Artículo de método

Uso de las herramientas de optogenética LEXY y LINuS y análisis automatizado de imágenes para cuantificar la dinámica de transporte nucleocitoplasmático en células vivas

DOI:

10.3791/68585

⸱

22 de julio de 2025

 , 
1Institut de Génétique Humaine (IGH), Université de Montpellier, CNRS, UMR9002

En este artículo

Resumen

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Este protocolo describe cómo configurar y realizar análisis automatizados de manera eficiente de datos de imágenes de células vivas obtenidos a partir del seguimiento del transporte nucleocitoplasmático a través de herramientas optogenéticas.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El transporte nucleocitoplasmático (NCT) es esencial para mantener la homeostasis celular, y su interrupción está implicada en diversas enfermedades, como los trastornos neurodegenerativos y la esclerosis lateral amiotrófica. Esto subraya la necesidad de desarrollar herramientas para monitorear y cuantificar la NCT. Entre estas herramientas, las sondas optogenéticas rápidas y reversibles, LEXY (sistema de exportación nuclear inducible por luz) y LINuS (señal de localización nuclear inducible por luz), permiten medir la dinámica de NCT en células vivas.

Las publicaciones originales describen la segmentación manual y la cuantificación de la señal de la sonda fluorescente en el núcleo y el citosol tras la transfección de las construcciones LEXY y LINuS en imágenes de células vivas. Sin embargo, tanto la transfección como la segmentación manual limitan el número de celdas que se pueden analizar y están sujetas a imprecisión debido a posibles errores dependientes del usuario. Si bien la alta velocidad y la reversibilidad proporcionadas por la optogenética deberían, en principio, permitir una alta sensibilidad en la detección de cambios en la dinámica de la NCT, depende de los parámetros de adquisición y el análisis de un número suficiente de células.

Por lo tanto, hemos establecido vectores lentivirales que expresan LEXY y LINuS para crear líneas celulares estables, hemos probado marcadores de imágenes en vivo y condiciones de control, e implementamos una línea de análisis de imágenes semiautomatizada que permite el análisis de cientos de células. Este método de análisis utiliza el software de acceso abierto FIJI, es accesible para principiantes en bioinformática y no requiere configuraciones informáticas avanzadas. Aquí proporcionamos un protocolo paso a paso para configurar LEXY como un ejemplo de estas herramientas optogenéticas para monitorear la exportación nuclear, desde la preparación de las muestras hasta la adquisición de imágenes de células vivas y el análisis automatizado, mientras demostramos cómo adaptar el protocolo a otras condiciones, controles o modelos en cualquier laboratorio. Todos los plásmidos y líneas celulares utilizados en este protocolo se pondrán a disposición de la comunidad científica, lo que aumentará aún más la accesibilidad del método.

Introducción

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La importancia del transporte nucleocitoplasmático (NCT) para regular las vías celulares clave y mantener la homeostasis celular ha sido bien estudiada en los últimos años1. En consecuencia, se generaron varias herramientas para estudiar la dinámica de la NCT 2,3,4. Entre estas herramientas, las sondas optogenéticas LINuS5 y LEXY6, publicadas respectivamente en 2014 y 2016, proporcionan una forma poderosa de monitorear NCT en células vivas. Estas herramientas, diseñadas para seguir la exportación inducible (LEXY) o la importación (LINuS) de un indicador fluorescente, son inducibles por exposición a la luz azul y reversibles.

En resumen, estas dos pequeñas sondas utilizan las propiedades del dominio LOV2 de la proteína fototropina-1 de la planta Avena sativa7. En ausencia de luz azul, la hélice Jα del dominio LOV2 se fotojaula y se incrusta en el núcleo de la proteína. Como la hélice Jα puede responder a los estímulos luminosos, la iluminación por luz azul induce un cambio conformacional y el posterior desacoplamiento de la hélice Jα del dominio LOV2. Los autores de LEXY y LINuS utilizaron esta sensibilidad a la luz para fusionar una señal de localización nuclear (NLS) o una señal de exportación nuclear (NES) a la hélice Jα, para LINuS y LEXY, respectivamente (Figura 1). La herramienta resultante es una sonda que se transloca al núcleo (LINuS) o al citosol (LEXY) tras la iluminación con luz azul.

Para rastrear las sondas con imágenes fluorescentes, también se agregó un reportero fluorescente mCherry a las construcciones. Finalmente, se añadió al sistema un NES débil (para LINuS) o NLS (para LEXY) para garantizar que las sondas no estuvieran en su localización final antes de la iluminación con luz azul, lo que evitaría observar la translocación de LEXY o LINuS entre el núcleo y el citosol.

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Figura 1: Representación de las sondas LEXY y LINuS. Ambas sondas constan de una proteína mCherry fusionada con el dominio LOV2 sensible a la luz. La diferencia entre las dos herramientas reside en la secuencia de señalización oculta por la hélice Jα: una NES para LEXY y una NLS para LINuS. Ambas sondas también poseen una secuencia de señal débil para controlar su localización inicial: un NLS débil para LEXY y un NES débil para LINuS. Por lo tanto, la activación de los sistemas mediante iluminación con luz azul induce su exportación para LEXY o su importación para LINuS, lo que permite a los usuarios controlar la exportación o importación nuclear. Abreviaturas: LEXY = sistema de exportación nuclear inducible por luz; LINuS = señal de localización nuclear inducible por luz; NLS = señal de localización nuclear; NES = señal de exportación nuclear. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

La localización de la fluorescencia mCherry informa de la transmisión de las sondas LEXY y LINuS entre los núcleos y el citosol, por lo que puede seguirse en imágenes de células vivas, lo que permite a los usuarios monitorizar la NCT. Además de ser utilizados como sondas simples, LEXY y LINuS también pueden ser diseñados para controlar la localización y estudiar proteínas de interés, in vitro 5,6,8,9 o in vivo 10,11.

El método de cuantificación propuesto en las publicaciones de LEXY y LINuS muestra la intensidad nuclear relativa de las sondas. El análisis sugerido se realiza manualmente y se basa en la medición de una región de interés (ROI) en el núcleo y el citosol. Aunque este método proporciona una buena representación de la señal de la sonda a lo largo del tiempo, es muy largo y tedioso, especialmente cuando se repiten experimentos y condiciones. Es importante destacar que este método también carece de precisión, ya que solo se representa una pequeña parte del compartimento diseñado.

Aquí proponemos un nuevo protocolo para la cuantificación de señales fluorescentes LEXY y LINuS. Implementamos técnicas automatizadas, que facilitan los análisis y proporcionan una mayor precisión. Esto facilitará el proceso para los nuevos usuarios de estas herramientas y ayudará a aumentar el rendimiento. Nuestro protocolo de cuantificación utiliza una sola interfaz, el plugin de código abierto TrackMate12 de FIJI. En particular, para mejorar la fiabilidad de las cuantificaciones, utilizamos un marcador de ADN rojo lejano compatible con imágenes en vivo para realizar la segmentación de todo el núcleo con StarDist13, una red neuronal convolucional entrenada, combinada con el seguimiento y la medición de la señal fluorescente de la sonda con TrackMate12.

Los datos obtenidos se pueden exportar fácilmente a la hoja de cálculo provista y lista para usar (Tabla Suplementaria S1) para obtener la intensidad nuclear relativa de cada núcleo identificado. Este protocolo también explica cómo agrupar los valores obtenidos en un gráfico ajustando la curva de curso de tiempo obtenida a un modelo monoexponencial, como en Yoo y Mitchison14 y cómo calcular la velocidad de transporte para las diferentes condiciones probadas. Con este protocolo y la hoja de cálculo proporcionada para el análisis, los usuarios podrán cuantificar fácilmente los datos de imágenes de células vivas, incluso con habilidades bioinformáticas limitadas.

Protocolo

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NOTA: Se describe el siguiente protocolo para monitorear la exportación nuclear con la sonda de LEXY. En la sección 5 se presentan los detalles sobre la configuración para ajustar LINuS.

1. Cultivo celular

NOTA: El procedimiento de esta sección debe realizarse en una campana de grado de cultivo de tejidos. Los pasos que se describen a continuación se han optimizado para la línea celular NIH/3T3 de fibroblastosde ratón 15 , utilizando DMEM (o DMEM sin rojo de fenol cuando esté indicado), suplementado con un 10% de suero fetal bovino y un 1% de penicilina-estreptomicina como medio (consulte la Tabla de materiales). Sin embargo, los usuarios pueden adaptar el procedimiento para otros tipos de células. El protocolo es adecuado para células transfectadas o líneas celulares estables. Sin embargo, recomendamos crear líneas celulares estables, como se mencionó en la sección de discusión.

  1. Prepare la solución de recubrimiento con 23 μg/mL de colágeno y 2 μg/mL de fibronectina en 1x PBS estéril. Añada 800 μL de la solución de recubrimiento a cada placa de imagen en vivo (consulte la Tabla de materiales) y manténgala en la incubadora durante 90 minutos.
  2. Lave la mezcla de recubrimiento con PBS estéril 1x y siembre 60.000 células en las placas de imágenes en vivo en los medios, para una adquisición al día siguiente.
  3. Si es necesario, transfecte las células con el plásmido LEXY de acuerdo con el método de transfección que mejor se adapte al tipo de célula utilizado. Para seguir este protocolo, realice una co-transfección de la sonda con un vector vacío para aumentar la eficiencia, en una proporción de 1:5 para el vector LEXY:vacío. Protege las células de la luz en una caja oscura o con papel de aluminio y déjalas crecer durante un día.
  4. Antes de la adquisición, tiña las células con un marcador de ADN de rojo lejano compatible con la obtención de imágenes de células vivas, en un medio libre de rojo fenol, y asegúrate de que estén completamente protegidas de la luz hasta la adquisición.
    NOTA: En nuestro caso, utilizamos SiR-DNA16 a 1 μM, incubado durante al menos 1 h antes de las adquisiciones.
  5. Para controlar la exportación, se utilizó el inhibidor nuclear de la exportación Leptomicina B17 a 0,5 nM (inhibición leve de la exportación) y 1 nM (inhibición fuerte de la exportación), aplicado a las células 1 h antes de las adquisiciones.

2. Imágenes

NOTA: Las adquisiciones se pueden realizar con un microscopio confocal compatible con imágenes en vivo, que tiene la capacidad de crear un patrón de adquisiciones elegidas y una iluminación láser pulsátil de 458 nm. Nuestras imágenes se realizaron en la oscuridad en una cámara de 37 °C (con 5% de CO2) de un microscopio confocal con barrido resonante. La configuración está optimizada con el objetivo 20x, lo que permite la obtención simultánea de imágenes de varias células en el mismo campo de visión. La secuencia de imágenes se compone de tres fases, como se muestra en la Figura 2.

  1. Fase estable
    1. Realice una adquisición de señales mCherry (LEXY, láser de 561 nm) y rojo lejano (SiR-DNA, láser de 633 nm) cada 15 s, y repítalo 10 veces, durante una duración total de 150 s. Asegúrese de que en este punto no se observe ni el blanqueamiento ni la translocación de LEXY al citosol.
      PRECAUCIÓN: Una iluminación del sistema con luz azul en esta etapa activaría LEXY, lo que induciría inmediatamente su exportación al citosol.
  2. Fase de iluminación
    NOTA: Esta fase se compone de tres pasos, repetidos 15x.
    1. Realice iluminación pulsátil con luz azul (láser de 458 nm), con pulsos de 36 ms repetidos 150x, durante una duración total de ~5 s.
    2. Realice una adquisición de señales fluorescentes mCherry (LEXY, láser de 561 nm) y rojo lejano (SiR-DNA, láser de 633 nm).
    3. Pausa de 15 s.
  3. Fase de recuperación
    1. Realice una adquisición de señales mCherry (LEXY, láser de 561 nm) y rojo lejano (SiR-DNA, láser de 633 nm) cada 15 s, repita 25x, durante una duración total de 375 s.
      NOTA: Este paso es opcional y se puede eliminar si los usuarios solo desean observar la exportación de la sonda y no la recuperación.

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Figura 2: Configuración de las tres fases de LEXY. Para controlar la exportación nuclear con LEXY, se deben configurar tres fases en el software del microscopio. La parte superior indica la configuración que se utilizará para las adquisiciones de imágenes de células vivas de LEXY. Esta configuración consta de una fase estable, para asegurar que la señal sea estable en el núcleo, una fase de iluminación, para inducir la translocación de LEXY desde el núcleo al citosol, y una fase de recuperación, para observar el regreso de LEXY al núcleo. La parte inferior de la figura indica los resultados esperados con imágenes de células vivas. En rojo, el mCherry indica la localización de LEXY. En gris, el SiR-DNA tiñe el núcleo de las células. Barras de escala = 10 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

3. Análisis para LEXY

NOTA: Todo el análisis de segmentación y seguimiento se realiza utilizando FIJI, con TrackMate12, un complemento de código abierto de Fiji (versión requerida detallada en la Tabla de Materiales).

  1. Instale FIJI y luego descargue los complementos StarDist13 y TrackMate. Para instalar los plugins, vaya a Ayuda | Actualización ... | Administre sitios de actualización y marque CSBDeep, StarDist y Trackmate-StarDist, luego haga clic en Aplicar cambios. Reinicie Fiyi.
  2. Mientras que algunos microscopios pueden tomar cada fase de adquisición (Iluminación Estable-Recuperación) juntas, otros (por ejemplo, el microscopio confocal al que se hace referencia) las guardan por separado. Por lo tanto, un paso adicional, si se utiliza esta configuración, es concatenar las fases juntas: abrir las imágenes de las tres secuencias, ejecutar la función de concatenar para compilar las tres fases de lapso de tiempo en un solo archivo: haga clic en Imagen | Pilas | Herramientas | Concatenar....
  3. Seleccione la fase estable como Imagen1, la fase de iluminación como Imagen2 y la fase de recuperación como Imagen3. La imagen resultante es una sola imagen para el lapso de tiempo de las tres fases, con los canales mCherry (canal 1) y SiR-DNA (canal 2) fusionados.
  4. Guarde la imagen obtenida para el paso de segmentación posterior y guárdela: vaya a Archivo | Guardar como | Tiff....
  5. Divida solo el canal mCherry para los siguientes análisis: vaya a Imagen | Colores | Dividir canales y guardarlo: vaya a Archivo | Guardar como | Tiff....
  6. Para comprobar si se ha producido un blanqueo eventual durante la adquisición, ejecute el comando Trazar perfil del eje Z en el canal mCherry: vaya a Imagen | Pilas | Trazar perfil del eje Z. En la tabla generada, haga clic en Datos | Copie el 1er conjunto de datos y péguelo en la hoja de cálculo lista para usar que se proporciona con este protocolo (Tabla complementaria S1), debajo de la celda de perfil del eje Z.
  7. Dibuje una región circular de interés (ROI) del tamaño medio de un núcleo y guárdela: vaya a Analizar | Herramientas | Gerente de ROI.... Añade el ROI y guárdalo: ve a Más | Salvar...
    NOTA: Se debe utilizar el mismo ROI para medir el fondo para todas las condiciones analizadas.
  8. Coloque el ROI guardado en una región sin celdas durante todo el lapso de tiempo y mida la intensidad promedio dentro de este ROI con la función de interfaz ROI. En primer lugar, asegúrese de que el valor medio de gris esté marcado haciendo clic en Analizar | Establecer medidas. A continuación, haz clic en Más | Medida múltiple. Marque Mida las 50 rebanadas y una cruda por rebanada, y haga clic en aceptar.
  9. Copie y pegue todos los valores que se muestran en la hoja de cálculo proporcionada (Tabla complementaria S1), debajo de la celda "Fondo de ROI".
  10. En Fiji, cierre la imagen solo con el canal mCherry y seleccione la imagen guardada anteriormente con los canales mCherry y SiR-DNA combinados.
  11. Abre el plugin de TrackMate: ve a Plugins | Seguimiento | TrackMate.
  12. Compruebe que el número de puntos de tiempo es correcto (de 0 a 49 si se han seguido las fases propuestas) y haga clic en Siguiente.
  13. Seleccione el detector StarDist y haga clic en Siguiente.
  14. Seleccione el canal 2 (SiR-DNA) para segmentar los núcleos y haga clic en Siguiente. Espere unos segundos a que finalice el proceso de segmentación. Inspeccione visualmente que la segmentación obtenida corresponde al borde de los núcleos y haga clic en Siguiente (Figura 3). En caso de segmentación inexacta, tome nota del identificador de núcleo correspondiente (SpotID) para excluirlo del análisis adicional en el paso 3.26.
  15. Deje los parámetros predeterminados y haga clic en Siguiente en la ventana de configuración de umbrales inicial . Esta ventana da el número de puntos segmentados (núcleos) entre los 50 puntos de tiempo.
  16. Establecer filtros en puntos puntuales: crear y establecer filtros:
    1. Cree dos filtros con la intensidad media ch1 como parámetro para eliminar núcleos con señal demasiado intensa o demasiado débil, lo que podría sesgar los análisis: un filtro para seleccionar valores por encima del umbral definido y el otro para seleccionar los valores por debajo del umbral. Defina el valor para eliminar solo la señal muy baja o saturada.
      NOTA: Es posible que estos filtros no sean necesarios si se utilizan líneas celulares estables. Tenga en cuenta estos valores, ya que deben volver a aplicarse para todas las condiciones.
    2. Cree dos filtros Área para eliminar objetos no deseados (residuos, células moribundas o en división) de los análisis: un filtro para seleccionar los valores por encima del umbral definido y el otro para seleccionar los valores por debajo del umbral. Haga clic en Siguiente.
      NOTA: Vuelva a aplicar estos valores para todas las condiciones.
  17. Seleccione un rastreador: elija Rastreador LAP simple y haga clic en Siguiente.
  18. Seleccione los parámetros para el seguimiento. Ajuste la distancia máxima de enlace (aquí, 30 μm), la distancia máxima que se permitirá vincular a objetos entre fotogramas. Utilice la Distancia máxima de cierre de espacio (aquí, 15 μm) y el Espacio máximo de fotograma de cierre de espacio (aquí, 3) para definir cuántos puntos de una sola pista se pueden omitir sin excluir esta misma pista. Haga clic en Siguiente (Figura 3).
    NOTA: Estos parámetros propuestos se optimizaron para nuestra configuración y modelo celular utilizando un enfoque de prueba y error y es posible que deban ajustarse experimentalmente.
    La distancia máxima de enlace debe ajustarse para evitar el desalineamiento de un núcleo a otro, especialmente si las células se mueven mucho.
  19. Después de los cálculos, haga clic en Siguiente y establezca filtros en las pistas. Para seleccionar solo los núcleos que han sido rastreados durante todo el curso de tiempo (50 puntos de tiempo con la secuencia propuesta), seleccione el mayor número de puntos en la pista (coloque el cursor en más de 49 para la secuencia propuesta). Haga clic en Siguiente.
    NOTA: Esto facilitará el análisis, pero solo es posible si se han rastreado suficientes núcleos durante todo el curso de tiempo, si no: ver discusión.
  20. Opciones de visualización: marque Mostrar nombres de puntos para poder volver a trazar cada núcleo en análisis posteriores. Personalice las características mostradas de acuerdo con las preferencias del usuario.
  21. En la parte inferior de la página, haz clic en Pistas | Exportar a CSV para guardar la tabla con todas las medidas. Cierre la tabla y haga clic en Siguiente.
  22. Opcionalmente, trace las entidades de rastreo con T (tiempo) como eje X y la intensidad media del ch1 para el eje Y. Haga clic en Trazar características. Cierre el gráfico y haga clic en Siguiente.
    NOTA: Esto dará a los usuarios una idea de la tendencia general de la exportación. En este punto, no se normaliza al fondo y la intensidad inicial.
  23. Haga clic en Capturar superposición como acción y Ejecutar | De acuerdo. La imagen generada servirá para identificar los núcleos cuantificados. Guardar: ir a Archivo | Guardar como | Tiff....
  24. En un archivo de hoja de cálculo, importe el archivo CSV obtenido con TrackMate: En la pestaña Datos , en el grupo Obtener y transformar datos , haga clic en De texto/CSV e Importar.
  25. Seleccione las cuatro columnas siguientes haciendo clic en su letra correspondiente y cópielas y péguelas en la parte superior de la hoja de cálculo proporcionada (Tabla complementaria S1), columnas de la A a la D, con el fondo: ID de punto (B), ID de pista (C), Marco (I), Intensidad media ch1 (M).
    NOTA: Asegúrese de que el comienzo de las medidas pegadas comience en la fila 6 de la Tabla Suplementaria S1. Si este no es el caso, las mediciones podrían desplazarse de una o más celdas y, por lo tanto, ser incorrectas. Consulte la hoja de cálculo de la Tabla complementaria S2 para tener un ejemplo de la disposición esperada.
  26. Ordene los resultados alfabéticamente primero por TrackID (núcleo individual) haciendo clic en la flecha en la celda B5 y Frame (punto de tiempo) haciendo clic en la flecha en la celda C5.
  27. Para eliminar el ruido de fondo, reste los valores obtenidos en el paso 3.8 de cada valor obtenido en la intensidad media ch1 (precalculada en la hoja de cálculo proporcionada, consulte la Tabla complementaria S1).
  28. Para normalizar la señal de LEXY, calcule la intensidad media de la señal fluorescente mCherry en la fase estable (fotogramas 0 a 9). A continuación, divida todos los resultados obtenidos en Intensidad media ch1 por la intensidad media de la fase estable (precalculada en la hoja de cálculo proporcionada, consulte la Tabla complementaria S1).
    NOTA: El número obtenido es la intensidad nuclear fluorescente media de LEXY. Todas las medidas ya se muestran por núcleos de la columna L y se pueden trazar en un gráfico.

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Figura 3: Análisis de TrackMate usando FIJI. En la parte superior, la representación esquemática de los análisis TrackMate, en la parte inferior, las imágenes obtenidas de los análisis FIJI. La primera representación de la izquierda muestra la tinción de SiR-DNA sin segmentar, un marcador del núcleo, en gris. El segundo panel representa la segmentación automática realizada con el canal SiR-DNA por Stardist. Los núcleos se colorean según la intensidad del canal mCherry, para facilitar la visualización y el paso final. El tercer panel muestra las trazas obtenidas mediante el seguimiento de la tinción de SiR-DNA en los puntos de tiempo de toda la secuencia de imágenes de células vivas. El último panel de la derecha muestra la señal fluorescente de LEXY, en rojo, en el área definida por la segmentación, que se medirá para cada punto de tiempo. Barra de escala = 50 μm Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

4. Tasa de transporte, estadísticas y cifras

  1. Traza el gráfico de intensidad nuclear relativa.
    1. Abra GraphPadPrism y cree una hoja: haga clic en Ingresar o importar datos a una nueva tabla y, en las opciones, seleccione los tiempos transcurridos para X y el número máximo de núcleos segmentados para los valores replicados en subcolumnas lado a lado para Y. Haga clic en Crear y pegue los datos obtenidos en la tabla.
    2. Para los valores X (tiempo), si los parámetros de las adquisiciones se mantuvieron como se sugiere, copie y pegue la columna debajo de 'tiempo' en la hoja de cálculo proporcionada. De lo contrario, ajuste los valores de acuerdo con los parámetros utilizados.
    3. Para crear el gráfico de la intensidad nuclear relativa, vaya a la sección Gráficos. Seleccione XY como familia de gráficos y Puntos y línea de conexión con barras de error como tipo de gráfico.
    4. En la sección Trazado , seleccione Media, Error y SEM y haga clic en Aceptar para ver los gráficos. Cambie las escalas y las imágenes de acuerdo con los parámetros elegidos.
  2. Ajuste la intensidad nuclear relativa a un modelo monoexponencial.
    1. En la sección Tabla de datos , haga clic en Nueva tabla de datos.
      1. Seleccione Introducir valores X como X e Intro y trace un único valor Y para cada punto como Y, y haga clic en Crear.
      2. En la columna X , informe los tiempos en decimales solo para las fases estable y de iluminación; si se mantuvieron los parámetros sugeridos de adquisiciones, copie y pegue la columna debajo de 'Tiempo decimal' en la hoja de cálculo proporcionada, Tabla complementaria S1.
      3. Pegue los valores obtenidos como intensidad nuclear relativa en la tabla, solo para las fases estable y de iluminación.
      4. En la sección Resultados , seleccione el siguiente análisis: Análisis XY | Exponencial | Regresión no lineal (ajuste de curva) y haga clic en Aceptar.
      5. En los parámetros, seleccione Meseta seguida de un decaimiento de fase como Modelo, y en los parámetros de restricción, seleccione una constante igual a 2,25 como X0 (el tiempo de inicio de la iluminación), una constante igual a 1 como Y0 (intensidad nuclear relativa al comienzo de la iluminación), una constante igual a 0 para la meseta (los valores hacia los que debe inclinarse la intensidad nuclear relativa), e indicar que K (la tasa de exportación), debe ser mayor que 0. Deje los demás parámetros de forma predeterminada. Haga clic en Aceptar.
      6. En la sección Resultados , la fila K indica todas las tasas de exportación para los núcleos de la condición probada.
      7. Repita los pasos 4.2.1 a 4.2.1.5 para las demás condiciones si es necesario.
  3. Cree el gráfico de tasa de exportación.
    1. Crear una nueva tabla: seleccione Introducir valores X como X y Entrar y trace un único valor Y para cada punto como Y, y haga clic en crear.
    2. Para cada condición (en columnas), pegue y transponga los valores K obtenidos en el paso anterior.
    3. Para crear el gráfico de la tasa de exportación, vaya a la sección Gráficos , seleccione columna como familia de gráficos y, en la sección Caja y violín , seleccione Gráfico de violín como tipo de gráfico, con Gráfico de violín. Mostrar todos los puntos como gráfico. Haga clic en Aceptar para ver el gráfico. Personalice la forma de representar los datos si es necesario.
    4. Para ejecutar una prueba estadística de la tasa de exportación, realice una prueba t de Welch de dos caras, como se describe en Yoo y Mitchison14, siguiendo los siguientes pasos:
      1. En la tabla que contiene las tasas de exportación de todas las condiciones, haga clic en Analizar | Comparación de grupos | T-Test (y pruebas no paramétricas), seleccione las condiciones a probar y haga clic en Aceptar. Marque No emparejado, Sí usar prueba paramétrica y Prueba t no emparejada con corrección de Welch. No asuma SD iguales y haga clic en Aceptar.
    5. Observe los resultados del análisis en la tabla de la sección Resultados e informe sobre el gráfico de tasa de exportación si es necesario.

5. Adaptaciones para LINuS

NOTA: El protocolo descrito anteriormente se puede adaptar fácilmente para monitorear la importación nuclear con LINuS aplicando los siguientes cambios.

  1. Cultivo celular
    1. En lugar de leptomicina B en el paso 1.5, use importazol18 como inhibidor nuclear, a una concentración de 10 μM durante 1 h antes de la adquisición.
  2. Imagenológico
    1. Para tener una importación óptima del sistema, reemplace las 150 repeticiones de pulsos de iluminación de 36 ms por el láser de 458 nm en el paso 2.2.1 por 250 repeticiones para una duración total de ~ 9 s.
      NOTA: la temporización de la secuencia puede depender del tipo de celda, y los parámetros de ambas sondas pueden necesitar un ajuste para ser óptimos, ya que los sistemas dependen del reconocimiento de NLS y NES, que son específicos del tipo de celda19,20.
  3. Tarifa de transporte, estadísticas y cifras
    1. En lugar de ajustar una curva a una meseta seguida de un decaimiento de fase en el paso 4.2.1.5, seleccione la meseta seguida de un análisis de asociación de fase.
    2. Restrinja X0 a 2,25, Y0 como 1 y K (la tasa de importación en el caso de LINuS) mayor que 0.
      NOTA: Los análisis de LINuS con TrackMate son idénticos a los de LEXY. La intensidad nuclear relativa sigue siendo el valor medido y analizado, pero en lugar de observar una disminución debido a la exportación de la sonda, se debe observar un enriquecimiento de la señal fluorescente en el núcleo después de la iluminación con luz azul.

Resultados

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El protocolo mencionado anteriormente debe permitir a los usuarios visualizar la localización y translocación de la sonda durante la adquisición en imágenes de células vivas. En la Figura 4 se muestra un ejemplo de las imágenes esperadas adquiridas para visualizar la exportación nuclear con LEXY. Se debe observar una rápida disminución de la señal del núcleo y un enriquecimiento en el citosol después de un par de rondas de iluminación con luz azul. Una recuperación progresiva de la señal de la sonda puede ser visible después de detener los ciclos de iluminación. Para controlar el sistema, la leptomicina B, un inhibidor de la exportación, atestigua que con los análisis se puede visualizar un cambio en la exportación, ya que evita que LEXY se exporte con iluminación de luz azul (Figura 4).

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Figura 4: Visualización de la señal de LEXY a lo largo del tiempo. Captura de puntos de tiempo representativos de las fases estable, de iluminación y de recuperación, adquiridos con imágenes de células vivas. La condición de metanol representa la condición de control. Tras la iluminación pulsátil de luz azul, en rojo, la señal fluorescente mCherry, reportera de la ubicación de LEXY, se transloca del núcleo al citosol. Después de detener la iluminación, la señal se recupera en el núcleo. El tratamiento con el inhibidor de la exportación Leptomicina B a 1 nM o 0,5 nM muestra la ausencia o disminución de la exportación de LEXY cuando la exportación está bloqueada. Barra de escala = 30 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

En cuanto a los análisis, mientras que los valores de la curva de intensidad nuclear relativa durante la fase estable deberían estar en torno a 1, después de la activación de la luz azul, deberían mostrar una disminución lenta hasta alcanzar una meseta al final de la fase de iluminación (Figura 5A). Si la disminución es demasiado rápida o demasiado lenta, se pueden optimizar los parámetros de adquisición (ver discusión). El tratamiento con leptomicina B a concentraciones suficientes también puede confirmar que los análisis y la técnica son lo suficientemente sensibles como para demostrar que la exportación nuclear está completamente bloqueada, con valores de intensidad nuclear relativa estables en torno a 1 durante todo el experimento. Sin embargo, las concentraciones intermedias de leptomicina B deberían mostrar una exportación nuclear leve (Figura 5A). Estas observaciones visuales deben confirmarse cuantitativamente con la obtención de la tasa de exportación (Figura 5B).

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Figura 5: Intensidad nuclear relativa esperada de LEXY y velocidad de transporte. (A) El gráfico representa la intensidad nuclear relativa de la señal fluorescente de LEXY a lo largo del tiempo, normalizada a la intensidad media mCherry de la fase estable. La intensidad nuclear relativa de la condición de metanol (control, rojo) disminuye a la mitad después de la iluminación, en contraste con las células tratadas con el inhibidor de exportación Leptomicina B, a una concentración de 0,5 nM (azul claro) o 1 nM (azul oscuro). Barras de error: SEM. (B) Tasa de exportación de las condiciones control y Leptomicina B, obtenida ajustando la curva a un modelo monoexponencial. Los valores obtenidos cuando la exportación es bloqueada por Leptomicina B son significativamente más bajos que la condición de control. N = 18 células para metanol (rojo), 19 células para leptomicina B 0,5 nM (azul claro) y 15 células para leptomicina B 1 nM (azul oscuro). Los valores de p se calcularon mediante una prueba t de Welch bilateral. : P < 1×10−4, ****: P < 1×10−5. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Tabla complementaria S1: Hoja de cálculo con cálculos predefinidos. Esta hoja de cálculo se proporciona para facilitar el análisis. Los valores de intensidad obtenidos con TrackMate se pueden copiar y pegar directamente en la hoja de cálculo para obtener los valores de intensidad nuclear relativa normalizados. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Tabla suplementaria S2: Ejemplo de los resultados esperados para una condición de control del análisis de LEXY. La hoja de cálculo representa un ejemplo de los valores obtenidos para una condición de control de la línea celular estable de LEXY. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Discusión

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Como se menciona en el protocolo, la creación de líneas celulares estables mejora en gran medida la calidad de los análisis. En primer lugar, el hecho de que el 100% de las células expresen las sondas aumenta el número de núcleos rastreados y analizados, lo que refuerza la solidez de los análisis. En segundo lugar, reduce la muerte celular inducida por la sobreexpresión de las sondas y la toxicidad de los reactivos de transfección utilizados. Y, por último, reduce la fuerte heterogeneidad de las señales fluorescentes entre las células. Este parámetro es importante ya que una señal saturada no permitirá la detección adecuada del cambio de intensidad después de la iluminación. La misma conclusión es válida para las señales débiles, que pueden blanquearse o no permitir la cuantificación de las diferencias. Por lo tanto, recomendamos probar primero las sondas por transfección para asegurarse de que funcionan correctamente, configurar los parámetros de adquisición y, a continuación, crear rápidamente líneas celulares estables. Creamos vectores de lentivirus para las sondas LEXY y LINuS, que están disponibles para compartir a pedido, así como las líneas estables NIH/3T3 LEXY o LINuS creadas con estos lentivirus.

Si las sondas están transfectadas o si las celdas son escasas, es probable que los parámetros sugeridos disminuyan el número de pistas detectadas y los análisis sean menos sólidos. Si este es el caso, los usuarios pueden ser más permisivos con los puntos omitidos en el seguimiento disminuyendo el filtro Número de puntos en las pistas (sugerimos mantener al menos 45 de 50 lugares). Atención: si este filtro se disminuye, el archivo de Excel proporcionado (Tabla complementaria S1) debe ajustarse manualmente: de hecho, los valores pegados del CSV importado no tendrán en cuenta los espacios. El usuario necesita encontrar dónde están los puntos faltantes con el número TrackID y correlacionarlos con el número de núcleo, lo que generalmente toma algunas rondas de copiar y pegar.

Un parámetro crítico para garantizar el éxito del experimento es mantener las células en la oscuridad. Dado que las sondas reaccionan a la luz azul, los usuarios deben garantizar el transporte de las células en la oscuridad durante al menos 30 minutos antes de la adquisición. Una pequeña caja cerrada o usar aluminio para cubrir el plato es suficiente. Del mismo modo, hay que tener mucho cuidado de utilizar únicamente la luz mCherry para buscar las células en el microscopio, ya que la iluminación con luz azul activa las células. Si se produce una eventual iluminación bajo el microscopio, busque otro campo distante para la adquisición. Trazar el perfil del eje Z en el paso 3.6 ayudará a saber si las celdas se vieron afectadas por una iluminación, si la curva está disminuyendo en lugar de ser una meseta.

La secuencia de imágenes consta de tres fases. En primer lugar, la fase estable, para evaluar el posible blanqueamiento, pero también para garantizar que la localización de LEXY sea constante sin activación (1). En segundo lugar, la fase de activación, que consiste en rondas de iluminación de luz azul pulsátil, para inducir la translocación de LEXY desde el núcleo al citosol (2). Por último, la fase de recuperación opcional, en la que la señal vuelve progresivamente a su ubicación inicial en el núcleo (3).

La secuencia descrita para las adquisiciones puede ser específica del tipo de célula19,20. Para el primer experimento, el usuario debe probar y modificar la potencia y los tiempos del láser para ver cómo el sistema se transloca progresivamente entre el núcleo y el citosol. Es importante destacar que una potencia láser demasiado fuerte, ya que una pausa demasiado corta, podría impedir una translocación progresiva, sino una caída/enriquecimiento brutal (dependiendo de la sonda utilizada) de la intensidad de mCherry después de la iluminación.

Si la optimización de la secuencia no resuelve el problema, es probable que la NES y/o la NLS no sean adecuadas para el tipo de célula utilizada. Los usuarios pueden consultar el artículo8 del método LINuS para diseñar y modificar las sondas. Los usuarios también pueden consultar este artículo para obtener imágenes de LINuS con un microscopio de epifluorescencia.

La segmentación de los núcleos es un paso crítico del análisis. Se debe utilizar un marcador nuclear robusto y fiable para la obtención de imágenes de células vivas de las sondas. Dado que la iluminación con luz azul activa la translocación de la sonda, y debido a que las sondas se monitorean con la proteína fluorescente mCherry, este marcador debe ser visible en el espectro rojo lejano o cerca. En nuestro caso, usamos SiR-DNA que tiñe las células durante 1 a ~ 24 h de incubación, pero el uso de SPY-DNA 650 también es una opción (consulte la Tabla de materiales para referencias).

Por último, si la segmentación con StarDist combinada con el seguimiento filtrado de TrackMate demuestra su eficacia, es importante tener en cuenta que el usuario siempre debe comprobar visualmente los resultados de la segmentación y la cuantificación. Una célula en división o moribunda podría incluirse en la cuantificación, mientras que no debería. Para reducir los riesgos de análisis de tales eventos, la hoja de Excel proporcionada atribuye un código de color a la intensidad nuclear relativa (azul = valores bajos, rojo = valores altos). Al inspeccionar los colores antes de trazar los valores en GraphPad Prism, el usuario debería poder notar cualquier valor inusual. Por ejemplo, las intensidades nucleares relativas de LEXY deben variar desde altas (rojo, cantidades fuertes de la sonda en los núcleos) durante la fase estable hasta bajas (azul, cantidades reducidas de la sonda en los núcleos) al final de la fase de iluminación, antes de volver a valores altos (rojo), en la fase de recuperación (como se muestra en la Tabla Suplementaria S2).

Este protocolo presenta varias ventajas sobre los métodos propuestos anteriormente 5,6. La tubería semiautomática facilita el análisis del transporte nucleocitoplasmático de LEXY y LINuS, y proporciona más precisión que la cuantificación manual propuesta anteriormente 5,6. El uso de nuestro protocolo permitirá a los principiantes en el campo realizar análisis eficientes, pero también proporcionará una nueva herramienta para los usuarios experimentados, que solo necesitarán una interfaz de acceso abierto para realizar análisis semiautomatizados del transporte nucleocitoplasmático.

Este método se puede utilizar para otras aplicaciones que el estudio de la tasa de transporte nucleocitoplasmático global en líneas celulares NIH3T3. De hecho, con unos pocos pasos de optimización, se puede adaptar para estudiar la velocidad de transporte de la sonda en varios tipos de células o animales vivos8. Además, mediante la fusión de una proteína de interés para LEXY o LINuS, también es posible estudiar su velocidad de transporte o los efectos posteriores de su translocación inducida por la luz dentro o fuera del núcleo. Por ejemplo, es posible secuestrar una proteína en el citoplasma con LEXY, o forzar su localización en el núcleo con LINuS 5,6,21,22,23. Por último, los análisis descritos también pueden extenderse a más aplicaciones que LEXY y LINuS, para rastrear cualquier señal que se transloque entre compartimentos subcelulares que se puedan segmentar.

Divulgaciones

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Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.

Agradecimientos

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Agradecemos al centro de imagen MRI, miembro de la infraestructura nacional France-BioImaging (https://ror.org/01y7vt929), apoyado por la Agencia Nacional de Investigación de Francia (ANR-24-INBS-0005 FBI BIOGEN), y especialmente a Marie-Pierre Blanchard, Julio Mateos-Langerak y Baptiste Monterroso por su ayuda con la configuración del microscopio y los análisis FIJI. Agradecemos a todos los miembros del laboratorio Boumendil por sus consejos y fructíferas discusiones, en particular a Parisa Nobari por su ayuda en el inicio del proyecto. Agradecemos a Joey Dufourd por la revisión del manuscrito.

El trabajo del grupo CB cuenta con el apoyo del Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS), el Institut National du Cancer (Instituto Nacional del Cáncer de Francia) / Canceropole Grand Sud-Ouest (Grant Emergence 2023 E07), la Agence Nationale pour la recherche (ANR-23-TERC-0015-01 y ANR-21-CE12-0039), el Institut National du Cancer (Grant INCa PLBIO23-207-2023-180) y la Universidad de Montpellier (programa I-SITE, Francia 2030, proyecto NAChO, proyecto ChOICe).

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
ColágenoSigma-Aldrich08-115
Microscopio confocalLEICASP8
DMEMGibco31966021
SobresalirMicrosoft
FBSSigma-AldrichF7524
FibronectinaSigma-AldrichF1141
Software FIJIFIJIImagenJ 2.16.0/1,54p; Java1.8.0_322
FluoróplatosDutscherFD3510-100Alternativa: Cámara de attofluor (Invitrogen #A7816)
GraphPad Prism 10.4.1Software GraphPad, Inc.
ImportazoleSigma-AldrichSML0341
Leptomicina BSigma-AldrichL2913
Plásmido LEXYAddgene72655pDN122
Plásmido LINuSAddgene61347pDN77
Pencillina-estreptomicinaGibco15140-122
DMEM sin rojo de fenolGibco21063-029
ADN SiREspirocromoSC007Alternativa: SPY-DNA650 (Espirocromo #SC501)
Plugin 2D de StardistDist estelarStarDist_0.3.0
Complemento TrackMateCompañero de pistaTrackMate-7.14.0

Referencias

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  1. Wing, C. E., Fung, H. Y. J., Chook, Y. M. Karyopherin-mediated nucleocytoplasmic transport. Nat Rev Mol Cell Biol. 23, 307-328 (2022).
  2. Kelley, J. B., Paschal, B. M. Fluorescence-based quantification of nucleocytoplasmic transport. Methods. 157, 106-114 (2019).
  3. Crefcoeur, R. P., Yin, R., Ulm, R., Halazonetis, T. D. Ultraviolet-B-mediated induction of protein-protein interactions in mammalian cells. Nat Commun. 4 (2), 1779(2013).
  4. Beyer, H. M., et al. Red light-regulated reversible nuclear localization of proteins in mammalian cells and zebrafish. ACS Synth Biol. 4 (9), 951-958 (2015).
  5. Niopek, D., et al. Engineering light-inducible nuclear localization signals for precise spatiotemporal control of protein dynamics in living cells. Nat Commun. 5, 4404(2014).
  6. Niopek, D., Wehler, P., Roensch, J., Eils, R., Di Ventura, B. Optogenetic control of nuclear protein export. Nat Commun. 7, 10624(2016).
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  9. Lataster, L., et al. Cell cycle control by optogenetically regulated cell cycle inhibitor protein p21. Biology. 12 (9), 1194(2023).
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