcionar 0,7 ml / min durante 20 min para equilibrar.
  7. Retire las muestras de una en una del congelador a -80 °C y centrifugue a 1.300 × g durante 30 s a temperatura ambiente.
  8. Inyecte la muestra completa en el HPLC, evitando cualquier material granulado. Comience a grabar si cuantifica el retinol.
  9. Recoja el pico de retinol en un pequeño tubo de vidrio (12 x 75 mm o 13 x 100 mm) a medida que el solvente pasa a través del detector. Recoja la parte media del pico para maximizar la pureza, normalmente valores de absorbancia superiores a 0,1 unidades de absorbancia (Figura 1), que pueden ajustarse en función de la concentración de retinol de la muestra. Espere a que el pico C-23 se eluya y detenga la grabación.
  10. Seque la muestra bajo un suave chorro de nitrógeno.
  11. Agregue 100 μL de metanol (grado MS) a la muestra seca y tapón inmediatamente. Agite la solución hacia arriba y hacia abajo por los lados del tubo, luego mezcle la muestra por vórtice durante 15 s. Coloque las muestras en un congelador a -80 °C durante al menos 5 min.
    NOTA: Las muestras pueden permanecer almacenadas en este paso a -80 °C hasta el día siguiente.
  12. Retire las muestras de una en una del congelador a -80 °C. Centrifugar a 1.300 × g durante 30 s.
  13. Inyecte la muestra completa en el sistema HPLC 2, evitando cualquier material granulado.
  14. A medida que eluye el pico de retinol, recoja el disolvente a medida que pasa a través del detector en un pequeño vial de vidrio (<1 ml) con fondo cónico y deslice suavemente el vial de muestra en un tubo de ensayo de 12 x 75 mm.
  15. Encienda el concentrador de vacío y deje que el condensador se enfríe durante 20 min.
  16. Coloque las muestras en una formación equilibrada en el carrusel, ajuste el ajuste de calor a ninguno y el vacío a 05.1, cierre la tapa y presione ejecutar.
    NOTA: Las muestras suelen tardar entre 10 y 20 minutos en secarse. Es importante para el cromatógrafo de gases que se haya eliminado todo el metanol de las muestras.
  17. Una vez seco, transfiera el vial de HPLC a un vial ámbar de 4 ml con tapa de rosca y reconstituya la muestra con 4-7 μl de hexano.
    NOTA: Esto suele ser de 7 μL, pero se reduce cuando se determina que la muestra tiene una concentración baja durante la purificación. Las muestras de hígado pueden estar mucho más concentradas, por lo que se reconstituyen en un volumen mayor. Apunte a entre 75 ng/μL y 400 ng/μL.
  18. Inyecte 1-5 μL en el GC-C-IRMS para lograr una señal adecuada, basada en la concentración de la muestra requerida para inyectar aproximadamente 75 ng de retinol.

3. Análisis de muestras con GC-C-IRMS

  1. Prepare el GC con una columna (100% dimetilpolisiloxano, no polar, 15 m, 0,25 mm de diámetro interior, película de 0,25 μm) y el caudal de helio de 1,2 ml/min.
  2. Realice comprobaciones del sistema para asegurarse de que no haya fugas y que la fuente IRMS esté correctamente enfocada en las masas 44, 45 y 46.
    Inyecte 2 μL de un estándar de retinol enriquecido con 13C de 75 ng/μL cada día como primera inyección para determinar el tiempo de retención y verificar el rendimiento del sistema.
  3. En el software de adquisición, cargue el método del instrumento, escriba el nombre de la muestra y presione ejecutar muestra. El sistema GC-C-IRMS realizará una rutina de configuración del sistema de preinyección. Una vez que se encienda la luz verde Listo para inyectar en la parte frontal del GC, inyecte el volumen predeterminado de muestra en el inyector PTV de vaporización de temperatura programable, retire la jeringa y presione el botón Inicio .
  4. Opere el inyector PTV en modo PTV Splitless, con la columna de protección asentada en la parte superior del inserto del inyector para una inyección simulada en la columna. Configure el programa del inyector para que comience con una temperatura inicial de 50 °C, manténgalo durante 1,05 min, aumente a 200 °C a una velocidad de 14,5 °C/s, manténgalo a 200 °C durante 1 min, pase a 300 °C a 14,5 °C/s, luego manténgalo presionado para purgar el inyector durante 4 min con un flujo dividido de helio de 50 mL/min antes de volver a 50 °C para la siguiente inyección.
  5. Programe la temperatura del horno GC a una temperatura inicial de 50 °C, manténgala durante 1 min, aumente 30 °C/min a 150 °C, luego 15 °C/min a 265 °C, luego hasta 295 °C a 40 °C/min, luego manténgala durante 2,50 min antes de enfriar a 50 °C para la siguiente inyección.
  6. Asegúrese de que cada cromatograma comience con tres pulsos de CO2 (99,999% de pureza), calibrados contra sacarosa (OIEA-CH-6). Acceda a los resultados en el software de adquisición.
  7. Después de cada inyección, inspeccione cada cromatograma para verificar que el pico de retinol esté presente y que la integración sea adecuada. Utilice el software para integrar automáticamente los picos de retinol tanto como sea posible para minimizar el posible sesgo de las integraciones manuales. Utilice configuraciones estándar de detección de pendiente inicial y final de 20 mV / s.
    NOTA: Una amplitud máxima de 200 mV o menos es demasiado pequeña para proporcionar una medición precisa de la relación de 13C.
  8. Exporte datos de cromatogramas a un programa de hoja de cálculo. Incluya las siguientes categorías de datos esenciales: nombre de la muestra, tiempo de retención máximo, amplitud máxima en masa 45 y AT%.
    NOTA: Los datos que se exportan se pueden especificar utilizando un método de exportación definido. El valor δ es beneficioso para facilitar la interpretación, pero no es necesario para los cálculos.

4. Cálculo de las reservas corporales totales de vitamina A y las concentraciones hepáticas

  1. Ecuaciones de dilución de isótopos de retinol.
    NOTA: La ecuación de equilibrio de isótopos preferida y la notación correspondiente utilizada por algunos investigadores se basan en las recomendaciones de la Unión Internacional de Química Pura y Aplicada16. Observamos que algunos grupos de investigación utilizan notación que intenta mantener el uso histórico de los factores utilizados en las ecuaciones RID. También observamos que los factores y la literatura de apoyo pueden diferir en cuanto a si se aplican más directamente a los cálculos de TBS o concentraciones de AV hepáticas, según el diseño del estudio, el modelo experimental y los resultados analíticos.
    1. Determine el retinol sérico TTR utilizando la abundancia isotópica de 13C de CO2 después de la combustión de acuerdo con la siguiente ecuación:
       figure-protocol-1    
      Donde F es la abundancia isotópica (también conocida como fracción de cantidad de isótopos, abreviada 'x') de la dosis del marcador (Fa), el retinol sérico al inicio (Fb) y el retinol sérico después de la dosificación y la mezcla con la reserva corporal (Fc). Los períodos de mezcla utilizados suelen ser de alrededor de 14 a 21 días para los humanos, pero pueden ser más cortos o más largos según el diseño específico del estudio.
    2. Utilice ecuaciones RID para calcular VA TBS de acuerdo con la siguiente ecuación base.
      figure-protocol-2
      Dónde
      figure-protocol-3
      NOTA: Los factores utilizados para la absorción y el almacenamiento incluyen: i) el almacenamiento de la dosis en el momento del equilibrio (absorción de dosis) generalmente estimado entre el 75% y el 90% para individuos sanos. La estimación se puede reducir si hay inflamación. ii) Retención de dosis; Constante: e-kt; k = ln(2)/vida media del retinol; 32 a 136 días para niños; 140 días para adultos); t = días desde la dosificación (generalmente 14-21 días); partición de trazadores suero/hepático: TTRserum / TTRliver; 0,65-0,9 con la ingesta de VA durante el período de mezcla; 0.9-.1 si se usa una dosis baja de trazador, ingesta controlada de VA y muestreo en ayunas.
      figure-protocol-4
    3. Calcule las concentraciones de VA en el hígado con supuestos adicionales para el peso del hígado y la fracción de TBS de VA en el hígado.
      figure-protocol-5
      Dónde
      figure-protocol-6
      La relación entre el hígado y el peso corporal se estima comúnmente como una constante específica de la edad: bebés: 4-4,2%; niños: 3%; adultos: 2,4%; La fracción de TBS en el hígado varía según el estado de la vitamina A. Las estimaciones utilizadas anteriormente son el estado marginal o bajo de VA: 0,5; estado adecuado de VA: 0.8-0.9.

Resultados

Se proporciona un ejemplo de cromatograma de muestra de suero monitoreado a 325 nm para la sección 2 del protocolo (Figura 1). Dependiendo del sistema específico y la columna utilizada, el tiempo de retención típico para el retinol es de 4-6 min y de 6-8 min para el estándar interno. El área sombreada en verde muestra el rango de recolección objetivo de la fracción de retinol para minimizar las impurezas. La eficiencia de extracción del retinol del suero suele ser del 85% ≥ mientras que la leche materna saponificada y las muestras de tejido tienden a tener eficiencias más bajas, con un promedio de ~ 70-80%. Se pueden observar cantidades menores de isómeros cis de retinol que se eluyen poco antes o después del pico principal de all-trans durante la purificación por HPLC. No se observó ningún isómero cis apreciable en la muestra presentada en la Figura 1 , pero se puede ver en la Figura complementaria 1 de la referencia17. A menudo, se separará un isómero adicional durante la segunda purificación de HPLC (no se muestra) o durante la separación de GC (Figura 2).

Se muestran ejemplos de cromatogramas GC-C-IRMS para un estándar, una muestra de suero y un blanco para la sección 3 del protocolo (Figura 2)9. Cada muestra incluye picos de referencia deCO2 con enriquecimiento de 13C calibrados según un estándar de sacarosa del OIEA (IAEA-CH-6).

La precisión experimental de IRMS (CV%) para la abundancia isotópica de 13C / C total para: 1) CO2 de referencia fue de 0,012 para estabilidad y 0,031 para linealidad (n = 10 cada uno); 2) el estándar de retinol fue de 0,036 para la estabilidad entre días y de 0,022 para la linealidad intradía (n = 4 cada uno); y 3) experimental fue de 0,073 ± 0,061 en los grupos de tratamiento inicial y ocho grupos de tratamiento dietético en jerbos (n = 46 en 9 grupos)9.

A continuación se muestra un ejemplo de cómo se utilizan los datos séricos resultantes de GC-C-IRMS para calcular las concentraciones de TBS y VA hepáticas determinadas 14 días después de la administración de la dosis utilizando la ecuación RID para el Método 4:

Características de los participantes del estudio:

Edad:4 años
Peso corporal:16,0 kg
Fa (2 carbonos etiquetados más abundancia natural):0.11
Fb:0.010757
Fc:0.011057
Dosis de trazador aplicada:1,0 μmol
Tiempo desde la dosificación:14 días
Vida media de VA:32 días
Absorción:0.8
Proporción de TTR en suero/hígado (dieta no controlada):0.9
Fracción de TBS en hígado:0.8

Cálculo:

TTR = (Fc-F b)/(Fa-F c)
TTR = (0,0110568 - 0,010757) / (0,11 - 0,0110568) = 0,0030300213
1/TTR = 1 / 0,0030300213 = 330,03

Retención de dosis = e-kt con vida media de 32 días y tiempo de muestreo de 14 días
k = ln (2) / 36 = 0.693147181 / 36 = 0.021660849
t = 14
e-kt = e-0.02166 x 14 = 0.738413073

figure-results-1

TBS = 1 × 330,03 x 0,8 x 0,738413073 × 0,9 = 175 μmol

Para el cálculo de las concentraciones de AV en el hígado:
Peso del hígado (g) = 1,000 × peso corporal (kg) × 3% (estimación para niños)
Peso del hígado = 1.000 x 16,0 x 0,03 = 480 g
figure-results-2
Concentración de VA en el hígado = (175 / 480) x 0,8 = 0,29 μmol/g

figure-results-3
Figura 1: Cromatografía HPLC de la muestra de suero humano. Sistema HPLC 1 con fase móvil isocrática 90:10 MeOH:H2O y detección a 325 nm. El pico de retinol se recopila para valores de absorbancia superiores a ~ 0.1 (área sombreada en verde). El estándar interno C-23 β-apo carotenol se utiliza para cuantificar la concentración sérica de retinol (si se desea) durante este paso. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

figure-results-4
Figura 2: Cromatogramas GC-C-IRMS que demuestran la determinación de retinol 13 C / 12 C. Cromatograma GC-C-IRMS de (A) retinol estándar, (B) retinol purificado a partir de suero y (C) inyección en blanco adaptada de Gannon et al.9. Tres trazas son para la masa 44 (correspondiente a 12C16O2), 45 (correspondiente a 13C16O2 o 12C16O17O) y 46 (correspondiente principalmente a 12C16O18O, que se utiliza para corregir la masa 45 para la contribución de 17O). Tres picos anchos antes de 200 s son picos de referencia de CO2 calibrados con un material de referencia de sacarosa 13C. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discusión

Los métodos descritos para medir el enriquecimiento de 13C de retinol utilizando GC-C-IRMS pueden proporcionar datos valiosos para evaluar intervenciones dietéticas,18 modelado de la cinética de la vitamina A,19,20,21 investigación clínica o estudios poblacionales que incorporan RID para mejorar las estimaciones del estado de VA22.

En esta prueba, el retinol purificado de una muestra biológica se transporta a través de la columna GC mediante helio de grado de investigación (>99,99999% de pureza) con un gradiente de temperatura, separándolo de las impurezas restantes en la muestra. El retinol se quema para formarCO2 y agua, y se elimina el agua. El CO2 se transporta al IRMS, donde se miden las masas 44, 45 y 46, y se determinan el δ y el AT% en relación con una referencia de gas CO2 , que además se calibra con el estándar de sacarosa (IAEA-CH-6).

En la preparación del retinol para inyección, el retinol extraído debe ser de máxima pureza para lograr proporciones isotópicas reproducibles y maximizar la longevidad de la plataforma analítica entre limpiezas a fondo. Los disolventes utilizados para la extracción deben ser del grado de pureza más alto disponible, que suele ser de grado MS. Toda la cristalería, como los tubos de extracción, las pipetas Pasteur y los viales de inyección de HPLC, deben ser nuevos porque son difíciles de limpiar adecuadamente para el análisis de MS. Es importante utilizar tubos y pipetas de vidrio en lugar de plástico para minimizar los plastificantes en los extractos que se acumulan en las columnas de GC y combustión.

Se pueden realizar modificaciones en este flujo de trabajo de análisis de muestras según el diseño específico del estudio y la fuente de muestreo. Por ejemplo, un sistema de HPLC probablemente podría optimizarse para la purificación de retinol. En nuestra experiencia, esto requeriría agua en la fase móvil, y requeriría un gradiente de fase móvil o un mayor tiempo de secado de la muestra antes de la inyección en el GC-C-IRMS. Encontramos que el uso de dos sistemas HPLC con métodos isocráticos cortos equilibra los requisitos analíticos mientras se obtienen señales claras en el GC-C-IRMS (Figura 2). El uso de LC-MS/MS podría proporcionar un flujo de trabajo analítico más optimizado para las muestras de RID7. Sin embargo, la sensibilidad de GC-C-IRMS tiene claras ventajas de poder usar cantidades más bajas de etiquetado de dosis e isótopos, cuantificar trazadores en puntos de tiempo más largos y analizar muestras con bajo enriquecimiento de muestras.

Las limitaciones de este método incluyen la necesidad de múltiples instrumentos, manejo técnico calificado y restricciones de rendimiento de muestras debido a tiempos de preparación de muestras más largos. El tiempo-persona requerido para preparar cada muestra podría mejorarse mediante la implementación de una HPLC con capacidades automatizadas de recolección de fracciones, ya que los pasos de purificación de HPLC utilizan métodos isocráticos, lo que da como resultado tiempos de retención de analitos consistentes. El método podría optimizarse para usar solo una purificación de HPLC. Utilizamos dos sistemas en paralelo para aumentar el rendimiento y facilitar el secado de la muestra antes de la reconstitución en hexano y la inyección en el GC-C-IRMS.

Si bien GC-C-IRMS es extremadamente sensible para determinar las proporciones de isótopos, requiere más masa total de retinol de muestra para una señal de retinol adecuada. Los requisitos de la muestra dependen tanto de la cantidad de muestra como de la concentración de VA de la muestra. Por lo general, 75 ng de retinol se dirigen a un pico fuerte, lo que permite variaciones en la transferencia de GC y la eficiencia de combustión. En la práctica, en condiciones óptimas de funcionamiento, hemos obtenido una señal adecuada con muestras que dan como resultado inyecciones de GC-C-IRMS tan bajas como 25 ng. Esto corresponde a una muestra de suero con menor volumen (~0,4 ml), baja concentración de retinol (~0,5 μmol/L) y pérdidas menores en los procedimientos de extracción y purificación. En el desarrollo analítico del método RID, una mejora importante fue cambiar a un inyector PTV. La baja temperatura de arranque evita que el hexano que transporta la muestra se expanda demasiado rápido, lo que permite inyecciones simuladas de muestras en columna. La inyección directamente en la columna maximiza la señal del retinol con el inconveniente de una forma de pico algo peor y un mantenimiento más constante.

La leche materna se ha propuesto como sustituto de las muestras de suero en la prueba RID. Esto se ha validado en mujeres lactantes de Zambia que en gran medida tenían reservas bajas de VA11. Todavía no se ha validado en mujeres que tienen una mayor ingesta de AV preformada, como se encontraría en países de altos ingresos o en poblaciones que consumen múltiples fuentes de AV, incluida la ingesta dietética, la fortificación de alimentos y la suplementación.

La evaluación de la AV de la leche materna tiene varias ventajas sobre otros indicadores bioquímicos del estado de la AV. La recolección de leche materna a menudo es más fácil que la sangre porque no se necesitan flebotomistas, y la recolección de leche materna generalmente se considera menos invasiva para los sujetos23. El uso de muestras ocasionales de leche materna es conveniente y solo requiere 5 ml de leche. Además, no es necesario procesar las muestras de inmediato, lo que acorta el tiempo de manipulación de las muestras, especialmente en entornos de campo. Sin embargo, la estandarización de la recolección de muestras para muestras de leche materna completa es fundamental porque las concentraciones de grasa y retinol son más altas en la leche final que en la leche inicial, y las concentraciones de grasa y retinol de la leche tienden a variar con la hora del día y el intervalo desde la última alimentación 1,24. Para muestras casuales, la concentración de retinol se expresa mejor por g de grasa láctea. La grasa láctea debe determinarse idealmente justo después de la recolección utilizando el método de creamatocrit25. Las muestras deben protegerse de la luz. Las alícuotas (generalmente de 1 a 5 ml) para el análisis de HPLC deben prepararse en el momento de la recolección porque la leche no es homogénea después de la congelación y descongelación.

Hay dos circunstancias principales en las que la medición del enriquecimiento de 13C de la AV en el hígado puede ser posible e interesante. La situación más común es cuando se utiliza retinol marcado con 13C en estudios con animales cuando se recolecta el hígado. Los TBS calculados de VA se compararán con la concentración de VA en el hígado determinada por HPLC / UPLC, pero el enriquecimiento de 13C de las reservas hepáticas también es útil para determinar cómo se distribuye el marcador en circulación en relación con las reservas a largo plazo. Además, en algunas circunstancias únicas, es posible obtener muestras de biopsia hepática de humanos que han dado su consentimiento y también han tomado una dosis etiquetada de vitamina A26,27. Estas muestras también son útiles para la validación y prueba de la mezcla de 13C-retinol. El procesamiento de muestras de hígado comienza con la molienda de una muestra medida con sulfato de sodio anhidro para atrapar agua y descomponer el tejido. Luego se extrae con 50 ml de cloruro de metileno a través de papel de filtro. Una fracción se seca bajo nitrógeno y se reconstituye en etanol con hidroxitolueno butilado al 0,1% agregado como conservante. La muestra se saponifica y se extrae con el mismo procedimiento utilizado para la leche materna.

Divulgaciones

Los autores no tienen conflictos de intereses que declarar.

Agradecimientos

Este trabajo fue financiado por NIH-R01 DC019357 y el Proyecto de Investigación Coordinada E43035 del OIEA.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Material de referencia 13C rastreable a la escala VPDB-LSVEC (Sucrose)Agencia Internacional de Energía AtómicaOIEA-CH-6 Nombre del Instituto Nacional de Normas y Tecnología: RM 8542
Acetonitrilo (grado HPLC)Fischer ScientificUN1648
Etanol (puro de 200 grados, anhidro y ge; 99.5%)Sigma459836
Pipetas pasteur de vidrioCualquier
Tubos de ensayo de vidrioCualquier
Helio (gracia de investigación, (>99,9995% pureza)Cualquier
HexanosSigma178918
Metanol (grado MS)VWRMSPP-A-456
Mortero y pestel, cerámicaCualquier
Pipeta de desplazamiento positivo 3-25 y micro; LGilsonFD10002
Pipeta de desplazamiento positivo 10-100 y micro; LGilsonFD10004
Pipeta de desplazamiento positivo 50-250 y micro; LGilsonFD10005
Pipeta de desplazamiento positivo 100-1000 y micro; LGilsonFD10006
Hidróxido de potasioFisher ScientificUN1813
Papel filtro cualitativo #1 150 mmWhatman1001-150
Chmeneos separadoresCualquier
Sulfato de sodio, anhidroFischer ScientificS415-212
Matrazas volumétricas (50 mL)Cualquier

Referencias

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