Artículo de método

Microscopía de expansión: Imagen fluorescente de alta resolución con microscopio convencional

DOI:

10.3791/68595

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19 de diciembre de 2025

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1University of Bordeaux, CNRS, MFP, iMet UMR 5234, 2Université Claude Bernard Lyon 1, MeLiS-UCBL-CNRS UMR 5284-INSERM U1314, 3University of Bordeaux, CNRS, MFP, ProParaCyto UMR 5234

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

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Aquí presentamos un protocolo detallado que combina métodos de criofijación y microscopía de expansión (Cryo-ExM), permitiendo imágenes de alta resolución con preservación estructural adaptada a diversas muestras biológicas. Las muestras biológicas se congelan, se incrustan en un polímero hinchable, se desnaturalizan, se expanden e se inmunomarcan, permitiendo obtener imágenes de superresolución con microscopios ópticos estándar.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La microscopía de expansión (ExM) es una innovadora técnica de microscopía de fluorescencia de superresolución que agranda físicamente las muestras biológicas, permitiendo obtener imágenes más allá del límite de difracción utilizando sistemas convencionales como los microscopios confocales. Al incrustar muestras en una matriz hidrogel hinchable, ExM permite la expansión isotrópica de la muestra, mejorando la resolución espacial sin necesidad de equipos especializados de nanoscopía. Variantes avanzadas, como la Microscopía de Expansión de Ultraestructura (U-ExM), conservan detalles celulares finos, incluidos orgánulos y conjuntos macromoleculares.

La observación de estructuras celulares o orgánulos específicos depende significativamente del método de fijación aplicado a la muestra, especialmente mediante el uso de entrecruzamientos químicos basados en aldehídos y la precipitación de proteínas con metanol frío. Recientemente, la integración de la criofijación —una técnica de fijación estándar de oro— con el método U-ExM ha permitido observaciones a nanoescala de una amplia gama de muestras biológicas, desde células de mamíferos cultivadas hasta organismos completos, en su estado casi nativo. La microscopía de expansión es una herramienta poderosa para estudiar estructuras biológicas a escalas, desde orgánulos aislados hasta tejidos enteros. Cuando se combina con la criofijación, proporciona una visión sin precedentes sobre la arquitectura celular y los procesos dinámicos, minimizando los artefactos asociados con los métodos tradicionales de fijación. Estos avances sitúan a ExM como un marco versátil para la imagen biológica de alta resolución y casi nativa.

El presente estudio describe un protocolo detallado para la criofijación junto con microscopía de expansión de muestras de diversos orígenes. Este protocolo destaca pasos críticos, incluyendo la fijación de la muestra, la formación de polímeros, la expansión, la inmunotinción y la obtención de imágenes, proporcionando la orientación necesaria para implementar este método en cualquier laboratorio.

Introducción

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La microscopía desempeña un papel fundamental en la investigación biológica, permitiéndonos visualizar la ultraestructura y la organización a través de los sistemas vivos a escalas sin precedentes, desde organismos completos hasta moléculas individuales. El campo de la microscopía abarca dos sistemas distintos: la microscopía electrónica (EM), altamente resolutiva pero con capacidad limitada para el marcaje específico, y la microscopía óptica, que permite una visualización precisa y específica de la estructura subcelular pero con resolución limitada debido al límite de difracción de la luz. Aunque la microscopía de fluorescencia de superresolución (SRM) ha evolucionado como un método potente para la imagen de fluorescencia con resolución subdifracción de células, visualizar los detalles ultraestructurales de conjuntos macromoleculares, como organismos completos, sigue siendo un desafío1. Además, las técnicas SRM, que alcanzan resoluciones que van de 10 a 120 nm, dependen de microscopios avanzados y algoritmos de reconstrucción de imágenes y requieren experiencia y microscopios especializados, lo que limita su accesibilidad a muchos laboratorios de biología. Un método emergente de superresolución, la microscopía de expansión (ExM), ha superado estas limitaciones. Desarrollada en el laboratorio de Edward S. Boyden hace una década, la ExM es una técnica innovadora de microscopía fotónica que ahora se considera microscopía de superresolución que permite obtener imágenes sin necesidad de microscopiosespecializados 2. En lugar de depender de tecnologías sofisticadas de imagen, la ExM implica la incrustación de muestras biológicas en un polímero hinchable que se expande isotrópicamente. Esta expansión física aumenta el tamaño de la muestra en un factor de cuatro o más, mejorando la resolución y permitiendo la observación con microscopios ópticos convencionales. Originalmente desarrollados en cortes cerebrales, los protocolos ExM han evolucionado para mejorar la resolución y simplificar los procedimientos. Esta técnica se ha adaptado con éxito a diversas muestras biológicas, incluyendo células eucariotas, organismos unicelulares, parásitos, tejidos y organismos completos, demostrando su versatilidad 3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14, 15.

Actualmente, existen dos clases principales de protocolos:pre-expansión 2,16 ypost-expansión 17,18, que se refieren al momento de la tinción biológica de la muestra, ya sea antes o después del procedimiento de expansión. Este artículo se centrará específicamente en el protocolo post-expansión, en el que se realiza el inmunomarcaje tras la desnaturalización y expansión de la muestra.

En este protocolo, las muestras biológicas se fijan criogenicamente o químicamente e incuban con agentes químicos, permitiendo el anclaje de proteínas al polímero futuro. Las muestras se incrustan entonces en un polímero hinchado compuesto por acrilamida/bis-acrilamida (comúnmente usada en geles de electroforesis) y acrilato de sodio (que permite la expansión). Añadir agua desencadena la expansión del gel, aumentando la distancia entre proteínas en proporción a la expansión del gel. Las proteínas de interés se marcan directamente dentro del gel usando anticuerpos específicos (Figura 1).

Todas las técnicas de imagen mencionadas, incluyendo microscopía electrónica, microscopía fotónica, microscopía de superresolución y ExM, requieren fijación biológica de muestras. La fijación basada en aldehídos crea entrecruzamiento entre proteínas, manteniendo la organización celular durante los tratamientos necesarios para la microscopía fotónica o electrónica. Sin embargo, la fijación también puede conducir a artefactos y cambios morfológicos en la célula, que pueden ser sutiles en la microscopía óptica clásica pero que se han hecho cada vez más evidentes con el avance y desarrollo de la MRS, lo que ha llevado a los científicos a reconsiderar las consecuencias de los métodosde fijación 19. Una forma de evitar artefactos relacionados con la fijación es utilizar microscopía en vivo, que permite la visualización dinámica de estructuras celulares en su estado casi nativo. Sin embargo, la microscopía en vivo presenta varias desventajas, especialmente la necesidad de expresión de transgénicos, que puede afectar potencialmente la fisiología celular y alterar el comportamiento de las proteínas en comparación con sus homólogos endógenos. Además, la microscopía en vivo suele ofrecer una resolución menor que la microscopía fija y tiene opciones limitadas de etiquetado, ya que las etiquetas fluorescentes deben ser no tóxicas y estables en condiciones vivas, lo que limita los marcadores disponibles. El campo de la microscopía electrónica, debido a su alta resolución, ha contribuido considerablemente al desarrollo de métodos óptimos para fijar estructuras subcelulares o macromoleculares preservando su estado nativo. Hace décadas, la criofijación fue desarrollada por los laboratorios Dubochet, Frank y Henderson, que consistía en la fijación rápida de la célula en agua vítrea y demostrando que era el único método para preservar la ultraestructuranativa 20,21. Mientras que las moléculas purificadas pueden observarse directamente en hielo vítreo mediante criomicroscopía electrónica, las células deben estar incrustadas en resina y seccionadas antes de la observación. Para estabilizar aún más las muestras en el estado más nativo posible, se someten a sustitución por congelación. En este proceso, cuando las moléculas de hielo vuelven a un estado líquido, son reemplazadas instantáneamente por acetona, que tiene un coeficiente de difusión mayor que el agua. Durante la eliminación de agua, las moléculas de interés pueden agregarse y colapsar, similar a lo que ocurre en la fijación química por reticulación. Para limitar esta agregación, se realiza sustitución por congelación a bajas temperaturas, reduciendo la agregación al aumentar la viscosidadintracelular 22. Este enfoque controlado limita la formación de grandes agregados y preserva la ultraestructura celular más cerca de su estado nativo.

En 2022, la creciente evidencia de que la fijación química introduce artefactos, combinada con los avances en la microscopía de expansión, llevó al laboratorio Guichard/Hamel a desarrollar un método que integra la criofijación con la microscopía de expansión, conocido como 'Cryo-ExM'23. Este enfoque aprovecha las fortalezas de ambas técnicas preservando estructuras biológicas con una distorsión mínima. Las muestras se criocongelan mediante congelación a alta presión o inmersión manual, ambos requieren equipos especializados habituales en laboratorios de microscopía electrónica o instalaciones de núcleo.

Este artículo describe un protocolo paso a paso para realizar criofijación seguida de microscopía de expansión y presenta resultados representativos de dos modelos experimentales: células cultivadas en humanos y el parásito unicelular Trypanosoma brucei, el agente causante de la enfermedad del sueño. Destacaremos las mejoras que ofrece la criofijación frente a los métodos convencionales y destacaremos los errores y artefactos de fijación más comunes asociados a la técnica.

Protocolo

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NOTA: Los reactivos utilizados en este protocolo se listan en la Tabla de Materiales. Este protocolo está adaptado, con modificaciones menores, para la observación de diversos procesos celulares en diferentes muestras biológicas (incluyendo levaduras24,25, Toxoplasma gondii26, parientes cercanos especiesanimales 27, algasverdes 28,29, eucariotasmicrobianos 30, así como muestrasde ratón 23 yhumanas 23,31,32,33)). Las modificaciones para adaptar el protocolo a estas diferentes muestras no se mencionan en este artículo, ya que pueden recuperarse de las publicaciones originales. Aquí, las células RPE1 y Trypanosoma brucei se utilizan como sustitutos de células y parásitos de mamíferos. Este protocolo enfatiza los pasos de fijación y expansión de las muestras biológicas; Por lo tanto, la información sobre el cultivo de muestra no se presenta en este artículo.

1. Preparación de la solución de stock

  1. Solución de polilisina
    1. Resuspender el hidrobromuro de poli-L o poli-D-lisina (Tabla de Materiales) en agua para obtener una solución estándar de polilisina a 1 mg/mL. Almacena esta solución de stock a -20 °C y dilúyela aún más en agua a 0,2 mg/mL para recubrir las cubiertas (Tabla 1, Tabla de Materiales).
  2. Solución de anclaje
    1. Preparar una solución fresca de acrilamida/formaldehído (bajo la capucha química) mezclando 38 μL de formaldehído (36,5%-38%; Tabla de Materiales) y 50 μL de acrilamida (40%, Tabla de Materiales) en 912 μL de PBS para obtener 1 mL de solución.
  3. Solución de gel sin APS (iniciador)
    1. Prepara una solución mezcla añadiendo 500 μL de acrilato de sodio al 38% (19% final), 250 μL de acrilamida al 40% (10% final), 50 μL de bisacrilamida al 2% (0,1% final), 50 μL de TEMED (0,5% final) y 100 μL de 10x PBS (1x final). En volumen de alícuota, adecuado para 2 geles como máximo (80-90 μL) y almacenado a -20 °C durante al menos 12 horas antes de su uso (véase la Tabla 1 para conservación a largo plazo).
      NOTA: Tenga en cuenta que el volumen indicado para preparar la mezcla de solución de gel se calcula para obtener un volumen final de 1 mL, pero el volumen real de la solución es de 950 μL, ya que el APS, que representa 1/20 del volumen total de cada uno, se añade de forma espontánea. El tiempo de almacenamiento original de la soluciónde gel 17 se amplió tras observar que podía conservarse hasta 1 mes a -20 °C sin comprometer la solidez del gel ni la eficiencia de expansión.
  4. TEMED y APS
    1. APS 10% p/v: Polvo de APS diluido en agua, alicuota y guárdalo a -20 °C.
    2. TEMED 10% v/v: Diluir TEMED en agua, alicuota y almacenarlo a -20 °C.
  5. Acrilato de sodio (SA) 38%
    1. Prepara un 38% de SA purificado (AK scientific o Sigma; Tabla de Materiales)
      1. Resuspende 38 g de acrilato de sodio en 100 mL de agua bajo agitación constante (importante). Incorpora la SA progresivamente para evitar agregados y remueve durante la noche a 4 °C para asegurar una resuspensión completa. Asegúrate de que la solución sea translúcida e incolora o ligeramente amarilla. Alícuota y conservar a 4 °C hasta 1 año.
    2. Preparar 38% de ácido asilódico a partir de ácido acrílico (Sigma; Tabla de Materiales)
      1. Prepare 90 mL de acrilato de sodio al 38% neutralizando el ácido acrílico con NaOH bajo una capucha química.
      2. Mezcla 29 mL de agua con 25 mL de ácido acrílico mientras remueves.
        NOTA: A partir de este paso, la reacción debe realizarse sobre hielo con un control constante del pH y la temperatura, ya que la reacción es exotérmica.
      3. Añade 10 N de NaOH gota a gota usando una pipeta Pasteur.
        NOTA: Asegúrate de que la temperatura no supere los 25 °C (si lo hace, deja de añadir NaOH y espera a que la temperatura se enfríe).
      4. Continúa neutralizando hasta que el pH alcance 7-8 y agita durante 1 hora sobre hielo.
        NOTA: Si el pH sube repentinamente a más de 10, añade ácido acrílico hasta que el pH baje a 7-8.
      5. Guarda la solución en un recipiente cerrado durante la noche. Si la solución ha precipitado, centrifugar a 1.000 × g durante 10 minutos. Recoge el sobrenadante, el alicuota, y guárdalos a -20 °C.
  6. Solución desnaturalizante
    1. TrisBase 1 M: Diluye 121,14 g de TrisBase en 1 L de agua, ajusta el pH con HCl a 9 y almacena en RT.
    2. Tampón de desnaturalización: Mezcla 200 mM de Dodecilo Sulfato de Sodio (SDS), 200 mM de NaCl y 50 mM de TrisBase en agua. Para una solución de 200 mL, añade 10 mL de Tris-BASE 1 M (pH 9) en 124,9 mL deddH 2O, añade 57,1 mL de SDS (20%/700 mM) y 8 mL de NaCl (5 M) mientras se remueve. Guarda en RT (Mesa 1).

2. Procedimiento de criofijación y expansión

  1. Preparación de muestras y criofijación
    NOTA: Este protocolo está optimizado para muestras cultivadas/cargadas en cubiertas de 12 mm. Por favor, revisa el volumen de la solución para otro tipo de soporte.
    1. Preparación de muestras
      1. Cultivar la muestra en una condición adaptada a la muestra biológica, ya sea directamente sobre cubiertas de 12 mm (células adherentes de mamíferos) o en suspensión (T. brucei).
      2. Carga la muestra sobre la cubierta (T. brucei) pre-recubierta con polilisina de la siguiente manera: incuba brevemente cubiertas de 12 mm en polilisina (0,2 mg/mL) durante 1 hora a 37 °C, lávalas rápidamente y seca al aire.
      3. Centrifuga los parásitos a 300 g durante 10 minutos a temperatura ambiente (RT). Resuspensión en PBS complementada con un 10% de medio de cultivo y carga en las cubiertas de cubierta 5-10 minutos antes de la criofijación.
    2. Montaje de inmersión (Figura 2A-C)
      PRECAUCIÓN: Trabaja bajo una capucha química con guantes y bata de laboratorio al manipular acetona. Usa bata de laboratorio y gafas de protección siempre que manipules nitrógeno líquido y etano líquido.
      1. Bajo una capucha química, llena 5 mL de tubos (1 cubreta/tubo) con 1 mL de acetona extra seca usando una jeringuilla y una aguja para evitar la contaminación del aire.
        NOTA: Para una mejor preservación biológica de la membrana, es necesario añadir paraformaldehído (PFA)/glutaraldehído (GA) (0,1/0,02 %). Adapta el tubo según el diámetro del abriabridor (los cubridores > 12 mm no caben en tubos de 5 mL).
      2. Congela los tubos en nitrógeno líquido usando una rejilla de plástico o metal resistente al frío para mantenerlos en pie.
      3. Llena la mitad de una caja de poliestireno (paredes de 30 cm x 30 cm de grosor) con hielo seco.
      4. Llena el dewar tipo Vitrobot con nitrógeno líquido hasta que deje de evaporarse y espera 10-15 minutos a que la temperatura se estabilice. El uso de la araña es necesario para facilitar el enfriamiento del sistema (Figura 2B, asterisco). Reponla si es necesario.
      5. Retira la araña y llena la cámara metálica de sumergimiento con etano líquido.
      6. Espera 10 minutos a que el etano esté equilibrado.
        NOTA: Rellena el sistema de inmersión con etano líquido durante el experimento si es necesario (ya no uses la araña en este punto). La transición del etano gaseoso al líquido es difícil. El uso de la presión adecuada es fundamental para la formación de etano líquido. La alta presión evitará la formación de líquido por desbordamiento constante de gas dentro de la cámara metálica, mientras que la baja presión formará etano sólido dentro de la cámara metálica y el tubo de relleno. Evitar la formación de hielo es esencial para el experimento. Mantener la punta de llenado en la interfaz líquido/aire ayuda a prevenir la formación de etano sólido.
    3. Caída (Figura 2A-C)
      PRECAUCIÓN: Utiliza bata de laboratorio y gafas de protección siempre que manipules nitrógeno líquido y etano líquido.
      1. Coge una funda de 12 mm con pinzas finas.
      2. Absorbe cualquier exceso de medio con papel de seda.
      3. Sujeta la cubierta a mitad con las pinzas y un anillo de sujeción adaptado al desatascador criogénico.
      4. Coloca las pinzas que sujetan la cubierta en el soporte del desatascador criogénico. Seca cualquier exceso restante de medio con papel Whatman.
      5. Activa el émbolo criogénico para sumergir el cubrecubierta en la solución de etano de la cámara metálica.
      6. Transfiere rápidamente el abrigo al tubo que contiene acetona congelada (1 cobertura/tubo).
        NOTA: No uses las mismas pinzas para recoger las muestras y para sumergir, evitando la contaminación con el medio de cultivo. Ten especial cuidado si usas cubiertas >de 1 mm (las cubiertas de 15 o 18 mm de diámetro encajan con el portabebés pero pueden ser más difíciles de sumergir). Durante este paso, es posible sumergir el cubrecubierto en nitrógeno líquido tras el sumergimiento para facilitar la transferencia al Eppendorf manteniendo la muestra congelada. Como la acetona se congela a -96 °C, es necesario colocar las cubiertas sobre acetona congelada para la sustitución por congelación.
    4. Sustitución por congelación y rehidratación
      PRECAUCIÓN: Trabaja por debajo del capó al manipular muestras durante la sustitución por congelación. Al subir la temperatura, se crea presión dentro del tubo, lo que puede desencadenar una explosión del tubo.
      1. Incubar los tubos en hielo seco con un ángulo de inclinación (aproximadamente 45°).
      2. Agita durante la noche con un agitador orbital. Coloque la caja cerrada sobre un agitador a 4 °C o RT para que la temperatura suba de -180 °C a -80 °C.
      3. Retira la mayor parte del hielo seco de la caja (solo deja unos pocos en el fondo), libera la presión en los tubos abriéndolos y cerrándolos rápidamente, y sigue agitando durante 45 minutos en el agitador orbital para que la temperatura suba de -80 °C a -20 °C.
      4. Transfiere los cubreabritas a una placa de 12 pozos (o cualquier recipiente conveniente) que contenga una solución de etanol puro preenfriado (100%). Incuba durante 5 minutos y procede con la rehidratación gradual de la siguiente manera: EtOH 100% (5 min) - EtOH 95% (3 min) - EtOH 95% (3 min) - EtOH 70% (3 min) - EtOH 50% (3 min) - EtOH 25% (3 min) - H2O 100%.
      5. Transfiere las cubiertas en PBS y orientalas bajo un microscopio (rascando la superficie con la punta) para que todas estén hacia arriba.
        NOTA: El EtOH al 100% y 95% se almacenan a -20 °C, el EtOH al 70% y el EtOH al 50% a 4 °C y el EtOH al 25% y el ddH2O en RT para seguir aumentando la temperatura hasta la RT. Para el marcaje de membrana, es necesario añadir PFA/GA (0,1%/0,02%) en soluciones de acetona y rehidratación, excepto enddH 2O.
  2. Expansión
    1. Anclaje de proteínas
      1. Preparar una solución fresca de formaldehído al 1,4% / 2% de acrilamida (FA/AA) en PBS 1x.
      2. Coloca los cubrecubos en una placa de pozo 4/12 llena con 0,5/1 mL de AA/FA.
      3. Incubar durante 3-5 horas a 37 °C sin agitación.
        NOTA: El formaldehído vincula grupos aminas libres de proteínas con la acrilamida. El exceso de acrilamida ayuda a limitar la reticulación de proteínas normalmente inducida por formaldehído y ancla las proteínas al polímero de expansión futura. Puede ser necesario alargar el paso de anclaje de proteínas hasta la noche a la mañana, dependiendo de la muestra biológica. En cualquier caso, una incubación más larga no afectará a ninguno de los siguientes pasos. Llena los pozos libres con agua o colócalos en una cámara húmeda para evitar la evaporación.
    2. Gelificación
      1. Descongelación, APS (10%) y solución de gel (acrilato de sodio 19%, acrilamida 10%, bisacrilamida 0,1%, TEMED 0,5% diluido en 10x PBS) sobre hielo 10 minutos antes de la gelificación.
      2. Prepara una cámara húmeda con una fina capa de papel húmedo y parafilm, luego guárdala a 4 °C durante 10 minutos.
      3. Coloca la cámara húmeda sobre hielo.
      4. Saca las cubiertas de la solución de anclaje proteico y retira el exceso de solución con papel de seda (dos seguidas).
      5. Añade APS (concentración final 0,5%) en la solución de gelificación, usa el vórtice durante 2-3 segundos y carga 2 gotas de 35 μL sobre la parapelícula de la cámara húmeda.
      6. Cubre cada gota con la capa de cobertura, las células mirando hacia la solución gelificante.
      7. Incuba en hielo durante 5 minutos para permitir la penetración del gel.
      8. Incuba a 37 °C durante 30-60 minutos.
    3. Desnaturalización
      1. Perfora el gel con una herramienta de biopsia (0,4 cm de diámetro, Figura 2D) y agita durante 10/15 minutos en una placa de 6 pozos llena con 1 mL de tampón de desnaturalización hasta que los geles se desprendan de las cubiertas.
      2. Transfiere el gel a un tubo microcentrífuga de 1,5 mL lleno con un tampón de desnaturalización fresco.
      3. Incubar durante 1 hora y 30 a 95 °C.
      4. Transfiere el gel a ddH2Odurante 10 minutos y repite 3 veces para lavar bien el buffer de desnaturalización.
      5. Mide el gel con papel milimétrico o pinza para evaluar el factor de expansión del gel.
      6. Transfiere el gel a PBS para la inmunotinción.
      7. Alternativamente, almacenar los geles en PBS-azida 0,02% a 4 °C durante un corto periodo (Tabla 1) o a -20 °C para un almacenamiento más prolongado (Tabla 1). Para almacenamiento prolongado, los geles deben incubarse en varios baños de agua: solución de glicerol al 50% durante 2-3 horas bajo agitación y colocados a -20 °C en un volumen suficiente de solución, que debe adaptarse al tamaño del gel.
        NOTA: El gel puede conservarse entero si se prefiere (Figura 2D, E) (paso 2.2.3.1). Se pueden reunir hasta 5 punzones (equivalente a un gel entero) en un solo tubo (paso 2.2.3.2). Se debe respetar la temperatura y el tiempo de desnaturalización (paso 2.2.3.3). El calor alto puede provocar la apertura del tubo, lo que lleva a la evaporación del tampón de desnaturalización y/o la expulsión del gel. Asegúrate de usar tubos de seguro o de cubrirlos. El lavado del gel tras la desnaturalización debe hacerse en agua destilada, ya que el PBS desencadena precipitación de SDS, afectando la eficiencia de los lavados. Este paso desencadenará una ligera expansión del gel que no tendrá consecuencias en los siguientes pasos del protocolo (paso 2.2.3.4). El glicerol puede diluirse en PBS para ahorrar espacio en caso de geles grandes. Para un punzón de 0,4 mm, los geles se almacenan idealmente en una placa de 12 pozos llena con 3 mL de agua: glicerol.

3. Inmunotinción y expansión final

  1. Cambia el baño de PBS por otra incubación de 15 minutos.
  2. Corta todo el gel en 4 partes iguales.
  3. Transfiere las piezas de gel o punzones a un portador adaptado (Figuras 2D, E) e incubar con anticuerpos primarios diluidos en PBS-BSA al 2% durante 3 horas hasta toda la noche con agitación ( véase la Tabla 2 y la Tabla 3 para condiciones detalladas).
  4. Geles de lavado 3 veces con PBS+Tween 0,1% durante 10 minutos de descanso con agitación.
  5. Incubar el gel en anticuerpos secundarios y Hoechst en PBS-BSA al 2% durante 3 horas hasta toda la noche con agitación (véase la Tabla 2 y la Tabla 3 para condiciones detalladas).
  6. Gel de lavado 3 veces con PBS+Tween 0,1% durante 10 minutos de descanso con agitación.
  7. Opcional: Realizar marcaje en pan del proteoma completo incubando gel con éster NHS (véase la Tabla 2 para más detalles) en PBS durante 1h30 en RT bajo agitación, y luego lavar 3 veces en PBS+Tween 0,1% durante 10 minutos.
  8. Transfiere el gel a un portador adaptado y procede con la expansión del gel por incubación en agua destilada (ddH2O).
    NOTA: La concentración y el tipo de detergente (Tween, Triton-X100, Saponina) usados para los jabones anticorporales pueden adaptarse a muestras biológicas. Cambiar el agua varias veces es crucial para eliminar rastros de sales, que impiden la expansión completa.

4. Montaje e imagen

  1. El cobertizo se cubre con polilisina (véase la sección 1.1) cubriendo los engobe con aproximadamente 200 μL de polilisina, incubando 1 hora en RT y lavando 3 veces conddH2Opara eliminar el exceso de polilisina. Deja que las fundas se sequen y guárdalas a 4°C hasta que se usen.
  2. Colocar geles expandidos sobre fundas no recubiertas en la cámara de imagen para comprobar la orientación de las muestras usando un microscopio de fluorescencia.
  3. Una vez orientados, seca los geles sobre un papel sin pelusa para eliminar el exceso de agua y monta sobre fundas recubiertas de polilisina (véase el paso 1.1 para el protocolo).
  4. Observa muestras con un microscopio invertido.

Resultados

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Este artículo destaca los resultados de combinar criofijación con microscopía de expansión en dos tipos diferentes de muestras: células de mamíferos cultivadas y parásitos de T. brucei . Ambas muestras fueron criofijadas o químicamente fijadas en un 4% de PFA antes de la expansión y la inmunotinción. Cabe señalar que otras fijaciones químicas podrían ser más adecuadas para orgánulos específicos (como metanol o glutaraldehído) y que solo se ha elegido PFA, una fijación química común, para comparar con la criofijación por simplicidad.

Se tintorcieron RPE1 humanos (células epiteliales pigmentarias retinianas) para αβ-tubulina, ATP5a y Hoechst para visualizar microtúbulos, mitocondrias y núcleos, respectivamente. Además, los geles se incubaron con éster fluorescente NHS antes de la expansión, un colorante que reacciona con los grupos aminas libres y, por tanto, tiñe todo el proteoma celular. Pudimos observar varias ventajas de la criofijación en comparación con la fijación química, como ya se ha demostrado23. La característica más llamativa fue que la criofijación preservó perfectamente la red mitocondrial, visible tanto mediante NHS-ester como anticuerpos específicos contra la subunidad alfa de la ATP sintasa (ATP5a) (Figura 3A,B). Además, dado que ATP5a está localizado en la membrana mitocondrial interna, podríamos resolver las cristas mitocondriales mediante criofijación (Figura 3B"). Por el contrario, la fijación de PFA no permitía preservar la red mitocondrial y, por tanto, las cristas mitocondriales no eran visibles en esta condición (Figura 3C"). También tiñimos microtúbulos en ambas condiciones y demostramos que la criofijación preservaba mejor los microtúbulos dinámicos, como los microtúbulos citoplasmáticos o astrales (Figura 3B-E). Sin embargo, microtúbulos estables, como los de los centriolos y cilios, orgánulos no membranosos compuestos por tripletes/dobletes de microtúbulos de 9 veces, se conservaron igualmente, si no mejor, en células fijadas en PFA en comparación con las células criofijadas (Figura 3B', C'). Es importante señalar que la criofijación, al preservar la integridad de las proteínas celulares, podría ser menos aplicable a estructuras muy densas como los centriolos o cilios. Esta observación también se ha hecho en estructuras rígidas como los poros nucleares, donde la fijación química desencadena un lavado de proteínas citoplasmáticas, permitiendo una mejor observación de las estructuras de los porosnucleares 23,32. Finalmente, pudimos demostrar que la criofijación también evita el efecto de reticulación de la fijación química, que afecta negativamente a la capacidad de expansión, como se muestra en los husos mitóticos, que estaban casi el doble de expandidos en condición criofijada en comparación con PFA (Figura 3D,E).

Las células de Trypanosoma brucei se coloraron para TDH34 (Figura 4A-D) para visualizar la mitocondria única y paraBiP 35 (Figura 4E,F) para resaltar el retículo endoplásmico. Además, los geles se teñieron con éster fluorescente del NHS. Como se observa en células humanas, la criofijación combinada con la expansión preserva mejor la arquitectura celular general (Figuras 4B, E), especialmente estas dos estructuras membranosas, en comparación con la fijación de PFA (Figura 4C, D, F). El citoesqueleto de microtúbulos de T. brucei es más rígido y estable que el de las células humanas; en consecuencia, no se observó una diferencia significativa entre PFA y criofijación. Además, el límite de resolución de la técnica U-ExM nos impide distinguir microtúbulos individuales (no mostrado).

En general, la criofijación aborda limitaciones de la fijación química clásica, como la preservación de orgánulos membranosos (mitocondrias, retículo endoplasmático) y elementos dinámicos del citoesqueleto (microtúbulos citoplasmáticos o astrales). Además, dado que la criofijación no crea ningún enlace cruzado entre proteínas, preserva completamente la capacidad de expansión, especialmente en estructuras rígidas y densas.

Controlar la calidad de la criofijación y expansión es esencial para preservar la ultraestructura celular de las muestras biológicas. Varios errores pueden resultar en una mala fijación y crear artefactos dentro de las muestras biológicas. Aquí destacamos los inconvenientes y resultados más comunes de la fijación criogénica y los resultados de una mala fijación. El artefacto más evidente creado por la criofijación es la aparición de grietas dentro de la muestra biológica (Figura 5A), también común en la criomicroscopía electrónica. Aunque estas grietas no alteran la ultraestructura intrínseca de los orgánulos, como se muestra en la Figura 5A (inserto) para mitocondrias y microtúbulos, podrían conducir a una mala interpretación de la relevancia biológica de estas grietas y deben considerarse con cautela. No existe una correlación específica entre los problemas de manipulación y la apariencia o abundancia de estas grietas.

Una característica específica indicativa de una mala fijación es la aparición de "estructuras similares a burbujas" dentro del citoplasma celular, indicando la presencia de cristales de hielo. Estas estructuras son especialmente visibles con la tinción de éster del NHS (Figura 5B). Normalmente se acompañan de una conservación limitada de elementos del citoesqueleto, como microtúbulos ondulados (Figura 5B), y una conservación muy pobre de orgánulos membranosos (mitocondrias en la Figura 5B). Estas características presentan problemas importantes de fijación, que pueden ser causados por (i) volumen y/o temperatura inapropiados de etano (pasos 2.2.4-2.2.6 del protocolo), (ii) calentamiento no gradual de la muestra biológica (pasos 2.3 y 2.4 del protocolo) y (iii) presencia de impurezas en la solución de sustitución por congelación (paso 2.2.1 del protocolo). Imágenes representativas de soluciones de acrilato de sodio que destacan el aspecto esperado de un 38% de acrilato de sodio utilizable (incoloro y translúcido [1]) o ligeramente amarillo y translúcido [2]), o no utilizable para expansión (amarillo/naranja y turbio [3]) se muestran en la Figura 5C.

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Figura 1 Flujo de trabajo Cryo-ExM. (A) Las células vivas (células humanas o T. brucei) se criofijan sumergiéndose en etano líquido a -180 °C e incubadas en acetona congelada sobre hielo seco. La sustitución por congelación se realiza mediante un aumento constante y lento de la temperatura de -180 °C a -80 °C mediante incubación sobre hielo seco, lo que desencadena la licuefacción de acetona (-96 °C), y luego de -80 °C a -20 °C mediante incubación sin hielo seco. La rehidratación se realiza mediante baños sucesivos de etanol mezclados con una concentración en forma de media luna de agua destilada junto con un aumento constante de temperatura de -20 °C a temperatura ambiente. (B) Las muestras rehidratadas se proceden para su expansión de la siguiente manera: Las muestras se incuban en una mezcla de acrilamida: formaldehído (AA/FA) a 37 °C, permitiendo anclar las proteínas al polímero hinchado compuesto por acrilamida, bis-acrilamida y acrilato de sodio (AA/BIS/SA), este último confieriendo la propiedad de expansión al gel. Las muestras se incuban en NaCl/SDS a 95 °C para realizar la desestabilización de la interacción proteína-proteína y la desnaturalización suave. Este paso es esencial para la expansión isotrópica. Las muestras se inmunejan con anticuerpos primarios y secundarios regulares y finalmente se expanden en agua destilada. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

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Figura 2. Crio-plungado y configuración de expansión. (A) Crio-émbolo en posición armada (panel superior) y posición abajo (panel inferior). La flecha indica el botón PULSADOR para activar el descenso. (B) Montaje de crio-inmersión listo para la inmersión, mostrando el nivel de nitrógeno líquido (N2) adecuado para criofijación, indicado por la altura de la espuma que rodea el dewar (punta de flecha roja). La araña extraíble está indicada con asteriscos. (C) Ilustración de los pasos clave del crio-precipicio desde mantener la cubierta (arriba a la izquierda), la posición de las cubiertas en dewar de etano líquido (abajo a la izquierda), y del tubo de recogida para la sustitución por congelación (derecha). (D) Ilustración del método de 'punzonamiento en gel' para la inmunotinción en muestras humanas. El gel polimerizado en las cubiertas (1) se corta usando un punzón específico para biopsia (P), formando un punzón de gel de 0,4 cm de diámetro (2), que puede teñirse en una placa de silicona (paneles derechos) para reducir la cantidad de anticuerpo. (E) Ilustración del método de 'corte en gel' para inmunotinción en muestras humanas y de T. brucei . Los geles polimerizados y desnaturalizados (1) se cortan en 4 piezas iguales (2), permitiendo su incubación en una placa de 12 pozos con anticuerpos. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

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Figura 3. Comparación de criofijación y fijación de PFA en células humanas. (A) Imagen de disco giratorio de células RPE1 criofijas y expandidas teñidas para αβ-tubulinas (cian), subunidad 5a de ATP sintasa mitocondrial (ATP5a, amarillo) y éster NHS (rojo/gris) que muestra la excelente conservación tanto de orgánulos de membrana como de elementos del citoesqueleto, incluidos los centriolos y los cilios (punta de flecha). Barra de escala: 10 μm. (B, C) Imagen giratoria del disco giratorio de células RPE1 criofijas (B) y fijas por PFA (C) teñidas para αβ-tubulinas (cian), ATP5a mitocondrial (amarillo) y Hoechst (magenta) con énfasis en cilio primario (flechas, B', C') y mitocondrias (B", C"). Si la criofijación y la PFA preservan por igual los centrioles y los cilios primarios, la criofijación supera ampliamente la PFA en cuanto a preservación de la estructura mitocondrial (B", C"- puntas de flecha rojas indican cristas mitocondriales solo visibles en condiciones criofijas). Barras de escala: 1, 1 y 2,5 μm respectivamente. (D,E) Imagen de disco giratorio de células RPE1 criofijas (D) y fijadas con PFA (E) teñidas para αβ-tubulinas amarilla/gris), ATP5a mitocondrial (magenta) y Hoechst (azul BOP) que muestran que la criofijación permite una mejor expansión del husillo mitótico (puntas de flecha rojas) y preserva mejores microtúbulos del husillo mitótico (flechas rojas). Mediciones de la longitud del husillo mitótico: 12 μm y 7 μm para criofijación y PFA, respectivamente. Barras de escala: 10 μm. Por favor, haga clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

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Figura 4. Comparación entre la criofijación y la fijación de PFA en Trypanosoma brucei. (A, B) Imágenes confocales de células procíclicas criofijadas y expandidas de T. brucei teñidas para la treonina mitocondrial deshidrogenasa (TDH, amarillo) y el éster NHS (rojo/gris), mostrando la excelente preservación de la mitocondria única y la arquitectura general de la célula. Barras de escala: 5 μm. (C, D) Imagen confocal de células procíclicas de T . brucei fijadas y expandidas con PFA teñidas para TDH (amarillo) y éster NHS (rojo/gris). Comparando la preservación de la estructura mitocondrial y la red, la criofijación supera a la fijación PFA. Barras de escala: 5 μm. (E, F) Imágenes confocales de células procíclicas criofijas (E) y PFA fijadas (F) y expandidas de T. brucei teñidas para marcadores endoplásmicos BiP y NHS-éster (gris), mostrando que la criofijación permite una mejor expansión y conservación del retículo endoplásmico. Barras de escala: 5 μm. Por favor, haga clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

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Figura 5. Problemas de criofijación. (A,B) Imágenes de disco giratorio de RPE1 criofijado y expandido teñidas para αβ-tubulinas (cian), subunidad 5a de ATP sintasa mitocondrial (ATP5a, amarillo) y éster NHS (rojo) que muestran efectos clásicos de criofijación: grietas (A, flechas) y burbujas (B, flecha). Aunque las grietas no afectan a las ultraestructuras de orgánulos (A), la presencia de burbujas en el citoplasma (B) indica una mala fijación y altera significativamente la preservación de los orgánulos subcelulares (mitocondrias y microtúbulos, insertos). Barras de escala: 5 μm y 2 μm (insertos). (C) Imagen que muestra diferentes soluciones de acrilato de sodio que destaca el aspecto esperado de un 38% de acrilato de sodio utilizable (incoloro y translúcido (1) o ligeramente amarillo y translúcido (2), o no utilizable para expansión (amarillo/naranja y turbio (3)). Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Tabla 1: Condiciones de almacenamiento de la solución Por favor haga clic aquí para descargar esta tabla.

Tabla 2: Lista de anticuerpos Por favor, haga clic aquí para descargar esta tabla.

Tabla 3: Condiciones de inmunotinción Por favor haga clic aquí para descargar esta tabla.

Discusión

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

En este artículo, presentamos un protocolo detallado que integra la criofijación con la microscopía de expansión (Cryo-ExM), ofreciendo un enfoque robusto para visualizar compartimentos subcelulares evitando artefactos comúnmente asociados a la fijación química, como la distorsión estructural y la pérdida de antígenos. Al preservar la arquitectura celular en un estado casi nativo, Cryo-ExM elimina la necesidad de una optimización extensa de la fijación, permitiendo una localización proteica más precisa.

Aunque el protocolo es generalmente sencillo, varios pasos críticos requieren especial atención para garantizar resultados exitosos. El paso de crio-plunging es especialmente sensible, ya que requiere tanto materiales específicos (véase Tabla de Materiales) como un nivel de destreza, especialmente al manipular el relleno líquido de etano, que representa un posible riesgo. El conocimiento previo de técnicas de criofijación es ventajoso; recomendamos consultar con un especialista en crio-electromagnética o con un responsable de centro de microscopía electrónica al adoptar este método por primera vez. Durante la fase de expansión, es esencial respetar estrictamente las condiciones de desnaturalización, ya que las desviaciones pueden comprometer tanto la preservación como la eficiencia de la expansión. Por último, mantener las condiciones adecuadas de almacenamiento para todos los reactivos (véase la Tabla 1) es crucial para garantizar la reproducibilidad y una calidad de imagen consistente a lo largo del tiempo.

Este artículo destaca varias ventajas clave del protocolo Cryo-ExM. Cabe destacar que la criofijación minimiza la pérdida de proteínas solubles, una limitación común de los métodos convencionales de fijación, y preserva mejor la integridad de la membrana, mejorando así la fidelidad de la imagen celular. Una de las principales fortalezas de esta técnica radica en su compatibilidad con microscopios estándar de campo amplio y confocales. A diferencia de muchos otros métodos de superresolución que requieren equipos especializados y a menudo costosos, el ExM puede implementarse utilizando microscopios de fluorescencia convencionales. Otra ventaja significativa de ExM es su versatilidad. La técnica se ha aplicado con éxito a una amplia variedad de muestras biológicas —desde células individuales hasta tejidos complejos— demostrando su amplia aplicabilidad en diversos ámbitos de investigación. Este artículo enfatiza específicamente la compatibilidad de este protocolo con dos sistemas modelo muy diferentes: T. brucei y células humanas, pero hay que señalar que una muestra más grande o compleja requeriría fijación por congelación a alta presión, ya que el inmersione manual no es suficiente para preservar toda la muestra 24,25,30. La microscopía de expansión ha revolucionado la capacidad de visualizar estructuras celulares a nanoescala que antes eran difíciles o imposibles de resolver, permitiendo avances en campos como la biología celular, la biología del desarrollo y laneurociencia. En particular, el método ha sido transformador en la parasitología, un campo en el que la microscopía óptica convencional a menudo queda corta. Para muchos parásitos, la microscopía de expansión de ultraestructura (U-ExM) ha demostrado ser un factor decisivo, permitiendo la obtención de imágenes de alta resolución de intrincados orgánulos como el apicoplasto, el conoide y los elementos del citoesqueleto con una claridadsin precedentes 6,37,38. Estos avances demuestran el poder de la U-ExM para descubrir detalles estructurales previamente inaccesibles, abriendo nuevas vías para el descubrimiento en biología celular, neurociencia y biología de parásitos, y ayudando en la búsqueda de posibles objetivos terapéuticos. Además, ExM sigue siendo compatible con los anticuerpos de inmunofluorescencia comúnmente utilizados, lo que facilita su integración en los flujos de trabajo existentes. En la mayoría de los casos, los anticuerpos usados habitualmente en microscopía de fluorescencia o western blot funcionan eficazmente en muestras expandidas, eliminando la necesidad de reactivos especializados. Esta accesibilidad hace que Cryo-ExM sea una opción atractiva para muchos laboratorios de investigación biológica, ofreciendo imágenes de alta resolución sin el coste ni la complejidad que suelen asociarse a los sistemas avanzados de imagen.

A pesar de sus ventajas, ExM tiene ciertas limitaciones. Un gran inconveniente es el consumo considerable de anticuerpos, que puede ser costoso o problemático, especialmente para anticuerpos caseros disponibles en cantidades limitadas. Aquí es por qué proponemos esta estrategia protocolaria para reducir el volumen de anticuerpos utilizados para la inmunotinción (Figura 2D,E). El proceso de expansión también aumenta el grosor de la muestra, lo que puede afectar la capacidad de visualizar estructuras más profundas debido a las limitaciones de distancia de trabajo de los objetivos estándar de microscopio. Esta limitación puede ser especialmente desafiante al estudiar muestras más grandes y gruesas, donde las regiones más profundas pueden no ser capturadas eficazmente con microscopios convencionales. Además, la expansión tisular puede a veces introducir distorsiones mecánicas, lo que requiere pasos cuidadosos de validación y corrección para asegurar representaciones espaciales precisas. Finalmente, la ExM clásica depende estrictamente de la fijación de la muestra, que puede variar según muestras biológicas o estructuras subcelulares para observar. Aunque los centriolos y cilios son lo suficientemente estables como para expandirse sin necesidad de fijación previa, los orgánulos celulares requieren diferentes tipos de fijación química (PFA, metanol, glutaraldehído), que pueden crear artefactos e impedir la observación de varias estructuras celulares juntas. Por último, dado que ExM es compatible con diversas modalidades de imagen de superresolución como la Microscopía de Iluminación Estructurada (SIM)39, la Microscopía de Depleción por Emisión Estimulada (STED)40, la Microscopía de Reconstrucción Óptica Estocástica Directa (dSTORM)41 y, más recientemente, la Microscopía de láminade luz 42, el enfoque descrito en este estudio proporciona una herramienta versátil para investigar estructuras celulares con alta precisión. Un estudio reciente combinó criofijación con microscopía de expansióniterativa 32, llevando aún más al límite de la resolución mientras preserva el estado natural de la célula tanto como sea posible gracias a la criofijación.

Al permitir que estas técnicas avanzadas de imagen capturen células en su estado nativo, Cryo-ExM allana el camino para futuros estudios de procesos celulares complejos con una claridad sin precedentes. Este enfoque también abre nuevas posibilidades para la microscopía correlativa de luz y electrónica (CLEM), aumentando aún más su potencial para la imagen multimodal.

En conclusión, ExM representa una herramienta poderosa para la imagen de superresolución con amplia aplicabilidad en diversas muestras biológicas. Su compatibilidad con microscopios estándar, versatilidad en los tipos de muestra y su implementación relativamente sencilla lo convierten en una opción atractiva para muchos laboratorios. Con los continuos avances en la técnica, esperamos nuevas mejoras en la resolución, el uso de anticuerpos y el manejo de muestras que mejoren sus capacidades y la harán aún más accesible para una amplia gama de aplicaciones biológicas. Cryo-ExM, en particular, representa un avance prometedor, ya que proporciona un medio para estudiar estructuras celulares con un detalle excepcional preservando su integridad nativa, superando finalmente los límites de la microscopía moderna.

Divulgaciones

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores declaran que no hay conflicto de intereses

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Agradecemos a Jennifer Vieillard por sus consejos críticos y la lectura del manuscrito. Reconocemos la contribución de SFR Santé Lyon-Est (UAR3453 CNRS, US7 Inserm, UCBL): CIQLE (miembro de LyMIC) para la adquisición de imágenes de células RPE1. Agradecemos a Mónica Fernández Monreal del BIC por darnos acceso al émbolo y al etano, y al Centro de Imagen de Burdeos, unidad de servicio del CNRS-INSERM y de la Universidad de Burdeos, miembro de la infraestructura nacional France BioImaging, por la adquisición de imágenes de T. brucei . Este trabajo fue apoyado por el CNRS (T. brucei) y INSERM (células humanas) y financiado por las siguientes instituciones: Agence National de la Recherche (ANR-20-CE91-0003, ANR-19-CE17-0014 a M.B.), el LabEx ParaFrap (ANR-11-LABX-0024) y la Fondation pour la Recherche sur le Cerveau (FRC-AP2024, M.L). P.H contó con financiación de ANR-OIL (ANR24-CE15-2171-01 a L.R.), L.K contó con el apoyo de ANR-BBDIV (ANR-22-CE13-0014 a B.D)

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Soporte metálico para tubos de 5 mlDominique DutscherQB-E5Paso de sustitución por congelación
Crio-émbolo manual 620RHOSThttps://rhost-em.com/Paso de criofijación
Acetona 99,8% AcroSealAcros OrganicsGato. nº 67-64-1 Paso de sustitución por congelación
Acrilamida 40% (AA)Sigma-AldrichA4058Procedimiento de expansión   (ancla)
Ácido acrílico y nbsp;Sigma-Aldrich8.00181 Procedimiento de expansión (polímero)
Persulfato de amonio (APS)Thermo Fisher17874Procedimiento de expansión (polímero)
Punzón para biopsiaDominique DutscherPUK-40Necesario para cortar el gel antes de la desnaturalización y no es necesario;
BSASigma-AldrichP1379Inmunotinción  
Cámara celular AttofluorInvitrogenA7816Cámara de imagen adaptada a cubiertas de 24 mm para imagen
Cámara de celdasServicio de Ampliación de Vida10900Cámara de imagen adaptada a cubiertas de 18 mm para imagen
Coberturas 12 mm Dominique Dutscher100040Crecimiento de células / unión de T. brucei
Coberturas 24 mm Dominique Dutscher900547Imagens 
Cubiertas de 18mmVWR631-0153Imagens 
Etano gaz Linde Gaz88888DENecesario para la criofijación
Formaldehído 36.5– 38% (FA)Sigma-Aldrich  F8775Procedimiento de expansión   (ancla)
Glutaraldhehído 25% (GA)Sigma-Aldrich  G5882Paso de sustitución por congelación
Glicerol y nbsp;Euromedex EU3550Almacenamiento a largo plazo en gel y nbsp;
Nitrógeno líquido  Linde Gaz2200975Necesario para la criofijación (enfriar el sistema)
Microtubo de bloqueo transparente 5 ml Dominique Dutscher390932ANecesario para la sustitución por congelación
Aguja 18GDominique Dutscher050123BNecesario para recoger acetona
N,N-metilbisacrilamida 2% (BIS)Sigma-AldrichM1533, SIGMAProcedimiento de expansión (polímero)
Paraformaldehído 16% (PFA)EMSGato. Nº 15710Paso de sustitución por congelación
Poli-D-lisinaSigma-AldrichP1024Cubiertas de recubrimiento para muestra / imagen/nbsp;
Poli-L-lisinaSigma-AldrichP1274Cubiertas de recubrimiento para muestra / imagen/nbsp;
Reducidor de presión  Linde GazCPLH0SJ-LIN224Reduicador de presión que permite la distrurgación de etano (criofijación)
Seringe Terumo 10 mlDominique Dutscher50132Necesario para recoger acetona
Kit de elastómeros de siliconaDow4001834Kit para la preparación de placas de pozo en silioneado (inmunotinción) y nbsp;
Acrilato de sodio 97-99% (SA)Sigma-Aldrich408220Procedimiento de expansión (polímero)
AK ScientificR624Procedimiento de expansión (polímero)
Dodecilo sulfato de sodioEuromedexEU0660Procedimiento de expansión (desnaturalización)
Tetrametiletilendiamina (TEMED)Thermo Fisher17919Procedimiento de expansión (polímero)
Tubings y nbsp;Termo Científica8060-0060Tubos para la desplegación de etano (criofijación)
Preadolescente-20Euromedex1005-7Inmunotinción  
Pinzas Dumont n° 5 FineScienceTools11255-20Manipulación de los portados  

Referencias

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