Artículo de método

Lactiloma basado en espectrometría de masas y confirmación de proteínas lactiladas

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DOI:

10.3791/68597

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24 de abril de 2026

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1Department of Immunology and Cell Biology, Faculty of Medicine and Health Sciences, Université de Sherbrooke, 2Centre de Recherche du Centre Hospitalier de l'Université de Sherbrooke (CRCHUS), 3Institut de Recherche sur le Cancer de l'Université de Sherbrooke (IRCUS)

En este artículo

Resumen

Este protocolo describe un método que utiliza líneas celulares de carcinoma escamoso esofágico como ejemplo para analizar la lactilación de proteínas. El proceso consiste en analizar la lactilación de proteínas desde cultivo celular hasta la confirmación de candidatos, incluyendo análisis por espectrometría de masas basado en lactilación y confirmación por inmunoprecipitación.

Resumen

Identificada por primera vez en 2019, la lactilación, una nueva modificación postraduccional (PTM) sobre residuos de lisina, ha demostrado ser de interés en múltiples patologías y contextos fisiológicos. Posee dos isómeros (L- y D-lactilación) y se sabe que altera la formación del complejo, la localización celular o la estabilidad de proteínas objetivo. Este protocolo describe un método para analizar la lactilación desde cultivo celular hasta la confirmación de posibles objetivos lactilados, usando como ejemplo la línea celular TE11 de carcinoma escamoso esofágico. El siguiente protocolo proporcionará detalles sobre la identificación de proteínas lactiladas mediante inmunoprecipitación (IP) específica de L-lactilisina (KL-LA) de péptidos para análisis por espectrometría de masas (EM): (1) extracción de proteínas, (2) reducción de proteínas, alquilación y digestión, (3) purificación de proteínas y concentración de péptidos, (4) IP usando perlas de KL-LA y (5) concentración de péptidos de KL-LA . Siguiendo estos pasos, se realizarán análisis de los datos en bruto de la EM para identificar sitios lactilados, y se describirá la confirmación de estas proteínas lactiladas presuntas mediante IP. Con este método, se puede identificar un rango de 100 a 500 péptidos y se pueden confirmar proteínas lactiladas de interés. Para concluir, estudiar proteínas lactiladas tiene el potencial de mejorar nuestra comprensión de la señalización celular impulsada por PTM tanto en condiciones normales como en condiciones de enfermedad.

Introducción

La lactilación es una modificación postraduccional (PTM) sobre residuos de lisina utilizando metabolitos derivados de la glucólisis. La L-lactil-CoA y la lactoilglutatión son sustratos de la L-lactilación (KL-LA) y la D-lactilación (KD-LA), respectivamente 1,2. La L-lactilación es un proceso enzimático que involucra enzimas como la acetiltransferasa 3,4. Por el contrario, la D-lactilación es un proceso no enzimático por sustitución nucleofílica entre lactoilglutatión y un residuode lisina 5. Como proceso dinámico, las desacetilasas como HDAC1-3 han sido implicadas como borradores de lalactilación 6. Desde su descubrimiento en 20193, se ha demostrado que es de interés en múltiples patologías y contextosfisiológicos 2. Esta PTM fue identificada por primera vez en histonas mediante la observación de un desplazamiento de masa de 72,021 Da mediante el análisis de cromatografía líquida de alta eficiencia (HPLC) con espectrometría de masas en tándem (MS/MS) 3. Desde entonces, se ha detectado lactilación en otras proteínas distintas de histonas y se ha demostrado que afecta a la diversidad funcional, localización o estabilidad de las proteínas modificadas dependiendo delcontexto 7,8,9,10.

Teniendo en cuenta que las MTP suelen estar en baja abundancia11 y forman parte de un proceso dinámico ytransitorio 12, se requiere enriquecimiento de la MTP investigada mediante inmunoprecipitación (IP). A continuación, la EM se utiliza frecuentemente para describir el proteoma ligado a PTM en péptidos digeridos, como el fosfoproteoma o el perfil de ubiquitinación11. Como ocurre con otros PTM, lactiloma o péptidos lactilados enriquecidos, la proteómica basada en EM es el método estándar de oro para identificar nuevos sitios de lactilación.

Este protocolo describe la identificación de péptidos enriquecidos en KL-LA mediante proteómica basada en EM, seguida de la confirmación de proteínas lactiladas mediante inmunoprecipitación. Usando como ejemplo líneas celulares de carcinoma escamoso esofágico (ESCC), describimos un protocolo para extraer proteínas lactiladas para la identificación de objetivos lactilados basada en EM y su posterior confirmación por IP.

Protocolo

Como las PTM son un proceso dinámico y transitorio, es importante preestablecer la confluencia en la que el nivel total de lactilación es óptimo utilizando citometría de flujo o Western blot con un anticuerpoanti-K L-LA . Por ejemplo, una confluencia del 70%-80% es preferible en líneas celulares ESCC para experimentos con lactiloma e IP, ya que el nivel total de lactilación es más alto. Los reactivos y el equipo utilizado se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Cultivo celular

  1. Cultivar células en placas de Petri de 100 mm hasta alcanzar la confluencia requerida, como se indicó anteriormente.
    NOTA: Haz crecer suficientes células para obtener entre 0,5 y 1 mg de proteínas para lactilomas o más de 2 mg para IP.
  2. Enjuaga las células con 5 mL de solución fisiológica prefría 1x tamponada con fosfato (PBS).
  3. Añade 500 μL de PBS preenfriado y cosecha las células usando un raspador de celdas. Transfiere a un microtubo de baja unión de 1 mL.
  4. Centrífuga las celdas a 2.000 x g durante 5 minutos a temperatura ambiente (RT) y descarta el sobrenadante transparente. Los pellets celulares pueden almacenarse a -80 °C.

2. Lactiloma

NOTA: Siempre utiliza guantes para evitar la contaminación de la muestra. Utiliza siempre puntas filtradas, microtubos de baja unión y agua de grado MS.
NOTA: Las réplicas biológicas (3-5 en nuestra experiencia) siempre deben realizarse para asegurar que las modificaciones identificadas sean reproducibles.

  1. Extracción de proteínas
    NOTA: Trabaja sobre hielo.
    1. Prepara el tampón de lisis de lactiloma (Tabla 1) y guárdalo a 4 °C antes de su uso. Añade inhibidores de proteasas justo antes de usar.
    2. Extrae las proteínas utilizando el volumen adecuado de tampón de lisis.
    3. Sonica sobre hielo 12 ciclos de pulso de 5 s + 5 s de apagado a una intensidad del 20%-25%.
    4. Centrifugar a 16.000 x g durante 10 minutos a 4 °C. Transfiere el sobrenadante transparente que contiene las proteínas a un nuevo microtubo de baja unión.
    5. Cuantifica las proteínas usando un kit de ácido bicinquinínico (BCA) según la recomendación del fabricante.
      NOTA: El kit de BCA es compatible con un máximo de 3 M de urea. Por tanto, las muestras deben diluirse en consecuencia.
    6. Transfiere de 500 μg a 1 mg de proteínas a nuevos microtubos de baja unión. Utiliza la misma cantidad de proteína para cada muestra. Completa el volumen de todas las muestras con el tampón de lisis de lactiloma hasta el mismo volumen final.
  2. Reducción, alquilación y digestión enzimática
    1. Añadir ditiotreitol a una concentración final de 5 mM. Incubar a 95 °C durante 2 minutos.
    2. Incubar durante 30 minutos en tiempo de descanso.
    3. Añadir cloroacetamida a una concentración final de 7,5 mM. Incubar en temperatura respiratoria durante 20 minutos en la oscuridad.
    4. Añadir 3 veces el volumen de muestra (del paso 2.1.6) de 1 M (NH4)2CO3 para reducir la urea de 8 M a 2 M.
      NOTA: Si el volumen total supera la capacidad de los microtubos, divídelos en dos microtubos.
    5. Añadir 1 μg de tripsina de grado EM por cada 100 μg de proteínas. Incubar durante la noche a 30 °C. Proceder con la purificación de la muestra.
  3. Purificación y concentración de péptidos
    NOTA: Trabajo en RT.
    1. Acidifica la muestra añadiendo ácido trifluoroacético (TFA) a una concentración final del 0,2%.
    2. Preparar las siguientes soluciones en agua de grado MS frescamente: 0,1% TFA, 1% ácido fórmico (FA) y 1% FA/50% acetonitrilo.
    3. Usa columnas de C18 de 100 mg para proceder con la purificación.
      NOTA: Para usar esta columna, utiliza dos puntas de pipeta: carga la columna con una y corta la punta de la otra para expulsar el líquido de la columna. Asegúrate de que la columna permanezca siempre húmeda. Utiliza una columna por muestra.
    4. Carga la columna con 1 mL de acetonitrilo al 100%, la solución humectante, y expulsa. Repite dos veces.
    5. Equilibra la columna cargando 1 mL de 0,1% TFA y eyección. Repite dos veces.
    6. Carga la columna con 1 mL de la muestra acidificada. Procede con 10 ciclos de carga/expulsión de la muestra. Repite si queda algo de la muestra.
    7. Lava la columna cargando 1 mL de 0,1% de TFA y expulsa. Repite dos veces.
    8. Para la elución, proceda con 10 ciclos de carga/eyección utilizando 750 μL de 1% de FA/50% acetonitrilo. Recoge en un nuevo microtubo de baja unión. Repite con 750 μL adicionales de acetonitrilo al 1%/50% para un total de 1,5 mL de péptidos purificados.
      NOTA: Identifica el microtubo en el lateral en lugar de en la tapa para evitar contaminar muestras al perforar agujeros en la tapa.
    9. Perfora de 1 a 3 orificios en la tapa de los microtubos con una aguja para evaporación.
    10. Utilizando un concentrador de vacío, concentra las muestras a 60 °C durante el tiempo que sea necesario (para muestras en un volumen final de 1,5 mL, esto puede tardar al menos 4 horas). Luego, procede con la inmunoprecipitación de los péptidos.
  4. Inmunoprecipitación usando perlas de KL-LA
    1. Prepara el buffer de lavado y el buffer de IP de lactiloma (Tabla 2).
    2. Sobre hielo, añade 200 μL de tampón IP a los péptidos concentrados, mezclándolos completamente arriba y abajo hasta que se disuelvan. Algunos precipitados aún pueden ser visibles.
    3. Centrifugar a 12.000 x g durante 10 minutos a 4 °C para eliminar cualquier precipitado.
      NOTA: Tras la centrifugación, la muestra puede dosificarse como paso de control usando, por ejemplo, un espectrofotómetro para cuantificar la concentración de péptido a 205 nm.
    4. Lava las perlas conjugadas con agarosa KL-LA 3 veces con 200 μL de PBS 1x helada centrifugando a 2.000 x g durante 1 minuto a 4 °C y retirando el sobrenadante transparente tras cada lavado.
      NOTA: Para 1 mg de proteína al inicio de este protocolo, utilice 20 μL de perlas conjugadas con agarosa deK-L-LA , previamente alicitadas en tubos de baja unión de 0,5 mL para facilitar su uso.
    5. Transfiere el sobrenadante transparente que contiene los péptidos resuspendidos al microtubo de 0,5 mL que contiene las perlas prelavadas. Sella los tubos con película de parafina para evitar fugas.
    6. Incubar durante la noche con una suave rotación de extremo a extremo a 4 °C.
      NOTA: Los pasos 2.4.7-2.4.12 se realizan todos a 4 °C.
    7. Pelleta las perlas por centrifugación a 2.000 x g durante 1 minuto. Desecha el sobrenadante transparente.
    8. Añade 200 μL de buffer de lactiloma IP y lava durante 15 s invirtiendo el tubo. Centrifuga a 2.000 x g durante 30 s y descarta el sobrenadante transparente.
    9. Repite el paso 2.4.8 una vez.
    10. Añade 200 μL de buffer de lavado y lava durante 15 s invirtiendo el tubo. Centrifuga a 2.000 x g durante 30 s y descarta el sobrenadante transparente.
    11. Repite el paso 2.4.10 dos veces.
    12. Añade 200 μL de agua de grado MS y lava durante 30 s invirtiendo el tubo. Centrifuga a 2.000 x g durante 1 minuto y descarta el sobrenadante transparente.
      NOTA: Los pasos restantes del protocolo de lactiloma se realizan en RT.
    13. Eluir los péptidos unidos con 100 μL de tampón de elución (0,1% TFA recién preparado) durante 1 minuto con una suave rotación extremo a extremo en RT. Centrifugar a 2.000 x g durante 2 minutos.
    14. Repite el paso 2.4.13 dos veces más y combina los elues. Procede con la purificación de las muestras.
  5. Concentración y purificación de péptidos de KL-LA
    1. Prepara las siguientes soluciones en agua dulce de grado EM: 0,1% TFA, 1% FA y 1% FA/50% acetonitrilo.
      NOTA: Justo antes de comenzar la purificación, preparar la cantidad adecuada de solución en microtubos de 1,5 mL (paso 2.5.3: 300 μL de acetonitrilo al 100%, paso 2.5.4: 300 μL de 0,1% TFA, paso 2.5.6: 300 μL de 0,1% TFA y paso 2.5.7: 300 μL de 1% de FA/50 %).
    2. Utiliza puntas de C18 de 100 μL para proceder con la purificación.
      NOTA: Las puntas C18 de 100 μL se utilizan de la misma manera que las puntas tradicionales de pipeta. Mantén el pulgar enganchado y nunca suelta el émbolo entre pasos y pasos para mantener la columna húmeda y evitar la entrada de aire.
    3. Aspira 100 μL de acetonitrilo al 100%, la solución humectante, y dispensa cuidadosamente sin expulsar todo el líquido. Repite dos veces.
    4. Equilibra la columna aspirando 100 μL de 0,1% TFA y dispensa con cuidado. Repite dos veces.
    5. Carga la columna con 100 μL de la muestra de péptidos de KL-LA . Procede con 10 ciclos de carga/expulsión en un nuevo microtubo de baja unión. Repite si queda algo de muestra.
    6. Lava la columna aspirando 100 μL de 0,1% TFA y dispensa. Repite dos veces.
    7. Proceder con 10 ciclos carga/eyección para la elución usando 100 μL de 1% FA/50% acetonitrilo en un nuevo microtubo de baja unión. Repita dos veces y combine los eluados.
      NOTA: Los péptidos que se unen a la punta C18 podrían impedir que la punta aspire 100 μL a la vez. Repite este paso hasta que no quede más líquido en el microtubo (300 μL) en el paso 2.5.7.
    8. Perfora de 1 a 3 orificios en la tapa de los microtubos con una aguja para evaporación.
      NOTA: Identifica los microtubos en el lateral del tubo en lugar de en la tapa para evitar contaminar las muestras al perforar los agujeros.
    9. Utilizando un concentrador de vacío, concentra las muestras a 60 °C durante el tiempo necesario para que el líquido se evapore (para un volumen total de 300 μL, puede tardar al menos 2 horas).
    10. Resuspende los péptidos concentrados en 30 μL de 1% de FA.
    11. Siguiendo las pautas de tu plataforma de espectrometría de masas, cuantifica los péptidos con un espectrofotómetro a 205 nm para determinar su concentración.
    12. Transfiere a un frasco de cristal y mantenlo a 4 °C hasta el análisis de EM.

3. Análisis de MS y bioinformática

NOTA: Las muestras se analizaron en la Instalación Central de Proteómica de la Universidad de Sherbrooke utilizando un espectrómetro de masas (MS) (operado en modo de Adquisición Dependiente de Datos con Fragmentación Paralela por Acumulación Serial (DDA-PASEF)).

  1. Espectrometría de masas
    1. Para cada muestra, inyectar 375 ng de péptidos en un sistema de cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC).
    2. Carga péptidos sobre una columna trampa a un caudal constante de 4 μL/min.
    3. Separa los péptidos sobre una columna analítica de C18 usando un gradiente de 2 horas del 5%-37% acetonitrilo en 0,1% de FA a un caudal de 400 nL/min.
    4. Realizar ionización por electropulverización con los siguientes ajustes: voltaje capilar: 1500 V, gas seco: 3,0 L/min, temperatura en seco: 180 °C, presión TIMS-in: 2,6 mBar.
    5. Adquiere los espectros de masas en un rango de 100-1700 m/z usando el modo DDA auto-MS/MS.
      NOTA: El instrumento está configurado para detectar estados de carga de 0 a 5+. Se utiliza una configuración de espectrometría de movilidad de iones atrapados dual (TIMS) con un tiempo de rampa de 100 ms y 10 escaneos de Acumulación Paralela de Fragmentación Serial (PASEF) por ciclo de adquisición, resultando en un ciclo de trabajo de 1,17 s. La exclusión dinámica se establece en 0,4 min.
    6. Realizar fragmentación utilizando una energía de disociación inducida por colisión (CID) con una rampa lineal de 20-59 eV en un rango de movilidad iónica de 0,6-1,6 Vs/cm².
      NOTA: La intensidad objetivo se establece en 20.000, con un umbral de intensidad de 2.500. Se aplica un polígono de filtro estándar para priorizar precursores a lo largo de la línea diagonal de barrido para péptidos cargados +2, +3 y +4 en el plano de movilidad m/z-ión.
  2. Preprocesamiento de datos: Análisis MaxQuant
    NOTA: Los siguientes pasos se realizan utilizando el software MaxQuant v.2.6.713 para identificar los péptidos lactilados.
    1. En la sección superior derecha, haz clic en la pestaña Configuración y verifica que la lactilación se ha añadido como modificación.
    2. Si no, utiliza la base de datosde Unimod.org 14. Inicia sesión como invitado y busca lactilación (acceso #2114).
    3. Haz clic en el botón Añadir . En Nombre, escribe Lactilación (K), introduce la composición tal como está escrita en Unimod haciendo clic en el botón Cambiar .
    4. Verifica la masa monoisotópica obtenida. Haz clic en OK.
    5. En la esquina superior izquierda de la pantalla, en azul, haz clic en el botón Guardar cambios .
    6. En la sección superior izquierda, haz clic en Datos en bruto. Carga archivos de datos en bruto y nómbrales automáticamente usando el botón Sin fracciones .
    7. Establece el número de hilos en la esquina inferior izquierda según el número de núcleos accesibles en el ordenador.
    8. En la pestaña específica del grupo , haz clic en Modificaciones en azul.
    9. Añadir Lactilación a modificaciones de variables haciendo clic en el botón de flecha para añadir al cuadrado de la derecha.
    10. Haz clic en Cuantificación sin etiqueta. Introduce LFQ y cambia el tipo de normalización a ninguno.
    11. Haz clic en Digestión. Asegúrate de que la tripsina/P se añada al cuadrado de la derecha.
    12. Aumenta el máximo de clivajes perdidos a 4 , ya que la lactilación podría afectar la digestión de la tripsina.
    13. Haz clic en Instrumento. Cambia la tolerancia de péptidos de búsqueda principal a 20, considerando que la lactilación no es una PTM común.
    14. En la sección superior izquierda, haz clic en Parámetros Globales. Añade un archivo Fasta, descargado previamente desde Uniprot o Ensembl, para la especie correspondiente.
    15. Haz clic en la regla de identificador y Prueba para asegurarte de que el archivo Fasta puede leerse correctamente.
    16. Haz clic en Cuantificación de proteínas en azul. Añade Lactilación al cuadrado de la derecha.
    17. Haz clic en Identificación en azul. Cambia FDR a 0,05. Asegúrate de que se comprueben los segundos péptidos y la coincidencia entre ejecuciones .
    18. Haz clic en Cuantificación sin etiqueta en azul. Marca las casillas iBAQ y Top3.
    19. En la sección superior derecha, haz clic en Rendimiento.
    20. En la sección inferior, haz clic en Iniciar en azul.
  3. Identificación de proteínas lactiladas
    NOTA: Al final de la ejecución de MaxQuant, se obtendrán múltiples archivos de salida, tales como:
    • Sitios de lactilación (K): archivo principal de interés - contiene información específica del sitio sobre residuos de lisina lactilados en una secuencia peptídica precisa (proteína identificada, localización de la lactilación en secuencia, intensidades, nivel de confianza).
    • Parámetros de lactilación: contiene toda la información sobre ajustes y umbrales utilizados durante el análisis MaxQuant.
    • Péptidos lactilados: péptidos identificados modificados y no modificados.
    • Grupos de proteínas lactiladas: grupos proteicos identificados y su vínculo con la lactilación detectada.
    El uso de esos archivos dependerá de la pregunta de investigación. El siguiente paso describe cómo identificar un sitio lactilado.
    1. Abre el archivo Lactylation (K)Sites en Excel.
    2. Duplica la pestaña en la parte inferior de Lactilación (K)Sitios para conservar los datos originales.
    3. Ordena de la A a la Z las columnas Inverso y Potencial contaminante . Si hay valor en algunas filas, elimina esas filas.
    4. En esta nueva pestaña, solo conserva las columnas necesarias, tales como: (1) Proteína:UniProt 14 Número de acceso primario, (2) Posiciones dentro de las proteínas: Posición predicha de lactilación, importante de confirmar como se describe más adelante, (3) Nombres de proteínas, (4) Nombres de genes, (5) Número de lactilación (K detectado en el péptido correspondiente), (6) Probabilidades de lactilación (K) (Probabilidad de 1 sobre la posición de lactilación), (7) Intensidad (suma de todas las intensidades individuales pertenecientes al péptido correspondiente).
    5. Completa cualquier valor que falte, como nombres de proteínas o nombres de genes.
    6. Solo guarda el primer número de acceso en la columna de ''Proteínas''. La tabla obtenida representa todos los péptidos lactilados detectados junto con la proteína más probable en la que se pueda encontrar este péptido.
      NOTA: Como la lactilación no es una PTM abundante, se espera que entre 100 y 500 péptidos se identifiquen como lactilados. Como los péptidos detectados difieren de una réplica a otra, es posible establecer un umbral de al menos detectado en 2 réplicas biológicas.
    7. Para confirmar la posición de un residuo modificado, utilice una herramienta web de alineación como BLAST de NIH15 o Align de UniProt16 con la secuencia peptídica en la columna ''Probabilidades de lactilación (K)' (borrar cualquier probabilidad) y la secuencia proteica de la base de datosUniProt 17.
      NOTA: Dado que se pueden identificar múltiples sitios de lactilación en una sola secuencia proteica, es posible alinear estos sitios simultáneamente. Esto también ayudará a identificar sitios duplicados que pueden estar en diferentes péptidos pero en la misma ubicación de la secuencia proteica.
    8. El análisis de datos dependerá de la pregunta de investigación, pero es necesario considerar los pasos de normalización, centrado, escalado y transformación logarítmica antes de realizar cualquier análisis estadísticode datos 18.
    9. Para confirmar las proteínas lactiladas identificadas mediante el análisis de EM, proceda con el protocolo de inmunoprecipitación.

4. Inmunoprecipitación (IP)

  1. Extracción de proteínas
    NOTA: Trabaja sobre hielo.
    1. Prepara el tampón de lisis/lavado IP (Tabla 3) y guárdalo a 4 °C antes de usarlo. Añade los inhibidores de la proteasa justo antes de usarlos.
      NOTA: Para la preparación de la muestra, se puede utilizar un pellet celular conservado a -80 °C. Si se trabaja con células nuevas, siga los pasos 4.1.2 y 4.1.3. De lo contrario, resuspende el pellet celular en el mismo volumen de lisis/buffer de lavado IP que se indica en el paso 4.1.2 y continúa con el paso 4.1.4.
    2. Añade 1 mL de lisis/tampón de lavado IP e incuba las células a 4 °C durante 10 minutos.
    3. Extrae células usando un raspador celular y transfiere la lisis a un microtubo de 1,5 mL.
    4. Incuba con una suave rotación de extremo a extremo durante 30 minutos a 4 °C.
    5. Centrifugar a 16.000 x g durante 10 minutos a 4 °C.
    6. Transfiere el sobrenadante transparente a un nuevo microtubo de 1,5 mL.
    7. Cuantifica la proteína con un kit de BCA según el protocolo del fabricante.
  2. Pre-limpieza de las perlas e incubación con anticuerposK-L-LA
    NOTA: Trabajar sobre hielo. Para cada condición experimental, preparar un tubo IP de control (IgG de la misma especie que el anticuerpo KL-LA ) y un tubo para IP KL-LA .
    1. Transfiere 1 mg de proteínas a un nuevo microtubo de 1,5 mL. Completa todas las muestras hasta el mismo volumen final usando lisis/tampón de lavado IP.
      NOTA: Este protocolo puede realizarse usando cuentas magnéticas o de agarosa. Para los siguientes pasos, se utilizaron cuentas magnéticas.
    2. Transfiere el volumen necesario de perlas a un nuevo microtubo de 1,5 mL.
    3. Para prelavar las perlas, magnetízalas durante 30 s o hasta que la solución esté clara. Desecha el sobrenadante transparente. Lava las perlas 3 veces con 500 μL de lisis/tampón de lavado IP. Desecha el sobrenadante transparente tras cada lavado. Añade el mismo volumen de buffer IP que el volumen de perlas tomadas inicialmente.
    4. Incubar las muestras de proteína con 10-15 μL de las perlas prelavadas con una suave rotación de extremo a extremo durante 20 minutos a 4 °C.
      NOTA: Para 1 mg de proteína, utilice entre 10 y 15 μL de perlas magnéticas. Este paso minimiza la unión de proteínas inespecíficas a las perlas durante el protocolo de inmunoprecipitación.
    5. Magnetiza las perlas durante 30 segundos o hasta que la solución esté clara. Transfiere el sobrenadante transparente a un microtubo nuevo de 1,5 mL.
    6. Añade 1,5 μL de anticuerpoanti-K L-LAen un tubo y la cantidad correspondiente de IgG en otro.
      NOTA: Para 1 mg de proteína al inicio de este protocolo, utilice 1,5 μg de anticuerpos.
    7. Incubar las muestras con una suave rotación de extremo a extremo durante la noche a 4 °C.
  3. Inmunoprecipitación KL-LA
    NOTA: Trabaja sobre hielo.
    1. Prepara el tampón de lisis/lavado IP (Tabla 3) y guárdalo a 4 °C antes de usarlo. Añade los inhibidores de la proteasa justo antes de usarlos.
    2. Prelava las cuentas como se describe en el paso 4.2.3.
      NOTA: Para 1 mg de proteína al inicio de este protocolo, utilice 40 μL de perlas magnéticas.
    3. Incubar las muestras con 40 μL de perlas magnéticas prelavadas con una suave rotación extremo a extremo durante 4 horas a 4 °C.
    4. Magnetiza las perlas durante 30 s o hasta que la solución esté clara. Recoge el primer sobrenadante transparente. Lava las perlas 3 veces con 500 μL de lisis/tampón de lavado IP. Retira el sobrenadante transparente tras cada lavado.
      NOTA: El primer sobrenadante puede cuantificarse y usarse en el blot occidental (WB). Es útil evaluar la eficacia de la inmunoprecipitación.
    5. Resuspende las perlas con 20 μL de 2x Laemmli y 5% de buffer β-mercaptoetanol.
    6. Incubar a 95 °C durante 5 minutos antes de cargar en un gel SDS-PAGE. Alternativamente, las muestras desnaturalizadas pueden almacenarse a -20 °C durante varias semanas.
  4. Detección de WB
    1. Coloca los tubos IP sobre el soporte magnético durante 30 segundos antes de recoger la muestra y cargarla sobre un gel SDS-PAGE.
    2. Realizar la albúmina blanca usando un anticuerpo contra la proteína de interés y/o el anticuerpoanti-K L-La para confirmar la extracción de proteínas lactiladas en albúmina sérica bovina al 5% (BSA). Los anticuerpos secundarios se diluyeron a 1:5000 en 5% de BSA.
    3. Detectar las bandas usando la detección de quimioluminiscencia basada en HRP.

Resultados

Por ejemplo, la línea celular TE11 del carcinoma escamoso esofágico se cultivó hasta alcanzar el 80% de confluencia. Siguiendo el flujo de trabajo ilustrado en la Figura 1 y el análisis MaxQuant tal como se describe en este protocolo, se determinó el lactiloma. En esas células, se identificaron 137 péptidos como potencialmente lactilados, representando 82 proteínas únicas, ya que se identificaron múltiples sitios en la misma proteína (Figura 2A). Cabe señalar que esto no tiene en cuenta los péptidos únicos. Se espera un número entre 100 y 500 péptidos identificados en esos experimentos en líneas celulares de carcinoma escamoso esofágico.

Las proteínas lactiladas identificadas están relacionadas con varios procesos biológicos, como la remodelación de la cromatina o el ensamblaje de la cromatina, que ya se habían descrito en la literatura como enriquecidos en proteínas lactiladas (Figura 2B). Algunas de las primeras proteínas lactiladas identificadas fueron histonas, que también pueden encontrarse en estos datos, como la histona H1.2 (Tabla 4). La lactilación pudo identificarse en varios residuos diferentes de lisina de la misma proteína. Por ejemplo, se identificaron dos sitios de lactilación en la histona H1.2: lisinas (K) 168 (probablemente) y 191. En el primer péptido (Tabla 4, línea 2), se observó que el residuo de K168 tiene una mayor probabilidad de ser el lactilado con 0,733 sobre 1, mientras que K169 tiene una probabilidad de solo 0,267. HNRNPA1 es un buen ejemplo de un péptido que requerirá alinearse para determinar el residuo modificado correcto.

Para validar la lactilación de HNRNPA1 basándose en los resultados del lactiloma (Tabla 4), se realizó un ensayo IP dirigido a esta modificación postraduccional. Primero, para determinar qué tipo de perlas muestra la interacción óptima con el anticuerpo anti-KL-LA, se compararon las perlas G y las perlas A/G. Tras realizar IP con un anticuerpo KL-LA y seguida de un albo blanco frente a KL-LA, se observó un enriquecimiento visible de proteínas KL-LA , en comparación con la entrada, como se esperaba, con ambos tipos de perlas (Figura 3). Estos resultados demuestran la eficiencia y robustez del protocolo en el enriquecimiento de proteínas lactiladas. No se observó una diferencia notable entre ambos tipos de perlas analizadas. Para validar los objetivos identificados por la EM, se pueden confirmar IPs específicos. Por ejemplo, se calibró la lactilación de HNRNPA1, que fue identificada por la EM (Tabla 4). Se detectó una banda específica correspondiente a HNRNPA1 tras KL-LA IP y HNRNPA1 WB, lo que indica que HNRNPA1 se modifica por lactilación (Figura 4). Aunque tanto las perlas G como A/G inmunoprecipitaron con éxito la proteína objetivo, se observa una señal de HNRNPA1 más intensa con las perlas A/G, lo que sugiere una mayor afinidad o recuperación.

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Figura 1: Visión general del flujo de trabajo para el análisis de lactiloma. Abreviaturas: IP = Inmunoprecipitación; KL-LA = L-lactilisina; LC-MS/MS = cromatografía líquida-espectrometría de masas tándem. Por favor, haga clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

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Figura 2: Resultados representativos para algunas proteínas obtenidas para el lactiloma de células TE11. (A) Número total de proteínas y péptidos identificados. Se pueden identificar múltiples sitios de lactilación en la misma proteína. (B) Los 5 procesos biológicos principales enriquecidos para proteínas lactiladas en células TE11 obtenidos mediante la base de datos STRING. El valor p fue corregido para múltiples pruebas usando Benjamini-Hochberg. El número en cada barra representa el número de proteínas en la red que se identificaron como lactiladas del total de proteínas en esta Ontología Génica (GO). Por favor, haga clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

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Figura 3: Inmunoprecipitación de KL-LA usando perlas G o A/G y detección en WB dePan-K L-LA en células TE11. La detección de Pan-KL-LA sirve como un control crucial para confirmar la eficacia y especificidad de la inmunoprecipitación de esta PTM. Este experimento asegura que el IP enriquece con éxito las proteínas que albergan la modificación KL-LA . (*) indica las cadenas pesadas y ligeras del anticuerpo, como se observa claramente en IP: Líneas IgG (control IP) (N = 3). Por favor, haga clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

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Figura 4: Inmunoprecipitación de KL-LA usando perlas G o A/G y detección de HNRNPA1 por WB. La detección de HNRNPA1 por WB en inmunoprecipitaciones específicas de KL-LA usando perlas G o A/G confirma su lactilación en células TE11 (N = 3). Por favor, haga clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

SoluciónConcentración final
Urea8 M
Bicarbonato de amonio1 M
HEPES20 mM

Tabla 1: Tampón de lisis de lactiloma. Preparar en agua de grado EM y ajustar el pH a 8.

Solución - Buffer de lavado de lactilomaConcentración final
NaCl100 mM
EDTA1 mM
Tris-HCl20 mM
Añadir para el buffer IP de lactilomaConcentración final
NP-400.5%

Tabla 2: Amortiguador de lavado de lactiloma y tampón IP. Preparando en agua de grado EM y ajustando el pH a 8 para ambas soluciones.

SoluciónConcentración final
Cloruro de sodio100 mM
Fluoruro de sodio50 mM
Tris-HCl (pH 7,5)50 mM
β-glicerofosfato40 mM
EDTA (pH 8)5 mM
Glicerol5%
Triton X-1001%
Añadir fresco:
Cóctel inhibidor de proteasas 100X1X
PMSF1 mM
Orthovanadate0,2 mM

Tabla 3: Lisis/tampón de lavado de IP. Debe estar libre de desnaturalizantes, ya que pueden desestabilizar la presencia de las PTM en las proteínas.

Posiciones dentro de las proteínasProteínaNombres de proteínasNombres de genesNúmero de lactilación (K)Probabilidades de lactilación (K)Intensidad
168P16403Histone H1.2HIST1H1C1KPAAATVTK(0.733)K(0.267)1.98E+04
191P16403Histone H1.2HIST1H1C1SAAK(1)AVKPK6.91E+04
51A8K2U0Proteína tipo alfa-2-macroglobulina 1A2ML11VCLDLSPGYSDVK(1)3.18E+04
5; 5; 5C9JMM0Homólogo de proteína Chromobox 3CBX31ASNK(1)TTLQK1.21E+05
10; 10; 10C9JMM0Homólogo de proteína Chromobox 3CBX31TTLQK(0.828)MGK(0.172)2.49E+05
112; 141O76095-2JTB de proteínasJTB2K(0,858)ALEK(0,18)VRK(0,962)1.47E+04
350; 298; 298; 297; 285; 245;
253; 169; 48; 100; 95; 93; 79;
23; 93; 92; 79; 28; 74; 50; 73;
51; 57; 56; 48; 61; 66; 66; 73		P09651Ribonucleoproteína nuclear heterogénea A1HNRNPA11SSGPYGGGGQYFAK(1)PR6.13E+04

Tabla 4: Resultados representativos para péptidos lactilados obtenidos para la línea celular TE11 de carcinoma escamoso esofágico. Esta tabla se obtiene tras el análisis MaxQuant.

Discusión

Este protocolo describe cómo la inmunoprecipitación de proteínas modificadas por KL-LA puede utilizarse en la EM para descubrir nuevas proteínas lactiladas y sus sitios de lactilación. Este protocolo de lactiloma se realiza utilizando perlas conjugadas, pero podría lograrse usando anticuerpo KL-LA o incluso anticuerpoK D-LA según la pregunta de investigación. Si se utiliza un anticuerpo en lugar de perlas conjugadas, elegir un anticuerpo policlonal facilita la formación de complejos más cerrados, ya que puede unirse a múltiples epítopos; sin embargo, este enfoque puede introducir variabilidad. Una ventaja de usar perlas conjugadas es que evitan que el anticuerpo se libere del soporte sólido, lo que podría contaminar las muestras de EM. También es más eficiente en tiempo que usar un anticuerpo no conjugado.

Además, es importante señalar que la cantidad de péptidos identificados en este tipo de análisis puede verse influenciada por múltiplesfactores: 1. En primer lugar, la especificidad de anticuerpos desempeña un papel crucial para asegurar que se capture la proteína correcta. Añadir un paso de pre-limpieza con perlas de agarosa podría ser una forma de eliminar interacciones inespecíficas. Por otro lado, se desconoce si la lactilación puede afectar a la digestión de tripsina, ya que corta los péptidos en el lado c-terminal del residuo de arginina, pero lo más importante, en el residuo de lisina. Si este es el caso, podría conducir potencialmente a una reducción de la cobertura peptídica. Por tanto, es posible considerar otras opciones para proteasas. En este protocolo, el parámetro ''Max. cliavages omitidos'' se incrementa para tener en cuenta esta limitación. Por último, también debe considerarse la preparación y manipulación de la muestra, como el uso de guantes para evitar la contaminación de muestras con queratina de la piel, por ejemplo, o la estabilidad de la modificación, ya que la renovación PTM es un proceso dinámico y a vecesrápido 6.

A diferencia del enfoque más amplio de la EM que llevó a una baja detección de PTM de baja abundancia, como la lactilación, la identificación de péptidosL-LA enriquecidos con K mediante proteómica basada en EM permite un análisis detallado de los sitios PTM, como la identificación de los sitios de lactilación y proteínas lactiladasrecién caracterizados 19. Western blot puede proporcionar información sobre el patrón general de lactilación presente en las células, pero no puede informar sobre la lactilación específica de proteínas. Así, IP es el enfoque comúnmente utilizado para confirmar la detección de PTM20 detectada por EM. El ensayo de ligadura por proximidad (PLA) es otra técnica que puede usarse para confirmar la lactilación de posibles objetivos identificados por laproteómica 21. Esta técnica también puede indicar la localización de las proteínas modificadas, pero tiene una especificidad menor. Utilizar un enfoque IP específico para lactilación es apropiado para un cribado PTM amplio, pero podría ser interesante realizar IP específico de proteínas dependiendo de la pregunta de investigación en juego.

Al cuantificar la proporción de una proteína lactilada específica en un extracto total de proteína, realizar una IP por sí sola no es suficiente. Aunque la IP usando perlas deL-LA de K permite capturar proteínas lactiladas, no cuantifica con precisión la proporción de lactilación, ya que se limita a proteínas objetivo enriquecedoras. Por ello, se requiere espectrometría de masas, que proporciona un análisis más detallado que permite una medición cuantitativa precisa de la lactilación. Así, realizar IP de una proteína potencialmente lactilada usando un anticuerpo contra esa proteína, seguido de un análisis de espectrometría de masas, podría determinar el porcentaje de proteínas lactiladas en una muestra total de proteína, mientras que realizar IP es un enfoque eficiente para confirmar la lactilación de las proteínas identificadas como lactiladas por la EM.

En un IP que utiliza anticuerpos no conjugados, optimizar la proporción perla-anticuerpo es esencial para asegurar una captura óptima de proteínas lactiladas. De hecho, el equilibrio entre estos dos componentes impacta directamente en la especificidad y eficiencia del IP. Un exceso de anticuerpos puede conducir a una unión inespecífica, lo que aumenta el ruido de fondo y reduce la precisión global de la detección. En cambio, lo contrario puede conducir a un enriquecimiento ineficiente de proteínas objetivo, resultando en señales más débiles y una sensibilidad reducida. Estas consideraciones técnicas son fundamentales para obtener resultados fiables y precisos en el estudio de proteínas lactiladas.

Para concluir, este protocolo puede utilizarse para monitorizar cambios en los perfiles de lactilación tras la desregulación de la homeostasis, como el cáncer 8,10, que podrían afectar la respuesta relacionada con fármacos. La identificación de biomarcadores incluso podría lograrse mediante este método. Aplicable a múltiples líneas celulares, tipos de tejido e incluso biopsias de pacientes, esta técnica tiene el potencial de profundizar en la comprensión de la señalización celular impulsada por PTM en enfermedades o condiciones normales.

Divulgaciones

No hay conflicto de intereses que revelar.

Agradecimientos

Agradecemos sinceramente a todos los miembros del Laboratorio Giroux por sus debates científicos. Estamos agradecidos a la plataforma de Proteómica y espectrometría de masas de la Facultad de Medicina y Ciencias de la Salud - Université de Sherbrooke por ofrecer servicios y orientación. VG cuenta con el apoyo del Consejo de Investigación en Ciencias Naturales y Ingeniería de Canadá (RJPIN-2019-06185) y los Institutos Canadienses de Investigación en Salud (178171). VG posee la Cátedra de Investigación de Canadá Nivel 2 en Biología de Células Madre Gastrointestinales. MH es beneficiario de becas del Centre de Recherche en Inflammation et Oncologie Digestive de l'Université de Sherbrooke, Université de Sherbrooke-Fondation De Sève, CRCHUS, el programa TRaIning A New Generation of researchers in Gastroenterology and LivEr (TRIANGLE) y FRQ. FMB es becario FRQS Merit Research Scholar (366044). VG y FMB son miembros del "Centre de Recherche du CHUS" financiado por FRQS.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Punta zip de 100 uL C18 Pierce87784
Aclamación PepMap100 C18Dionex Corporation1649460,3mm de identificación x 5mm
Acetonitrilo (grado MS)FisherA955-4
Bicarbonato de amonioSigma-AldrichA6141-500
Anticuerpo monoclonal anti-HNRNPA1Novus Biologicals NB100-672
Anticuerpo monoclonal anti-L-Lactillysine (KL-La)PTM-BioPTM1401RM
Anti-IgG de ratón, anticuerpo vinculado a HRPCST7076S
Anti-IgG contra conejos, anticuerpo vinculado a HRPCST7074S
Azure 280BiosistemasAZI280-01
Equipación BCAThermo Fisher ScientificP123227
Albúmina Sérica de Bovin (BSA)Wisent800-095-EG
Fuente nanoESI de Cautividad SprayBruker Daltonics
CloroacetamidaSigma-AldrichC0267
Sustrato Clarity Max Western ECLBio-Rad1705062
Ditiotreitol (TDT)Thermo Fisher ScientificR0861
Dynabeads Protein G para inmunoprecipitaciónThermo Fisher Scientific10004D
EDTASigma-AldrichE9884
Ácido fórmico (FA; grado de máster)Thermo Fisher ScientificA117-50
GlicerolFisher ScientificBP229-1
HEPES (1M)Wisent330-050-EL
Columna Hypersep C18 100mgFisher60108-302
Cuentas conjugadas de agarosa KL-LAPTM-BioPTM-1404
Laemmli 2X (SDS, Bromofenol)Wisent, J.T. Baker800-100-CG, D293-01
Microtubo de baja unión 0,5 mLSarstedt72.704.600
Microtubo de baja unión 1,5 mLThermo Fisher ScientificP190410
Microtubo 1,7 mLAxygenMCT-175-C
Sistema HPLC NanoEluteBruker DaltonicsTamaño de partícula de 1,9 um, 75 um de identificación x 25 cm
Anticuerpo policlonal IgG de Conejo normalMillipore Sigma12-370
PepSepBruker Daltonics1811112
Solución salina tamponada con fosfato (PBS)Wisent311-425-CL
PMSFThermo Fisher Scientific36978
Cóctel inhibidor de proteasas (PIC)Sigma-AldrichP8340-5
Partículas magnéticas de proteína A/G de Sera-Mag SpeedBeadsThermo Fisher Scientific09-981-920
Cloruro de sodioSigma-AldrichS9888-500
Fluoruro de sodioSigma-AldrichS1504
Ortovanadato sódicoSigma-AldrichS6508
TimsTOF pro espectrómetro de masas  Bruker Daltonics
Ácido trifluoroacético (TFA)Thermo Fisher ScientificA116-50
Tris-HClWisent600-125-IK
Triton X-100Sigma-AldrichX100
Tripsina (grado MS)Pierce90058
UreaThermo Fisher ScientificU15-500
Vaccufuge plusEppendorf22820168
Agua (grado MS)VWR10803-890A
β-glicerofosfatoSigma-AldrichG5422
β-mercaptoetanolSigma-AldrichM3148

Referencias

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