Microscopía de localización por ultrasonido para el mapeo de superresolución de la microvasculatura cerebral de roedores

Resumen

La microscopía de localización por ultrasonidos (ULM) es una técnica desarrollada recientemente que permite un nivel de resolución sin precedentes en la obtención de imágenes de la microvasculatura in vivo. En este trabajo, describimos en detalle cómo obtener imágenes superresueltas de la microvasculatura cerebral en roedores utilizando una plataforma de imágenes de ultrasonido funcional estandarizada diseñada para la investigación preclínica.

Resumen

La microscopía de localización por ultrasonidos (ULM) es una técnica de imagen de superresolución que permite la visualización in vivo de la arquitectura microvascular del cerebro superando el límite de difracción del ultrasonido convencional. Al detectar y rastrear microburbujas inyectadas por vía intravenosa a medida que circulan a través de los vasos cerebrales, ULM produce mapas de alta resolución de densidad vascular, velocidad de flujo y amplitud de señal retrodispersada a escalas espaciales de hasta 5-10 μm. Este protocolo presenta un flujo de trabajo completo para realizar imágenes ULM en roedores, incluida la preparación de animales, el posicionamiento de la sonda, la adquisición de imágenes, la inyección de microburbujas y el procesamiento de datos, utilizando una plataforma de ultrasonido funcional dedicada. Se describen dos métodos de preparación, adaptados para ratones (transcraneales) y ratas (con ventanas craneales), seguidos de instrucciones detalladas para la alineación de la sonda y la orientación anatómica utilizando un atlas cerebral integrado. Durante la adquisición, las secuencias de ultrasonido ultrarrápidas se sincronizan con las inyecciones en bolo de microburbujas para capturar datos de flujo dinámico. Los pasos de reconstrucción posteriores implican el filtrado de desorden, la interpolación de imágenes, la detección de microburbujas, la localización de subpíxeles y el seguimiento de trayectorias. Los resultados incluyen mapas de densidad que reflejan la ocupación de los buques, mapas de velocidad que revelan patrones de flujo y direccionalidad, y mapas de amplitud que ofrecen contraste adicional para la interpretación estructural. Los resultados representativos ilustran la adquisición exitosa en planos coronales completos y resaltan los escollos comunes, como la mala calidad de la inyección, los artefactos de movimiento y la aberración inducida por el cráneo. El protocolo es compatible tanto con estudios transversales como longitudinales y es especialmente adecuado para investigar alteraciones cerebrovasculares en modelos de envejecimiento, ictus, aneurismas y enfermedades neurodegenerativas. Al combinar la penetración en profundidad, la alta resolución espaciotemporal y las imágenes vasculares sin etiquetas, ULM ofrece una poderosa herramienta para el análisis no invasivo de la microcirculación cerebral en modelos preclínicos.

Introducción

Aunque el cerebro representa solo el 2% de la masa corporal, consume alrededor del 20% de su oxígeno y glucosa para mantener^{la actividad} neuronal. Esta alta demanda metabólica es satisfecha por una intrincada red vascular, desde grandes arterias y venas hasta microvasos como arteriolas, vénulas y capilares, regulada a través del acoplamiento neurovascular². La interrupción de este proceso finamente ajustado se ha implicado en un amplio espectro de trastornos neurológicos. El desacoplamiento neurovascular, por ejemplo, es una característica patológica temprana en enfermedades como el Alzheimer, el Parkinson, la enfermedad de Huntington y la esclerosis lateral amiotrófica (ELA), que a menudo precede a las características clásicas de la neurodegeneración, como la patología beta-amiloide y tau 3,4,5,6. Por lo tanto, la obtención de imágenes de la naturaleza compleja del cerebro in vivo ha sido una preocupación principal para abordar la creciente necesidad de comprender los procesos fisiológicos. Los avances tecnológicos han proporcionado capacidades únicas para sondear la función y la actividad cerebral, tanto directa como indirectamente, con mayor precisión, resolución y accesibilidad.

La ecografía Doppler ha surgido como una poderosa herramienta para la medición funcional de la actividad cerebral utilizando el flujo sanguíneo⁷. En particular, las imágenes Doppler de potencia, diseñadas para detectar el movimiento de los glóbulos rojos (RBC), transmiten pulsos ultrasónicos repetidos a los vasos sanguíneos y registran la amplitud de los ecos ultrasónicos retrodispersados por los glóbulos rojos en movimiento⁸. El advenimiento de las imágenes de ultrasonido ultrarrápido, específicamente el ultrasonido funcional (fUS), marcó un punto crucial para superar las limitaciones anteriores. De hecho, la ecografía convencional explora tejido por línea, un enfoque secuencial que limita su aplicación a las principales arterias cerebrales, ya que no se pueden detectar los flujos sanguíneos lentos típicos de la microvasculatura del cerebro⁹. La técnica fUS más reciente utiliza múltiples transmisiones de onda plana para adquirir miles de fotogramas por segundo, mejorando drásticamente tanto la resolución temporal como la relación señal-ruido (SNR). Fundamentalmente, fUS permite la detección de cambios hemodinámicos en vasos muy pequeños con velocidades tan bajas como 1 mm/s, lo que respalda la obtención de imágenes funcionales en tiempo real de la actividad cerebral hasta el nivel de las arteriolas⁸.

Si bien los métodos Doppler ultrarrápidos han mejorado significativamente las imágenes microvasculares, todavía están limitados por la resolución limitada por difracción del ultrasonido¹⁰. Junto con la fUS, la microscopía de localización por ultrasonido (ULM) rompe este impedimento, permitiendo la visualización de estructuras microvasculares a nivel capilar aprovechando los agentes de contraste y los algoritmos de localización de alta precisión¹¹. Esto proporciona información sin precedentes sobre la morfología y función vascular. Más específicamente, en ULM, se inyectan agentes de contraste hechos de microburbujas llenas de gas estabilizado, de aproximadamente 1-3 μm de diámetro, en el torrente sanguíneo. Actúan como fuertes dispersores acústicos que pueden detectarse como fuentes puntuales individuales. Dado que las microburbujas son significativamente más pequeñas que la longitud de onda del ultrasonido, pueden aislarse espacial y temporalmente, apareciendo como la función de dispersión puntual (PSF) del sistema. Inspirado en técnicas ópticas de superresolución como STORM y PALM, la localización de subpíxeles de estas microburbujas se logra utilizando métodos de deconvolución que mapean sus posiciones con alta precisión 10,12,13,14. Esto permite que las estructuras vasculares se resuelvan a una resolución espacial de 5-10 μm, mucho más allá del límite impuesto por la difracción de las imágenes Doppler de potencia ultrarrápida de ultrasonido ultrarrápido convencionales.

ULM es una herramienta poderosa y eficaz para el mapeo vascular hasta la escala capilar y supera las limitaciones de muchos métodos ópticos que se limitan a las capas superficiales. Su capacidad para realizar imágenes microvasculares en animales vivos, lo que permite estudios longitudinales y farmacológicos, es otra ventaja clave de ULM sobre otras técnicas que requieren fijación y tinción cerebral. La información extraída se extiende más allá de los mapas vasculares estáticos, proporcionando estimaciones cuantitativas del flujo sanguíneo hasta el nivel capilar, abriendo así vías prometedoras para aplicaciones preclínicas y clínicas. Para facilitar la reproducibilidad, describimos un flujo de trabajo completo para imágenes cerebrales basadas en ULM en roedores, implementado utilizando una plataforma estandarizada de imágenes de ultrasonido funcional diseñada para la investigación preclínica.

Protocolo

Todos los procedimientos descritos en este estudio se llevaron a cabo de conformidad con la Directiva del Consejo de la Comunidad Europea del 22 de septiembre de 2010 (010/63/UE) y fueron aprobados por el comité de ética local (Comité d'éthique en matière d'expérimentation animale número 59, 'Paris Centre et Sud', proyecto #2020-16). Los experimentos se llevaron a cabo en ratones machos adultos C57BL / 6 Rj (2 meses de edad, 20-30 g) y ratas Sprague-Dawley Rj: Han (200-300 g) de origen comercial. Los animales se alojaron en grupos de cuatro por jaula bajo un ciclo de luz/oscuridad de 12 h, con una temperatura constante de 22 °C, y con alimentos y agua proporcionados ad libitum. Antes del inicio de los experimentos, todos los animales se sometieron a un período mínimo de aclimatación de una semana a las condiciones de alojamiento. Los reactivos y el equipo utilizado se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Preparación de animales

1. Anestesia y preparación animal en ratones
   1. Coloque el ratón en la cámara de inducción de isoflurano, administrando isoflurano al 2% con aire (0,075 L / min) y oxígeno (0,175 L / min, o aire medicinal).
   2. Después de 5 min de inducción de anestesia, transfiera al animal al marco estereotáxico, que se coloca sobre una almohadilla térmica a 37 ° C para mantener la temperatura corporal, y asegure la administración continua de isoflurano a través de una máscara a la misma concentración y caudal.
   3. Confirme la profundidad adecuada de la anestesia verificando la ausencia de reflejos en respuesta a un pellizco en el dedo del pie o la cola con una presión firme pero no dañina. Si hay un reflejo, aumente ligeramente la concentración de isoflurano. Vuelva a evaluar antes de continuar.
   4. Aplique ungüento para los ojos para prevenir la formación de cataratas.
   5. Afeitar la cabeza del ratón con una recortadora. Aplique una crema depilatoria, déjela reposar durante 1-1,5 minutos, luego enjuague con agua tibia y seque con una gasa. Repita según sea necesario hasta que se elimine todo el vello. Evite dejar la crema depilatoria por períodos de tiempo más largos, ya que puede causar daños químicos en la piel.
   6. Aplique gel de ultrasonido centrifugado (sin burbujas, desgasificado) en la cabeza para asegurar el acoplamiento acústico.
2. Anestesia y preparación animal en ratas
   1. Después de pesar la rata, administre una inyección intraperitoneal de una mezcla de ketamina (75 mg / kg) y xilacina (10 mg / kg) con una jeringa de 1 ml. Afeitar el pelaje de la parte superior de la cabeza y limpiar la piel con una solución de yodo.
      NOTA: La ketamina es una sustancia altamente regulada en muchos países y puede requerir una autorización especial para su adquisición y uso. Se pueden usar regímenes anestésicos alternativos para lograr anestesia a nivel quirúrgico.
   2. Coloque al animal en un aparato estereotáxico que se coloca sobre una almohadilla térmica ajustada a 37 °C para mantener la temperatura corporal. Aplique una cantidad generosa de ungüento oftálmico en los ojos para evitar la sequedad y la formación de cataratas.
   3. Inyecte meloxicam por vía subcutánea (2 mg/kg) con una jeringa de 1 ml para la analgesia intraoperatoria.
   4. Confirme la profundidad adecuada de la anestesia verificando la ausencia de reflejos en respuesta a un pellizco en el dedo del pie o en la cola con una presión firme pero no dañina. Si hay un reflejo, administre una dosis adicional igual a una cuarta parte de la dosis anestésica inicial. Espere aproximadamente 5 minutos antes de volver a evaluar la profundidad de la anestesia. Proceda solo una vez que se confirme un plano quirúrgico de anestesia y vuelva a evaluar cada 20-30 minutos.
   5. Haga una incisión longitudinal a lo largo de la sutura sagital con un bisturí, asegurándose de que el corte sea lo suficientemente profundo como para incluir la piel y los tejidos conectivos adheridos al cráneo.
   6. Mantenga los tejidos circundantes bien hidratados durante toda la cirugía utilizando solución salina fisiológica.
   7. Con un taladro giratorio, trace ligeramente el contorno de la ventana craneal marcando la capa superficial del cráneo. Para un acceso óptimo al cerebro, la ventana debe ser de alrededor de 14 mm en la dimensión lateral y de al menos 2 mm en la dimensión anteroposterior, dependiendo del tamaño del cráneo.
   8. Continúe fresando a lo largo del contorno hasta que no quede resistencia ósea. Durante la perforación, aplique periódicamente unas gotas de solución salina fisiológica para enfriar el hueso y minimizar el daño térmico. Una espátula fina y de bordes redondeados debe insertarse fácilmente en el espacio sin fuerza.
   9. Con movimientos cortos de escariado unidireccionales, adelgace la última capa de hueso hasta que la resistencia sea apenas perceptible.
   10. Inserte una espátula delgada y ligeramente curvada con bordes redondeados en el borde lateral de la ventana craneal.
   11. Mueva lentamente la espátula hacia el centro, separando suavemente el hueso de las meninges. Una vez que no sienta resistencia, levante y retire completamente la pieza de hueso desprendida.
   12. Aplique gel de ultrasonido centrifugado sobre la duramadre. En la Figura 1 se muestra una descripción de la configuración experimental.

Figura 1: Esquema de la configuración experimental para imágenes cerebrales ULM en roedores. El sistema de imágenes consiste en una unidad de adquisición de ultrasonidos conectada a una sonda de alta frecuencia montada en una platina de posicionamiento motorizada. Tanto los ratones como las ratas se muestran en marcos estereotáxicos: el ratón presenta un cuero cabelludo afeitado para imágenes transcraneales, mientras que la rata se somete a imágenes a través de una ventana craneal preparada quirúrgicamente. Se coloca un catéter en la vena de la cola para la inyección de agente de contraste en ambas especies. Esta configuración permite la adquisición estable de datos de ultrasonido funcional de alta resolución durante la inyección de microburbujas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

3. Cateterismo de la vena de la cola
   1. Utilice un equipo de infusión con alas de 27 G × 1/2" conectado a una aguja de 18 G × 1/2" con un tubo de 8". Acorte el tubo, si es posible, para minimizar el volumen muerto.
   2. Gire suavemente la cola del animal 90 grados para exponer las venas laterales de la cola (ver Figura 2). Asegure la cola en su lugar con cinta adhesiva para garantizar la estabilidad y evitar movimientos innecesarios durante el cateterismo.
   3. Identifique la vena de la cola comenzando en el extremo distal (punta de la cola) y moviéndose hacia la base. Para facilitar este paso, la cola se puede calentar con agua tibia para promover la vasodilatación y mejorar la visibilidad de las venas.
   4. Con un dedo, aplique una presión suave en la base de la cola y deslícela hacia el lugar de la inyección (es decir, en contra de la dirección del flujo sanguíneo). Esta maniobra impide temporalmente el retorno venoso, lo que hace que las venas caudales se distiendan y se vuelvan más prominentes, lo que facilita la inserción del catéter.
   5. Inserte la aguja de 27 G × 1/2" de la infusión alada paralela a la vena, asegurándose de que el bisel quede hacia arriba.
   6. Observe el tubo para detectar la presencia de retroceso de sangre, lo que confirma la colocación correcta de la aguja.
      NOTA: Comience el cateterismo en el extremo distal de la cola para evitar fugas de punciones anteriores durante las inyecciones posteriores. Si el cateterismo de la vena de la cola resulta desafiante o infructuoso, se pueden considerar vías centrales alternativas. Estos incluyen el seno retroorbitario, la vena yugular o la vena safena.

Figura 2: Anatomía transversal de la cola del roedor que ilustra los puntos de referencia vasculares para el cateterismo. Un dibujo esquemático de una sección transversal a través de la cola distal del roedor, que muestra las posiciones relativas de los vasos sanguíneos principales. Dos arterias están presentes cerca de la línea media: la arteria caudal dorsal, ubicada en la región superior (dorsal), y la arteria caudal ventral, ubicada en la parte inferior (ventral) de la sección transversal de la cola. Estas arterias generalmente se evitan durante los procedimientos intravenosos. Flanqueando las arterias lateralmente están las venas caudales, que corren simétricamente a ambos lados y se encuentran justo debajo de la piel, lo que las convierte en los sitios de acceso preferidos para el cateterismo o la inyección de microburbujas. Esta descripción anatómica ayuda en la localización precisa de las venas, especialmente cuando se mejora con el calentamiento para promover la vasodilatación. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

4. Posicionamiento de la sonda mediante el software IcoScan
   1. En la plataforma de adquisición, inicie el software de adquisición fUS (por ejemplo, IcoScan para Iconeus One) y cree una sesión de experimento. Ajuste la posición de la sonda de ultrasonido.
      NOTA: Coloque la sonda aproximadamente 1 mm por encima de la cabeza del animal. Asegúrese de que la sonda esté en contacto con el gel de ultrasonido antes de comenzar cualquier secuencia de imágenes.
   2. Inicie la adquisición de Live View y ajuste la posición de la sonda según sea necesario mediante imágenes de volumen sanguíneo cerebral (CBV) en tiempo real. El cerebro debe estar centrado en la imagen. Optimice los parámetros de imagen, como el contraste y la compresión, para mejorar la calidad de visualización.
   3. Abra el menú Angio3D en el software de adquisición. Ajuste los parámetros de escaneo (primer corte, último corte y tamaño de paso), asegurándose de que cubran todo el cerebro. Inicie la adquisición.
      NOTA: Al configurar los parámetros de exploración, asegúrese de que la exploración cubra la parte posterior del cerebro, es decir, todas las arterias posteriores.
   4. Mantenga abierto el software de adquisición e inicie el software IcoStudio para el análisis y la visualización de datos. Cargue el escaneo Angio3D .
   5. Vaya al panel Registro cerebral y registre el escaneo en el Marco de coordenadas comunes de Allen Mouse utilizando el modo de registro totalmente automático o manual.
   6. Guarde el registro como un archivo .bps.
   7. A continuación, vaya al menú Navegación cerebral . En el panel Administrador de Atlas , utilice el navegador de árbol principal/secundario para examinar el Atlas de cerebro de ratón Allen. Seleccione las regiones anatómicas objetivo, que se superpondrán al escaneo en el panel de 3 vistas.
   8. Elija un plano de imagen que se superponga a las regiones de interés. Establezca manualmente dos marcadores en la vista coronal para definir el corte de imágenes objetivo.
   9. Haga clic en el sistema de posicionamiento cerebral (BPS) para extraer las coordenadas del motor correspondientes a la posición de la sonda para obtener imágenes del plano seleccionado. Verifique la vista previa de la imagen, calculada a partir del escaneo Angio3D, y haga clic en Copiar coordenadas BPS.
   10. Cambie al software IcoScan y abra el panel Posicionamiento de la sonda . Haga clic en Introducir coordenadas BPS y pegue los valores extraídos en el paso 1.4.9. La sonda se moverá y alineará automáticamente con el plano de imagen seleccionado.
   11. Realice una adquisición de Live View para confirmar que el plano de imágenes actual coincide con el plano predicho del paso 1.4.8.
       NOTA: Al guardar y reutilizar los mismos marcadores espaciales, el plano de imagen se puede redefinir de manera consistente en todas las sesiones, lo que permite un reposicionamiento preciso de la sonda para estudios longitudinales.

2. Adquisición de ULM

1. Preparación de microburbujas
   NOTA: Se puede utilizar una variedad de agentes de contraste de ultrasonido disponibles comercialmente. Sin embargo, la composición del gas, la concentración de burbujas, el diámetro y la estabilidad pueden variar según el producto utilizado. Siga las recomendaciones del fabricante con respecto a la preparación y el almacenamiento.
   1. Con una jeringa estéril, inyecte 5 ml de solución de cloruro de sodio al 0,9% en el vial a través del tabique.
      NOTA: Para administraciones repetidas en bolo o infusión continua, se puede usar un volumen menor de solución de cloruro de sodio al 0,9% para preparar una suspensión de microburbujas más concentrada. Ajuste el factor de dilución en consecuencia según la aplicación prevista.
   2. Agite el vial vigorosamente durante 20 s para resuspender completamente las microburbujas y lograr una dispersión uniforme.
2. Grabación ULM
   1. Predefina los parámetros de grabación, incluida la secuencia de ultrasonido, la velocidad de fotogramas y el tiempo total de grabación.
      NOTA: Los parámetros recomendados para la grabación son de 5 a 10 minutos a 2,5 Hz.
   2. Dibuje el volumen de microburbujas a inyectar y comience la adquisición. Una vez iniciada la adquisición, proceder a la inyección de microburbujas. Se recomienda inyectar 200 μL para ratas y 100 μL para ratones, en la dilución adecuada.
   3. Confirme la mejora del contraste en la imagen de Visión en Directo. Inmediatamente después, enjuague las microburbujas restantes en el volumen muerto inyectando líquido fisiológico en el catéter. En la Figura 3 se muestra un ejemplo típico de un perfil de intensidad de microburbujas.
   4. Espere a que se complete la adquisición y guarde los datos.
   5. Al final de la adquisición, proceda de la siguiente manera, según el protocolo utilizado:
      1. Para ratones (protocolo no invasivo): Revierta la anestesia suspendiendo la administración de isoflurano y controle al animal durante la recuperación en un ambiente cálido hasta que esté completamente despierto.
      2. Para ratas (protocolo invasivo con ventana craneal): Eutanasia al animal mediante inyección intraperitoneal de Euthasol (pentobarbital sódico, 140 mg/kg), de acuerdo con las directrices institucionales y éticas.

Figura 3: Intensidad de la señal de microburbujas a lo largo del tiempo. (A) Ilustración de la región de interés (ROI) utilizada para la extracción de señales, que abarca todo el corte coronal del cerebro. (B) Curso temporal de la intensidad de la señal de microburbujas durante una adquisición de 5 minutos. El bolo de microburbujas se inyectó a 30 s, lo que resultó en un aumento característico en la amplitud de la señal. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

3. Reconstrucción de imágenes mediante el software IcoLab

1. Abra IcoLab y navegue hasta ULM haciendo clic en la pestaña ULM en la parte más a la izquierda de la pantalla.
2. Haga clic en Calcular mapas ULM para iniciar el flujo de trabajo de procesamiento, como se detalla en la Figura 4.
3. Seleccione la carpeta de origen que contiene los datos adquiridos.
4. Elija el escaneo específico que se procesará y ajuste los límites de tiempo de procesamiento si es necesario.
5. Haga clic en Siguiente para continuar con el paso Informes. En el paso Informes, configure la ruta de la carpeta de salida donde se guardarán los archivos procesados. Establezca los parámetros de visualización para las imágenes que se incluirán en el informe de PowerPoint.
6. Revise el resumen de las opciones seleccionadas que se muestran en la pantalla final.
7. Cuando esté listo, haga clic en EJECUTAR para iniciar el procesamiento. Una vez que se complete el procesamiento, se generará un archivo .trk, que contiene todas las coordenadas de las microburbujas localizadas, junto con archivos TIFF rasterizados para densidad, velocidad y amplitud retrodispersada (BSA).
   NOTA: Una adquisición de 5 minutos puede requerir varias horas de procesamiento. Este paso se realiza mejor durante la noche o en una estación de trabajo dedicada.
   1. Generación de mapas de densidad de microburbujas: Las posiciones localizadas de todas las microburbujas detectadas se acumulan durante el tiempo de adquisición seleccionado. Asigne estas posiciones a una cuadrícula espacial de resolución fija.
      NOTA: Cada píxel del mapa de densidad resultante refleja el recuento de microburbujas localizadas dentro de ese intervalo espacial. El resultado final es una imagen en escala de grises (TIFF) donde la intensidad de los píxeles corresponde a la ocupación de los vasos, lo que permite una reconstrucción de alta resolución de la red vascular.
   2. Generación de mapas de velocidad: El software rastrea microburbujas individuales en fotogramas consecutivos para formar trayectorias. Para cada trayectoria, el software calcula un vector de velocidad dividiendo el desplazamiento por el tiempo transcurrido (lo que produce un vector de velocidad en mm/s).
      NOTA: Se pueden generar dos tipos de mapas de velocidad: mapas de velocidad absoluta, donde cada píxel almacena la magnitud de velocidad promedio de las microburbujas que pasan, y mapas de velocidad direccional, donde la velocidad se descompone a lo largo de un eje anatómico elegido (es decir, x o z) y se almacena el componente con signo correspondiente. Estos mapas se rasterizan en la misma cuadrícula espacial y se guardan como imágenes TIFF individuales.
   3. Generación de mapas BSA: Para cada microburbuja localizada, se muestra la amplitud de la señal de ultrasonido sin procesar (intensidad retrodispersada). Proyecte estas amplitudes en la cuadrícula espacial, acumulando la intensidad de la señal en cada píxel. El mapa BSA resultante resalta las regiones donde las microburbujas pasaron a través del área focal del haz, proporcionando un contraste que complementa los mapas de densidad y velocidad¹⁵.

Figura 4: Diagrama de flujo de la canalización de procesamiento para la reconstrucción del mapa ULM. La figura ilustra los pasos de procesamiento secuencial realizados en el software de análisis para generar mapas ULM a partir de datos de ultrasonido sin procesar. A partir de fotogramas compuestos (n = 200), el paso 1 aplica el filtrado de descomposición de valores singulares (SVD) para aislar las señales de microburbujas (MB) del fondo del tejido. En el paso 2, las señales MB se someten a la interpolación de Lanczos, lo que da como resultado una pila de imágenes preprocesadas. El paso 3 realiza la detección de máximos locales y los correlaciona con la función de dispersión de puntos (PSF) del sistema para identificar ubicaciones de microburbujas candidatas. En el Paso 4, la localización de subpíxeles (detección de centroides) y el seguimiento de partículas se utilizan para extraer trayectorias de microburbujas, a partir de las cuales se calculan mapas de velocidad y amplitud retrodispersada. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

4. Visualización de datos mediante el software IcoStudio

1. Cargue un archivo .trk en IcoStudio para comenzar la exploración de datos.
2. Ajuste los parámetros de visualización, como el contraste, la compresión y el mapa de colores, en el panel del lado derecho para refinar la representación de datos.
3. Establezca el tiempo de integración utilizando el control deslizante doble en la parte inferior de la vista principal para definir los fotogramas inicial y final.
4. Abra la pestaña Densidad para ver las ocurrencias de microburbujas y seleccione entre Densidad absoluta (recuento por píxel) y Densidad direccional (ponderada axialmente).
5. Utilice la pestaña Velocidad para mostrar la velocidad de las microburbujas en mm/s a través de varios modos: Absoluto, Direccional, Axial y Lateral. Ajuste los umbrales de contraste, compresión y velocidad para mejorar la visualización.
6. Explore la pestaña BSA para visualizar la reflectividad de las microburbujas, proporcionando un mecanismo de contraste alternativo que resalta las estructuras microvasculares y el movimiento fuera del plano. Exporte capturas de pantalla PNG de alta resolución o genere archivos TIFF para análisis cuantitativos con configuraciones personalizables de tamaño de píxel y tipo de datos.

Resultados

Los ejemplos representativos de la Figura 5 muestran un ejemplo típico de datos ULM de un cerebro de rata adquirido durante 1 minuto de registro después de 200 μL de inyección de bolo de microburbujas, con una resolución de 10 μm.

Figura 5: Resultados representativos de ULM adquiridos de una rata craneotomizada después de una sola inyección de microburbujas. Se muestran mapas de ejemplo de densidad de microburbujas (MB) (izquierda), velocidad (centro) y amplitud retrodispersada (derecha) para un corte de cerebro coronal completo, adquirido durante 1 minuto de registro después de una inyección de microburbujas en bolo de 200 μL. Barra de escala: 2mm. Los recuadros ampliados resaltan la microvasculatura cortical izquierda (barra de escala: 0,5 mm). El mapa de densidad refleja la distribución espacial de las ocurrencias de MB, revelando la estructura de la red vascular. El mapa de velocidad ilustra la velocidad de flujo y la direccionalidad de los MB individuales, lo que permite diferenciar entre tipos de recipientes. El mapa de amplitud muestra la señal de ultrasonido retrodispersada de los MB, proporcionando un mecanismo de contraste adicional que mejora la visualización de la morfología de los vasos y el movimiento fuera del plano. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Los mapas resultantes ilustran tres vistas complementarias de la microvasculatura cerebral: densidad de microburbujas (MB) (izquierda), velocidad (centro) y amplitud retrodispersada (derecha). Cada mapa corresponde a una rebanada coronal completa del cerebro, con recuadros ampliados que resaltan la microvasculatura cortical izquierda (barras de escala: 2 mm y 0,5 mm, respectivamente).

El mapa de densidad muestra la distribución espacial de las ocurrencias de MB en todo el campo de visión. La morfología de los vasos se resuelve muy por debajo del límite de difracción, revelando tanto vasos grandes como estructuras capilares finas. Este tipo de mapa permite una visualización clara de la topología de la red vascular, incluidas las bifurcaciones y los patrones de ramificación, incluso en regiones corticales profundas.

El mapa de velocidad muestra la velocidad de flujo de los MB individuales proyectados a lo largo de la dirección axial (z). Esta proyección produce valores de velocidad con signo, donde las velocidades negativas reflejan el flujo ascendente hacia la corteza y los valores positivos reflejan el flujo descendente. En la corteza cerebral de los roedores, la arquitectura vascular es altamente estereotipada: las arteriolas penetrantes descienden de la superficie pial a las capas corticales, mientras que las vénulas ascienden desde la corteza de regreso a la superficie para drenar la sangre desoxigenada¹⁶. Esta disposición anatómica consistente permite el uso de mediciones de velocidad direccional para distinguir entre tipos de vasos, con velocidades axiales positivas que generalmente indican flujo arterial y velocidades negativas que indican drenaje venoso. En general, los valores de velocidad medidos con ULM son consistentes con los rangos previamente reportados en la literatura^10,17, que van desde 10-20 mm/s en arteriolas penetrantes hasta varios centímetros por segundo en las principales arterias intracraneales. Estos hallazgos están en línea con observaciones anteriores de que las microburbujas que fluyen imitan de cerca el comportamiento reológico de los glóbulos rojos¹⁸, validando el uso de ULM para cuantificar la dinámica fisiológica del flujo sanguíneo a microescala.

El mapa de amplitud retrodispersada (BSA) proporciona una representación espacial de la intensidad de la señal de ultrasonido devuelta por cada MB. Como la energía retrodispersada se maximiza cuando los MB pasan a través de la región focal, este mapa ofrece contraste basado en la posición de elevación. Ayuda a refinar la segmentación al identificar movimientos fuera del plano o vasos de baja amplitud, particularmente a mayores profundidades o cerca de los bordes focales. Los mapas BSA también son valiosos para detectar la atenuación de la señal relacionada con la profundidad o identificar desajustes en la alineación focal¹⁵.

Para demostrar la reproducibilidad de la orientación del plano con el sistema de posicionamiento cerebral, la Figura 6A muestra los mapas de densidad vascular ULM adquiridos en el mismo ratón bajo anestesia el día 0 (semana 1) y el día 7 (semana 2), dirigidos al mismo plano coronal. La superposición de ambos mapas muestra una fuerte correspondencia espacial de la señal vascular, confirmando la precisión del reposicionamiento del plano y la confiabilidad de los experimentos longitudinales, como se mostró anteriormente¹⁹.

El análisis cuantitativo se puede aplicar a cualquiera de estos resultados. Por ejemplo, los usuarios pueden segmentar los vasos utilizando umbrales de intensidad o algoritmos de agrupación, y luego extraer estadísticas regionales como la densidad de los vasos, la velocidad promedio del flujo y los parámetros morfométricos, incluido el radio del vaso, la longitud promedio, el número de ramas y otros descriptores estructurales de la red vascular. Las comparaciones entre regiones corticales o grupos experimentales (p. ej., inyectados con fármacos frente a control) se pueden realizar directamente en estos mapas o mediante estadísticas paramétricas derivadas en vasos comúnmente identificados^20,21. Como ejemplo de dicho análisis, realizamos cuantificaciones regionales de parámetros vasculares en la corteza somatosensorial izquierda (S1BF, Figura 6B) y el tálamo izquierdo (Figura 6C). Los mapas de densidad se binarizaron, esqueletizaron y los radios de los vasos se estimaron utilizando una transformada de distancia euclidiana. Las velocidades de flujo se obtuvieron directamente de las trayectorias de MB, y la velocidad de flujo se derivó del radio del vaso utilizando la ley de Poiseuille como se detalló anteriormente²¹. Aquí se aplicó la misma metodología descrita en ese estudio. Los gráficos de bigotes muestran las distribuciones del radio, la velocidad y el caudal de los vasos para d0 y d7, lo que demuestra una buena reproducibilidad en todas las sesiones. Juntos, estos resultados multimodales de ULM permiten una caracterización integral de la red microvascular del cerebro, ofreciendo información anatómica y dinámica con una resolución sin precedentes.

Figura 6: Reproducibilidad longitudinal de la orientación del plano y ejemplo de cuantificaciones vasculares utilizando el Sistema de Posicionamiento Cerebral. (A) Mapas de densidad vascular ULM adquiridos del mismo ratón anestesiado el día 0 (semana 1) y el día 7 (semana 2), dirigidos al mismo plano coronal utilizando el sistema de posicionamiento cerebral (barra de escala = 1 cm). La superposición de ambos mapas muestra una fuerte correspondencia espacial de la señal vascular, lo que ilustra la reproducibilidad del posicionamiento del plano en todas las sesiones. (B, C) Cuantificación representativa de parámetros vasculares extraídos de dos regiones de interés: corteza somatosensorial izquierda (S1BF, B) y tálamo izquierdo (C). Para cada región, mostramos el mapa de densidad vascular en d0 (barra de escala = 0,5 cm), junto con gráficos de bigotes que muestran la distribución del radio del vaso (μm), la velocidad del flujo (mm/s) y el caudal (mm³/s) en d0 y d7 (mediana, percentil 25-75, bigotes = 1,5×IQR, valores atípicos trazados individualmente). Estos resultados ilustran la capacidad de la tubería para extraer métricas morfométricas y hemodinámicas de los datos de ULM. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discusión

La microscopía de localización por ultrasonido (ULM) representa un avance transformador en las imágenes por ultrasonido, lo que permite la visualización de súper resolución de la microvasculatura más allá del límite de difracción convencional. Esta discusión destaca los pasos críticos en el protocolo ULM, aborda posibles modificaciones y estrategias de resolución de problemas, explora las limitaciones del método, evalúa su importancia en comparación con las modalidades de imagen alternativas y considera su importancia y aplicaciones potenciales en la investigación biomédica.

Pasos críticos en el protocolo ULM

Varios pasos son cruciales para la implementación exitosa de ULM, y su influencia se ilustra en la Figura 7. Uno de los pasos más importantes es la administración de microburbujas, ya que tanto la concentración como la calidad de la administración afectan directamente los resultados de las imágenes. Es necesaria una concentración óptima para equilibrar la resolución espacial y la detectabilidad. La administración inadecuada, como la mala colocación del catéter o la extravasación, puede dar lugar a una señal vascular muy baja y reconstrucciones incompletas, como se muestra en la Figura 7B, donde solo un número escaso de microburbujas llega al torrente sanguíneo. Las imágenes de alta velocidad de fotogramas, generalmente en el rango de kilohercios, son esenciales para capturar el rápido movimiento de las microburbujas y permitir un seguimiento confiable a través de los cuadros. Cualquier inestabilidad durante la adquisición, como el movimiento introducido por la respiración, la mala fijación o la anestesia insuficiente, puede degradar la precisión de la localización. Un ejemplo de esto se ilustra en la Figura 7C, donde el movimiento excesivo durante la adquisición da como resultado un mapa de densidad borroso e inutilizable.

La localización y el seguimiento de microburbujas dependen de algoritmos avanzados de procesamiento de imágenes que detectan burbujas individuales, realizan la localización de subpíxeles y reconstruyen trayectorias con precisión de subdifracción. Incluso con la adquisición y el procesamiento adecuados, los factores anatómicos, como las aberraciones inducidas por el cráneo, pueden afectar la calidad de la imagen. En las imágenes transcraneales, particularmente en ratones más viejos, el engrosamiento del cráneo puede introducir distorsión acústica. Esto conduce a artefactos de sombreado característicos debajo de la sutura sagital, donde no se detectan microburbujas, como se muestra en la Figura 7D. Tales aberraciones reducen la relación señal-ruido y pueden oscurecer las estructuras vasculares a menos que se corrijan con filtrado adaptativo o refinando la colocación de la sonda.

Cuando todos los pasos se realizan con éxito, se pueden lograr mapas ULM de alta calidad, como se muestra en la Figura 7A, donde se reconstruye una red vascular densa y bien resuelta a través de un enfoque transcraneal.

Figura 7: Ejemplos de referencia y solución de problemas para la calidad de imágenes ULM en ratones. El panel (A) muestra un mapa de densidad de microburbujas (MB) transcraneales ULM de alta calidad adquirido en un ratón adulto joven, que ilustra un mapeo vascular exitoso en todo el plano coronal. El panel (B) muestra un ejemplo de una señal vascular deficiente debido a la extravasación de microburbujas o al acceso venoso insuficiente, lo que resulta en detecciones de MB escasas. El panel (C) muestra una adquisición afectada por el movimiento excesivo de los animales, produciendo un mapa de densidad borroso y no interpretable. El panel (D) destaca la aberración acústica inducida por el cráneo comúnmente observada en ratones más viejos, visible como un cono de sombra debajo de la sutura sagital donde no se detectan MB debido a la reducción de la relación señal-ruido. Estos ejemplos sirven como referencias visuales para identificar y abordar artefactos experimentales comunes en las imágenes de ULM. Barra de escala: 1 mm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Limitaciones del método

A pesar de sus muchas ventajas, ULM tiene limitaciones inherentes que afectan su aplicabilidad. El sesgo de los vasos fuera del plano es un problema importante en las imágenes 2D, ya que los vasos que se extienden fuera del plano de la imagen no se reconstruyen adecuadamente, lo que lleva a mapas vasculares incompletos. Esta limitación se puede mitigar mediante la transición a enfoques de imágenes volumétricas (3D)²², aunque esto aumenta la complejidad computacional. Los desafíos del cateterismo intravenoso también representan un obstáculo, especialmente en modelos de animales pequeños, donde lograr una administración constante de microburbujas puede ser técnicamente exigente. La estabilidad de las microburbujas también es un factor limitante, especialmente durante sesiones de imágenes prolongadas. Debido a su corta vida media de circulación, las microburbujas pueden requerir inyecciones repetidas en bolo o protocolos de infusión continua para mantener un contraste adecuado durante todo el período de adquisición. Los artefactos de movimiento siguen siendo una preocupación importante, particularmente para sujetos despiertos, donde incluso pequeños movimientos involuntarios pueden degradar las imágenes de superresolución. Finalmente, la penetración de profundidad en ULM está inherentemente limitada por la atenuación de ultrasonido. Si bien esto generalmente no es problemático para las imágenes de roedores a altas frecuencias (por ejemplo, 15 MHz), se vuelve más desafiante en animales más grandes como cerdos o primates no humanos. En estos casos, es posible que se requieran sondas de menor frecuencia para lograr una profundidad de imagen suficiente, pero esto tiene el costo de una resolución espacial reducida, lo que subraya una compensación clave entre profundidad y detalle que debe tenerse en cuenta al traducir ULM a modelos preclínicos más grandes.

Importancia de ULM en comparación con los métodos existentes

La microscopía de localización por ultrasonido (ULM) ofrece ventajas sustanciales sobre las modalidades de imágenes convencionales, particularmente en el contexto de las imágenes microvasculares. Entre sus fortalezas más notables se encuentra su capacidad para superar el límite de difracción del ultrasonido tradicional, logrando imágenes de subdifracción a escalas espaciales comparables a técnicas ópticas como la microscopía de dos fotones. Sin embargo, a diferencia de estos métodos ópticos, ULM proporciona una penetración más profunda en el tejido, lo que permite el acceso a regiones del cerebro que de otro modo serían difíciles de visualizar de forma no invasiva.

ULM también ofrece capacidades de imágenes funcionales, lo que permite la evaluación cuantitativa de la velocidad del flujo sanguíneo, la dinámica de perfusión y la remodelación vascular. Estas características lo hacen muy adecuado para investigar tanto los procesos fisiológicos como los cambios patológicos en las redes neurovasculares. En comparación con la resonancia magnética y la PET, ULM es más rentable, no requiere infraestructura pesada y evita el uso de agentes de contraste con riesgos de toxicidad conocidos, confiando en cambio en microburbujas llenas de gas con perfiles de seguridad favorables.

La combinación de alta resolución espacial y temporal hace que ULM sea particularmente valioso para una variedad de aplicaciones de investigación. Es especialmente poderoso en estudios dirigidos a estructuras microvasculares y núcleos cerebrales profundos, donde las modalidades tradicionales a menudo se quedan cortas. Además, a diferencia de los enfoques histológicos que requieren fijación y tinción de tejidos, ULM permite obtener imágenes en tiempo real en animales vivos, lo que respalda diseños longitudinales e intervenciones dinámicas como desafíos farmacológicos.

Más allá del mapeo vascular estático, ULM también permite obtener imágenes funcionales de alta resolución al capturar la dinámica del flujo sanguíneo cerebral con una precisión espacial y temporal excepcional. Los avances recientes han demostrado su viabilidad para la neuroimagen funcional de todo el cerebro en roedores, revelando cambios evocados por estímulos y dependientes de la actividad espontánea en el flujo sanguíneo a nivel capilar a través de redes cerebrales distribuidas². Esto posiciona a ULM como una herramienta poderosa para estudios funcionales, cerrando efectivamente la brecha entre las imágenes hemodinámicas de mesoescala y el mapeo de actividad neuronal.

Consideraciones de usabilidad, eficiencia y reproducibilidad

El flujo de trabajo de ULM descrito en este protocolo se ha optimizado para facilitar la implementación y la reproducibilidad en diferentes configuraciones experimentales. El uso de componentes disponibles comercialmente, incluidas las microburbujas aprobadas por la FDA y la EMA y los procedimientos estándar de anestesia con roedores, garantiza una amplia accesibilidad. Además, la integración de toda la canalización de procesamiento dentro del software dedicado (IcoLab) mejora en gran medida la usabilidad al automatizar pasos complejos como la localización de microburbujas, la reconstrucción de trayectorias y la generación de mapas. Esta interfaz optimizada reduce la necesidad de código personalizado y minimiza la intervención del usuario, lo que admite resultados consistentes entre usuarios y experimentos. Si bien el procesamiento ULM de alta resolución es computacionalmente intensivo, especialmente para adquisiciones largas o datos volumétricos, las herramientas de procesamiento por lotes y la aceleración de GPU reducen significativamente el tiempo de análisis. El diseño modular del protocolo también admite la reproducibilidad, lo que permite a los investigadores ajustar los parámetros de adquisición y procesamiento mientras mantienen un marco analítico sólido. El protocolo también incluye una sección dedicada al posicionamiento de la sonda mediante IcoScan e IcoStudio, que permite a los usuarios reposicionar de forma fiable la sonda en el mismo segmento de imagen exacto en todas las sesiones, con una precisión de aproximadamente 100 μm. Esta característica es particularmente valiosa para estudios longitudinales, donde la consistencia espacial precisa es esencial para rastrear los cambios vasculares a lo largo del tiempo. Estas características reducen colectivamente la barrera de entrada para nuevos usuarios y respaldan la implementación escalable de ULM en estudios de imágenes exploratorios y longitudinales.

Conclusión

Este protocolo presenta un flujo de trabajo completo para implementar la microscopía de localización por ultrasonido (ULM) en imágenes cerebrales de roedores, que cubre la preparación quirúrgica, la administración de microburbujas, la adquisición de imágenes y el mapeo vascular de alta resolución utilizando una plataforma estandarizada de adquisición y análisis optimizada para la investigación preclínica. ULM representa un gran avance en la imagen biomédica, ya que ofrece una visualización in vivo de superresolución de la microvasculatura con un detalle sin precedentes. En comparación con las modalidades de imagen existentes, ULM proporciona una combinación única de alta resolución espacial, cuantificación de flujo funcional y accesibilidad, lo que lo hace especialmente adecuado para estudios de desarrollo vascular, acoplamiento neurovascular y fisiopatología de enfermedades. A medida que la tecnología continúa madurando, ULM está preparada para convertirse en una piedra angular tanto en la investigación preclínica como, eventualmente, en las aplicaciones clínicas de neuroimagen.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Controlador de temperatura animal (placa calefactora acoplada a una sonda rectal)	Fisitempo	TCAT-2DF
Atipamezole	Orion Pharma, Francia	Antisedán	Solución inyectable de 5 mg/mL
Ratones C57BL/6	Janvier Labs	SC-C57J-M	C57BL/6Rj, ratones machos de 8 semanas
Broca dental	Foredom, EE. UU.	Kit de micromotor rotativo de alta velocidad K.1070
Crema depilatoria	Vichy	N/A
Pomada para ojos	TVM, Reino Unido	Ocry-gel
Recortador de pelo	Phymep	ISIS GT 421 Esculap
Software de procesamiento IcoLab (v 1.2.0.0)	Iconeo, Francia	IcoLab
Configuración del Iconeus One Xpand	Iconeo, Francia	IconeusOne Xpand
Sonda IcoPrime de 15MHz	Iconeo, Francia	Sonda IcoPrime-15MHz
Software de adquisición IcoScan (v1.9.0)	Iconeo, Francia	IcoScan
Software de análisis IcoStudio (v2.2.0)	Iconeo, Francia	IcoStudio
Solución de yodo	Mylan, Francia	N/A
Estación de anestesia de isoflurano	Minerve, Esternay, Francia	N/A
Ketamina	Virbac, Francia	Ketamine1000	Solución inyectable de 100 mg/mL
Meloxicam	Boehringer Ingelheim	Metacam	Solución inyectable de 0,5 mg/mL
Agujas	Terumo, Francia	AN*1838R1	18 G x & frac12; ” aguja de 8" Tubería
Agua salina	Laboratoire Gilbert Physiodose, Farmacia, Francia	N/A
Bisturí	DREXCO Medical, Francia	80011
Microburbujas SonoVue	Bracco Imaging	SonoVue 8ul/ml
Espátula	Phymed, Francia.	Kit de micromotor rotativo de alta velocidad K.1070
Sprague-Dawley Rj:Han rats	Janvier Labs	RN-SD-M	RjHan:SD - Ratas macho Sprague Dawley, 200-300 g
Marco estereotáxico	David Kopf (Tujunga, EE. UU.)	900-WA	Uso de Adaptador de Ratón  (Ref: 922) y barras auriculares sin rotura (ref: 922) y nbsp;
Jeringuilla	DREXCO Medical, Francia	2058
Gel de ultrasonidos	DREXCO Medical, Francia	Medi'Gel
Juego de infusión alado	Terumo, Francia	SV*27EL
Xylazine 2%	Bayer, Francia	Rompun	Solución inyectable de 20 mg/mL