In situ Detección de células metabólicamente activas en tejido de carcinoma hepatocelular mediante imágenes de criosección basadas en MTT

Resumen

Aquí, presentamos un protocolo simple para detectar las células metabólicamente activas en el tejido del carcinoma hepatocelular utilizando imágenes de criosección basadas en MTT. Este método también se puede usar para detectar células activas in situ en otros tejidos u órganos.

Resumen

La evidencia emergente, incluidos estudios anteriores, destaca una subpoblación de células dentro de los tejidos del carcinoma hepatocelular (CHC) que exhiben una actividad metabólica superior y resistencia al estrés. Estas células son impulsores clave de la progresión tumoral y la resistencia a la terapia. Sin embargo, los métodos existentes para la detección de células viables in situ a menudo comprometen la integridad del tejido, alteran la viabilidad celular o son técnicamente exigentes. Este estudio presenta un enfoque novedoso, simple y no destructivo para la detección in situ de células metabólicamente activas en tejidos de HCC a través de la reducción dependiente de mitocondrias del bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio (MTT) a cristales de formazán insolubles. Al optimizar el tamaño del fragmento de tejido (1 × 1 × 0,2 cm³), las condiciones de cultivo (20% de FBS, 1 mg / ml de MTT y 3 h de incubación con remolino intermitente) y los parámetros de criosección (20 μm de espesor, 4% de fijación de PFA y contratinción de DAPI), se logró el mapeo espacial de células de CHC viables en 5 h. Este protocolo rentable no requiere equipos especializados y mantiene la arquitectura tisular, lo que permite la identificación espacial de grupos celulares de alta viabilidad y resistentes al estrés en las regiones de la superficie. Las limitaciones incluyen la pérdida progresiva de viabilidad más allá de las 6 h y el desplazamiento de cristales durante el corte, que puede mitigarse mediante la suplementación con FBS y la congelación controlada. Este método proporciona una plataforma práctica para el aislamiento unicelular de subpoblaciones resistentes a la terapia, avanzando en la investigación del microambiente del CHC.

Introducción

El carcinoma hepatocelular (CHC), la tercera causa principal de muertes relacionadas con el cáncer a nivel mundial, se caracteriza por una alta heterogeneidad y tasas de recurrencia¹. Esta heterogeneidad espacial y temporal hace que ciertas poblaciones celulares dentro de los tejidos tumorales sean más activas que otras en el metabolismo, la proliferación, la progresión, la tolerancia al estrés y la resistencia a los medicamentos. La detección in situ de células viables dentro de los tejidos de HCC tiene una profunda importancia clínica y biológica, ya que estas células abarcan subclones proliferantes, poblaciones resistentes a la terapia y células iniciadoras de metástasis. Tales células viables podrían servir como impulsores críticos de la recurrencia tumoral, la evasión inmune y el fracaso terapéutico².

Sin embargo, las tecnologías actuales de perfiles espaciales (por ejemplo, transcriptómica espacial) requieren instrumentación especializada y están asociadas con altos costos, mientras que los análisis masivos tradicionales a menudo pasan por alto la heterogeneidad espacial de las células viables y sus interacciones dinámicas con los componentes estromales³. Por ejemplo, las células de CHC viables residuales después de la resección exhiben perfiles metabólicos distintos que no se pueden recapitular fielmente en sistemas celulares disociados⁴. Por lo tanto, el avance de las tecnologías de detección resueltas espacialmente es imperativo para desentrañar la diafonía funcional entre las células tumorales viables y su microambiente, lo que en última instancia informa estrategias terapéuticas de precisión. Aunque los métodos convencionales como la citometría de flujo o la inmunohistoquímica (IHC) han sido utilizados por nuestro grupo para detectar las células viables en el CHC, requieren disociación o fijación tisular, perdiendo así el contexto espacial y dificultando el análisis de las interacciones célula-célula ^5,6. Por lo tanto, el desarrollo de tecnologías no destructivas de alta resolución para la detección in situ de células viables es fundamental para dilucidar los mecanismos de resistencia al CHC y guiar las terapias de precisión.

Para detectar y mostrar rápidamente las células viables en los tejidos del CHC in situ sin tratamiento destructivo, se desarrolló un método simple de cultivo de tejidos basado en el bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio (MTT). Brevemente, los tejidos frescos y delgados de HCC (aproximadamente 1 × 1 × 0,2 cm³) se cultivaron primero en medio DMEM durante 3 h que contenían un 20% de suero fetal bovino (FBS) y MTT (1 mg / mL). Luego, después de la fijación con paraformaldehído (PFA) al 4% y el montaje que contenía DAPI, los portaobjetos de tejido congelado incrustados en OCT (20 μm de espesor) se sometieron a observación microscópica bajo luz brillante o ultravioleta. Las celdas viables mostrarán una coloración púrpura, rojo púrpura o negro púrpura. Usando este protocolo, detectamos con éxito las células viables en los tejidos de HCC en 5 h. Mientras tanto, este método conserva la microarquitectura 3D, es compatible con el análisis multiómico posterior y es simple, así como rápido y económico. Sin embargo, este método presenta ciertas limitaciones. Los procesos de lavado, corte y cultivo de varios pasos pueden inducir deformación estructural y apoptosis en los tejidos, especialmente en muestras con alto metabolismo, como el tejido de HCC en este estudio. Además, el mayor grosor de los cortes de criosección compromete la claridad y la planitud de las observaciones microscópicas.

Protocolo

Todos los experimentos se llevaron a cabo de acuerdo con la Declaración de Helsinki y fueron aprobados por el Comité de Ética del Primer Hospital Afiliado de Quanzhou (No. FJMU IACUC2021257). Los tejidos de HCC se extrajeron quirúrgicamente y se recolectaron en el Primer Hospital de Quanzhou, afiliado a la Universidad Médica de Fujian, con el consentimiento informado de los pacientes. Este experimento requiere medidas de protección estándar, incluido el uso de una bata de laboratorio, una máscara desechable y guantes.

1. Preparación de tejidos

1. Coloque una placa de Petri estéril de 9 cm sobre hielo. Agregue 30 ml de solución salina tampón de fosfato (PBS) helada.
2. Transfiera inmediatamente el tejido de HCC humano resecado quirúrgicamente al PBS.
3. Agite suavemente el plato durante 5 s para eliminar los contaminantes de la sangre. Aspire el PBS con una pipeta estéril.
   NOTA: Repita tres veces.
4. Transfiera el pañuelo a la tapa de la placa de Petri.
   NOTA: Los pañuelos se adhieren fácilmente a la tapa de la placa de Petri sin humedecer para un mejor manejo posterior.
5. Recorte el tejido en fragmentos de aproximadamente 1 × 1 ×^{0,2 cm 3} con una cuchilla quirúrgica estéril (n.º 11).
   NOTA: La longitud y el ancho de los fragmentos podrían cambiarse, pero la profundidad debe ser inferior a 0,2 cm.
6. Regrese los fragmentos a un plato fresco de 9 cm lleno con 30 ml de PBS helado.
7. Agite suavemente el plato durante 5 s para eliminar los contaminantes de la sangre. Aspire el PBS con una pipeta estéril.
   NOTA: Repita el paso 1.7 tres veces. Un fragmento de tejido hervido en PBS (95 °C, 10 min) se estableció como control negativo. Realice todos los pasos en condiciones estériles.

2. Cultivo de tejidos

1. Añadir 1,8 ml de medio de cultivo completo DMEM (precalentado a 37 °C) que contenga glucosa (concentración final = 4,5 g/L) y L-glutamina (concentración final = 2 mM) en cada pocillo de una placa de 6 pocillos. Luego, agregue 0.6 ml de FBS (concentración final = 20% v/v) y 0.6 ml de existencias de MTT (concentración final = 1 mg/ml) en cada pocillo de una placa de 6 pocillos.
2. Transfiera los fragmentos de tejido a pocillos con pinzas estériles.
3. Coloque la placa de 6 pocillos en la incubadora. Incubar durante 3 h a 37 °C con un 5% de CO₂.
   NOTA: Agite suavemente el plato durante 3 s cada 30 min. La incubación podría terminarse una vez que la superficie de los fragmentos de tejido se vuelva púrpura o púrpura-negra.

3. Terminación y fijación

1. Aspirar el medio MTT. Lave los fragmentos de tejido con solución salina helada.
   NOTA: Repita cinco veces.
2. Agregue 2 ml de formalina tamponada neutra (NBF) al 4% en cada pocillo de una placa de 6 pocillos.
3. Colocar el plato en el frigorífico a 4 °C durante 1 h.

4. Criosección

1. Seque los fragmentos suavemente sobre papel absorbente limpio.
2. Coloque el tejido en un criomold lleno de compuesto OCT.
   NOTA: Asegúrese de que el tejido esté completamente cubierto con compuesto OCT.
3. Congele el pañuelo en un refrigerador a baja temperatura a -80 °C durante 20 min.
4. Monte el bloque congelado en un mandril de criostato a -20 °C.
5. Cortar secciones de 100 μm a -20 °C hasta que la superficie del tejido quede expuesta.
   NOTA: La superficie del tejido muestra una coloración similar a la púrpura.
6. Recoja rodajas de 20 μm con portaobjetos recubiertos de adhesivo.
   NOTA: Las rodajas de tejido deben presentarse en un tono de púrpura, rojo púrpura o negro púrpura.
7. Fije las rodajas en paraformaldehído (PFA) al 4% a temperatura ambiente durante 2 min.
8. Enjuague suavemente los portaobjetos con PBS durante 1 min.
   NOTA: Repita tres veces.

5. Montaje

1. Aplique 1 gota de medio de montaje que contenga DAPI (concentración final: 1 μg / ml).
2. Cubra con un cubreobjetos.
3. Sella los bordes con esmalte de uñas.
   NOTA: Los portaobjetos con bordes sellados se pueden almacenar a 4 °C en la oscuridad si la microscopía no se realiza inmediatamente.

6. Microscopía

1. Visualice depósitos de formazán púrpura, rojo púrpura o púrpura-oscuro (células viables) con un aumento del 20× bajo campo claro utilizando microscopía de campo claro.
2. Detecte DAPI azules (núcleos) bajo iluminación UV mediante microscopía de fluorescencia.
3. Fusionar canales de campo claro y fluorescencia para la correlación espacial.
   NOTA: El software utilizado aquí es NIS Element F (versión 4.00.06).

Resultados

Este estudio detectó con éxito células metabólicamente activas en el tejido HCC sin alterar la arquitectura del tejido. En primer lugar, las imágenes de campo claro (Figura 1A) mostraron que la superficie del tejido exhibía una densa cobertura celular y un apilamiento multicapa de células en el portaobjetos, lo que confirma la integridad arquitectónica preservada del tejido del HCC durante el cultivo y el procesamiento. En particular, los grupos de células dentro de las regiones superficiale...

Discusión

Las metodologías actuales para la detección de células viables in situ aún enfrentan limitaciones multifacéticas. La IHQ y la inmunofluorescencia (IF), que se utilizan ampliamente para identificar marcadores de proliferación o proteínas relacionadas con la apoptosis, sufren una alteración de la integridad de la membrana inducida por la fijación de formaldehído⁷. Además, la penetración de anticuerpos en secciones de tejido grueso es subóptima

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
-80 ºC; Congelador C (vertical)	Thermo Fisher Scientific	TSX60086V
Banco limpio (flujo laminar vertical)	AIRTECH	SW-CJ-1FD
Incubadora CO2 (165 L)	Thermo Fisher Scientific	Heracell VIOS 160i (por ejemplo, 51030400 / 51033559)
Slip (24 y más veces; 50 mm, #1,5)	CITOGLAS (Citotest)	0341-3610
Placa de Petri de cultura (90 mm)	NIDO	752001 (ejemplo)
Medio de montaje que contiene DAPI	Beyotime	P0131 (5 mL/25 mL)
DMEM (glucosa alta, con piruvato)	Invitrogen (Gibco)	11995-065
FBS (Calificado, origen estadounidense)	Invitrogen (Gibco)	A3160501
Microscopio fluorescente	Nikon	Serie ECLIPSE Ti2
Microtomo congelante (criostato)	Leica	CM1950
Portaobjetos de microscopio (simples, 25 y más veces; 75 mm)	CITOGLAS (Citotest)	0317-0001
Reactivo MTT (polvo)	Beyotime	ST316
Esmalte de uñas (transparente)	Beyotime	—
NBF (Formalina Neutral Buffered)	Beyotime	—
Compuesto OCT	SAKURA (Sakura Finetek)	4583
Microscopio óptico (vertical)	Nikon	Serie Ci de ECLIPSE (por ejemplo, Ci-L)
PBS (500 mL)	Beyotime	C0221A
PFA, 4% en PBS (fijador)	Beyotime	P0099
Punta de pipeta (1 mL, baja fijación)	KIRGEN	KG1313-L
Punta de la pipeta (200 y micro; L)	Axygen (Corning)	T-200-Y (a granel) / T-200-Y-R-S (racked, estéril)
Pipettor (canal único)	Thermo Fisher Scientific	Finnpipette F2 (cat# específico de rango)
Escalpelo	HISTERÍA	El modelo varía (por ejemplo, referencia del proveedor 100022208326)
Pinzas	HISTERÍA	El modelo varía