Artículo de método

Reprogramación Xenolibre Definida de Progenitores de Sangre del Cordón Umbilical a Células Madre Inducidas Pluripotentes y Similares a Blastómeros

583 vistas

⸱

DOI:

10.3791/68613

⸱

22 de agosto de 2025

 ,  , 
1Department of Oncology, Division of Pediatric Oncology and Institute for Cell Engineering, The Johns Hopkins University School of Medicine

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

Este protocolo describe métodos químicamente definidos para la reprogramación episomal libre de xenos (XF), libre de alimentadores (FF) de progenitores mieloides de sangre del cordón umbilical humano (CB) a células madre pluripotentes inducidas humanas convencionales (hiPSC). Estas XF/FF CB-hiPSC (XF-hiPSC) se pueden revertir de manera eficiente a células madre vírgenes reguladas por inhibidores de tankirasa / PARP1 similares a blastómeros (TIRN-SC) que poseen una diferenciación aumentada y un potencial de quimera entre especies.

Resumen

La reprogramación del progenitor mieloide de la sangre del cordón umbilical humano (CB) a un estado de células madre pluripotentes inducidas humanas (hiPSC) de alta fidelidad se puede lograr utilizando vectores episomales no integradores y señales estromales. Estas líneas CB-hiPSC convencionales cebadas se pueden revertir químicamente posteriormente con altas eficiencias a un estado de células madre naive reguladas por inhibidores de tankirasa / inhibidor de blastómeros (TIRN-SC) con totipotencia funcional. Las TIRN-SC reguladas por PARP son células madre humanas con alta plasticidad epigenética, huellas epigenómicas estables y tienen una mayor potencia de diferenciación que las hiPSC convencionales cebadas por linaje. Aquí, se describen los métodos XF/FF optimizados para una reprogramación episomal eficiente activada por el estroma mesenquimal de los progenitores mieloides CD34+ CD33+ CB en XF/FF hiPSC convencional. La reversión de TIRN potenció de manera reproducible la hiPSC convencional XF / FF para adoptar características transcripcionales, epigenéticas y funcionales de células embrionarias humanas en etapa de escisión con una expresión génica cebada de linaje disminuida. Validamos que la XF-hiPSC derivada de CB revertida por TIRN mostró una marcada mejoría en la diferenciación dirigida de múltiples linajes (incluidos los linajes hematovasculares) en un amplio repertorio de antecedentes genéticamente independientes. Estos métodos sirven como primer paso para generar líneas TIRN-SC que cumplen con las buenas prácticas de fabricación actuales para bancos de donantes "universales" definidos por HLA de grado clínico TIRN-SC (UTIRN-SC). La derivación de líneas UTIRN-SC con una versatilidad de diferenciación mejorada de los progenitores CD34+ CD33+ CB podría tener un alto impacto en la medicina regenerativa. Por ejemplo, las UTIRN-SC podrían generar bancos de tejidos de progenitores de donantes cardíacos, vasculares y neurales criopreservados definidos por HLA para terapias celulares integrales de múltiples linajes "listas para usar".

Introducción

Aunque las células madre pluripotentes inducidas por humanos (hiPSC) ofrecen oportunidades prometedoras para terapias celulares personalizadas, su aplicación clínica enfrenta grandes desafíos, incluida la tumorigenicidad, la inmunogenicidad y la heterogeneidad fenotípica y funcional1, que afectan su seguridad, eficacia y rentabilidad. Además, los progenitores comprometidos con el linaje derivados de líneas hiPSC convencionales cebadas se generan con eficiencias de diferenciación entre líneasaltamente variables 2 y exhiben un injerto y funcionalidad in vivo limitados. Sin embargo, tales limitaciones pueden superarse utilizando métodos de reprogramación optimizados3 o estados alternativos de células madre 4,5.

Aunque las eficiencias de reprogramación episomal no viral de las células somáticas de la piel o la sangre en hiPSC son bajas (~0,01%-2%)6, se puede lograr una reprogramación de cuatro factores altamente optimizada de los progenitores CB y puede alcanzar hasta un 50% de eficiencias a granel en condiciones de cocultivo activadas por progenitores del tallo del estroma mesenquimal (MSC)7. En este sistema, la reprogramación celular de los progenitores mieloides CB se aceleró mediante señales estromales solubles y dependientes del contacto. Las líneas episomales de hiPSC derivadas de CB cebadas por estroma (SP) se diferenciaron en progenitores vasculares (VP) con mayores eficiencias que las hiPSC derivadas de fibroblastos convencionales 3,5. Los VP derivados de SP-CB-iPSC exhibieron una identidad transcripcional de VP embrionaria más auténtica, senescencia reducida y sensibilidad al daño del ADN 3,4. El VP derivado de SP-CB-iPSC también demostró un injerto in vivo más robusto que el VP convencional derivado de hiPSC después del trasplante sistémico o directo en el vítreo de ratones adultos inmunodeficientes lesionados por isquemia retiniana 3,4.

Zimmerlin et al. establecieron un sistema de reprogramación química de dos pasos ('LIF-5i -> LIF-3i') que hace la transición de células madre pluripotentes humanas convencionales preparadas a un estado TIRN-SC con un potencial de diferenciación multilinaje mejorado5. Los progenitores vasculares diferenciados derivados de TIRN-SC exhibieron una mayor funcionalidad, mayor estabilidad genómica y un injerto in vivo superior, como lo demuestra su capacidad mejorada para migrar y revascularizar las capas neurales profundas de la retina isquémica4. TIRN-SC se sometió a reprogramación proteogenómica para adquirir un estado similar a un blastómero híbrido funcional con alta contribución en el ensayo de quimera interespecífica8. TIRN-SC mantuvo la expresión de DNMT1 y se protegió contra la erosión en las regiones de impronta genómica metilada con CpG. Curiosamente, SP-CB-hiPSC se revirtió en TIRN-SC de manera más eficiente que hiPSC derivada a través de métodos alternativos menos eficientes 5,9.

Por lo tanto, las TIRN-SC son un estado alternativo de células madre con una capacidad de diferenciación multilinaje mejorada y una contribución eficiente a las quimeras. Mayor optimización de
La reprogramación de TIRN-SC en condiciones de cultivo definidas y compatibles con cGMP facilitará la generación de una amplia gama de tipos de células y tejidos funcionales e injertables para terapias. Para abordar la necesidad de progenitores terapéuticos rentables, estos métodos se pueden aplicar para producir bancos de grado cGMP de TIRN-SC (UTIRN-SC) de 'donante universal' utilizando CB hematopoyético CD34+ definido por HLA o progenitores de sangre periférica. Los progenitores derivados de UTIRN-SC definidos por HLA podrían satisfacer las necesidades de un mayor número de pacientes que requieren una regeneración inmediata y multilinaje de tejidos complejos.

Los paradigmas desarrollados para el trasplante clínico de médula ósea (TMO) pueden guiar el desarrollo de bancos UTIRN-SC a partir de células madre hematopoyéticas parcialmente compatibles con HLA o HLA-haplo-idénticas de registros nacionales de donantes. Un análisis computacional predictivo y global de los 10 haplotipos principales combinados de 18 países, incluidos los EE. UU., Proporcionaría una cobertura media de pacientes del 68,4% de dichos "haplobancos" de hiPSC10. Un banco UTIRN-SC definido no solo podría proporcionar progenitores comprometidos con el linaje, sino también respaldar aplicaciones terapéuticas de TIRN-SC de sistemas de complementación de blastocistos interespecíficos dentro de animales domésticos (p. ej., cerdos) para la generación de órganos completos11,12, incluida la generación de progenitores hematopoyéticos inductores de tolerancia para reducir el rechazo del injerto en poblaciones con amplia diversidad genética (p. ej., EE. UU.).

Este protocolo de reprogramación modificado para generar líneas XF/FF hiPSC competentes para TIRN es un primer paso para desarrollar futuros bancos UTIRN-SC compatibles con cGMP. Este protocolo describe la reprogramación escalonada del estroma y la validación funcional de los progenitores mieloides CB humanos en líneas XF-hiPSC convencionales. Estas XF-hiPSC demostraron una fácil reversión a TIRN-SC, con una eficiencia similar a los métodos sin XF7 y alcanzaron una pluripotencia funcional sin restricciones, incluida una capacidad mejorada para producir teratomas bien formados con sesgo de linaje reducido (en relación con XF-hiPSC cebado isogénico)4,5,9. También describimos protocolos que validan XF-hiPSC revertido por TIRN por su diferenciación directa mejorada y robusta a linajes hematovasculares.

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Protocolo

Todos los experimentos de reprogramación se ajustaron a las pautas publicadas por la Academia Nacional de Ciencias y la Sociedad Internacional de Investigación de Células Madre (ISSCR). Para la generación de hiPSC, los protocolos de recolección de células de donantes y el consentimiento informado del donante fueron aprobados por la supervisión de la Junta de Revisión Institucional (IRB) de la Universidad Johns Hopkins (JHU). Todos los experimentos se llevaron a cabo bajo el ámbito de la Supervisión Institucional de Investigación con Células Madre (ISCRO) de JHU y se ajustan a los estándares institucionales con respecto al consentimiento informado y la evaluación de la procedencia. Además, todos los procedimientos quirúrgicos y de uso de animales se realizaron de acuerdo con los protocolos aprobados por el Comité del Instituto de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de JHU. Todos los experimentos que involucran procedimientos con animales (p. ej., inyecciones subcutáneas/intramusculares de NOD. Los ratones Cg-Prkdcscid IL2rgtm1Wjl / SzJ (NOG SCID) (Jackson Labs, Bar Harbor, ME) para análisis de teratoma y transferencia de blastocistos a ratones pseudopreñados ICR) fueron revisados y aprobados por la JHU IACUC. Estas revisiones incluyeron consideraciones para el sacrificio ético, el alojamiento humano y las medidas apropiadas para minimizar la incomodidad de los animales.

1. Reprogramación episomal de hiPSC xenolibre sin alimentador

  1. Preparación de células progenitoras hematopoyéticas del donante
    1. Use células madre/progenitoras hematopoyéticas CD34+ criopreservadas (p. ej., 1x106 células CB neonatales) inmediatamente después del parto o almacene los crioviales en un tanque de almacenamiento de nitrógeno líquido. Asegúrese de que las celdas se hayan mantenido continuamente en estado congelado durante el transporte y la manipulación.
      NOTA: Alternativamente, las células de donantes no criopreservadas también se pueden utilizar inmediatamente después de la recolección y el enriquecimiento de CD34 utilizando protocolos aprobados.
    2. Antes de descongelar las células en el baño de agua, abra suavemente el criovial esterilizado dentro de un gabinete de bioseguridad para liberar cualquier gas atrapado dentro del vial y luego ciérrelo herméticamente.
    3. Colocar el vial en un baño de agua a 37 °C durante 1 a 2 min. Agite suavemente el vial hasta que casi no quede hielo. Retire el vial del baño de agua y esterilícelo completamente (es decir, spray de etanol al 70%).
      NOTA: Todos los pasos requieren una técnica aséptica adecuada y se realizan dentro de un gabinete estéril de seguridad biológica.
    4. Transfiera suave y lentamente las células a un tubo cónico estéril vacío de 50 ml. Lave el vial con 1 ml de medio de expansión de progenitor hematopoyético xenolibre frío (XF-HP) (Tabla 1) y combínelo suavemente (gota a gota a lo largo de los bordes del tubo) con las células para diluir el crioprotector DMSO.
    5. Deje el tubo en una rejilla durante 30 s y agregue lentamente (gota a gota) 2 ml de medio XF-HP frío. Agite suavemente la suspensión celular mientras agrega el medio. Repita este paso dos veces agregando secuencialmente 4, 8 y 4 ml de medio XF-HP frío (hasta 20 ml de volumen total). Centrifugar las células diluidas a 100 x g durante 10 min a 4 °C.
      NOTA: No pipetee las células hacia arriba y hacia abajo en la solución crioprotectora y durante los pasos de dilución. Agregue XP-HP medio gota a gota y lentamente hasta que el DMSO se diluya al menos 10 veces. Use medio frío ya que la dilución de DMSO da como resultado una reacción exotérmica.
    6. Aspirar sobrenadante libre de células en una cabina de bioseguridad. Desaloje suavemente el sedimento celular. Vuelva a suspender en 2 ml de medio de expansión XF-HP para el recuento de células utilizando un hemocitómetro o un contador automático de células.
    7. Transfiera las células descongeladas a placas multipocillos de cultivo celular de fijación ultrabaja (por ejemplo, transfiera 2 ml de mezcla de células/medio XF-HP a 1 pocillo de una placa de 6 pocillos).
    8. Envuelva bien la placa en una envoltura Saran para imitar las condiciones hipóxicas. Transfiera la placa a una incubadora (37 °C, 5% de CO2, atmósfera húmeda). Alternativamente, coloque la placa sin envolver en una incubadora con control de O2 (5% O2, 5% CO2, atmósfera húmeda).
    9. Cultivar los progenitores hematopoyéticos durante 3 días en medio XF-HP.
  2. Preparación de células progenitoras madre mesenquimales (MSC)
    1. Descongelar una alícuota (0,75 - 1x106 células) de MSC humano de bajo paso (p2 a p3) incubando una alícuota criopreservada en un baño de agua a 37 °C durante 1 a 2 min. Agite suavemente el vial hasta que casi no quede hielo. Retire el vial del baño de agua y esterilice completamente (es decir, etanol al 70%).
      NOTA: Las MSC humanas de bajo paso (p2) se pueden comprar o preparar a partir de médula ósea humana utilizando protocolos establecidos y criopreservadas. Las MSC se pueden descongelar con unos 7-10 días de anticipación e irradiarse / platearse como una capa alimentadora el día anterior a la nucleofección (Figura 1).
    2. Transfiera suave y lentamente (gota a gota a lo largo de los bordes del tubo) las células a un tubo cónico de 15 ml que contenga medio de células madre mesenquimales sin suero xenolibre frío (XF-MSC) (Tabla 1) dentro de un gabinete de bioseguridad para diluir el crioprotector DMSO al menos 10 veces (p. ej., transfiera 1 mL de alícuota de células criopreservadas a 9 mL XF-MSC de medio).
    3. Use 1 o 2 ml de medio XF-MSC frío para enjuagar el tubo y combinarlo en el tubo cónico. Centrifugar las células diluidas a 100 x g durante 5 min a 4 °C.
    4. Aspirar sobrenadante libre de células en una cabina de bioseguridad. Vuelva a suspender suavemente el sedimento celular en 1 ml de medio XF-MSC para el recuento celular utilizando un hemocitómetro o un contador automático de células.
    5. Transfiera las células descongeladas a placas de múltiples pocillos de cultivo celular tratadas con tejidos (por ejemplo, 5.000-6.000 células por cm2 o aproximadamente 50.000 células en 1 pocillo de una placa de 6 pocillos). Coloque las placas en una incubadora (37 °C, 5% de CO2, atmósfera húmeda). Actualice el medio XF-MSC cada 2-3 días dentro de un gabinete de bioseguridad.
    6. El día anterior a la nucleofección, aspire el sobrenadante libre de células en un gabinete de bioseguridad. Lave MSC una vez con PBS (2 ml/pocillo). Aspirar PBS. Agregue 1 ml/pocillo de reactivo de disociación celular (p. ej., solución de tripsina-EDTA 1X). Incubar durante 5 min a 37 °C en una incubadora deCO2 .
    7. Neutralice el reactivo de disociación añadiendo 1 ml de medio XF-MSC (dilución de al menos 2 veces) y triture suavemente con una pipeta en una suspensión unicelular. Recoja la suspensión celular en un tubo cónico de 15 ml. Centrifugar a 100 x g durante 5 min.
    8. Aspira el sobrenadante. Vuelva a suspender el sedimento celular en 1 ml de medio XF-MSC para el recuento celular utilizando un hemocitómetro o un contador automático de células.
    9. Irradie progenitores mesenquimales (2.000 rad) en 5 conductos utilizando un irradiador de rayos G o X y una placa en placas de superficie sintética recubiertas de péptidos Arg-Gly-Asp (RGD) de 6 pocillos (2x105 células por pocillo) en medio XF-MSC. Mantener las placas durante la noche en una incubadora (37 °C, 5% de CO2, atmósfera húmeda).
  3. Reprogramación episomal xenolibre
    1. Recoja cultivos CB HP de 3 días de antigüedad en medio de expansión XF-HP en un tubo cónico de 15 ml en un gabinete de bioseguridad. Centrifugar a 200 x g durante 5 min.
    2. Aspirar sobrenadante libre de células en una cabina de bioseguridad.  Vuelva a suspender suavemente el sedimento celular en 1 ml de medio de expansión XF-HP para el recuento de células utilizando un hemocitómetro o un contador automático de células.
    3. Combine 1x106 células HP expandidas con 100 μL de solución de nucleofección de células CD34+ humanas (kit de nucleofectores de células CD34+ humanas). Agregue 6 μg de episoma concentrado purificado (<5 μL) y transfiéralo cuidadosamente a una cubeta de nucleofector utilizando la pipeta de transferencia de plástico del kit de nucleofección. Evita las burbujas. Coloque la cubeta en el dispositivo nucleofector y use el programa U-008.
      NOTA: Prepare existencias del vector pCEP4 pEP4 EO2S EM2K basado en EBNA episomal (OCT4, SOX2, MYC, KLF4) mediante transformación rutinaria en E. coli TOP10 y purifique utilizando kits de preparación maxi de plásmidos. El día de la nucleofección, limpiar y concentrar el plásmido con un kit de purificación por PCR 7.
    4. Inmediatamente después de la nucleofección, agregue 500 μL de medio de expansión XF-HP precalentado en la cubeta y transfiera las células en 1 ml de medio XF-HP a 1 pocillo de placa de 6 pocillos de cultivo celular de fijación ultrabaja utilizando una pipeta de transferencia estéril.
      NOTA: Las células nucleofectadas son muy frágiles y no sobrevivirán al esfuerzo cortante de las puntas de pipeta normales de 1 ml. La transferencia a placas de cultivo de fijación ultrabaja es un paso que promueve la recuperación celular posterior a la nucleofección antes de la unión final a placas recubiertas de RGD.
    5. Envuelva bien el plato en una envoltura de plástico para imitar las condiciones hipóxicas. Coloque la placa en una incubadora deCO2 (37 °C, 5% deCO2, atmósfera húmeda). Alternativamente, coloque la placa sin envolver en una incubadora con control de O2 (5% O2, 5% CO2, atmósfera húmeda). Incubar de 4 a 6 horas.
      NOTA: Este paso permitirá que las células HP nucleofectadas se recuperen antes de transferirlas a las monocapas de MSC.
    6. Recoja las células en un tubo cónico de 15 ml en un gabinete de bioseguridad. Centrifugar a 200 x g durante 5 min.
    7. Aspire el sobrenadante dentro de un gabinete de bioseguridad. Vuelva a suspender el sedimento celular en 1 ml de medio de expansión XF-HP. Placas de células HP nucleofectadas sobre MSC irradiadas a una densidad de aproximadamente 17.500 células por cm2 en placas recubiertas de RGD en medio de expansión XF-HP (2 ml / pocillo) suplementado con inhibidor de ROCK Y-27632 (concentración final de 10 μM). Coloque la placa en una incubadora deCO2 (37 °C, 5% deCO2, atmósfera húmeda).
    8. Dos días después de la nucleofección, agregue 2 ml (volumen igual) de medio E8 en cada pocillo dentro de un gabinete de bioseguridad.
    9. Reemplace la mitad del volumen de medio de cultivo cada dos días con medio E8. Recoja las células flotantes en un tubo cónico de 15 ml, centrifugue a 200 x g durante 5 min y vuelva a añadir las células recuperadas al cultivo.
    10. El día 21, prepare placas de 6 pocillos tratadas con cultivo de tejidos recubiertos de vitronectina. Agregue 1 ml de solución de vitronectina diluida (por ejemplo, 40 ml / ml para Vitronectina-XF) a 1 pocillo de una placa de 6 pocillos e incube durante 1 hora a temperatura ambiente.
    11. Recoja manualmente colonias individuales de XF-hiPSC utilizando un microscopio invertido dentro de un gabinete de bioseguridad. Triturar con pipeta y transferir colonias individuales a placas recubiertas de vitronectina en medio E8 suplementado con inhibidor de ROCK Y-27632 (concentración final 5 μM). Coloque la placa en una incubadora deCO2 (37 °C, 5% deCO2, atmósfera húmeda).
    12. Al día siguiente, reemplace cuidadosamente el medio con medio E8 sin suplementos de inhibidores de ROCK. Cambie el medio E8 todos los días a partir de entonces (2 ml / pocillo) en un gabinete de bioseguridad.

2. Cultivo y mantenimiento rutinario de hiPSC

  1. Cuando las colonias se hacen más grandes de 5 a 6 días después (es decir, de 0,5 a 1 mm de diámetro o aproximadamente un 80% de confluencia), aspire el medio en un gabinete de bioseguridad.
  2. Agregue 2 ml / pocillo de PBS para lavar las células. Aspirar el PBS. Agregue 1 ml de solución de disociación celular a base de EDTA. Incubar durante 5 min en una incubadora deCO2 (37 °C, 5% deCO2, atmósfera húmeda). Verifique que las células estén sueltas (por ejemplo, células redondas brillantes, pero aún unidas a la placa) usando un microscopio.
  3. Aspire suavemente la solución de disociación dentro de un gabinete de bioseguridad sin alterar las células.
  4. Recoja las células en 1-2 ml de medio E8 suplementado con inhibidor de ROCK Y-27632 (concentración final de 5 μM) con pipeteo no vigoroso para mantener los grumos celulares. Transfiera los grupos celulares a placas tratadas con cultivo celular de 6 pocillos recubiertas de vitronectina (ver sección 1.3.11) (equivalente a 10 colonias por pocillo o división 1:10). Coloque la placa en una incubadora deCO2 (37 °C, 5% deCO2, atmósfera húmeda).
  5. Continúe el subcultivo con una solución de disociación celular a base de EDTA cada 5-7 días.
    NOTA: Por lo general, no se requiere subclonación adicional o selección manual de colonias para la reprogramación de SP-CB-hiPSC, pero si los clones de hiPSC contienen colonias con morfología anormal (p. ej., diferenciación espontánea como fibroblastos o formación de cuerpos embrioides, aparición de colonias anormales no planas), seleccione manualmente las colonias utilizando una micropipeta y un microscopio dentro de un gabinete de bioseguridad o descarte clones aberrantes. La reprogramación no eficiente y no estable de hiPSC no es compatible con la reversión TIRN-SC.

3. Validación fenotípica de clones XF-hiPSC

  1. Ampliar los clones de XF-hiPSC durante al menos 5-7 pases para su validación inicial (Figura 2) como se describe en la sección 2, antes de la criopreservación a largo plazo y su aplicación en estudios funcionales. Registre el número de pasajes en cada vial criopreservado.
    NOTA: La caracterización inicial de clones XF-hiPSC de bajo paso se puede confirmar mediante múltiples ensayos, como la actividad de la fosfatasa de akalina y la inmunodetección del antígeno TRA-1 o NANIG.
  2. Realice la validación y enumeración de XF-hiPSC con tinción de fosfatasa alcalina (Figura 2A, B).
    NOTA: Las eficiencias de reprogramación en cultivos a granel se pueden determinar en P0 3-5 semanas después de las nucleofecciones episomales enumerando el número de colonias completamente reprogramadas por células de entrada individuales sembradas en el día 3 7,13.
    1. Aspirar el medio de cultivo en una cabina de bioseguridad.
    2. Lave las células con PBS (2 ml por pocillo). Aspirar PBS. Fije las células agregando una solución de paraformaldehído / PBS al 2%. Incubar durante 10 min a temperatura ambiente.
    3. Retire y deseche la solución de paraformaldehído/PBS de acuerdo con las pautas de seguridad de desechos químicos.
    4. Lave las células con PBS (2 ml por pocillo). Aspirar PBS. Agregue 1-2 ml de sustrato de fosfatasa alcalina e incube durante 10 a 15 minutos a temperatura ambiente con agitación lenta.
    5. Lavar 3 veces con PBS para detener la reacción. Fotomicrografía y enumerar.
      NOTA: Evite el tiempo o la temperatura de incubación excesivos, ya que pueden provocar manchas falsas positivas.
  3. Realice la validación y enumeración de la tinción XF-hiPSC con inmunotinciones de antígeno TRA-1 (Figura 2C).
    NOTA: Para la reprogramación episómica, la detección de la expresión transgénica y la columna vertebral del vector EBNA1 durante los pasajes iniciales debe realizarse utilizando protocolos publicados7. La validación de rutina incluye cariotipo mediante bandas G (Figura 2D) o ensayos de cobertura basados en matrices de genoma completo. La pluripotencia funcional básica también se puede ensayar utilizando protocolos de diferenciación de teratomas (Figura 2E) o tarjetas de puntuación cuantitativas de expresión multigénica de diferenciaciones de cuerpos embrioides no dirigidas14.
    1. En un gabinete de bioseguridad, la inmunotinción replica los pocillos para antígenos TRA-1-60 o TRA-1-81 durante 30 min agregando anticuerpos vivos de tinción viva conjugados con fluorocromo al medio E8 en la concentración adecuada.
    2. Aspirar el medio de cultivo. Lavar dos veces con E8 medio (2 ml por pocillo).
    3. Fotografíe y enumere en medio E8 o medio sin rojo de fenol.
      NOTA: Alternativamente, fije las células con una solución de paraformaldehído/PBS al 2% durante 10 min a temperatura ambiente e inmunotiñe los antígenos TRA-1 con anticuerpos estándar.
  4. Validar el inmunofenotipo XF-hiPSC mediante citometría de flujo.
    1. En un gabinete de bioseguridad, aspire el medio de cultivo.
    2. Lave las células en PBS (2 ml por pocillo). Aspirar PBS. Agregue reactivo de disociación enzimática (p. ej., Accutasa, 1 ml por pocillo). Incubar la placa durante 5 min a 37 °C en una incubadora deCO2 (5% deCO2, atmósfera húmeda).
    3. Recoger las células añadiendo un volumen igual de medio de cultivo y pasar por un colador celular (filtro de 40-70 μm). Centrifugar celdas a 200 x g durante 5 min.
    4. Vuelva a suspender el sedimento celular en PBS con FBS al 5% (1 ml por pocillo equivalente). Cuente el número de células usando un hemocitómetro o un contador automático de células. Distribuya alrededor de 100,000-200,000 células en tubos de fondo redondo por ensayo FACS (manteniendo volúmenes de aproximadamente 100 μL por ensayo).
    5. Para las tinciones extracelulares, después de un paso de bloqueo opcional con suero de ratón puro (agregue 5 μL por ensayo, 5 min a temperatura ambiente), incube con anticuerpos conjugados con fluorocromo (p. ej., TRA-1-81 PE, SSEA4 APC) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Lavar con 3 ml de PBS. Centrifugar durante 5 min a 300 x g. Vuelva a suspender en el búfer FACS (por ejemplo, PBS con FBS al 5%) y adquiera usando un instrumento FACS.
      NOTA: utilice siempre controles de isotipo apropiados y tiña muestras paralelas para validar la especificidad de las proteínas inmunodetectadas.
    6. Para tinciones intracelulares (p. ej., NANOG-PE, OCT3/4-PE, SOX2-PE), siga las instrucciones del fabricante para los pasos de fijación/permeabilización. Incubar con anticuerpos conjugados con fluorocromo o controles de isotipo coincidentes. Adquirir utilizando un instrumento FACS.

4. Criopreservación y descongelación de clones de XF-hiPSC

  1. Expanda los clones de XF-hiPSC durante al menos 5-7 pases para realizar la validación inicial (Figura 2) antes de la criopreservación a largo plazo y la aplicación en estudios funcionales. Registre el número de pasajes en cada vial criopreservado.
    1. Aspirar el medio de cultivo en una cabina de bioseguridad.
    2. Lave las células con PBS (2 ml por pocillo). Aspirar PBS.  Agregue una solución de desprendimiento celular basada en EDTA (1 ml por pocillo) para disociar las colonias de XF-hiPSC en grupos celulares. Incubar la placa durante 5 min en una incubadora deCO2 (37 °C, 5% deCO2, atmósfera húmeda). Verifique que las células estén sueltas (por ejemplo, células redondas brillantes) con un microscopio.
    3. Aspire suavemente la solución de disociación sin interrumpir las colonias de monocapa celular y recoja las células en medio E8 de 1-2 ml con pipeteo no vigoroso para mantener los grupos celulares (10-50 células por grupo). Recoja XF-hiPSC en un tubo cónico estéril de 15 ml. Centrifugar celdas a 200 x g durante 5 min.
    4. Aspire el sobrenadante en un gabinete de bioseguridad. Vuelva a suspender el sedimento celular en una solución de congelación (Tabla 2, ~ 1 pocillo equivalente por ml).
    5. Transfiera las células a tubos criogénicos de almacenamiento a largo plazo. Coloque los tubos en un recipiente de congelación lenta y deje que las muestras se congelen durante la noche en un congelador a -80 °C. Al día siguiente, coloque los crioviales en un congelador de nitrógeno líquido para su almacenamiento a largo plazo.
  2. Para descongelar, preparar una placa mediante recubrimiento previo con vitronectina (ver sección 1.3.11).
    1. Coloque el vial congelado en un baño de agua a 37 ° C y descongele las células durante ~ 1-2 min. Esterilizar (es decir, spray de etanol).
    2. Transfiera lentamente XF-hiPSC a un tubo cónico estéril de 15 ml que contenga 9 ml de medio de descongelación (Tabla 2) para diluir lentamente las células 10 veces dentro de un gabinete estéril de la campana de seguridad biológica.
      NOTA: No pipetee vigorosamente.
    3. Centrifugar a 200 x g durante 5 min.
    4. Aspire el sobrenadante libre de células en un gabinete de bioseguridad. Vuelva a suspender el sedimento celular en medio E8 (1-2 ml) suplementado con inhibidor de ROCK (concentración final 5 mM).
      Nota: La exclusión de Y-27632 dará como resultado una eficiencia de recuperación posterior a la descongelación deficiente.
    5. Transfiera las células descongeladas a 1 o 2 pocillos recubiertos de vitronectina de una placa de 6 pocillos. Al día siguiente, cambie el medio con medio E8 regular sin inhibidor de ROCK para la expansión celular.

5. Diferenciación hematovascular xenolibre de XF-hiPSC

  1. Diferenciar XF-hiPSC utilizando nuestro protocolo de diferenciación hematovascular xenolibre optimizado (Figura 3)4.
    NOTA: Este protocolo se modifica de15.
    1. Prepare XF-hiPSC a ~40-50 % de confluencia (1-3 días después de pasar).
    2. Aspire el medio de cultivo y agregue 2 ml de medio de determinación mesodérmica (Tabla 2) en un gabinete de bioseguridad.
    3. Después de 2 días, aspire el medio y agregue 2 ml / pocillo de medio de diferenciación vascular (Tabla 2) en un gabinete de bioseguridad. Si se ven muchas células muertas o flotantes en este paso, lávese una vez con 2 ml de PBS.
    4. Reemplace el medio de diferenciación vascular cada dos días en un gabinete de bioseguridad hasta el día 11.
      NOTA: Si el medio se vuelve amarillo debido a la alta densidad celular y al bajo pH, agregue 1 ml de medio fresco o reemplácelo todos los días.
  2. Después de 7-10 días de cultivo en medio de diferenciación vascular, purifique las células vasculares CD31+ o CD34+ de la monocapa adherente con un método de clasificación de células de perlas magnéticas.
    NOTA: Cada clon individual puede mostrar una cinética de diferenciación distinta. Determine el punto de tiempo máximo para la expresión de CD31 / CD34 mediante análisis FACS (Figura 4A). Se requiere un análisis FACS de enriquecimiento de perlas pre y post magnéticas. Los progenitores hematopoyéticos (HP) pueden recuperarse en esta etapa del sobrenadante y enriquecerse con microperlas CD34. El HP derivado de CD34+ XF-hiPSC puede validarse aún más mediante el ensayo de metilcelulosa (Figura 4B-C)16.
    1. En una cabina de bioseguridad, aspire el medio de cultivo y lave las células en PBS (2 ml por pocillo). Aspire PBS y disocie las colonias de hiPSC en células individuales agregando un reactivo de disociación enzimática (p. ej., Accutasa, 1 ml por pocillo). Incubar las células durante 5 min a 37 °C en una incubadora deCO2 (5% deCO2, atmósfera húmeda).
    2. En un gabinete de bioseguridad, recolecte células agregando un volumen igual de medio de cultivo. Centrifugar celdas a 200 x g durante 5 min.
    3. Resuspender el sedimento celular en medio de diferenciación vascular (Tabla 2). Cuente el número de células usando un hemocitómetro o un contador automático de células. Reserve alrededor de 50,000-100,000 células para el ensayo FACS de enriquecimiento de perlas premagnéticas utilizando anticuerpos anti-CD31 o anti-CD34 directamente conjugados.
    4. Centrifugar las células restantes a 300 x g durante 5 min. Vuelva a suspender el sedimento celular en un tampón de enriquecimiento de perlas magnéticas (PBS pH 7,2, albúmina sérica bovina al 0,5% (BSA) y EDTA 2 mM) en una cabina de bioseguridad.
    5. Pasar las células a través de un filtro celular (filtro de 40-70 μm). Centrifugar a 300 x g durante 5 min. Vuelva a suspender en un tampón de enriquecimiento de perlas magnéticas de 60 μl.
    6. Agregue 20 μL de reactivo de bloqueo de FcR, luego agregue 20 μL de microperlas CD31 o CD34 e incube durante 15-20 min a 4 °C.
    7. Lave las células con 2 ml de tampón de enriquecimiento de perlas magnéticas en un gabinete de bioseguridad y centrífuga (300 x g, 5 min).
    8. Vuelva a suspender el sedimento celular en un tampón de enriquecimiento de perlas magnéticas de 1 ml en un gabinete de bioseguridad.
    9. Coloque una columna LS en el campo magnético de un separador magnético de células dentro del gabinete de bioseguridad. Columna de lavado con tampón de enriquecimiento de perlas magnéticas de 3 ml.
    10. Aplicar celdas a la columna.  Recoja las células no marcadas en un tubo cónico de 15 ml. Lave la columna 3 veces con un tampón de enriquecimiento de perlas magnéticas de 3 ml.
    11. Retire la columna del separador y colóquela en un nuevo tubo cónico de 15 ml.
    12. Enjuague las células marcadas magnéticamente agregando 3-5 ml de medio de crecimiento endotelial. Centrifugar a 200 x g durante 5 min.
    13. Volver a suspender en 1 ml de medio de crecimiento endotelial en una cabina de bioseguridad. Cuente el número de células usando un hemocitómetro o un contador automático de células. Reserve alrededor de 50,000 células para la pureza de clasificación de enriquecimiento de perlas postmagnéticas mediante análisis FACS utilizando anticuerpos anti-CD31 o anti-CD34 directamente conjugados.
    14. La VP aislada se puede expandir aún más en placas de matraces tratados con cultivo de tejidos recubiertos de fibronectina (10 μg / ml) en medio de crecimiento endotelial.

6. Directrices de diseño experimental para la validación funcional de XF-hiPSC

  1. Establecer existencias de XF-hiPSC validadas en los primeros pasajes utilizando un método no integrador establecido, como la reprogramación episomal 7,17, del virus de Sendai18 o del ARNm19.
    NOTA: En otra parte se proporciona una comparación de la eficacia y fiabilidad de los métodos de no reprogramación6. La eliminación de material transgénico en métodos de reprogramación episomal o del virus de Sendai se puede verificar durante los pasajes iniciales utilizando métodos de PCR 7,20. La retención de transgenes no es compatible con la generación de TIRN-SC.
  2. Validar el cariotipo normal en clones XF-hiPSC mediante ensayos de cobertura basados en bandas G o matrices de genoma completo9.
  3. Valide la expresión génica y la integridad epigenómica de las líneas XF-hiPSC (es decir, improntas parentales, activación X) utilizando matrices de metilación del ADN y expresión génica o métodos de secuenciación 5,11,14.
  4. Valide la pluripotencia funcional básica utilizando protocolos de diferenciación de teratomas (Figura 2E), ensayos cuantitativos de diferenciación del cuerpo embrioide (EB) utilizando matrices de RT-PCR14 o ensayos de diferenciación dirigida hacia las 3 capas germinales9.
    NOTA: En otra parte se proporcionan métodos cuantitativos para la capacidad de diferenciación multilinaje y el índice proliferativo intralinaje de los ensayos de teratoma mediante caracterización histológica por microscopía4. Los protocolos para la diferenciación dirigida hacia linajes mesodérmicos y la especificación hematovascular (Figura 4A-C) se detallaron previamente 4,5,9, así como el ensayo de diferenciación dirigida hacia el endodermo definitivo (Figura 4D)5. En otros lugares se proporcionan ejemplos de ensayos de diferenciación dirigida hacia el ectodermo 4,5.

7. Adaptación química de TIRN de XF-hiPSC

  1. Compre o prepare alimentadores MEF de bajo paso internos a partir de embriones de ratón híbridos E13.5 CF1 o CF1 x DR4 siguiendo los protocolos publicados 9,21. Coloque 200.000 alimentadores de MEF por pocillo en una placa de 6 pocillos gelatinizada (gelatina al 0,1 % en agua, 1 ml por pocillo) tratada con cultivo de tejidos al menos un día antes del paso de adaptación de TIRN (los protocolos detallados de TIRN se proporcionan en otra parte 4,5,9).
  2. Mantener y expandir cultivos XF-hiPSC libres de transgenes con cariotipos normales validados en un sistema de cultivo sin alimentador (p. ej., medio E8, consulte la Tabla 1 para la formulación interna).
  3. Reemplace el medio E8 con medio LIF-5i (2 ml por pocillo; Tabla 1) después de que los cultivos XF-hiPSC hayan alcanzado una confluencia de ~50% (es decir, 3-5 días después de la siembra inicial) en un gabinete de bioseguridad.
  4. Al día siguiente, aspire el medio de cultivo y lave el XF-hiPSC adaptado a LIF-5i una vez con PBS (2 ml por pocillo) en un gabinete de bioseguridad. Aspire el sobrenadante y agregue 1 ml de reactivo de disociación celular enzimática a cada pocillo. Incubar durante 5 min a 37 °C en una incubadora deCO2 .
  5. Triture suavemente con una pipeta en una suspensión unicelular en un gabinete de bioseguridad. Neutralizar con medio LIF-5i (1 ml por pocillo). Recoja la suspensión celular en un tubo cónico estéril de 15 ml.  Centrifugar a 200 x g durante 5 min.
  6. Aspire el sobrenadante en un gabinete de bioseguridad. Vuelva a suspender el sedimento celular en 2 ml de medio LIF-5i.
    NOTA: Si es posible, tome una alícuota para el recuento de células. Es posible neutralizar la actividad enzimática con el medio LIF-5i/LIF-3i sin suplementación con inhibidores o factores de crecimiento.
  7. Lave la placa MEF dos veces con PBS (2 ml por pocillo en placas de 6 pocillos) y agregue células (1 pocillo equivalente de células adaptadas a LIF-5i en 1 pocillo de alimentadores MEF en medio LIF-5i de 2 ml).
    NOTA: La optimización de las densidades de recubrimiento iniciales para cada línea XF-hiPSC individual es opcional. Si se contaron las células en el paso anterior, coloque un mínimo de 1x106 células por pocillo en los comederos.  Transfiera la placa a una incubadora de CO2 (37 °C, 5% de CO2, atmósfera húmeda).
  8. Cultivar y mantener XF-hiPSC durante 3-5 días en LIF-5i en MEF en una incubadora de CO2 (37 °C, 5% de CO2, atmósfera húmeda). Cambie el medio LIF-5i diariamente.
  9. Cuando se forman colonias de TIRN-SC en forma de cúpula (después de 3-5 días de cultivo en comederos), aspire el medio de cultivo en un gabinete de bioseguridad. Lave cada pocillo con 2 ml de PBS.
  10. Aspirar PBS. Agregue 1 ml de solución de desprendimiento celular (por ejemplo, Accutasa) a cada pocillo. Incubar durante 5 min a 37 °C en una incubadora deCO2 (5% deCO2, atmósfera húmeda).
  11. Agregue 1 ml de medio LIF-3i (Tabla 1) a cada pocillo en un gabinete de bioseguridad para neutralizar el reactivo de disociación. Triture suavemente y recoja las células en un tubo cónico de 15 ml. Centrifugar a 200 x g durante 5 min.
  12. Aspire el sobrenadante en un gabinete de bioseguridad. Vuelva a suspender en medio LIF-3i (1 ml por pocillo) para el recuento de células utilizando un hemocitómetro o un contador automático de células. Coloque ~5 x 105 células en medio LIF-3i de 2 ml por pocillo sobre MEF irradiado en placas gelatinizadas de 6 pocillos en un gabinete de bioseguridad.
    NOTA: repita los pasos 7.12 5o 7.16 para todos los pasajes posteriores.  Después del cultivo inicial adaptado a LIF-5i, se colocan cultivos de LIF-3i en placas a una densidad más baja (2x105 células/pocillo) y se realizan cada 3-4 días.
  13. XF-hiPSC revertido por TIRN durante al menos 6-7 pases continuos en medio LIF-3i antes de su uso en estudios funcionales o criopreservación. Registre el número de pasajes en medio de cultivo cebado xenolibre (p. ej., E8) o en medio LIF-5i / LIF-3i TIRN.
    NOTA: La reversión de TIRN de líneas XF-hiPSC de paso alto (por ejemplo, >p40) es ineficiente y no se recomienda. Las líneas de paso alto a menudo albergan defectos cromosómicos o subcromosómicos, que no son compatibles con la reversión eficiente de TIRN, y darán como resultado eficiencias de reversión deficientes y estabilidad de cultivo limitada. Además, no se recomienda el uso de cultivos de TIRN que hayan pasado más de 15 pases en medio LIF-3i para estudios funcionales. El impacto funcional de la reversión de TIRN de XF-hiPSC es más prominente entre 7 y 15 pasajes en medio LIF-3i.

8. Pautas de diseño experimental para la diferenciación dirigida de TIRN-SC derivado de HIPSC XF / FF.

  1. Utilice directamente TIRN-SC derivado de XF/FF hiPSC en protocolos de diferenciación dirigida establecidos sin ningún paso de "recebado" (es decir, sin necesidad de volver a cambiar las células madre TIRN a condiciones convencionales "cebadas" antes de su uso en ensayos de diferenciación dirigida).
  2. Para la evaluación funcional del impacto de TIRN en XF-hiPSC, configure cultivos isogénicos hermanos, en un número de paso equivalente en paralelo. Mantener cultivos XF-hiPSC isogénicos cebados/hermanos de TIRN en paralelo en sus respectivos medios (p. ej., E8 en vitronectina vs. LIF-3i en MEF) y realizar simultáneamente un ensayo de teratoma (Figura 5), o diferenciar utilizando un cuerpo embrioide idéntico o protocolos y materiales de diferenciación dirigida (Figura 6).
  3. Realizar una evaluación funcional de los linajes diferenciados terminales, cuando sea posible. Por ejemplo, los progenitores vasculares se pueden evaluar mediante la expresión de proteínas, el ensayo de captación de lipoproteínas de baja densidad (LDL) acetiladas conjugadas con DiI y el ensayo de tubo de Matrigel (Figura 7).
    NOTA: En otra parte se detallan ensayos funcionales adicionales para VP derivados de CB-hiPSC y TIRN-SC (es decir, ensayos de absorción/senescencia/proliferación / migración de DiI-Ac-LDL, ensayos in vitro de tubo de Matrigel, ensayo de tapón de Matrigel en animales, ensayos de xenotrasplante) 3,4.
  4. Ajuste y optimice las densidades y la cinética de la placa inicial (Figura 6) para cada clon XF-hiPSC individual en cada ensayo de diferenciación.
    NOTA: Las XF-hiPSC revertidas por TIRN tienen una capacidad proliferativa y de diferenciación más robusta en los ensayos de diferenciación dirigida que las cultivos de XF-hiPSC cebadas. Los cultivos de TIRN generalmente requieren una densidad de siembra inicial más baja que los cultivos E8 y no requieren el uso de suplementos antiapoptóticos para mejorar la supervivencia clonal.

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Resultados

Este protocolo optimiza los métodos publicados para la reprogramación eficiente de progenitores mieloides a un estado pluripotente cebado de alta fidelidad utilizando vectores episomales y señales estromales7. El protocolo (Figura 1) describe métodos definidos para la reprogramación episomal cebada por estromales XF/FF de progenitores CB CD34+ humanos en XF-hiPSC, e instruye cómo validar su funcionalidad a través de la especificación hematovascular...

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Discusión

El grupo de Zambidis informó originalmente de un método episomal de cuatro factores altamente optimizado para reprogramar progenitores mieloides CB comprometidos con el linaje en CB-hiPSC con eficiencias a granel que alcanzan hasta el 50% en células purificadas que expresan episomas7. En este documento, presentamos una versión modificada del protocolo original de reprogramación episomal del progenitor CB humano en condiciones de cebado con estroma XF / FF. Este mé...

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Divulgaciones

No hay divulgaciones que declarar.

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado por subvenciones de los NIH / NEI (R01EY032113; ETZ), el Fondo de Investigación de Células Madre de Maryland (2023-MSCRFV-5995; 2024-MSCRFV-6248; 2025-MSCRFV-0005; 2025-R2-MSCRFV-0004 (ETZ) y la Fundación Lisa Dean Moseley (ETZ).

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Amaxa Biosystems Nucleofector IILonzaAAB-1001
anticuerpo anti-CD143 (BB9), conjugado con APCBD Biociencias557929use 10-20 µ L por ensayo (FACS)
anticuerpo anti-CD144, conjugado con PE BD Biociencias560410use 10-20 µ L por ensayo (FACS)
anticuerpo anti-CD146, conjugado con PE BD Biociencias550315use 10-20 µ L por ensayo (FACS)
anticuerpo anti-CD184/CXCR4, conjugado con APC BD Biociencias555976use 10-20 µ L por ensayo (FACS)
anticuerpo anti-CD31BD Biociencias550389Diluir 1:100 en solución de bloqueo para ensayo inmunofluorescente
anticuerpo anti-CD31, conjugado con APC eBiociencia17-0319-42use 2 µ L por ensayo (FACS)
anticuerpo anti-CD34, APC conjugado BD Biociencias555824use 5 µ L por ensayo (FACS)
anticuerpo anti-CD45, conjugado con PE BD Biociencias555483use 10-20 µ L por ensayo (FACS)
anticuerpo anti-NANOG, conjugado PEBD Biociencias560483use 10-20 µ L por ensayo (FACS)
anticuerpo anti-OCT4, conjugado con PER& Sistemas DIC1759Puse 10 µ L por ensayo (FACS)
anticuerpo anti-SOX17, Alexa488 conjugado BD Biociencias562205use 5 µ L por ensayo (FACS)
anticuerpo anti-SOX2, conjugado con PER& Sistemas DIC2018Puse 10 µ L por ensayo (FACS)
anticuerpo anti-SSEA-4, conjugado con APC R& Sistema DFAB1435Ause 5 µ L por ensayo (FACS)
anticuerpo anti-SSEA-4 GloLIVE, NL493 conjugadoR& Sistema DNLLC1435GUso en dilución 1:50 (inmunotinciones vivas y fijas)
kit conjugado anti-TRA-1-60 A488ThermoFisher ScientificReferencia A25618
anticuerpo anti-TRA1-60, conjugado con PEBD Biociencias560193use 10 µ L por ensayo (FACS)
anticuerpo anti-TRA-1-60 GloLIVE, NL557 conjugado R& Sistemas DNLLC4770Ruse at  una dilución 1:50 (inmunotinciones vivas y fijas)
anticuerpo anti-TRA-1-60 StainAlive, conjugado DyLight 488Stemgent09-0068Uso en una dilución 1:100 (inmunotinciones vivas y fijas)
anticuerpo anti-TRA1-81, conjugado con PEBD Biociencias560161use 10 µ L por ensayo (FACS)
anticuerpo anti-TRA-1-81 StainAlive, conjugado DyLight 488Stemgent09-0069Uso en una dilución 1:100 (inmunotinciones vivas y fijas)
Kit de microperlas CD31, humanoMiltenyi Biotec130-091-935
Kit de microperlas CD34, humanoMiltenyi Biotec130-046-702
CD34+ Donantes mixtos,  Sangre del cordón umbilical, 1 millón de célulasTodas las celdasCB, CR, CD34+, Mixto, PS, CS10, 1MLas fuentes alternativas de células incluyen hígado fetal, médula ósea adulta y sangre periférica movilizada
Ratón CF1Río Charles023
CHIR99021R& Sistema DL5283reconstituir a 100 mM en DMSO
Placas de 6 pocillos tratadas con cultivo de tejidos Corning CostarCorning3506
Sustrato Corning Synthemax II-SC, vial de 10 mgCorning3535usar a 5 μ g/cm2 como reemplazo de Corning 3978
Placa de 6 pocillos Corning Synthemax-RCorning3978descontinuado y reemplazado a 3535
Costar Placa de 6 pocillos transparente de fondo plano ultra bajoCorning3471
Condesa  Portaobjetos de la cámara de recuento de célulasThermo Fisher ScientificC10228
Contador de celdas automatizado CountessThermo Fisher ScientificAMQAX1000
CryoStore CS10Tecnologías de células madre100-1061
DII-Ac-LDLThermo Fisher ScientificL3484uso a 5-15 µ g/ml
DMEM (medio de águila modificado de Dulbecco) Thermo Fisher Scientific11995065
DMEM/F-12 , Suplemento GlutaMAXThermo Fisher Scientific10565018
DMEM/F-12, HEPESThermo Fisher Scientific11330032
DMSO (dimetilsulfóxido)Sigma AldrichD2650
Ratón DR4El laboratorio Jackson3208
Esencial 8 (E8) medioTecnologías de células madre5940
Suero bovin fetal (FBS)Thermo Fisher ScientificSH30071.03
ARREGLAR & Kit de permeabilización celular PERMThermo Fisher ScientificGAS004
ForskolinaStemgent04-0025reconstituir a 100 mM en DMSO
Gelatina (porcina)Sigma AldrichG1890-100GVolver a suspender en agua y esterilizar con autoclave
nucleofector de células CD34+ humanas botiquínLonzaVPA-1003
Isotipo de ratón IgG1 PE conjugadoBD Biociencias554680
Isotipo de ratón IgG2a PE conjugadoBD Biociencias558595
Isotipo de rata IgG2b PE conjugadoR& Sistemas DIC013P
Reemplazo de suero KnockOutThermo Fisher Scientific10828-028
Ácido L-ascórbicoMillipore SigmaA8960
L-Glutamina (100X)Thermo Fisher Scientific25030-081
Columnas LSMiltenyi Biotec130-042-401
MatrigelCorning356237use 200 µ L/pocillo en placas de 48 pocillos
MEM Aminoácido no esencial (MEM NEAA) (100X)Thermo Fisher Scientific11140-050
MethoCult SF H4436Tecnologías de células madre04436
Separador MidiMACSMiltenyi Biotec130-042-302
mTeSR1 medioTecnologías de células madre85850
Viales criogénicos NalgeneThermo Fisher Scientific5000-0020
Solución de paraformaldehído, 4% en PBSThermo Fisher ScientificJ19943. K2diluir a la concentración requerida usando PBS
PD0325901Sigma AldrichPZ0162reconstituir a 100 mM en DMSO
Penicilina/estreptomicina (10,000 U/ml)Thermo Fisher Scientific15140-122
epísoma pEP4 E02S EM2KAddgene20923Los plásmidos se propagaron en TOP10 E.  coli (Invitrogen) y purificado con los kits Maxi de plásmidos QIAGEN.
Solución salina tamponada con fosfato (PBS)Industrias biológicas02-023-1A
Células madre mesenquimales humanas poiéticas LonzaPT-2501750,000 celdas en el pasaje 2 se pueden descongelar y expandir de acuerdo con las instrucciones del fabricante para 1-2 pases antes de su uso o almacenamiento secundario
PurmorfaminaStemgent04-0009reconstituir a 10 mM en DMSO
Activina A recombinantePeprotech120-14EVolver a suspender en (100 µ g/ml) en PBS estéril, albúmina sérica humana o bovina al 0,1%
FGF2 humano recombinantePeprotech100-18BVolver a suspender en (100 µ g/ml) en PBS estéril, albúmina sérica humana o bovina al 0,1%
FGF-básico humano recombinante (bFGF)Peprotech100-18Brecompensa a 100 µ g/ml en suero bovino al 0,1%/albúmina humana en PBS
ligando FLT3 humano recombinanteR& Sistemas D308-FKHB o 308E-GMPVolver a suspender en (100 µ g/ml) en PBS estéril, albúmina sérica humana o bovina al 0,1%
Insulina humana recombinanteBiogemas10-365
ligando kit humano recombinanteR& Sistemas DBT-SCF o BT-SCF-GMPVolver a suspender en (100 µ g/ml) en PBS estéril, albúmina sérica humana o bovina al 0,1%
LIF humano recombinantePeprotech300-05recompensa a 100 µ g/ml en albúmina sérica bovina/humana al 0,1% en PBS
TGF&beta humano recombinante; 1Peprotech  100-21recompensa a 100 µ g/ml en albúmina sérica bovina/humana al 0,1% en PBS
Trombopoyetina humana recombinanteR& Sistemas D288-TPN o 288E-GMPVolver a suspender en (100 µ g/ml) en PBS estéril, albúmina sérica humana o bovina al 0,1%
transferrina humana recombinanteMillipore SigmaT3705
BMP4 humano recomiendantePeprotech120-05Volver a suspender en (100 µ g/ml) en PBS estéril, albúmina sérica humana o bovina al 0,1%
SB431543SelleckchemS1067reconstituir a 10 mM en DMSO
SIGMAFAST, sustrato de fosfatasa alcalina, cromogénico, comprimidoMillipore SigmaB5655disuelva 1 tableta en 10 ml de agua purificada
Selenito de sodioMillipore SigmaS5261
Stemolecule Y27632 en soluciónStemgent04-0012-02Inhibidor de ROCK en solución (10 mM)
Reactivo de disociación celular StemPro AccutasaThermo Fisher ScientificA11105-01
StemPro MSC SFM XenoFree (XF-MSC)Thermo Fisher ScientificA1067501Prepare el medio XF-MSC mezclando 5 ml de suplemento StemPro MSC SFM XenoFree con 500 ml de medio basal StemPro MSC SFM. El medio alícuota se puede criopreservar, a -20°C.
StemSpan SFEMTecnologías de células madre9600
Thermo Scientific Mr. Frosty Contenedor de congelaciónThermo Fisher Scientific5100-0001
Aglutina I de Ulex Europaeus (UEA-1), biotipiladaLaboratorios VectorB-1065-2Diluir 1:200 en solución bloqueante para ensayo fluorescente
VEGFPeprotech100-20Volver a suspender en (100 µ g/ml) en PBS estéril, albúmina sérica humana o bovina al 0,1%
Solución de VerseneThermo Fisher Scientific15040066
Matriz de vitronectina XFTecnologías de células madre7180diluir a 40 µ L/ml en tampón de dilución CellAttach
XAV939Sigma AldrichX3004reconstituir a 100 mM en DMSO
β-mercaptoetanolThermo Fisher Scientific21985-023sensible a la luz

Referencias

  1. Yamanaka, S. Pluripotent stem cell-based cell therapy: Promise and challenges. Cell Stem Cell. 27 (4), 523-531 (2020).
  2. Kyttala, A., et al. Genetic variability overrides the impact of parental cell type and determines iPS cell differentiation potential. Stem Cell Rep. 6 (2), 200-212 (2016).
  3. Park, T. S., et al. Vascular progenitors from cord blood-derived induced pluripotent stem cells possess augmented capacity for regenerating ischemic retinal vasculature. Circulation. 129 (3), 359-372 (2014).
  4. Park, T. S., et al. Vascular progenitors generated from tankyrase inhibitor-regulated naïve diabetic human iPS cells potentiate efficient revascularization of ischemic retina. Nat Commun. 11 (1), 1195(2020).
  5. Zimmerlin, L., et al. Tankyrase inhibition promotes a stable human naïve pluripotent state with improved functionality. Development. 143 (23), 4368-4380 (2016).
  6. Schlaeger, T. M., et al. A comparison of non-integrating reprogramming methods. Nat Biotechnol. 33 (1), 58-63 (2015).
  7. Park, T. S., et al. Growth factor-activated stem cell circuits and stromal signals cooperatively accelerate non-integrated iPSC reprogramming of human myeloid progenitors. PLoS One. 7 (8), e42838(2012).
  8. Zimmerlin, L., et al. Proteogenomic reprogramming to a functional human blastomere-like stem cell state via a PARP-DUX4 regulatory axis. Cell Rep. 44 (5), 115671(2025).
  9. Park, T. S., Zimmerlin, L., Evans-Moses, R., Zambidis, E. T. Chemical reversion of conventional human pluripotent stem cells to a naive-like state with improved multi-lineage differentiation potency. J Vis Exp. (136), e57921(2018).
  10. Maiers, M., et al. Harnessing global HLA data for enhanced patient matching in iPSC haplobanks. Cytotherapy. 27 (3), 300-306 (2025).
  11. Thomas, J., et al. Running the full human developmental clock in interspecies chimeras using alternative human stem cells with expanded embryonic potential. NPJ Regen Med. 6 (1), 25(2021).
  12. Zheng, C., Ballard, E. B., Wu, J. The road to generating transplantable organs: From blastocyst complementation to interspecies chimeras. Development. 148 (12), 195792(2021).
  13. Chan, E. M., et al. Live cell imaging distinguishes bona fide human iPS cells from partially reprogrammed cells. Nat Biotechnol. 27 (11), 1033-1037 (2009).
  14. Bock, C., et al. Reference maps of human ES and iPS cell variation enable high-throughput characterization of pluripotent cell lines. Cell. 144 (3), 439-452 (2011).
  15. Orlova, V. V., et al. Generation, expansion, and functional analysis of endothelial cells and pericytes derived from human pluripotent stem cells. Nat Protoc. 9 (6), 1514-1531 (2014).
  16. Park, T. S., Zimmerlin, L., Zambidis, E. T. Efficient and simultaneous generation of hematopoietic and vascular progenitors from human induced pluripotent stem cells. Cytometry A. 83 (1), 114-126 (2013).
  17. Okita, K., et al. A more efficient method to generate integration-free human iPS cells. Nat Methods. 8 (5), 409-412 (2011).
  18. Fusaki, N., Ban, H., Nishiyama, A., Saeki, K., Hasegawa, M. Efficient induction of transgene-free human pluripotent stem cells using a vector based on Sendai virus, an RNA virus that does not integrate into the host genome. Proc Jpn Acad Ser B Phys Biol Sci. 85 (8), 348-362 (2009).
  19. Warren, L., et al. Highly efficient reprogramming to pluripotency and directed differentiation of human cells with synthetic modified mRNA. Cell Stem Cell. 7 (5), 618-630 (2010).
  20. Ban, H., et al. Efficient generation of transgene-free human induced pluripotent stem cells (iPSCs) by temperature-sensitive Sendai virus vectors. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (34), 14234-14239 (2011).
  21. Jozefczuk, J., Drews, K., Adjaye, J. Preparation of mouse embryonic fibroblast cells suitable for culturing human embryonic and induced pluripotent stem cells. J Vis Exp. (64), e3854(2012).
  22. Zimmerlin, L., Park, T. S., Zambidis, E. T. Capturing human naïve pluripotency in the embryo and in the dish. Stem Cells Dev. 26 (16), 1141-1161 (2017).
  23. Brunner, S., et al. Circulating angiopoietic cells and diabetic retinopathy in type 2 diabetes mellitus, with or without macrovascular disease. Invest Ophthalmol Vis Sci. 52 (7), 4655-4662 (2011).
  24. Caballero, S., et al. Ischemic vascular damage can be repaired by healthy, but not diabetic, endothelial progenitor cells. Diabetes. 56 (4), 960-967 (2007).
  25. Jarajapu, Y. P., Grant, M. B. The promise of cell-based therapies for diabetic complications: Challenges and solutions. Circ Res. 106 (5), 854-869 (2010).
  26. Khullar, M., Cheema, B. S., Raut, S. K. Emerging evidence of epigenetic modifications in vascular complications of diabetes. Front Endocrinol (Lausanne). 8, 237(2017).
  27. Manzar, G. S., Kim, E. M., Zavazava, N. Demethylation of induced pluripotent stem cells from type 1 diabetic patients enhances differentiation into functional pancreatic beta cells. J Biol Chem. 292 (34), 14066-14079 (2017).
  28. French, A., et al. Enabling consistency in pluripotent stem cell-derived products for research and development and clinical applications through material standards. Stem Cells Transl Med. 4 (3), 217-223 (2015).
  29. Zimmerlin, L., Park, T. S., Bhutto, I., Lutty, G., Zambidis, E. T. Generation of pericytic-vascular progenitors from tankyrase/parp-inhibitor-regulated naïve (tirn) human pluripotent stem cells. Methods Mol Biol. 2416, 133-156 (2022).
  30. Thorsell, A. G., et al. Structural basis for potency and promiscuity in poly(adp-ribose) polymerase (PARP) and tankyrase inhibitors. J Med Chem. 60 (4), 1262-1271 (2017).
  31. Huang, S. M., et al. Tankyrase inhibition stabilizes axin and antagonizes Wnt signalling. Nature. 461 (7264), 614-620 (2009).
  32. Ying, Q. L., et al. The ground state of embryonic stem cell self-renewal. Nature. 453 (7194), 519-523 (2008).
  33. Theunissen, T. W., et al. Molecular criteria for defining the naïve human pluripotent state. Cell Stem Cell. 19 (4), 502-515 (2016).
  34. Pastor, W. A., et al. Naïve human pluripotent cells feature a methylation landscape devoid of blastocyst or germline memory. Cell Stem Cell. 18 (3), 323-329 (2016).
  35. Taapken, S. M., et al. Karyotypic abnormalities in human induced pluripotent stem cells and embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 29 (4), 313-314 (2011).
  36. Mitalipova, M. M., et al. Preserving the genetic integrity of human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 23 (1), 19-20 (2005).
  37. Beers, J., et al. Passaging and colony expansion of human pluripotent stem cells by enzyme-free dissociation in chemically defined culture conditions. Nat Protoc. 7 (11), 2029-2040 (2012).
  38. Laurent, L. C., et al. Dynamic changes in the copy number of pluripotency and cell proliferation genes in human ESCs and iPSCs during reprogramming and time in culture. Cell Stem Cell. 8 (1), 106-118 (2011).
  39. Hussein, S. M., et al. Copy number variation and selection during reprogramming to pluripotency. Nature. 471 (7336), 58-62 (2011).
  40. Yang, Y., et al. Derivation of pluripotent stem cells with in vivo embryonic and extra-embryonic potency. Cell. 169 (2), 243-257.e25 (2017).
  41. Yang, J., et al. Establishment of mouse expanded potential stem cells. Nature. 550 (7676), 393-397 (2017).
  42. Gao, X., et al. Establishment of porcine and human expanded potential stem cells. Nat Cell Biol. 21 (6), 687-699 (2019).
  43. Liu, B., et al. Chemically defined and xeno-free culture condition for human extended pluripotent stem cells. Nat Commun. 12 (1), 3017(2021).
  44. Wu, J., et al. Interspecies chimerism with mammalian pluripotent stem cells. Cell. 168 (3), 473-486.e15 (2017).
  45. Yamaguchi, T., et al. Interspecies organogenesis generates autologous functional islets. Nature. 542 (7640), 191-196 (2017).
  46. Kobayashi, T., et al. Generation of rat pancreas in mouse by interspecific blastocyst injection of pluripotent stem cells. Cell. 142 (5), 787-799 (2010).
  47. Theunissen, T. W., et al. Systematic identification of culture conditions for induction and maintenance of naïve human pluripotency. Cell Stem Cell. 15 (4), 471-487 (2014).
  48. Gafni, O., et al. Derivation of novel human ground-state naïve pluripotent stem cells. Nature. 504 (7479), 282-286 (2013).
  49. Fang, R., et al. Generation of naïve induced pluripotent stem cells from rhesus monkey fibroblasts. Cell Stem Cell. 15 (4), 488-496 (2014).

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Reimpresiones y permisos

Solicitar permiso para reutilizar el texto o las figuras de este artículo de JoVE

Solicitar permiso

Etiquetas

C lulas madre pluripotentes inducidasreprogramaci n episomalm todos libres de xenog nicosinhibidor de la tankirasainhibidor de PARPc lulas madre ingenuasdiferenciaci n multilinajec lulas madre donantes universales
Video próximamente

Artículos relacionados