Artículo de método

Extracción de histonas de muestras clínicas para perfilado epigenético mediante espectrometría de masas

DOI:

10.3791/68584

⸱

21 de noviembre de 2025

 ,  , 
1Department of Experimental Oncology, IEO, European Institute of Oncology IRCCS, 2Department of Oncology and Hematology-Oncology (DIPO), University of Milan

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este protocolo permite la extracción eficiente de histonas de diversas muestras clínicas para el posterior análisis de modificaciones postraduccionales mediante LC-MS/MS. Al facilitar la detección robusta de modificaciones clave de histonas, sirve como una herramienta valiosa para un perfil epigenético integral en grandes cohortes clínicas.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Una amplia evidencia experimental apoya el papel de los mecanismos epigenéticos en el inicio, progresión y recurrencia del cáncer. Entre ellas, las variantes de histonas y sus modificaciones postraduccionales (PTM) regulan la organización y dinámica de la cromatina, así como la accesibilidad del genoma, influyendo así en procesos clave basados en el ADN, como la transcripción, replicación y reparación de daños en el ADN mediante el llamado código histona. Los patrones desregulados de la PTM de las histonas se observan frecuentemente en los cánceres, con algunos marcadores que han demostrado servir como biomarcadores diagnósticos y pronósticos. Por tanto, las metodologías novedosas que permiten un perfilado PTM de histonas sesgado y completo en muestras clínicas son de gran valor para caracterizar los paisajes epigenéticos de tumores. Aquí presentamos un protocolo para la extracción eficiente de histonas de muestras clínicas, incluyendo biopsias congeladas instantaneamente, congeladas a temperatura óptima de corte (OCT) y biopsias con parafina fijada en formalina (FFPE). Este enfoque proporciona proteínas de histonas de cantidad y calidad suficientes para el posterior análisis ascendente mediante cromatografía líquida de alto rendimiento acoplada a espectrometría de masas tándem (LC-MS/MS). Este flujo de trabajo permite la detección y cuantificación robusta de modificaciones clave de histonas, particularmente acetilaciones y metilaciones de lisinas, en muestras primarias de tumores, proporcionando una capa molecular adicional para la caracterización del cáncer.

Introducción

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

En el núcleo de las células eucariotas, las histonas se ensamblan con el ADN para formar los nucleosomas, las unidades estructurales fundamentales de la cromatina. Cada nucleosoma consta de aproximadamente 146 pb de ADN envuelto alrededor de un octámero compuesto por dos copias de histonas núcleo H2A y H2B, junto con dos dímeros de histonas H3 y H4. Además, también está presente una histona enlazadora H1 que facilita la organización de la cromatina de orden superior al unir tanto el estiramiento del ADN nucleosoma como el enlace entre losnucleosomas 1. Las histonas están decoradas con una gran variedad de modificaciones posttraduccionales (PTM) que están presentes principalmente en sus colas N-terminales. Estas modificaciones incluyen la metilación, varios tipos de acilación (acetilación, propionilación, butirilación, etc.), fosforilación, SUMOilación, ubiquitilación, ADP-ribosilación y crotonilación, entre las que la metilación y acetilación de lisina y arginina son las máscaracterizadas 2. Los tipos, ubicaciones y combinaciones específicas de modificaciones de histonas crean lo que se conoce como código de histona. Este código consiste en varias modificaciones postraduccionales (PTM) en las colas N-terminales de las histonas, que se añaden y eliminan mediante enzimas modificadoras específicas de histonas. Estas modificaciones son reconocidas por proteínas efectoras, lo que conduce a cambios en la estructura de la cromatina, como la compactación o la descondensación, influyendo finalmente en varios procesos biológicos, incluyendo la reparación de daños en el ADN, la replicación y, en particular, la transcripcióngénica 3,4.

La metilación del ADN y las PTM de histonas están entre las características epigenéticas más estudiadas en el cáncer3. Evidencias experimentales recientes han mostrado alteraciones en los niveles de diversas PTM de histonas en varios tipos de cáncer. Cabe destacar que la pérdida de H4K20me3 y H4K16ac se ha reportado como características del cáncer, ya que se encontró que su nivel es menor en prácticamente todos los tumores en comparación con los tejidosnormales 4. Nuestro grupo identificó la pérdida de H3K14ac como una posible característica del cáncer cuantificando su reducción en varios cánceres en comparación con los equivalentes normales utilizando enfoques basados en espectrometría de masas (EM). Además, numerosos estudios han destacado el valor pronóstico de las PTM de histonas, mostrando que las alteraciones en sus niveles globales, evaluadas principalmente mediante inmunohistoquímica en biopsias de pacientes, se correlacionan con la progresión del cáncer, la clasificación histológica y la respuesta terapéutica 6,7,8. Por ello, el análisis PTM de histonas en muestras de cáncer es importante para la identificación de nuevos biomarcadores diagnósticos y pronósticos, así como posibles objetivos de los llamadosepifármacos 8.

Métodos muy comunes para el análisis de PTM de histonas en líneas celulares y muestras clínicas se basan en técnicas basadas en anticuerpos, como inmunobloting, inmunohistoquímica y ensayo inmunoenzimático (ELISA)9. Sin embargo, los métodos basados en anticuerpos presentan diversas limitaciones, incluyendo la reactividad cruzada o, por el contrario, el enmascaramiento deepítopos 10. La reactividad cruzada ocurre cuando los anticuerpos se unen a objetivos no deseados con epítopos similares, lo que puede dar lugar a falsos positivos, mientras que el enmascaramiento de epítopos se refiere a la detección no detectada de un epítopo específico (una PTM o variante de histonas, en este caso) debido a la presencia de otras modificaciones en los residuos vecinos. Además, la cantidad de tejido requerida para el análisis de modificación de histonas mediante anticuerpos suele ser alta, ya que solo se puede detectar un número limitado de PTMs simultáneamente, por lo que varias cortes de tejido deben procesarse para análisismultiplexados 11. La espectrometría de masas (EM) ha surgido como el método preferido para perfilar las PTM y variantes de histonas, superando las limitaciones de los enfoques basados enanticuerpos 5,8. La EM se basa en la detección de una diferencia de masa (Δm, masa delta) entre las masas teóricas y medidas experimentalmente de péptidos y proteínas. Es imparcial, completo y cuantitativo, ya que permite la identificación y cuantificación de PTMs y variantes sin requerir conocimiento previo de su emplazamiento. Esto hace que la EM sea especialmente valiosa para el análisis sensible y preciso de los cambios de las PTM de las histonas en el cáncer y otras condicionespatológicas 8.

Aquí describimos un protocolo optimizado para la extracción de histonas de muestras clínicas, junto con el perfilado basado en esclerosis múltiple de las PTM de histonas, denominado posteriormente flujo de trabajo epi-proteómico. Las biopsias de pacientes se almacenan principalmente como muestras frescas congeladas (FF), muestras congeladas a temperatura óptima de corte (OCT) y muestras incrustadas con parafina fija enformalina (FFPE) 12. Mientras que las biopsias frescas se congelan rápidamente en nitrógeno líquido o isopentano preenfriado sin añadir ningún medio depreservación 13, las biopsias congeladas con OCT contienen un medio crioprotector soluble en agua, compuesto principalmente por alcohol polivinílico y polietilenglicol, que facilita el cortetisular 14. Las muestras de FFPE, por otro lado, fijadas en formol e incrustadas en parafina, representan el método de almacenamiento más común para muestras clínicas, ya que pueden almacenarse a temperatura ambiente durante varios años, evitando un mantenimiento costoso a temperaturas bajas o ultrabajas 15. Al estar libres de aditivos de conservación, las biopsias congeladas a golpe pueden procesarse directamente para la extracción de histonas, mientras que las biopsias congeladas por OCT y FFPE requieren pasos iniciales de eliminación del medio de incrustación/fijador. Las muestras de FFPE también requieren una extensa descruzización de proteínas y recuperación de antígenos.

Este protocolo describe métodos detallados para extraer histonas de muestras clínicas frescas congeladas, incrustadas en OCT y FFPE, asegurando cantidad y calidad suficientes para el análisis posterior de la EM teniendo en cuenta los desafíos específicos asociados a cada tipo de preservación de muestra (paso 1). Las histonas purificadas de muestras clínicas se separan mediante electroforesis en gel proteico en condiciones de desnaturalización (SDS-PAGE), seguidas de un paso de derivatización, y se digieren enzimáticamente para generar péptidos de una longitud adecuada (4-15 aminoácidos) para análisis de espectrometría de masasascendente 16 (paso 2). Más concretamente, las histonas se digieren con una estrategia similar a la ArgC, mediante la cual la tripsina, que normalmente corta en el C-terminal de lisinas (K) y argininas (R) no modificadas, se induce a cortar solo en el C-terminal de las argininas, debido a una acilación química previa de lisinas no modificadas y monometiladas con anhídrido propiónico (PRO). A continuación, los péptidos de histonas digeridos similares a Arg-C se acilan en sus colas N-terminales mediante la adición de fenocianato (PIC). Esta derivación adicional incrementa la hidrofobicidade peptídica y permite una mejor separación de péptidos cortos de histonas mediante cromatografía líquida de alta potencia en fase inversa (RP-HPLC), mejorando la identificación y cuantificación de peptidoformasisobáricos 17,18 (paso 3). En conjunto, los métodos descritos aquí destacan el poder del perfilado de histonas basado en la EM en los estudios de epigenética del cáncer.

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Protocolo

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Biopsias de tejido fresco congelado y congelado con OCT se obtuvieron bajo consentimiento informado de pacientes sometidos a cirugía en el Instituto Europeo de Oncología (Milán), mientras que las biopsias FFPE se obtuvieron de pacientes operados en el Istituto Neurológico Carlo Besta (Milán). Este estudio fue aprobado por el Comité Ético del Instituto Europeo de Oncología (Estudio UID 2550) y del Instituto Neurológico Carlo Besta (Estudio CET 39/24).

1. Extracción de histonas de tejidos derivados del paciente (Figura 1A)

NOTA: Para analizar histonas de poblaciones representativas de células tumorales y reducir la variabilidad entre muestras, se recomienda utilizar biopsias clínicas con una cellularidad tumoral de al menos el 50% y sin áreas necróticas y/o infiltración inmunitaria extensa.

  1. Enriquecimiento de histonas a partir de tejidos frescos congelados (duración estimada: 60 min)
    NOTA: Todos los pasos deben realizarse sobre hielo.
    1. Descongela el tejido sobre hielo y corta un trozo de aproximadamente 20-30 mg, normalmente correspondiente a unos 2mm3 de tejido.
    2. Transfiere la muestra a un tubo de 1,5 mL y pica el tejido en pequeños trozos usando tijeras (Tabla de Materiales).
    3. Añadir 1 mL de Buffer de Aislamiento de Núcleos (Tabla 1) recién suplementado con los inhibidores de proteasas listados en la Tabla de Materiales. Mezcla bien después.
    4. Transfiere la muestra a un homogeneizador de Dounce (Tabla de Materiales).
      NOTA: En presencia de grandes piezas de tejido, utiliza una punta p1000 (al cortar la punta con tijeras) para recoger mejor la muestra.
    5. Homogeneiza el tejido usando primero el mano LOOSE y luego el MESTRE (Tabla de Materiales) hasta que los fragmentos de tejido sean invisibles a simple vista.
    6. Filtrar la muestra homogeneizada mediante un colador celular de 100 μm (Tabla de Materiales) para eliminar los restos del tejido.
    7. Pipetea vigorosamente arriba y abajo con un p200 para disolver la membrana plasmática y transferir la muestra a un nuevo tubo de 1,5 mL.
    8. Pelletar los núcleos celulares mediante centrifugación a 2.300 x g durante 15 minutos a 4 °C utilizando una centrífuga de banco (Tabla de Materiales).
    9. Desechar el sobrenadante y volver a suspender los pastillazos nucleares en 50-100 μL de Amortiguador de Aislamiento de Núcleos, suplementado con SDS al 0,1% para disolver la membrana nuclear (Tabla de Materiales).
    10. Añade 250 U de nucleasa de Benzonasa para digerir los ácidos nucleicos, mezcla bien e incuba durante 2 minutos a 37°C (Tabla de Materiales).
      NOTA: Si la muestra sigue viscosa, la sonicación también puede realizarse en baño maria (ajuste: 10 min 30s ENCENDIDO/30s APAGADO; potencia: alta; temperatura: 4 °C). Tras este paso, las muestras pueden almacenarse a -20 °C.
  2. Enriquecimiento de histonas a partir de muestras OCT (duración estimada: 90 min)
    NOTA: Este protocolo ha sido optimizado para cuatro o cinco secciones OCT de 10 μm de grosor correspondientes a 20-60 mg de tejido. Sin embargo, el número de secciones de tejido depende del tipo de biopsia clínica y del área total del tejido. Teniendo en cuenta la escasez de muestras clínicas, se puede extraer de una menor cantidad de tejido inicial, aunque esto pueda resultar en una disminución en la detección de modificaciones de histonas.
    1. Coloque cuatro o cinco secciones de tejido de 10 μm de grosor, correspondientes a aproximadamente 20-60 mg de tejido, en un tubo de 1,5 mL.
    2. Lava las secciones con 1 mL de EtOH al 70% helado (Tabla 1) durante 2 minutos en una rueda giratoria (Tabla de Materiales) a 4 °C.
    3. Centrifugar a 16.000 x g durante 2 minutos a 4 °C en una centrífuga de sobremesa.
    4. Repite los pasos 1.2.2 y 1.2.3 un total de 3 veces.
    5. Rehidratar las muestras en 1 mL de agua doble destilada (ddH2O) con rotación (Tabla de Materiales) durante 2 minutos a 4 °C.
    6. Centrifugar a 16.000 x g durante 2 minutos a 4 °C en una centrífuga de mesa (Tabla de materiales).
    7. Repite los pasos 1.2.5 y 1.2.6 dos veces con 1x PBS (Tabla de Materiales).
    8. Procede al paso 1.1.2 del protocolo de enriquecimiento a partir de muestras frescas congeladas.
  3. Extracción de histonas a partir de muestras de FFPE (duración estimada: 8 h)
    NOTA: El protocolo descrito se ha desarrollado para cuatro secciones de FFPE de 10 μm de grosor que corresponden aproximadamente a 20-60 mg de tejido. Para la mayoría de los análisis MS de modificaciones de histonas, esta cantidad es excesiva y representa un punto de partida seguro cuando el material no es limitante. Sin embargo, también se puede utilizar menos material inicial, lo cual es especialmente relevante teniendo en cuenta la cantidad de tejido disponible al analizar muestras clínicas. El uso de menos material inicial, aunque factible, suele reducir la robustez a la cuantificación para modificaciones de histonas de baja abundancia (por ejemplo, H3K27ac o péptidos H3K27/K36 multimetilados), y este efecto puede variar según el tipo de tejido, así como de una muestra a otra. No obstante, nuestro laboratorio ha demostrado previamente que el perfilado PTM basado en EM puede realizarse con éxito a partir de áreas de tejido microdisecado con láser de muestras de cáncer de mama (FFPE) correspondientes a tan solo 1.000 células18.
    1. Coloque cuatro secciones de FFPE de 10 μm de grosor, correspondientes a aproximadamente 20-60 mg de tejido, en un tubo de 1,5 mL.
    2. Añadir 1 mL de agente disolvente de parafina a la muestra y al vórtice (Tabla de Materiales) a velocidad máxima durante 30 s, hasta que la parafina se disuelva completamente.
      PRECAUCIÓN: Los reactivos disolventes de parafina son mutagenos, cancerígenos e inflamables, por lo que deben usarse bajo una capucha química.
      NOTA: La disolución de parafina se logra cuando las piezas de parafina ya no son visibles a simple vista, y el agente disolvente de parafina tiene un color blanquecino y homogéneo.
    3. Centrifugar 16.000 x g durante 3 minutos a RT en una centrífuga de sobremesa y descartar el sobrenadante. Para evitar aspiraciones de muestras indeseables durante la extracción de sobrenadante, la bomba/pipetas de vacío puede taparse con una punta más pequeña (por ejemplo, p200, p10).
    4. Repite los pasos 1.3.2 y 1.3.3 tres veces más (4 veces en total) para asegurar la eliminación completa de parafina. Alternativamente, pesa la muestra completamente desparafinizada para obtener una lectura indicativa de la cantidad de tejido procesada.
    5. Añadir 1 mL de solución de EtOH al 95% (Tabla 1) y vórtice a velocidad máxima durante 30 s, para asegurar una resuspensión completa del tejido.
    6. Centrifugar 16.000 x g durante 3 minutos a RT en una centrífuga de sobremesa y descartar el sobrenadante. Alternativamente, pesa la muestra deshidratada para tener una medida indicativa de la cantidad de tejido seco procesado.
    7. Repite los pasos 1.3.5 y 1.3.6 con 70%, 50% y 20% de EtOH (Tabla 1) y ddH2O para rehidratar la muestra.
    8. Añadir 200 μL de buffer de extracción (Tabla 1).
      NOTA: Si hay trozos de tejido más grandes, córtalos en trozos más pequeños con tijeras. Dependiendo de la cantidad de tejido, se pueden añadir volúmenes más pequeños o mayores de buffer de extracción para asegurar una correcta lisis de la muestra. Para pellets particularmente pequeños resuspendidos en un volumen de buffer de extracción inferior a 100 μL, la sonicación puede realizarse usando un dispositivo de sonicación (Tabla de Materiales) (30 s ENCENDIDO/30 s APAGADO de potencia: alto, 10 ciclos).
    9. Homogeneizar tejido en el tampón de extracción mediante sonicación usando un sonificador digital (Tabla de Materiales) con una micropunta de 3 mm (>15 ciclos, 5s ENCENDIDO/2 min APAGADO, potencia: 15-30%).
      NOTA: Las muestras pueden considerarse correctamente homogeneizadas cuando no hay partículas de tejido visibles en la solución y el tampón de extracción presenta un color uniforme y no turbio. Mantén las muestras en RT durante los ciclos de sonicación. El hielo puede causar precipitación de SDS en el tampón de extracción, perjudicando así la homogeneización del tejido. La sonicación adecuada es crucial para lograr la lisis completa del tejido y la extracción de proteínas. Coloca la micropunta a la altura correcta en el tubo de muestra (no debe tocar el fondo del tubo, liberando partículas plásticas, y no debe estar en la interfaz de extracción de aire, creando espuma y burbujas).
    10. Tras la homogeneización, incubar muestras a 95 °C durante 45 minutos en un termomezclador. Cada 15 minutos, abre la tapa de los tubos para permitir que el formaldehído se evapore.
    11. Incubar muestras a 65 °C durante 4 horas en un termomezclador. Abre la tapa cada 20-60 minutos para que el formaldehído se evapore.
    12. Centrifugar 16.000 x g durante 1 minuto en RT en una centrífuga de sobremesa y transferir el sobrenadante a un tubo nuevo.
      NOTA: Las muestras pueden almacenarse a -20 °C en este punto.

Tabla 1: Composición del buffer. Por favor, haz clic aquí para descargar esta tabla.

2. Resolución de histonas mediante SDS-PAGE y digestión en gel

  1. SDS-PAGE (Figura 1B; duración estimada: 2 h)
    1. Para evaluar la pureza de las histonas y estimar su cantidad, se carga 1/10 de los extractos de histonas sobre un gel de poliacrilamida al 17% (SDS-PAGE; Tabla 1) junto con cantidades conocidas de histonas recombinantes, como se ilustra en la Figura 1B.
      NOTA: En lugar de cargar 1/10 de extractos de histonas, se pueden cargar entre 15 y 50 μg de proteínas, medidas mediante ensayos que toleran altas concentraciones de detergente, como el ensayo proteico19 del ácido bicincónico (BCA). Sin embargo, tenga en cuenta que el enriquecimiento de histonas sobre proteínas totales puede variar significativamente entre muestras frescas congeladas, congeladas en OCT y FFPE, y la cuantificación de la cantidad de histonas solo puede basarse en SDS-PAGE. Se pueden cargar 1, 0,5 y 0,25 μg de histona recombinante H3.1 (Tabla de Materiales) como referencia para cuantificar la cantidad de histonas con mayor precisión.
    2. Mezclar las muestras con buffer de carga de dodecil sulfato de litio (LDS), o con buffers de carga equivalentes para SDS-PAGE (por ejemplo, buffer de Laemmli) añadiendo ditiotreitol (DTT; Tabla de Materiales) a una concentración final de 10 mM.
    3. Desnaturaliza muestras a 95°C durante 5 minutos en un termomezclador.
    4. Tras la separación de proteínas en la SDS-PAGE, teñe el gel con tinción de Coomassie (Tabla de Materiales).
    5. Estimar el rendimiento de histonas mediante cuantificación visual o asistidapor software de 20 bandas de histonas en muestras clínicas en comparación con histonas recombinantes H3 cargadas en cantidades conocidas.
  2. Digestión en gel de histonas (Figura 2; duración estimada: 2 días)
    NOTA: La digestión tipo ArgC se emplea para el análisis en esclerosis múltiple de las PTM de histonas porque la digestión estándar de tripsina genera péptidos excesivamente cortos, debido a la alta frecuencia de aminoácidos lisina y arginina en su secuencia, lo que dificulta la detección de péptidos por LC-MS y la identificación de PTM. Al modificar químicamente las lisinas, se evita la clivación tríptica en estos sitios, lo que resulta en la clividad en el extremo C de las argininas, produciendo péptidos más largos (4-15 aminoácidos) que contienen lisinas modificadas dentro de la secuencia; en general, este protocolo facilita la detección y medición de péptidos modificados de histonas en EM y ha sido descrito en profundidad en numerosas publicaciones8,17,21.
    OPCIONAL: Un estándar interno (por ejemplo, péptidos marcados sintéticamente con spik-in y marcados con pico en fuerte22) puede mezclarse con muestras de histonas en una proporción 1:1 para lograr una cuantificación de péptidos más precisa en MS (Figura 2B).
    1. Carga entre 3 y 5 μg de muestra de histonas en un gel de poliacrilamida al 17%, basándose en la cuantificación estimada de histonas realizada en el Paso 2.1.5 (Figura 2B).
    2. Después de SDS-PAGE, visualiza las proteínas teñiendo el gel con la tinción de Coomassie.
      NOTA: Para evitar contaminaciones que puedan interferir con el análisis LC-MS/MS, es recomendable realizar los siguientes pasos en un entorno libre de queratina, como una campana dedicada, ya que la queratina es un fuerte contaminante de EM.
    3. Bandas de gel de extirpe correspondientes al peso molecular de las proteínas de histonas centrales (banda de gel entre 10 y 18 kDa, considerando el siguiente peso molecular para cada histona central: H3 aproximadamente 17 kDa, H2A-H2B aproximadamente 14 kDa, H4 aproximadamente 11 kDa) usando un bisturí (Tabla de Materiales) y bandas cortadas en piezas de aproximadamente 1mm 3 cada una.
    4. Con la ayuda del bisturí, transfiere las piezas de gel a un tubo de 1,5 mL.
      NOTA: Para cubrir completamente las piezas de gel, se pueden aumentar los volúmenes indicados a continuación, manteniendo la estequiometría del reactivo.
    5. Elimina los fragmentos de gel añadiendo una solución de acetonitrilo al 50% (ACN) en ddH2O(Tabla 1). Coloca en un termomezclador a 1.400 rpm durante 10 minutos de RT y desecha el sobrenadante después.
    6. Repite el paso 2.2.5 hasta que las piezas de gel estén completamente desmanchadas.
    7. Deshidrata las piezas de gel añadiendo 100% de ACN (Tabla de Materiales). Incuba mezclando a 1.400 rpm durante 10 minutos de descanso y descarta el sobrenadante después.
    8. Repite el paso 2.2.7 hasta que las piezas de gel parezcan blancas y duras, por lo tanto completamente deshidratadas.
    9. Seca las piezas de gel durante 5 minutos en RT en una centrífuga al vacío (Tabla de materiales).
      NOTA: Las histonas son pobres en cisteinas (solo dos cisteinas se encuentran en la histona H3 en las posiciones 96 y 110 (UniprotKB ID P68431), y solo una cisteína se encuentra en la histona H2B en la posición 154 (UniprotKB ID B4DR52)). Además, estas cisteinas están presentes en péptidos que no se detectan en la digestión similar al ArgC en la esclerosis múltiple de abajo hacia arriba, por lo que los aductos químicos de los grupostiol 23 no son un artefacto en el análisis de histonas por EM, y no se realizan pasos de reducción y alquilación de cisteína en el protocolo descrito.
    10. Añadir 15 μL de 7,7 M de solución de anhídrido propiónico (PRO) (Tabla de Materiales) y 26 μL de 1 M de bicarbonato de amonio (AmBic) (Tabla de Materiales) a cada tubo e incubar muestras en un termomezclador fijado a 350 rpm durante 10 minutos a 37 °C.
      NOTA: Dado que los anhídridos disueltos en un tampón reactivo tienden a evaporarse, no prepares una mezcla maestra de PRO y AmBic, sino añádelos individualmente a cada muestra, para mantener constante la concentración adecuada de PRO en cada tubo.
    11. Cubre completamente las piezas de gel añadiendo 1 M AmBic (volumen recomendado: 80 μL) e incuba las muestras mezclando a 1.400 rpm durante 4 horas a 37°C en un termomezclador. Retira todo el líquido después.
      NOTA: Se añade 1 M AmBic para mantener un pH básico, ideal para catalizar la propionilación de lisinas no modificadas y monometiladas mediante PRO.
    12. Lava tres veces con ddH2O, incubando muestras entre medias a RT durante 10 minutos mientras mezclas en un termomezclador a 1.400 rpm. Desecha el líquido después de cada lavado.
    13. Añade un 50% de ACN e incuba en un termomezclador a 1.400 rpm durante 15 minutos en RT. Luego descarta el líquido.
    14. Deshidrata completamente las piezas de gel añadiendo 100% de ACN e incuba a 1.400 rpm durante 15 minutos en RT en un termomezclador. Desecha el líquido después.
    15. Repite el paso 2.2.14 hasta que las piezas de gel parezcan blancas y secas.
    16. Piezas de gel seco 5 minutos en RT en una centrífuga de vacío.
    17. Añadir a cada muestra 4 μL de solución de tripsina (Tabla 1) y 20 μL de tampón de digestión (Tabla 1) e incubar 10 minutos sobre hielo para permitir la absorción de tripsina en fragmentos de gel.
      NOTA: Esta incubación —realizada con solución concentrada de tripsina y buffer de digestión (50 mM AmBic en ddH2O, creando un pH básico ideal para la escisión de tripsina)— permite que la enzima sea absorbida por las piezas de gel antes de su activación a 37 °C.
    18. Cuando la tripsina concentrada esté completamente absorbida, cubre bien las piezas de gel con un buffer de digestión adicional (volumen indicativo: 80 μL) e incuba a 37 °C durante la noche en un termomezclador.
    19. Para extraer péptidos digeridos de los fragmentos de gel, añade 100 μL de ACN al 100% e incuba a 1.400 rpm durante 20 minutos en RT en un termomezclador.
    20. Recoge el sobrenadante y transfierlo a un tubo nuevo de 1,5 mL.
    21. Añade 80 μL de 100% de ACN a piezas de gel e incuba a 1.400 rpm durante 10 minutos de RT en un termomezclador.
    22. Recoge el sobrenadante y lo agrupa con el recogido en el Paso 2.2.20, luego concentra los péptidos en una centrífuga de vacío a un volumen entre 1 y 5 μL.
      NOTA: El uso de una centrífuga de vacío permite la evaporación del disolvente orgánico (ACN). Sin embargo, se recomienda no secar completamente la muestra en esta etapa, ya que esto podría afectar negativamente al siguiente paso de derivatización. Si la muestra se seca, resuélvela en ddH2O de agua y sónica en baño maria durante 5 minutos.
    23. AñadirddH 2O a cada muestra, hasta un volumen final de 15 μL, luego añadir 2 μL de 1 M trietilamonio bicarbonato (Tabla de Materiales) y 3 μL de solución de fenocianato (PIC) (Tabla 1) e incubar a 350 rpm durante 90 minutos a 37 °C en un termomezclador.
      PRECAUCIÓN: La PIC es mutagénica y cancerígena, por lo que se recomienda manipularla bajo un protector químico. Dado que el PIC es altamente reactivo y volátil, se recomienda evitar preparar una mezcla maestra de bicarbonato de trietilamio y PIC, pero es recomendable añadir cada reactivo individualmente para asegurar la presencia exacta de la concentración de PIC.
    24. Añadir a cada tubo 8 μL de ácido trifluoroacético al 1 % (TFA; Tabla de Materiales) para detener la derivatización con PIC.
    25. Diluir cada muestra con 100 μL de Buffer A (Tabla 1) y cargarlas sobre las puntas de la etapa C18 (preparadas como se describe enel 24 o adquiridas a diferentes proveedores).
    26. Centrifugar las muestras a 2.100 x g durante 10 minutos a 4 °C en una centrífuga de rotor oscilante para permitir que los péptidos de histonas se unan a la resina C18.
      NOTA: Las muestras pueden almacenarse en las puntas del escenario a 4 °C durante varios meses.
    27. Añade 30 μL de buffer de elución (Tabla 1) a las puntas de etapa C18 y coloca las puntas en un tubo nuevo de 1,5 mL. Centrifugar muestras a 1.000 x g durante 10 minutos en una centrífuga de mesa a 4 °C para eluir péptidos de histonas.
    28. Concentra las muestras a un volumen entre 1 y 3 μL usando una centrífuga al vacío, luego añade un 1% de TFA para alcanzar un volumen final de 6 μL.
    29. Carga 5 μL de solución peptídica en una microplaca de 96 pozos para el análisis de la EM (Tabla de Materiales) y sella con una manta de sellado (Tabla de Materiales).

3. HPLC-MS/MS y análisis de datos (Figura 3)

NOTA: Los parámetros aquí descritos son adecuados para un sistema de cromatografía líquida ESAY-nLC 1200 conectado mediante una columna de pulverización EASY a un espectrómetro de masas Q Exactive Plus Orbitrap (Tabla de Materiales), pero también pueden usarse instrumentos similares o equivalentes, con parámetros ad hoc.

  1. HPLC-MS/MS (duración estimada: 90 min por muestra)
    1. Inyectar 3 μL de los péptidos de histonas de 5 μL del paso 2.2.29 (correspondientes aproximadamente a 0,25-0,8 μg, según la cuantificación de histonas por SDS-PAGE) en una nanocolumna de C18 (Tabla de Materiales) a un flujo constante de 500 nl/min en el Buffer A.
    2. Aplicar un gradiente lineal de 55 minutos de 10%-45% de Buffer B a un caudal de 250 nL/min para separar los péptidos.
    3. Adquiere los datos de MS/MS en modo dependiente de datos (DDA) para cambiar automáticamente entre MS1 y MS2 utilizando los paquetes de software dedicados (Table of Materials).
      NOTA: Para la adquisición y configuraciones generales, consulte la Tabla 2.
  2. Análisis de datos RAW MS
    NOTA: En este protocolo, la cuantificación de las PTM de histonas se realiza utilizando EpiProfile, un script abierto (https://github.com/zfyuan/EpiProfile2.0_Family), fácil de usar y adecuado para análisis estándar como los descritos para metilaciones y acetilaciones de lisina H3 y H4. Sin embargo, EpiProfile puede personalizarse para realizar análisis de modificaciones menos estándar y sobre diferentes protocolos de preparación de muestras por parte de usuarios más experimentados. Ten en cuenta que EpiProfile requiere una licencia MATLAB paraoperar en 25.
    1. Analizar los datos RAW adquiridos con el software EpiProfile 2.0 (versión PRO-PIC)25 (Tabla de Materiales) y cuantificar los péptidos de histonas seleccionando las opciones histone_normal, cuando el análisis se realiza sin marcador, y histone_SILAC, cuando se utiliza el spike-in SUPER-SILAC. Establecer ndebug = 0.
    2. Para cada péptido de histonas (por ejemplo, H3_3-8), calcular la abundancia relativa (%RA) de cada peptidoforma modificado (por ejemplo, H3_3-8 unmod, me1, me2, me3) dividiendo su cromatógrama iónico extraído (XIC) calculado por EpiProfile por la suma de todos los XIC calculados para ese péptido.
      NOTA: Opcionalmente, los XIC calculados por EpiProfile pueden validarse mediante la inspección de espectros de MS y la cuantificación manual de péptidos de histonas utilizando un diseño de espectros dedicado, como se describe en18,26.
    3. Para cada peptidoforma, calcular la relación ligero-pesado (L/H) dividiendo el %RA de cada péptido nativo y ligero por el %RA del péptido pesado correspondiente derivado de la mezcla SUPER-SILAC, insertado en cada muestra.
    4. Transforma las proporciones L/H en una escala logarítmica. Para destacar diferencias significativas en la abundancia de peptidoformos entre muestras, se puede realizar un análisis estadístico y representar visualmente las proporciones L/H en todas las muestras mediante mapas de calor y diagramas de dispersión, como en la Figura 4.

Tabla 2: Lista de los ajustes de adquisición y del ajuste general empleado para LC-MS/MS con el sistema utilizado en este protocolo. Por favor, haz clic aquí para descargar esta tabla.

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Resultados

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Hemos realizado la extracción de histonas de muestras frescas congeladas y congeladas de cáncer de mama OCT y de muestras de meningioma FFPE siguiendo el protocolo mencionado anteriormente. Como se ilustra en la Figura 1A, para muestras congeladas, eliminamos el OCT, cuando estaba presente, y homogeneizamos las muestras en un tampón de aislamiento de núcleos que contenía un detergente suave (0,1% paso de Tritón 1.1), permitiendo aislar núcleos. A continuació...

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Discusión

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El método descrito aquí proporciona un flujo de trabajo sencillo y robusto para aislar de manera eficiente histonas de muestras clínicas almacenadas como biopsias congeladas frescas, congeladas por OCT y FFPE para el perfilado de sus paisajes de modificación mediante análisis de EM. El protocolo posterior de preparación de muestras mediante separación SDS-PAGE y digestión en gel PRO-PIC con tripsina garantiza la eliminación efectiva de detergentes, sales y otros contaminantes de la

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Divulgaciones

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores no declaran conflictos de interés.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Reconocemos a cirujanos y clínicos del Instituto Europeo de Oncología y del Instituto Neurológico Carlo Besta por realizar biopsias de tejido congelado FF, OCT y FFPE. Agradecemos a Roberta Noberini la discusión científica y metodológica durante la preparación del manuscrito y nuestras financiaciones: PRIN2022 (CUPG53D23001530006), AIRC (número de subvención IG-2023-28767) y Fondazione IEO-Monzino (FIEORDT-2023-BONALDI).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Químicos
Histolemon RS para HistologíaCarlo Erba4549122,5 L
Acetonitrilo (ACN)Carlo Erba4123411L
Bicarbonato de amonio (AmBic)Sigma AldrichA6141500 g
Persulfato de amonio (APS)WDR1.012.010.500500 g
Inhibidor de la proteasa de aprotininaSigma Aldrich y Sigma Aldrich;A11535 mg
Nucleasa de la benzonasaMerkE101425 KU
Bisacrilamida 30% 37,5 MAppliChemAPA362610001 L
Amortigua A 0,1 % de ácido fórmico en ddH2OThermo Fisher Scientific10229884500 mL 
Buffer B 0,1 % ácido fórmico / 80% acetonitrilo en ddH2OThermo Fisher Scientific15431423500 mL
Resina C18Merck66883-U47 mm de diámetro
Coomassie Instant BlueAbcamab1192111 L
Ditioreitol (DTT) WDR441496P25 g
EtanolCarlo Erba4146082,5 L
Leuceptina y leupepina; Inhibidor de la proteasaSigma-Aldrich & nbsp;L85115 mg
N,N,N′,N′-tetrametil etilendiamina (TEMED)Sigma Aldrich1.107.320100100 mL
Búfer de ejemplo LDS de NuPAGEInvitrogenNP00074x
PBS - Suero tamponado con fosfato & nbsp;MicroGemTL1006500 mL
Fenoilianato (PIC)Sigma Aldrich185353100 g
Inhibidor de la proteasa de fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF)Sigma Aldrich y Sigma Aldrich;P76261 g
Anhídrido propiónico (PRO)Sigma Aldrich24031150 g
Histona Recombinante H3.1 HumanoNew England BiolabsM25031 & micro; G/& Micro; L
Tripsina de grado secuenciadorPromegaV5113100 ug
Inhibidor de la histona deacetliasa de butirato de sodio (NaBut)MerckB58875 g
Dodecilsulfato de sodio (SDS)Sigma AldrichL3771100 g
Bicarbonato de trietilamonioSigma AldrichT7408100 mL
Ácido trifluoroacético (TFA)Thermo Fisher Scientific289041x10mL
Tris-HClSigma AldrichT3253100 g
Detergente Triton X-100Sigma-Aldrich & nbsp;X100RS5 g
Kits/ Equipo/Software
Microplaca de 96 pozosCorningPCR-96-FS-CNo pirogénico, libre de Rnase/Dnase
EquilibrarKern19024
Centrífuga de mesaLaboratorio de Biofugas HareusPico, 23396
Dispositivo de Sonicación BioruptorDiagenodo
Sonificador Digital de Branson 250Emerson
Colador celular 100 y micro; mHalcón352360
Concentrador plusEppendorf5305000509
Homogeneizador de Dounce (por ejemplo y nbsp; Dounce, Wheaton...)Dounce, WheatonTriturador de tejido de 1 mL
Cromatografía líquida EASY-nLC 1200Thermo Fisher Scientific
Columna HPLC C18 de EASY-SprayThermo Fisher ScientificES9022 & micro; m, 100 y 10 años; Å, 75 µ m x 25 cm
Script EpiProfile2.0https://github.com/zfyuan/EpiProfile2.0_Family
Software de Fiyihttps://imagej.net/software/fiji/downloads
MATLABhttps://www.mathworks.com
Motor de búsqueda MaxQuanthttps://maxquant.net/maxquant/
Mortero A (suelto)Dounce, Wheaton
Pestel B (apretado)Dounce, Wheaton
Sistema Q Exactive Plus Orbitrap LC-MS/MSThermo Fisher Scientific
Rueda giratoriaThermo Fisher Scientific11496548
EscalpeloKiato13010
TijerasThermo Fisher Scientific15207266
Tapete de selladoCorningAM-96-PCR-RDCompatible con automatización
Centrífuga de rotor basculanteBeckman coulterAllegra X-15R
Compacto termomezcladorEppendorf5350
VórticePBIVibromix
Software XcaliburThermo Fisher ScientificOPTON-30965

Referencias

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