Artículo de método

Técnicas multiómicas para perfilar las transiciones de estado de la cromatina en colangiocitos primarios de ratón de baja entrada

DOI:

10.3791/68606

⸱

3 de julio de 2025

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Medical Oncology, Tianjin First Central Hospital, School of Medicine, Nankai University, 2Department of Biochemistry and Molecular Biology, School of Basic Medical Sciences, Tianjin Medical University, 3Shenzhen Hospital, Southern Medical University, 4Tianjin Institute of Urology, The Second Hospital of Tianjin Medical University, Tianjin Medical University

En este artículo

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este manuscrito presenta un protocolo completo para modificaciones de histonas de ChIP-seq de baja entrada para perfilar y ATAC-seq para evaluar la accesibilidad de la cromatina en pequeñas cantidades de colangiocitos primarios de ratón.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La enfermedad hepática poliquística (EPL) es un trastorno hereditario caracterizado por la formación de quistes llenos de líquido derivados de los colangiocitos, lo que conduce a una enfermedad progresiva y una reducción significativa de la calidad de vida de los pacientes. Los tratamientos actuales para la DLP son inadecuados, lo que enfatiza la necesidad de nuevas estrategias terapéuticas. El papel de la regulación epigenética en la progresión de PLD, en particular la accesibilidad a la cromatina y las modificaciones de las histonas, sigue siendo poco explorado. Las técnicas tradicionales de perfil epigenético, como ChIP-seq y DNase-seq, requieren un gran número de células, que son difíciles de obtener a partir de los colangiocitos primarios. Para abordar esto, optimizamos los protocolos ChIP-seq y ATAC-seq de baja entrada para números bajos de colangiocitos primarios. Estos enfoques permiten el análisis de las modificaciones de las histonas y la accesibilidad de la cromatina con una entrada mínima de células. ChIP-seq de baja entrada utiliza nucleasa microcócica (MNasa) para la fragmentación del ADN, mientras que ATAC-seq emplea la transposasa Tn5 para capturar regiones abiertas de cromatina. Estas técnicas multiómicas proporcionan información valiosa sobre la dinámica del estado de la cromatina durante las transiciones del destino de los colangiocitos en la PLD y otras enfermedades biliares. Es importante destacar que los protocolos optimizados se pueden aplicar con confianza a otras células primarias de baja entrada, lo que permite la exploración de mecanismos epigenéticos en diversos contextos celulares. Este trabajo presenta un enfoque sistemático para el estudio de las alteraciones del estado de la cromatina, contribuyendo al desarrollo de estrategias terapéuticas basadas en la epigenética para la PLD y enfermedades relacionadas.

Introducción

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La DLP es un trastorno hereditario caracterizado por el desarrollo de múltiples quistes llenos de líquido derivados de los colangiocitos. A medida que estos quistes se expanden progresivamente, impactan severamente en la calidad de vida de los pacientes 1,2. Las estrategias de tratamiento existentes para la DLP son inadecuadas, proporcionando solo beneficios limitados y con frecuencia conducen a altas tasas de recurrencia y complicaciones 3,4. Por lo tanto, existe una necesidad apremiante de enfoques terapéuticos más seguros y efectivos para enfrentar los desafíos clínicos no resueltos en el tratamiento de la DLP.

En condiciones normales, los colangiocitos permanecen inactivos, mientras que en la PLD presentan una proliferación excesiva, un factor clave de la progresión de la enfermedad 5,6. Los mecanismos moleculares que subyacen a esta transición quística siguen sin estar claros. Si bien la regulación epigenética, incluida la accesibilidad a la cromatina y las modificaciones de las histonas, desempeña un papel vital en las transiciones del destino celular 7,8, su papel en la progresión de la PLD sigue siendo poco estudiado. Sin embargo, muchas técnicas de perfil epigenético requieren un gran número de células. El ChIP-seq tradicional, que se basa en la fragmentación de la cromatina por sonicación, así como los ensayos de accesibilidad a la cromatina como DNase-seq y MNase-seq, suelen requerir más de 10a 6 células, muy por encima del número que se puede obtener de los colangiocitos primarios.

Este manuscrito proporciona un protocolo completo para ChIP-seq 9,10,11 de baja entrada para perfilar modificaciones de histonas y ATAC-seq 11,12,13 para evaluar la accesibilidad de la cromatina en un número bajo de colangiocitos primarios. ChIP-seq de baja entrada emplea MNasa para fragmentar el ADN9, mientras que ATAC-seq captura fragmentos de ADN de regiones abiertas de cromatina utilizando la transposasaTn5 12. El análisis multiómico que utiliza estos enfoques ofrece información valiosa sobre la dinámica del estado de la cromatina durante las transiciones del destino de los colangiocitos en la PLD y otras enfermedades biliares, lo que facilita el desarrollo de terapias epigenéticas dirigidas.

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Protocolo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Preparación de soluciones y colangiocitos para ATAC-seq

  1. Al menos 1 día antes del experimento ATAC-seq, prepare el tampón de lisis ATAC utilizando los reactivos enumerados en la Tabla 1.
    NOTA: ATAC Lysis Buffer puede almacenarse a 4 °C en la oscuridad durante al menos 1 mes.
  2. En el caso de los colangiocitos primarios recién aislados14, se contarán las células con un hemocitómetro inmediatamente después del aislamiento y se procederá con el experimento ATAC-seq.
    NOTA: Cuanto antes, mejor para minimizar el impacto en la viabilidad celular. Sin embargo, si se mantiene en hielo, proceder dentro de las 2 horas generalmente no es un problema.

2. ATAC-seq

NOTA: Utilice 100.000 colangiocitos para ATAC-seq. Mantenga las muestras y soluciones en hielo. Para el experimento ATAC-seq, todo el procedimiento dura aproximadamente 2 días.

  1. Centrifugar a 500 × g durante 5 min a 4 °C.
  2. Deseche el sobrenadante, agregue 200 μL de tampón de lisis ATAC que contiene inhibidor de proteasa, pipetee suavemente para mezclar e incube en hielo durante 20 minutos. Durante los primeros 10 minutos, pipetee suavemente para mezclar.
  3. Centrifugar a 1.500 × g durante 10 min a 4 °C.
  4. Prepare el tampón de reacción de transposición (50 μL) mezclando 3 μL de mezcla de enzimas del kit de preparación de la biblioteca de ADN de ATAC, 10 μL de tampón 5x del kit de preparación de la biblioteca de ADN de ATAC y 37 μL de agua sin nucleasas. Homogeneizar.
  5. Deseche con cuidado el sobrenadante, coloque la bolita nuclear recolectada en hielo e inmediatamente agregue 50 μL de tampón de reacción de transposición. Vuelva a suspender e incubar suavemente a 37 °C durante 60 minutos, agitando el fondo del tubo cada 10 minutos para mezclar.
    NOTA: Prepare el tampón de reacción de transposición antes de desechar el sobrenadante para evitar que las células se sequen.
  6. Purifique el ADN utilizando el kit de purificación PCR de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
    NOTA: Las perlas de proteína G residuales del proceso de aislamiento de colangiocitos14 podrían eliminarse en este paso. Las muestras de ADN pueden almacenarse a -80 °C para su conservación a largo plazo.
  7. Realice la construcción de la biblioteca utilizando el kit de preparación de bibliotecas de ADN ATAC de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
    NOTA: Mantenga todas las muestras y soluciones en hielo a menos que se especifique lo contrario. Si bien los procedimientos pueden diferir entre otras marcas de kits, todos son compatibles con nuestro protocolo.
    1. Enriquecimiento de PCR: Prepare la mezcla de enriquecimiento de PCR (50 μL) en un tubo de PCR mezclando los siguientes componentes en el orden especificado: 10 μL de muestra de ADN (del paso 2.6), 14 μL de agua sin nucleasas, 10 μL de 5x TAB, 5 μL de PPM, 1 μL de TAE, 5 μL de cebador P5 y 5 μL de cebador P7. Pipetear suavemente para mezclar.
    2. Transfiera el tubo a un instrumento de PCR y ejecute el siguiente programa: (72 °C durante 3 min) x 1 ciclo, (98 °C durante 30 s) x 1 ciclo, (98 °C durante 15 s, 60 °C durante 30 s, 72 °C durante 3 min) x 15 ciclos y (72 °C durante 5 min) x 1 ciclo, y manténgalo a 4 °C.
    3. Purificación: Lleve las perlas DNA Clean a temperatura ambiente durante 30 minutos antes de usarlas, luego realice una purificación magnética de perlas en dos pasos.
      1. Primera ronda: Añadir 30 μL de perlas DNA Clean a los productos PCR (a partir del paso 2.7.2), pipetear suavemente para mezclar e incubar a temperatura ambiente durante 5 min. Coloque el tubo de PCR en un separador magnético y espere hasta que la solución se aclare (~5 min). Transfiera con cuidado el sobrenadante a un nuevo tubo y deseche las perlas de DNA Clean.
      2. Segunda ronda: Añadir 7,5 μL de perlas DNA Clean al sobrenadante recogido (del paso 2.7.3.1), pipetear suavemente para mezclar e incubar a temperatura ambiente durante 5 min. Coloque el tubo en un separador magnético y espere hasta que la solución se aclare (~5 min). Deseche con cuidado el sobrenadante.
    4. Mantenga el tubo en el separador magnético y enjuague las perlas DNA Clean durante 2 x 30 s con 200 μL de etanol al 80% recién preparado a temperatura ambiente. Deseche cuidadosamente el sobrenadante después de cada enjuague. Con el tubo aún en el separador magnético, abra la tapa del tubo y seque las perlas al aire durante 10 minutos. Por último, añade 22 μL de agua libre de nucleasas para eluir el ADN.
      NOTA: Las muestras de ADN pueden almacenarse a -80 °C para su conservación a largo plazo.
  8. Secuenciar las bibliotecas utilizando un secuenciador estándar de última generación.
    NOTA: Recomendamos obtener al menos 50 millones de lecturas de extremo de par.

3. Preparación de soluciones y colangiocitos para ChIP-seq de bajos insumos

  1. Al menos 1 día antes del experimento ChIP-seq de baja entrada, prepare el tampón de lisis ChIP, el tampón ChIP MNase, el tampón ChIP Stop, el tampón ChIP 2x RIPA, el tampón ChIP RIPA y el tampón ChIP LiCl utilizando los reactivos enumerados en la Tabla 2, Tabla 3, Tabla 4 y Tabla 5.
    NOTA: Las soluciones anteriores pueden almacenarse a 4 °C durante al menos 1 mes.
  2. En el caso de los colangiocitos primarios14 recién aislados, se contarán las células con un hemocitómetro inmediatamente después del aislamiento y se procederá con el experimento ChIP-seq de baja entrada.
    NOTA: Cuanto antes, mejor para minimizar el impacto en la viabilidad celular. Sin embargo, si se mantiene en hielo, proceder dentro de las 2 horas generalmente no es un problema.

4. Día 1 de ChIP-seq de baja entrada: lisis celular, digestión de MNasa e incubación de anticuerpos

NOTA: Para el experimento ChIP-seq de baja entrada, todo el procedimiento dura aproximadamente 3 días.

  1. Divida los colangiocitos en alícuotas de 100.000 células por tubo y mantenga las muestras y soluciones en hielo.
    NOTA: Si se realiza un experimento ChIP-seq de baja entrada para múltiples modificaciones de histonas, es aceptable aumentar el volumen proporcionalmente antes de agregar el anticuerpo de modificación de histonas. Los volúmenes de reactivos de los siguientes pasos se basan en un tubo que contiene 1 × 105 células.
  2. Centrifugar a 2.000 × g durante 5 min a 4 °C.
  3. Deseche el sobrenadante, agregue 19 μL de tampón de lisis ChIP que contiene inhibidor de proteasa, pipetee suavemente para mezclar e incube en hielo durante 10 minutos. Evita generar burbujas.
  4. Agregue 19 μL de tampón ChIP MNase y pipetee suavemente para mezclar.
  5. Agregue 2 μL de MNasa (0,01 U/μL) y pipetee suavemente para mezclar. Incubar a 37 °C durante 5 min.
    NOTA: El tiempo de incubación es crítico. La concentración final de MNasa es de 0,0005 U/μL. La concentración óptima de MNasa se puede determinar en función del tipo y el número de células.
  6. Coloque inmediatamente la muestra en hielo, agregue 5 μL de tampón ChIP STOP para finalizar la digestión y pipetee suavemente para mezclar.
  7. Añadir 45 μL de tampón ChIP 2x RIPA que contiene inhibidor de la proteasa, pipetear suavemente para mezclar y seguir incubando en hielo durante 10 minutos.
  8. Centrifugar a 20.000 × g durante 15 min a 4 °C. Transfiera lentamente el sobrenadante a un tubo nuevo.
    NOTA: Las perlas de proteína G residuales del proceso de aislamiento de colangiocitos14 podrían eliminarse en este paso.
  9. Añadir 40 μL de tampón ChIP RIPA.
  10. Para muestras de inmunoprecipitación (IP), añadir 1 μg de anticuerpo por muestra e incubar la suspensión en un rotador (20 rpm) a 4 °C durante la noche.
  11. Para las muestras de entrada, no agregue ningún anticuerpo e incube la suspensión en un rotor (20 rpm) a 4 °C durante la noche.

5. Día 2 de ChIP-seq de bajos insumos: Inmunoprecipitación, lavado y elución

NOTA: Para muestras de IP, siga los pasos 5.1-5.7. Para muestras de entrada, siga los pasos 5.8-5.12.

  1. Prelava las perlas de proteína G con 1 ml de tampón ChIP RIPA helado.
  2. Añadir 400 μg de perlas de proteína G a las muestras e incubar con rotación (20 rpm) a 4 °C durante 2 h.
  3. Lave las perlas durante 5 x 5 min con 150 μL de tampón ChIP RIPA helado durante 5 min a 4 °C en un rotador (20 rpm). Retire el sobrenadante con un separador magnético.
  4. Lave las perlas con 150 μL de tampón ChIP LiCl helado durante 5 min a 4 °C en un rotador (20 rpm). Retire el sobrenadante con un separador magnético.
  5. Añadir 30 μL de tampón de elución ChIP (29 μL de agua sin nucleasas y 1 μL de proteinasa K) para resuspender las perlas y agitar a 900 rpm a 55 °C durante 90 min. Golpee suavemente el tubo periódicamente para mantener las cuentas en suspensión.
  6. Recoja el sobrenadante con un separador magnético y transfiéralo lentamente a un nuevo tubo. Incubar a 72 °C durante 40 min para inactivar la proteinasa K.
  7. Mida la concentración de ADN con un fluorómetro.
    NOTA: Las muestras de ADN pueden almacenarse a -80 °C para su conservación a largo plazo.
  8. Para las muestras de entrada, añadir 1 μL de proteinasa K y agitar a 900 rpm a 55 °C durante 90 min.
  9. Purifique el ADN mediante la extracción con fenol-cloroformo. Agregue 130 μL de reactivo de extracción de ADN y vórtice vigorosamente hasta que la solución se vuelva rosada. Centrifugar a 20.000 × g durante 5 min.
  10. Transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo, agregue 130 μL de isopropanol helado y luego agregue 1 μL de glucógeno y 6,5 μL de NaM 3A. Centrifugar a 20.000 × g durante 15 min.
  11. Deseche el sobrenadante, lave una vez con 1 mL de etanol al 70% y centrifugue a 20.000 × g durante 15 min. Seque el pellet y vuelva a suspenderlo en 30 μL de agua libre de nucleasas.
  12. Mida la concentración de ADN con un fluorómetro.
    NOTA: Las muestras de ADN pueden almacenarse a -80 °C para su conservación a largo plazo.

6. Día 3 de ChIP-seq de bajos insumos: Construcción de bibliotecas y secuenciación

  1. Realice la construcción de bibliotecas utilizando un kit de preparación de bibliotecas de ADN ChIP de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
    NOTA: Los pasos incluyen la preparación final, la ligadura del adaptador y la amplificación de la biblioteca. Pipetea 5 ng de muestras ChIP (muestras de entrada e IP) para la construcción de bibliotecas. Mantenga todas las muestras y soluciones en hielo a menos que se especifique lo contrario. Si bien los procedimientos pueden diferir entre otras marcas de kits, todos son compatibles con nuestro protocolo.
  2. Preparación final: Prepare el tampón de reacción de preparación final (65 μL) en un tubo de PCR mezclando 5 ng de muestra de ADN (del paso 5.6 o el paso 5.11), 15 μL de End Prep Mix 4, 6,5 μL de Tris EDTA y agua sin nucleasas hasta un volumen final de 65 μL. Pipetear suavemente para mezclar. Transfiera el tubo a un instrumento de PCR y ejecute el siguiente programa: 20 °C durante 15 min, 65 °C durante 15 min y manténgalo a 4 °C (tapa caliente: 105 °C).
  3. Ligadura del adaptador: Diluya el adaptador de ADN S en una proporción de 1:100. Prepare el tampón de reacción de ligadura del adaptador (100 μL) en un tubo de PCR mezclando 65 μL de productos de preparación final (del paso 6.2), 25 μL de tampón de ligadura rápida 2, 5 μL de ADN ligasa rápido y 5 μL de adaptador de ADN diluido S. Pipetear suavemente para mezclar. Transfiera el tubo a un instrumento de PCR y ejecute el siguiente programa: 20 °C durante 15 min, seguido de una retención a 4 °C (tapa caliente: 105 °C).
  4. Purificación:
    1. Lleve las perlas DNA Clean a temperatura ambiente durante 30 minutos antes de usarlas. Añadir 60 μL de perlas DNA Clean a los productos de ligadura adaptadora (a partir del paso 6.3). Pipetear suavemente para mezclar e incubar a temperatura ambiente durante 5 min.
    2. Coloque el tubo de PCR en un separador magnético y espere hasta que la solución se aclare (~5 min). Deseche con cuidado el sobrenadante.
    3. Mantenga el tubo en el separador magnético. Enjuague las perlas DNA Clean durante 2 x 30 s con 200 μL de etanol al 80% recién preparado a temperatura ambiente. Deseche cuidadosamente el sobrenadante después de cada enjuague.
    4. Con el tubo aún en el separador magnético, abra la tapa del tubo y seque las perlas al aire durante 5 minutos. Por último, añadir 22,5 μL de 10 mM de Tris-HCL (PH 8,0) para eluir el ADN.
  5. Amplificación de bibliotecas: Prepare el tampón de reacción de amplificación de bibliotecas (50 μL) en un tubo de PCR mezclando 20 μL de productos de purificación (del paso 6.4), 2,5 μL de cebador de PCR i5, 2,5 μL de cebador de PCR i7 y 25 μL de mezcla de amplificación. Pipetear suavemente para mezclar. Transfiera el tubo a un instrumento de PCR y ejecute el siguiente programa: (95 °C durante 3 min) x 1 ciclo, (98 °C durante 20 s, 60 °C durante 15 s, 72 °C durante 30 s) x 18 ciclos, (72 °C durante 5 min) x 1 ciclo y manténgalo a 4 °C.
  6. Purificación: Lleve las perlas DNA Clean a temperatura ambiente durante 30 minutos antes de usarlas, luego realice una purificación magnética de perlas en dos pasos.
    1. Primera ronda: Añadir 30 μL de perlas DNA Clean a los productos de amplificación de la biblioteca (a partir del paso 6.5). Pipetear suavemente para mezclar e incubar a temperatura ambiente durante 5 min. Coloque el tubo de PCR en un separador magnético y espere hasta que la solución se aclare (~5 min). Transfiera con cuidado el sobrenadante a un nuevo tubo y deseche las perlas de DNA Clean.
    2. Segunda ronda: Añadir 7,5 μL de perlas DNA Clean al sobrenadante recogido. Pipetear suavemente para mezclar e incubar a temperatura ambiente durante 5 min. Coloque el tubo en un separador magnético y espere hasta que la solución se aclare (~5 min). Deseche con cuidado el sobrenadante. Mantenga el tubo en el separador magnético. Enjuague las perlas DNA Clean durante 2 x 30 s con 200 μL de etanol al 80% recién preparado a temperatura ambiente. Deseche cuidadosamente el sobrenadante después de cada enjuague. Con el tubo aún en el separador magnético, abra la tapa del tubo y seque las perlas al aire durante 10 minutos. Por último, añadir 22,5 μL de 10 mM de Tris-HCl (PH 8,0) para eluir el ADN.
      NOTA: Las muestras de ADN pueden almacenarse a -80 °C para su conservación a largo plazo.
  7. Secuenciar las bibliotecas en un secuenciador estándar de última generación.
    NOTA: Recomendamos obtener al menos 10-20 millones de lecturas de extremo de par.

7. Análisis de datos de ATAC-seq y ChIP-seq de baja entrada

  1. Preparación del entorno virtual de análisis (miniconda)
    1. Descargue Miniconda3 desde el sitio web usando los siguientes comandos y siga las instrucciones de instalación de Miniconda.
      wget https://mirrors.tuna.tsinghua.edu.cn/anaconda/miniconda/Miniconda3-4.7.12.1-Linux-x86_64.sh
      Bash Miniconda3-4.7.12.1-Linux-x86_64.sh
    2. Cree un entorno virtual para la canalización de análisis de ATAC-seq y ChIP-seq.
      conda create -n NGSpipeline
      conda activate NGSpipeline
      conda install bioconda::fastqc bioconda::multiqc bioconda::trim-galore bioconda::bowtie2 bioconda::samtools bioconda::macs2 bioconda::d eeptools bioconda::p icard bioconda::igv
    3. Descargue el archivo de secuencia del genoma de referencia y haga un índice de alineación para la alineación bowtie2.
      wget https://ftp.ebi.ac.uk/pub/databases/gencode/Gencode_mouse/release_M25/GRCm38.p6.genome.fa.gz
      Gunzip GRCm38.p6.genome.fa.gz
      bowtie2-build-s GRCm38.p6.genome.fa GRCm38_bowtie2_index
  2. Realice el control de calidad de las lecturas de ATAC-seq y ChIP-seq con FastQC y resuma el informe de control de calidad mediante MultiQC para garantizar el sesgo de GC de los resultados de secuenciación y la complejidad suficiente de la biblioteca para el análisis posterior. Descarte la biblioteca de secuencias con resultados de control de calidad significativamente diferentes.
    fastqc -o < directorio de salida> ......
    multiqc
  3. Adaptador de secuenciación de recorte utilizando abundante recorte.
    trim_galore -q 20 --phred33 --rigency 3 --length 25 -e 0.1 --paired -j -o
  4. El mapa recortado lee el ensamblaje del genoma de referencia mm10 con Bowtie2 utilizando los parámetros predeterminados y pasa los parámetros de adición (--very-sensitive -X 2000) a bowtie2 para ATAC-seq debido a la amplia distribución de longitud del fragmento ATAC-seq.
    1. Para ATAC-seq:
      Bowtie2 -p --very-sensitive -X 2000 -x <índice del genoma del paso 7.1.3> -1 -2 | samtools view -S -O BAM -@ -o
    2. Para ChIP-seq:
      Bowtie2 -p -x <índice del genoma del paso 7.1.3> -1 -2 | samtools view -S -O BAM -@ -o
  5. Elimine las lecturas con puntuación de alineación baja (q30) y las lecturas alineadas con el genoma de las mitocondrias y el cromosoma no estándar.
    samtools view -bh -q 30 -f 2 | samtools view -h | grep -v 'chrM' | grep -v 'random' | grep -v 'chrUn' | samtools sort -l 9 -O BAM -o
  6. Utilice el comando MarkDuplicates de Picard para eliminar las lecturas duplicadas de PCR.
    picard MarkDuplicates I= O= M= REMOVE_DUPLICATES=verdadero
  7. Llame al pico usando el comando MACS2 callpeak con el parámetro -f BAMPE -g mm -B -q 0.01.
    macs2 callpeak -f BAMPE -t < eliminar el archivo bam de duplicación > -g mm -n -B -q 0.01
  8. Genere archivos BigWig con el comando BamCoverage de Deeptools.
    Índice de Samtools -@ 4
    bamCoverage -b <     eliminar archivo bam de duplicación> -o -bs 50 -p --effectiveGenomeSize2652783500--normalizeUsing RPGC -e -ignoreDuplicates
  9. Utilice el navegador del genoma IGV para ver el archivo narrowPeak de macs2 y los archivos BigWig de Deeptools BamCoverage.

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Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Para generar el paisaje de cromatina de los colangiocitos primarios, optimizamos los protocolos ChIP-seq y ATAC-seq de baja entrada para números bajos (~100,000) de colangiocitos primarios. Los resultados de la electroforesis en gel de agarosa para colangiocitos primarios indicaron que para 1 × 105 colangiocitos primarios, 0,02 U MNasa a 37 °C durante 5 min resultó en la producción de mononucleosomas, que se identificó como la concentración óptima (Figura 1).

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Discusión

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Para mapear de manera sistemática y exhaustiva la dinámica del estado de la cromatina que subyace a la transición de estado de los colangiocitos quísticos, optimizamos con éxito ChIP-seq y ATAC-seq de baja entrada para un número limitado de colangiocitos primarios. Aunque este estudio se centró en los colangiocitos primarios, estamos seguros de que el protocolo también se puede aplicar a otras células primarias de alta viabilidad con disponibilidad limitada. Del mismo modo, aunque este e...

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Divulgaciones

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores no tienen conflictos de intereses que declarar.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este trabajo fue apoyado por subvenciones de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (82402166 a R.J.).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
0,5 M EDTASolarbioE1170
1 M Tris-HCl (pH = 7,5)SolarbioT1140
1 M Tris-HCl (pH = 8,0)SolarbioT1150
3 M NaAcBeyotimeST342
8 M LiClSigmaL7026
Gel de agarosaBiosharpBS081
ATAC Biblioteca de ADN Kit de preparaciónVazymeTD501
CaCl2Sangon BiotechA5013301 M stock
ChIP DNA Library Prep Kit de preparaciónVazymeND607
DNA Clean beadsVazymeN411
Reactivo de extracción de ADNSolarbioP1012
EGTASolarbioE8050100 mM (pH = 8) stock
FluorómetroInvitrogenQ33226
GlucógenoThermo ScientificR0561
HemocitómetroQIUJINGXB. K.25.
Igepal CA-630SigmaI889610% stock
Separador magnéticoPromegaZ5342
MgCl2Sangon BiotechA1002881.5 M stock
MNaseSigmaN37550.01 U/µ L stock
NaClSangon Biotech A6104765 M stock
NP40SolarbioN8030
Agua libre de nucleasasLife TechnologiesAM9937
Instrumento de PCRApplied Biosystems4484073
Kit de purificación de PCRQIAGEN28106
Inhibidor de proteasaRoche
Perlas de proteína GInvitrogen10004D
Proteinasa KTransGenGE201-01
RotadorKylin-BellQB-528
SDSSolarbioS801010% 
stock Desoxicolato de sodioSigmaS1827
Thermomixer comfortEppendorf5355
Triton X-100SolarbioT8200
Tween-20SolarbioT8220
SoftwareCitation (PMID)/CompanyVersionWebsite
Bowtie2223882862.3.5.1https://github.com/BenLangmead/bowtie2
Deeptools270799753.4.3https://deeptools.readthedocs.io/en/latest/
FastQC0.12.1https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/
IGV212210952.12.3https://igv.org/
MACS2187989822.2.7.1https://hbctraining.github.io/Intro-to-ChIPseq/lessons/05_peak_calling_macs.html
MinicondaAnaconda4.7.12.1https://www.anaconda.com/
MultiQC273124111.23https://seqera.io/multiqc/
Picard2.27.5https://broadinstitute.github.io/picard/
samtools335908611.6https://www.htslib.org/
trim-galore0.6.6https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/trim_galore/
04693132001

Referencias

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