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Artículo de método

Agotamiento del nervio sensorial corneal dirigido mediante inyección subconjuntival: un modelo para investigar la adhesión bacteriana y las interacciones neuroinmunes

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DOI:

10.3791/68614

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29 de agosto de 2025

 ,  ,  , 
1New England College of Optometry

En este artículo

Resumen

Este estudio establece un modelo refinado para el agotamiento del nervio sensorial corneal utilizando bupivacaína, revelando su impacto en el nervio corneal y la adhesión bacteriana. El modelo simula afecciones neuropáticas, proporcionando información sobre las interacciones neuroinmunes en infecciones oculares y ofreciendo aplicaciones en estudios de administración de fármacos, neuroprotección, modulación inmune y modificación genética.

Resumen

Los nervios sensoriales de la córnea juegan un papel fundamental en el apoyo a la integridad de la superficie ocular y los mecanismos de defensa inmunitaria. La pérdida de esta inervación se ha asociado con una mayor vulnerabilidad a la invasión microbiana, sin embargo, la contribución precisa del agotamiento de los nervios a la adhesión bacteriana en la córnea sigue sin caracterizarse lo suficiente. Aquí, presentamos un método reproducible y controlado temporalmente para la supresión selectiva del nervio sensorial corneal utilizando bupivacaína, un bloqueador de los canales de sodio de acción prolongada. Al combinar las vías de administración subconjuntival y tópica, esta estrategia de doble aplicación logra una denervación robusta y sostenida, lo que permite una investigación precisa de cómo la información sensorial alterada influye en la susceptibilidad del epitelio corneal a la colonización bacteriana.

Usando este modelo, investigamos cómo la denervación sensorial influye en la dinámica de adhesión microbiana para Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis y Pseudomonas aeruginosa, tres patógenos clínicamente relevantes con distintos mecanismos de adhesión. La inoculación bacteriana estandarizada a través del método de transferencia de limpieza de laboratorio garantiza una deposición uniforme en la superficie corneal, seguida de una evaluación cuantitativa de la adhesión bacteriana. El agotamiento nervioso inducido por bupivacaína se correlaciona con una densidad nerviosa corneal reducida y una mayor adhesión bacteriana, lo que confirma un vínculo funcional entre el agotamiento sensorial y la susceptibilidad microbiana.

Al simular afecciones neuropáticas como la neuropatía diabética y la queratitis neurotrófica, este enfoque proporciona un marco novedoso para estudiar las interacciones neuroinmunes en las infecciones oculares. Más allá de los modelos de infección, esta estrategia de inyección subconjuntival ofrece una plataforma versátil para investigar la farmacocinética de los fármacos oculares, las intervenciones neuroprotectoras y la modulación inmunitaria. Además, se puede adaptar para estudios de modificación genética, incluida la administración subconjuntival de construcciones CRISPR / Cas o vectores virales, ampliando sus aplicaciones en la investigación oftálmica y terapéutica.

Introducción

La inervación sensorial corneal juega un papel fundamental en el mantenimiento de la integridad de la superficie ocular y la homeostasis inmune. La córnea es uno de los tejidos más densamente inervados del cuerpo, predominantemente irrigado por la división oftálmica del nervio trigémino1. Estos nervios sensoriales no solo median la nocicepción y los reflejos de parpadeo, sino que también regulan la proliferación epitelial, la cicatrización de heridas y la vigilancia inmunológica 2,3. Por lo tanto, cualquier interrupción en la inervación sensorial puede comprometer la barrera corneal, alterando el microambiente de la superficie ocular y aumentando la susceptibilidad a las infecciones microbianas.

La disfunción sensorial corneal se asocia con afecciones sistémicas como la diabetes mellitus y contribuye a patologías oculares, incluida la enfermedad del ojo seco, la queratopatía diabética, la queratitis neurotrófica y las complicaciones posquirúrgicas 3,4,5,6,7,8,9,10 . El deterioro de los nervios sensoriales conduce a una reducción de la producción de lágrimas, adelgazamiento epitelial y retraso en la cicatrización de heridas, todo lo cual facilita la colonización bacteriana11,12. Sin embargo, el vínculo mecanicista preciso entre el agotamiento del nervio sensorial y la adhesión bacteriana sigue sin comprenderse adecuadamente. Si bien los estudios han demostrado un aumento de la adhesión bacteriana después de la denervación corneal, faltan modelos estandarizados que permitan una investigación controlada de esta relación.

Para abordar esta brecha, desarrollamos un modelo dirigido de agotamiento del nervio sensorial corneal utilizando bupivacaína, un bloqueador de los canales de sodio de acción prolongada que imita la neuropatía clínica sin causar daño nervioso permanente 13,14,15. Este enfoque farmacológico proporciona un método controlado y reproducible para estudiar el agotamiento del nervio corneal y sus efectos sobre la superficie ocular15. Al integrar este modelo con ensayos de adhesión bacteriana, podemos evaluar sistemáticamente el impacto del agotamiento del nervio sensorial en la colonización microbiana, imitando aspectos clave de la queratopatía diabética y la queratitis neurotrófica.

La adhesión microbiana es un evento temprano crítico en las infecciones de la córnea, influenciado por la composición de la película lagrimal, las propiedades de la superficie epitelial y las respuestas inmunitarias del huésped. Entre los diversos patógenos capaces de colonizar la superficie ocular, S. aureus, S. epidermidis y P. aeruginosa representan tres bacterias clínicamente significativas con distintos mecanismos de adhesión. P. aeruginosa, una bacteria gramnegativa altamente virulenta, utiliza pili, flagelos y factores de virulencia secretados para adherirse rápidamente e invadir las células epiteliales corneales, lo que a menudo conduce a queratitis ulcerosa grave16,17. Por el contrario, S. epidermidis, una bacteria comensal grampositiva, explota predominantemente las superficies epiteliales alteradas y las alteraciones de la película lagrimal para establecer biopelículas, lo que contribuye a infecciones persistentes y, a menudo, subclínicas18,19. Las diferencias en las estrategias de adhesión entre estas especies resaltan la necesidad de comprender cómo el agotamiento del nervio corneal altera el microambiente ocular para favorecer la colonización bacteriana.

Un desafío clave en el estudio de la adhesión bacteriana es la elección de un modelo de inoculación apropiado. El modelo convencional de lesión por rascado, utilizado con frecuencia en estudios de infecciones, crea defectos epiteliales para facilitar la adherencia bacteriana. Si bien es eficaz para simular infecciones inducidas por traumatismos, este enfoque introduce variables de confusión significativas, incluido el daño tisular excesivo y una respuesta inflamatoria exagerada, que no representan con precisión las primeras etapas de la colonización bacteriana en las córneas neuropáticas. Además, la variabilidad en las lesiones mecánicas dificulta la obtención de resultados reproducibles. Para superar estas limitaciones, se requiere un método de inoculación bacteriana más controlado y fisiológicamente relevante.

La técnica de transferencia de limpieza de laboratorio ofrece un enfoque estandarizado para la deposición bacteriana, asegurando una adherencia bacteriana uniforme sin alterar la barrera epitelial20. Este método imita de cerca los escenarios de susceptibilidad del mundo real, donde la adhesión bacteriana ocurre en ausencia de un trauma mecánico manifiesto, pero en condiciones de composición lagrimal y homeostasis epitelial alteradas. Al eliminar la variabilidad asociada con las lesiones mecánicas, el método de transferencia de limpieza de laboratorio proporciona una evaluación más precisa de la dinámica de adhesión microbiana en las córneas neuropáticas. Además, permite la evaluación controlada de las contribuciones de la película lagrimal a la colonización bacteriana, lo que es particularmente relevante en casos de disfunción sensorial corneal donde la secreción lagrimal está alterada.

Dado el papel crítico de los nervios sensoriales corneales en la regulación de la producción de lágrimas y la homeostasis epitelial, es esencial establecer un modelo reproducible para estudiar las consecuencias del agotamiento de los nervios sensoriales en la adhesión microbiana. Este estudio tiene como objetivo refinar un protocolo para el agotamiento del nervio sensorial corneal dirigido utilizando bupivacaína, un anestésico local de acción prolongada, para evaluar sus efectos sobre la secreción lagrimal y la adhesión bacteriana. Al emplear una combinación de aplicación de bupivacaína subconjuntival y tópica, este enfoque garantiza un agotamiento sensorial localizado y sostenido en un punto de tiempo definido de máxima eficacia. Usando este modelo, investigamos cómo la denervación sensorial altera la dinámica de adhesión de S. aureus, S. epidermidis y P. aeruginosa, proporcionando información valiosa sobre la relación entre el agotamiento del nervio, las alteraciones de la película lagrimal y la susceptibilidad microbiana. Estos hallazgos tienen implicaciones más amplias para comprender la susceptibilidad a las infecciones en afecciones neuropáticas como la queratopatía diabética y la queratitis neurotrófica y ofrecen una base para futuros estudios sobre interacciones neuroinmunes oculares e intervenciones terapéuticas.

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Protocolo

Todos los procedimientos que involucraron animales se llevaron a cabo de acuerdo con los estándares establecidos por la Asociación para la Investigación en Visión y Oftalmología y fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) en el Colegio de Optometría de Nueva Inglaterra y se adhirieron a la política de PHS sobre el cuidado y uso humanitario de animales de laboratorio. Se obtuvieron ratones machos y hembras C57BL / 6J (tipo salvaje; cepa no. 000664) de seis a ocho semanas de edad en el laboratorio de Jackson, y los ratones se criaron bajo ritmos circadianos normales (un ciclo de luz / oscuridad de 12 h) y se les proporcionó comida y agua. Mantener la técnica estéril durante todos los procedimientos.

1. Preparación animal para inyección subconjuntival

  1. Induzca la anestesia usando isoflurano al 2-3% en oxígeno a través de un vaporizador calibrado. Controle la profundidad de la anestesia verificando la ausencia de respuesta refleja a un pellizco suave en el dedo del pie.
  2. Observe continuamente al animal para detectar cualquier signo de malestar o angustia grave.
  3. Si se observa angustia, induzca anestesia profunda con isoflurano al 5% y confirme la falta de respuesta.
  4. Realizar luxación cervical para asegurar la eutanasia.
  5. De lo contrario, realice inmediatamente la enucleación utilizando pinzas de enucleación curvas para análisis posteriores.

2. Bloqueo del nervio corneal mediante inyección subconjuntival

NOTA: Implemente un protocolo de dos pasos que involucre la inyección subconjuntival y la aplicación tópica de bupivacaína para lograr el agotamiento del nervio sensorial corneal específico. Complete las inyecciones subconjuntivales y las aplicaciones tópicas en 15 minutos para minimizar la exposición al anestésico sistémico.

  1. Preparación del sitio e incisión
    1. Cree una pequeña incisión (~0,5 mm) en la región limbal superotemporal con una aguja de 30 G. Evite los vasos sanguíneos y minimice el trauma tisular. Use la incisión para acceder al espacio subconjuntival para la administración controlada del fármaco.
  2. Inyección de bupivacaína
    1. Prepare una solución de clorhidrato de bupivacaína al 0,5% en condiciones estériles.
    2. Cargue 5 μL de la solución en una jeringa Hamilton de 10 μL equipada con una aguja roma de cubo pequeño de 33 G (estilo de punta 3).
    3. Inyecte la solución en el espacio subconjuntival en un ángulo de 15-20 ° para minimizar el reflujo y garantizar una distribución uniforme.
    4. Observe la formación de ampollas en el lugar de la inyección; Deje que persista durante 5-10 s y se disperse dentro del bolsillo subconjuntival hasta que se absorba por completo.
  3. Refuerzo tópico de la desensibilización corneal
    1. Aplique 5 μL adicionales de bupivacaína al 0,5% directamente en la córnea central inmediatamente después de la inyección subconjuntival.
      NOTA: Utilice este paso para mejorar la desensibilización del nervio superficial y prolongar el efecto anestésico local.
  4. Grupo de control
    1. Administrar 5 μL de solución salina tamponada con fosfato (PBS) mediante inyección subconjuntival y aplicación tópica en momentos idénticos para los animales de control. Haga coincidir los pasos del procedimiento y el volumen para tener en cuenta los efectos relacionados con la inyección.
  5. Análisis de la duración del tratamiento y del punto final
    1. Administre el tratamiento con bupivacaína cada dos días durante 15 días para lograr un agotamiento sostenido del nervio sensorial y minimizar la toxicidad.
    2. El día 15, eutanasia a los ratones 4 h después del tratamiento final con bupivacaína usando isoflurano al 5% en oxígeno a través de un vaporizador calibrado, seguido de luxación cervical.
    3. Recolecte inmediatamente córneas de un grupo de ratones (ver paso 5.5.) para evaluar las alteraciones de la densidad nerviosa mediante inmunohistoquímica (ver Figura 1 y Sección 6 del protocolo), y de otro grupo para análisis de adhesión bacteriana (ver Figura 1 y Sección 5 del protocolo).

3. Preparación animal para inoculación bacteriana

  1. Administrar ketamina intraperitoneal (80-100 mg/kg) y dexmedetomidina (0,25-0,5 mg/kg) para anestesiar ratones cuatro horas después de la inyección final de bupivacaína y la aplicación tópica el día 15.
  2. Confirme la anestesia profunda verificando la ausencia de respuestas reflejas al pellizco del dedo del pie.
  3. Enjuague la superficie ocular 3 veces con una pipeta con 5 μl de PBS estéril para eliminar el líquido lagrimal residual y los residuos, asegurando una superficie corneal limpia para los estudios de adhesión bacteriana (ver Figura 1)
  4. En el grupo experimental designado, use un pañuelo de papel sin pelusa para secar la superficie corneal de manera estandarizada.
    1. Dobla el papel de seda para asegurar un agarre seguro.
    2. Limpie suavemente la córnea del ratón anestesiado 4 veces, comenzando en la córnea central y usando un movimiento de rotación hacia la derecha y hacia la izquierda para incluir las regiones periféricas20.
      NOTA: Aplique una presión mínima para evitar lesiones mecánicas mientras elimina eficazmente el líquido lagrimal para facilitar la adhesión bacteriana.

4. Preparación de inóculo bacteriano e inoculación corneal

  1. Cultivo y preparación bacteriana
    1. Cultivar S. aureus ATCC 25923, S. epidermidis ATCC 12228 y P. aeruginosa O1 en agar tríptico de soja (TSA) e incubar a 37 °C con agua estéril colocada en la incubadora para mantener la humedad.
    2. Coseche colonias individuales y suspenda en solución salina tamponada con fosfato (PBS). Centrifugar la suspensión a 5.000 × g durante 5 min una vez para eliminar las células muertas y los subproductos metabólicos.
    3. Vuelva a suspender el gránulo bacteriano en PBS y ajuste la concentración a ~10¹¹ UFC/ml para garantizar una alta carga bacteriana para los estudios de adhesión.
  2. Protocolo de inoculación corneal
    1. Aplicar una alícuota de 5 μL de la suspensión bacteriana preparada en la superficie corneal una vez cada hora durante 4 h bajo anestesia sostenida.
    2. Coloque los ratones en una ligera inclinación para evitar la escorrentía y garantizar una exposición constante al inóculo.
    3. Repita la inoculación a intervalos de una hora para imitar la exposición bacteriana persistente relevante para escenarios de infección clínica.
  3. Evaluación de la eutanasia y la adhesión bacteriana posterior a la inoculación
    1. Después de 4 h, administre una inyección intraperitoneal de ketamina (80-100 mg / kg) y xilacina (5-10 mg / kg) para asegurar una anestesia profunda.
    2. Realizar la luxación cervical para sacrificar a los ratones de manera humana.
    3. Enuclee los ojos con pinzas estériles de punta curva mientras mantiene estrictas condiciones asépticas para evitar la contaminación.
    4. Enjuague la superficie ocular 5-6 veces con 2 ml estériles de PBS en una placa de Petri agitando suavemente para eliminar completamente las bacterias no adherentes.
    5. Homogeneice los ojos enucleados en 1 ml de PBS estéril utilizando un homogeneizador de tejido mecánico para garantizar una recuperación bacteriana constante y mantener condiciones asépticas para evitar la contaminación.
    6. Realice diluciones seriadas de seis veces del homogeneizado en PBS estéril.
    7. Plaque alícuotas de cada dilución en placas de TSA e incube durante la noche a 37 °C para permitir el crecimiento de la colonia.
    8. Cuente las unidades formadoras de colonias (UFC) y exprese los resultados como UFC logarítmicas por córnea para una comparación cuantitativa.

5. Inmunohistoquímica

  1. Eutanasia a los ratones mediante luxación cervical el día 15 después del tratamiento.
  2. Enuclee cuidadosamente los ojos y enjuague una vez con PBS a temperatura ambiente bajo una rotación suave.
  3. Fije los ojos enucleados en paraformaldehído (PFA) al 2% durante 1 h para preservar la integridad estructural
  4. Lave los ojos fijos 3 x 10 min en 1 ml de PBS con rotación suave a temperatura ambiente.
  5. Siga el protocolo de disección corneal descrito anteriormente21,22
    1. Diseccionar las córneas dentro de una placa de Petri de 35 mm de ancho llena de una cantidad mínima de PBS.
    2. Use fórceps de borde recto para estabilizar el ojo enucleado y tijeras quirúrgicas para crear una pequeña incisión en la cara posterior del globo.
    3. Utilice el pequeño punto de incisión para cortar con cuidado a lo largo de la cara posterior 360°.
    4. Deseche la retina murina, el nervio óptico, el cristalino, el pigmento del iris y cualquier estructura tisular adicional que no sea la córnea.
    5. Elimine cualquier exceso de tejido con pinzas de borde recto o haciendo una incisión cuidadosa con tijeras quirúrgicas manteniendo la córnea intacta.
    6. Lave las córneas disecadas 3 x 10 min en 1 ml de PBS colocado en tubos de microcentrífuga bajo rotación suave a temperatura ambiente.
  6. Incubar las córneas en 1 mL de solución bloqueante (BSA al 3% + Triton X-100 en PBS) durante 1 h a temperatura ambiente con rotación continua.
  7. Mejore la permeabilización de los tejidos incubando córneas en 1 ml de EDTA al 20% durante una hora adicional en las mismas condiciones.
  8. Incubar las córneas durante la noche a 4 °C con anticuerpo primario anti-β-tubulina III de conejo bajo rotación suave a temperatura ambiente.
  9. Al día siguiente, incube los tejidos con el anticuerpo secundario IgG de cabra conjugado Alexa Fluor 488 y DAPI para tinción nuclear durante 2-3 h a 4 °C en la oscuridad.
  10. Lave las córneas 3 x 10 min con PBS bajo rotación suave.
  11. Siga el protocolo de montaje plano de la córnea descrito anteriormente21,22
    1. Monte las córneas teñidas en portaobjetos de vidrio colocando la córnea en el borde del portaobjetos para eliminar el exceso de líquido.
    2. Vuelva a colocar la córnea en el centro del portaobjetos del microscopio con el lado epitelial hacia abajo, en contacto con la superficie del portaobjetos.
    3. Haga cuatro incisiones rectas (1-2 mm de longitud) desde el borde periférico hacia el centro usando una cuchilla de pluma quirúrgica para crear semicuadrantes.
    4. Aplique 20 μL de material de montaje y coloque un cubreobjetos de vidrio de 8 mm sobre la córnea.
    5. Presione suavemente el cubreobjetos para eliminar las burbujas de aire y evitar que la córnea se arrugue.
    6. Guarde la muestra a temperatura ambiente en la oscuridad para que se seque.
    7. Selle los bordes del cubreobjetos con un protector de uñas transparente para evitar que se sequen al aire y guarde los portaobjetos en la oscuridad hasta que estén listos para la toma de imágenes.

6. Imágenes

  1. Realice microscopía confocal utilizando un microscopio confocal vertical de dos fotones con un objetivo de inmersión en agua de 20x/1,00 NA.
  2. Coloque las muestras montadas en plano en la platina del microscopio y configure la lente del objetivo de inmersión en agua de 20x/1,00 NA.
  3. Atenúe las luces de la habitación y cubra el microscopio con un paño negro opaco para minimizar la interferencia de la luz externa durante la obtención de imágenes.
  4. Visualice los nervios corneales con el canal láser Alexa Fluor de 488 nm y detecte los núcleos celulares con el canal láser DAPI de 405 nm.
  5. Establezca el tamaño del marco en 1,536 x 1,536, el estenopeico en 1 unidad Airy (AU) y la velocidad de escaneo en 1.02 μs. Habilite el escaneo bidireccional y aplique un promedio de 2x.
  6. Ajuste la ganancia maestra (~750 V) y minimice la intensidad de la potencia del láser para evitar el fotoblanqueo y la fototoxicidad al tiempo que garantiza una captura de imágenes clara.
  7. Realice imágenes de pila Z para capturar el grosor completo de la córnea. Establezca el primer plano focal en el aspecto más anterior y el último en el aspecto más posterior de la muestra.
  8. Adquiera pilas Z a intervalos de paso de 0,8 μm o 1,0 μm, capturando aproximadamente 60 - 80 pilas totales por muestra.
  9. Evaluación de la densidad nerviosa corneal
    1. Analice la densidad del nervio corneal con el software Imaris.
    2. Confirme el grosor completo de la imagen comprobando las dimensiones del volumen.
    3. Active la opción de representación de volumen para generar una reconstrucción 3D.
    4. Cree una proyección de máxima intensidad para convertir la pila Z en una vista 2D para visualización y cuantificación.
    5. Califique la densidad del nervio corneal en una escala de 0 a 10 mediante evaluadores ciegos para garantizar una evaluación objetiva.

7. Análisis estadístico

  1. Evaluar la distribución de los datos mediante las pruebas de Shapiro-Wilk y Kolmogorov-Smirnov.
  2. Si la mayoría de los datos siguen una distribución normal, presente los resultados como la media ± la desviación estándar (DE).
  3. Para comparaciones entre dos grupos, aplique la prueba t de Student y use ANOVA de una vía seguida de la prueba de comparaciones múltiples de Tukey para análisis que involucren tres o más grupos.
  4. Considere un valor p < 0.05 estadísticamente significativo.

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Resultados

A menos que se especifique lo contrario, todos los experimentos se realizaron de forma independiente por triplicado, y cada réplica incluyó 3-4 ratones por grupo.

Reducción significativa de la densidad nerviosa corneal después del tratamiento con bupivacaína
Para evaluar sistemáticamente el impacto del agotamiento del nervio sensorial corneal dirigido, la densidad del nervio corneal se evaluó mediante inmunomarcaje y microscopía confocal. Los ratones recibieron inyecciones ...

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Discusión

Los nervios sensoriales corneales juegan un papel fundamental en el mantenimiento de la integridad de la superficie ocular, la regulación de la homeostasis epitelial y la modulación de las respuestas inmunitarias. La neuritis corneal, caracterizada por la degeneración nerviosa y la inflamación, se observa comúnmente en afecciones sistémicas como la diabetes mellitus, donde la hiperglucemia crónica contribuye a la neuropatía periférica, incluida la pérdida del nervio corneal. Los estudios...

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Divulgaciones

Los autores no tienen conflictos de intereses que declarar.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Solución de clorhidrato de bupivacaína al 0,5% Pfizer INC. EE. UU.NDC 00409-1162-01
Aguja de 30 gFabricante: BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, EE. UU.305106
Aguja roma de cubo pequeño de 33 G (estilo de punta 3) Compañía Hamilton, Reno, NV, EE. UU.7803-05
4',6-Diamidino-2-Fenilindol, DiclorhidratoThermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE. UU.D1306
Albúmina sérica bovinaSigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE. UU.Referencia A7906
Ratones C57BL/6J (Wild-Type)Laboratorio Jackson. 000664
Rotador de cantrifugioThe Lab Depot, Inc. (Dawsonville, GA, EE. UU.)Referencia 2020
Protector de uñas transparenteHúmedo y salvajeN/A
Microscopio de disección (SMZ-160-TLED Microscopio estéreo (de disección) con puerto trinocular)Stellar Scientific (Baltimore, MD, EUA)1.1002E+12
Ácido etilendiaminotetraacéticoSigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE. UU.E6511
Cabra anti-Conejo IgG Alexa Fluor 488 Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE. UU.A-11008
Hamilton 10-μ Jeringa LCompañía Hamilton, Reno, NV, EE. UU.7635-01
Microtijeras de disección de alta precisiónThermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE. UU.08-953-1B
IsofluranoVeterinaria Patterson, Estados Unidos07-890-8115
Vaporizador de isofluranoKent Scientific, Estados UnidosVETFLO1205S
Clorhidrato de ketaminaProductos veterinarios Dechra, Overland Park, KS, EE. UU.DP00050
Papel de seda sin pelusa KimwipeKimberly-Clark Professional, Roswell, GA, EE. UU.34155
Pinza de microdisección frontal curvada (para enucleación)Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE. UU.F4142-1EA
Pinzas de microdisección en línea rectaSigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE. UU.F4017
Placas de Petri (100 mm)Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE. UU.263991
Placas de Petri (35 mm)Avantor, vía VWR International (Radnor, PA, EUA).25373-041
Solución salina tamponada con fosfatoThomas Scientific, Swedesboro, Nueva Jersey, EE. UU.C987D24
Montaje antidecoloración ProLong GoldThermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE. UU.P36930
Conejo anti-β-Tubulina IIISigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE. UU.)T2200
Cubierta redonda Slip Vidrio alemán (8 mm)Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE. UU.50-949-314
Mangos de bisturíSigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE. UU.)S2896-1EA
Portaobjetos de microscopioSigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE. UU.)S8902-1PAK
Tubos de microcentrífuga de baja retención con tapón a presiónThermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE. UU.3453
Centrífuga de sobremesa RT6000B Sorvall InstrumentsThermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE. UU.3367898
Cuchillas de plumas quirúrgicasInstrumentos de precisión mundial (Sarasota, FL, EE. UU.)504169 
Agar tríptico de sojaSigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE. UU.)22091
Xilacina Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE. UU.1236-20-8

Referencias

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