Este protocolo describe un sistema de fijación del transductor de ultrasonido diseñado específicamente para la estimulación por ultrasonido de la médula espinal en ratones despiertos. El método emplea un sistema de fijación para garantizar un posicionamiento preciso del transductor de ultrasonido y, al mismo tiempo, permitir que los sujetos experimentales se muevan libremente sin comprometer la precisión de la estimulación.
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Artículo de método
Fijación de transductores de ultrasonido para la neuromodulación de la médula espinal en ratones
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Resumen
Resumen
El ultrasonido focalizado (FUS) se ha convertido en una innovadora tecnología de neuromodulación no invasiva que demuestra un potencial significativo para la regulación neural de la médula espinal. Sin embargo, lograr una fijación estable del transductor a lo largo de la columna vertebral presenta desafíos técnicos notables. Los métodos de inmovilización existentes a menudo requieren anestesia prolongada del animal o demuestran una confiabilidad de adhesión inadecuada. Estas limitaciones críticas subrayan la necesidad urgente de desarrollar un nuevo paradigma de fijación que garantice tanto la estabilidad operativa como la compatibilidad fisiológica. Este protocolo introduce un innovador sistema de fijación del transductor de ultrasonido para la estimulación de la médula espinal en ratones despiertos que se mueven libremente. Establecer un método confiable para la colocación precisa del transductor de ultrasonido en la columna vertebral es clave para los experimentos de neuroestimulación. Este método integra tres fases: exposición quirúrgica del cuerpo vertebral T13, rectificado de precisión del proceso espinoso para crear una interfaz de contacto plana y unión adhesiva segura de la base metálica y el colimador a la columna vertebral utilizando material de base de dentadura postiza y mezcla adhesiva. Permite comportamientos motores naturales a través del movimiento sin restricciones y asegura un posicionamiento estable con una variación espacial mínima entre sesiones, lo que facilita la investigación de intervenciones de la médula espinal mediadas por ultrasonido en modelos animales conscientes. Es particularmente relevante para los estudios que requieren evaluaciones conductuales en la reparación de lesiones espinales, la modulación de la barrera hematoespinal y los mecanismos de dolor crónico. Al abordar un desafío técnico crítico en la investigación de la neuromodulación de animales despiertos, este protocolo ofrece una interfaz transductor-espinal estable sin restricción de movimiento, allanando el camino para resultados experimentales más precisos y confiables.
Introducción
La médula espinal es un centro crucial para integrar información entre los sistemas nerviosos central y periférico, lo que la hace valiosa para la investigación clínica en áreas como la transducción de señales de dolor, la reconstrucción de redes neuronales motoras y la regulación de la neuroplasticidad. El ultrasonido focalizado (FUS), una tecnología emergente de neuromodulación no invasiva, se ha convertido en un medio importante de regulación neural de la médula espinal. Con sus características físicas de penetración de tejido profundo, resolución espacial a nivel milimétrico y parámetros de salida de energía controlables, su aplicación se extiende desde la investigación básica de neuromecanismos hasta estudios preclínicos de traducción de varios modelos patológicos de la médula espinal.
La investigación muestra que FUS puede regular los circuitos neuronales de la médula espinal de dos maneras: inhibiéndolos o activándolos a través de efectos térmicos y mecánicos. También se caracteriza por su reversibilidad temporal y seguridad para los tejidos 1,2,3. En el estudio de modelos de lesión de la médula espinal, FUS ha mejorado la capacidad motora de las ratas al modular las respuestas inflamatorias y promover la reparación neuronal 4,5,6. Además, se ha demostrado que FUS abre la barrera hematoespinal y mejora la eficiencia de la administración local de fármacos a través de un efecto de cavitación mediado por microburbujas 7,8. En el campo del dolor neuropático, Liao et al. han confirmado que FUS alivia eficazmente las manifestaciones de dolor neuropático en ratas al regular la expresión de KCC2 e inhibir la vía CaMKIV KCC29. Song et al. demostraron que tsFUS de baja intensidad aplicado en la médula espinal lumbar redujo significativamente la alodinia mecánica y suprimió la activación microglial en un modelo de lesión por constricción crónica en ratas10. Lograr una modulación precisa de la médula espinal con FUS depende de la estabilidad espacial del sistema de suministro de energía por ultrasonidos. Las estrategias de fijación actuales se dividen principalmente en dos categorías: 1) Método de fijación rígida: Logra un posicionamiento preciso mediante el uso de un marco estereotáctico, pero requiere anestesia continua, lo que suprime la actividad neuronal de los sujetos experimentales y afecta la validez de las evaluaciones conductuales 1,2,3,4,10 ; 2) Método de fijación flexible: Permite la investigación en sujetos conscientes mediante el uso de un dispositivo de cinturón elástico, pero debido a la gran movilidad de la columna vertebral, hay errores de desplazamiento y desprendimiento del transductor 6,8,9. Además, la heterogeneidad geométrica de la lámina de la columna vertebral conduce a una atenuación significativa de la energía ultrasónica, reduciendo la eficiencia de la modulación neuronal 7,8.
Este estudio propone de manera innovadora un esquema de fijación de transductor de ultrasonido enfocado implantable para la investigación de la modulación neural de la médula espinal en ratones conscientes que se mueven libremente. Este protocolo utiliza un enfoque quirúrgico mínimamente invasivo para integrar la base metálica, el colimador y la columna vertebral, admite el uso repetido del transductor de ultrasonido, asegura la consistencia del objetivo del ultrasonido y mantiene la atenuación de la energía del ultrasonido a través de la lámina dentro de un rango aceptable. La metodología desarrollada aborda las limitaciones críticas de los enfoques existentes, lo que permite experimentos de neuromodulación de la médula espinal más confiables y reproducibles en animales despiertos y que se comportan. Los parámetros clave incluyen una incisión de 2,5 cm en la línea media en T13, fijación de la base de metal de acero inoxidable y una relación de volumen de 3:1 entre el material de la base de la dentadura postiza y el adhesivo de cianoacrilato. Las limitaciones incluyen una invasividad quirúrgica moderada y una precisión dependiente del operador en la preparación de la superficie ósea.
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Protocolo
Todos los procedimientos con animales descritos en el presente estudio fueron aprobados por el Comité Ético Institucional de Experimentación Animal de los Institutos de Tecnología Avanzada de Shenzhen (número de certificado: SIAT-IACUC-200721-YGS-NLL-A1313). Todos los experimentos utilizaron ratones machos C57BL/6J (8 semanas de edad). Los ratones pesaban entre 18 y 22 g en el momento de la cirugía.
1. Inducción y mantenimiento de la anestesia (5 ± 1 min)
- Precargue el circuito de anestesia durante 5 min.
- Configure la cámara de inducción para administrar isoflurano al 4% en el aire medicinal a un caudal de 2 L / min.
- Cambie a la ventilación con mascarilla después de la pérdida del reflejo de enderezamiento.
- Ajuste el vaporizador para mantener una concentración de 1.5-2% de isoflurano.
- Mantenga la temperatura corporal del ratón con una manta térmica a 37 °C, con un rango objetivo de 36-38 °C durante la anestesia.
- Aplicar pomada oftálmica Terramicina.
2. Posicionamiento (1 ± 1 min)
- Utilice un adaptador estereotáctico ajustable para el mouse.
- Coloque el ratón en decúbito prono con alineación espinal para mantener la curvatura fisiológica espinal.
- Asegure la cabeza del mouse con barras para los oídos.
- Coloque las extremidades simétricamente.
3. Preparación del campo quirúrgico (1 ± 1 min)
- Utilice una maquinilla eléctrica (espacio entre cuchillas de 0,1 mm) para eliminar el vello del sitio quirúrgico.
- Asegúrese de que el área de depilación sea de aproximadamente 3 cm × 1 cm.
- Realice tres pasadas de recorte en la dirección opuesta al crecimiento del vello.
4. Incisión y abordaje (2 ± 1 min)
- Limpie el área con yodóforo 3 veces (intervalos de 30 s).
- Palpe la última costilla (unida a la vértebra T13 en ratones) y utilícela como
el hito principal. Cree una incisión de 2,5 cm a nivel vertebral T13 a lo largo de
la línea media dorsal con un bisturí. - Diseccionar secuencialmente la fascia subcutánea.
- Exponer los músculos paraespinales a través de los planos anatómicos.
5. Disección del músculo paraespinal (5 ± 1 min)
- Ajuste el aumento del microscopio quirúrgico a 5x para una visualización óptima de los músculos paraespinales y las estructuras vertebrales.
- Realice una disección aguda de los músculos paraespinales con microtijeras.
- Reseque completamente los músculos paraespinales dorsales y laterales mientras preserva las capas musculares ventrales.
- Controle el sangrado con una gasa hemostática absorbible.
6. Instalación de base metálica (1 ± 1 min)
- Monte la varilla de fijación (plástico) en el adaptador estereotáctico.
- Monte la base metálica personalizada (acero inoxidable, 0,28 g) en el extremo distal de la varilla (Figura 1A).
- Coloque la base metálica personalizada bilateralmente en las apófisis transversales espinales T13.
- Verifique la estabilidad del acoplamiento.
7. Preparación de la interfaz ósea (2 ± 1 min)
- Eliminar el tejido muscular residual de la lámina y los procesos espinosos bajo el microscopio quirúrgico.
- Logre una hemostasia completa con la compresión de preparaciones de algodón estériles.
- Cree una superficie de contacto plana con un taladro óseo de precisión con irrigación salina continua. Opere el taladro a una velocidad de 5,000-10,000 rpm para minimizar la generación de calor. Use un protector ocular y una máscara durante la perforación.
- Elimine el polvo óseo con hisopos de algodón humedecidos con solución salina.
8. Sellado del sistema de fijación (3 ± 1 min)
- Mezcle los materiales base de la dentadura postiza y el adhesivo de cianoacrilato (pegamento 502) en una proporción de volumen de 3:1. Use guantes de nitrilo y gafas de seguridad para evitar el contacto con la piel y los ojos.
- Fije el colimador ultrasónico (plástico, 0,6 g, Figura 1B) y la base metálica a la columna vertebral utilizando la mezcla adhesiva (Figura 1C).
- Deje que la mezcla adhesiva se cure en condiciones ambientales controladas (24 ± 1 °C, 40-60% de humedad relativa). Mantenga el posicionamiento estático durante 60 s hasta la confirmación visual de la solidificación completa (pérdida de brillo superficial y formación de una interfaz rígida).
- Separe la base metálica de la varilla de fijación de plástico.
- Verificación de la estabilidad de fijación: Aplique una fuerza de rotación suave a la base metálica en el plano horizontal. Observe la interfaz colimador-vértebra con un aumento de 5x para cualquier desplazamiento (tolerancia de <0,1 mm). Si el movimiento excede la tolerancia, vuelva a aplicar la mezcla adhesiva (paso 8.2) y repita el curado (paso 8.3).
9. Cierre de heridas (1 ± 1 min)
- Alinee los bordes de la herida para encapsular completamente la base de metal.
- Realice suturas interrumpidas con suturas de seda 4-0.
- Limpie la incisión con yodóforo.
- Limpie los restos de sangre/hueso residuales dentro del sitio de exposición laminar del colimador y empaquételos con algodón estéril para sellar y hemostasia.
10. Manejo postoperatorio
- Termorregulación: Mantenga al ratón sobre una manta térmica (37 ° C) hasta la recuperación completa de la deambulación (generalmente 2-3 h después de la anestesia).
- Profilaxis antibiótica postoperatoria: Administrar cefazolina sódica (50 mg/kg, disuelta en solución salina al 0,9% a una concentración de 50 mg/ml) mediante inyección subcutánea en la región dorsal del cuello inmediatamente después de la cirugía.
- Mantenga la higiene de las heridas. Limpie la herida con un hisopo de algodón humedecido con solución salina una vez al día durante los primeros 3 días y realice una inspección diaria del sitio quirúrgico en busca de signos de infección, dehiscencia o inflamación.
- Analgesia postoperatoria: Administrar carprofeno (5 mg/kg, por vía subcutánea) cada 12 h durante 3 días postoperatorios11.
NOTA: La Figura 1D muestra el sistema de fijación implantado en un ratón vivo después de la recuperación.
11. Eliminación de residuos peligrosos
- Recoja el polvo óseo y los materiales contaminados con sangre en bolsas de riesgo biológico a prueba de fugas etiquetadas con símbolos de "Riesgo biológico" para transferirlas a una instalación autorizada de eliminación de desechos médicos.
- Coloque el material base de la dentadura postiza sin curar y los residuos de pegamento 502 en recipientes sellados resistentes a productos químicos etiquetados como "Desechos químicos" y guárdelos en un gabinete ventilado designado para su eliminación a través de protocolos de gestión de desechos químicos.
- Deseche las agujas, las hojas de bisturí y los taladros óseos en recipientes para objetos punzantes resistentes a las perforaciones marcados con etiquetas de "riesgo biológico".
12. Advertencias de seguridad
- Cuando manipule materiales a base de dentaduras postizas, evite el contacto directo con la piel usando guantes de nitrilo y gafas de seguridad, y realice la mezcla y el curado en una campana extractora bien ventilada para minimizar la inhalación de monómeros volátiles.
- Deseche el material residual como residuo químico según las pautas institucionales. Para los adhesivos de cianoacrilato 502, evite el contacto con la piel o los ojos y enjuague inmediatamente con agua durante 15 minutos si se produce exposición, buscando ayuda médica. Úselos en áreas ventiladas, guárdelos en lugares frescos y secos lejos de fuentes de ignición y evite el contacto con telas de algodón o lana.
- Cuando use taladros de precisión, asegure la pieza de mano, use un protector facial y una máscara quirúrgica, e irrige el sitio de perforación con solución salina para evitar lesiones térmicas.
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Resultados
Prueba de campo abierto
La prueba de campo abierto se diseñó para evaluar posibles cambios de comportamiento en ratones después de la cirugía (Figura 2A). Se empleó una cámara de campo abierto estándar de 40 cm × 40 cm para garantizar suficiente espacio de actividad para los ratones mientras se mantenían condiciones ambientales relativamente consistentes y se minimizaba la interferencia externa. El experimento constó de dos fases: preoperatoria y 7 días posoperatoria. En ...
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Discusión
Este estudio presenta un novedoso protocolo de acoplamiento vertebral que facilita la neuromodulación ecográfica precisa de la médula espinal en ratones despiertos y que se comportan libremente. A diferencia de los enfoques de fijación convencionales, esta metodología supera las limitaciones de los enfoques de fijación convencionales. A diferencia de los marcos estereotácticos rígidos que necesitan anestesia continua (que suprime la actividad neuronal y complica las evaluaciones conductu...
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado en parte por el Proyecto de Puesta en Marcha de Investigación Científica de Talento de Alto Nivel del Hospital de la Universidad de Hong Kong-Shenzhen bajo la subvención HKUSZH202207003. Agradecemos sinceramente a todos los miembros del laboratorio por su ayuda en la optimización del protocolo y el cuidado de los animales, y al Instituto de Tecnología Avanzada de Shenzhen, Academia China de Ciencias (SIAT), por su apoyo institucional.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Cámara de inducción de anestesia | Shenzhen RWD | https://www.rwdls.com/product-solutions/life-sciences/modeling/anesthesia-parts | |
| Adhesivo de cianoacrilato (pegamento 502) | Fábrica química de Beijing | https://item.taobao.com/item.htm? detail_redpacket_pop=verdadero& id=736 869038961& ltk2=1752156592779 mdbp47qqp4vyv57mq156e& ns=1& priceTId=214780251752156543206 3926e1996& query=502%E8%83% B6%E6%B0%B4%20%E5%8C%97 %E4%BA%AC%E5%8C%96%E5% B7%A5%E5%8E%82& skuId=52584 34238219 | |
| Materiales base de la dentadura postiza | Dental del Nuevo Siglo | https://www.sncdental.com/product-item-11.html | |
| Varilla de fijación | Costumbre | ||
| Isoflurano | Shenzhen RWD | https://www.rwdls.com/product-solutions/life-sciences/modeling/anesthesia-parts | |
| Base metálica | Costumbre | ||
| Microinstrumento | Shenzhen Zongshi Scientific Instruments Co., Ltd. | ||
| Taladro de precisión | Shenzhen RWD | https://www.rwdls.com/product-solutions/life-sciences/modeling/auxiliary-equipment | |
| Sistema de anestesia multicanal para animales pequeños | Shenzhen RWD | https://www.rwdls.com/product-solutions/life-sciences/modeling/anesthesia/data_66.html | |
| Adaptador estereotáctico para ratones y ratas juveniles | Changsha Mayue | https://item.taobao.com/item.htm?abbucket=14&detail_redpacket_pop =verdadero& id=651346369142& ltk2=1752 157416717wlsrozz5uroehtbq5ycim4 & ns=1& priceTId=214781ce1752157 3520498589e101a& query=%E8%84 %91%E7%AB%8B%E4%BD%93%E5%AE% 9A%E4%BD%8D%E4%BB%AA%20% E9%95%BF%E6%B2%99%E8%BF% 88%E8%B6%8A& skuId=4891677573 207& spm=a21n57.1.hoverItem.14& utparam=%7B%22aplus_abtest% 22%3A%22a478799868a3178d0dd 433b763909e16%22%7D& xxc= taobaoSearch | |
| Microscopio quirúrgico | Shenzhen Zongshi Scientific Instruments Co., Ltd. | https://www.rwdls.com/product-solutions/life-sciences/modeling/auxiliary-equipment | |
| Sutura quirúrgica (Prolene) | Ethicon (Johnson & Johnson) | https://item.taobao.com/item.htm?abbucket=14&detail_redpacket_pop =verdadero& id=774292384846& ltk2= 1752157506907c0321finubb5 rpkub6av6n& ns=1& priceTId= 214781ce1752157493734800 4e101a& query=%E5%BC%B A%E7%94%9F%E7%BC%9D %E7%BA%BF& skuId=594224 1331046& spm=a21n57.1.hoverI | |
| Ungüento oftálmico de terramicina | Pfizer | https://theterramycin.com/terramycin-ophthalmic-ointment/ | |
| Colimador ultrasónico | Costumbre |
Referencias
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Reimpresiones y permisos
