Artículo de método

Clasificación de células basada en cremallera de leucina para la purificación de células transducidas de doble vector

DOI:

10.3791/68628

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24 de octubre de 2025

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1City of Hope Los Angeles and National Medical Center, 2Lymphoma and Cellular Therapy Services, Memorial Sloan Kettering Cancer Center, 3Department of Hematology and Hematopoietic Cell Transplantation, City of Hope National Medical Center

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

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Aquí, describimos un protocolo para purificar selectivamente células T de doble transducción a partir de una mezcla de células T cotransducidas. Este enfoque combina dos vectores retrovirales que codifican cada uno un componente de una metodología de clasificación celular basada en cremalleras de leucina emparejada que permite la purificación inmunomagnética selectiva de células transducidas de doble vector.

Resumen

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Las terapias adoptivas de células T, incluidas las células T con receptor de antígeno quimérico (CAR), han demostrado una actividad clínica impresionante contra las neoplasias hematológicas y se muestran prometedoras en el tratamiento de las neoplasias malignas de tumores sólidos. A pesar de estos éxitos, se han identificado múltiples mecanismos de resistencia a la inmunoterapia de células T que limitan el éxito terapéutico, incluida la pérdida o la expresión débil de antígenos diana, el desarrollo de agotamiento de células T y la presencia de un microambiente tumoral inmunosupresor. Se han desarrollado múltiples estrategias de ingeniería celular para superar estos mecanismos de resistencia. Sin embargo, pueden ocurrir múltiples mecanismos de resistencia simultáneamente, lo que requiere una combinación de múltiples estrategias de ingeniería para optimizar la actividad antitumoral. Las limitaciones de empaquetado de vectores limitan la entrega de grandes cantidades de información genética a las células T y presentan un desafío para coexpresar múltiples construcciones de ingeniería. Aquí, describimos un protocolo para co-transducir células T con dos vectores para codificar múltiples transgenes, aumentando así el número de funciones diseñadas. Al coexpresar una metodología de clasificación celular basada en cremalleras de leucina, denominada Zip-sort, dirigimos la purificación inmunomagnética selectiva de células de doble transducción que han incorporado dos vectores distintos.

Introducción

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La terapia de células T con CAR ha revolucionado el tratamiento de la leucemia de células B, el linfoma y el mieloma múltiple 1,2. Las células T con CAR también se están investigando para tumores malignos sólidos3. Sin embargo, se han identificado mecanismos recurrentes para el fracaso de la terapia de células T con CAR, incluida la expresión deficiente o la pérdida de la molécula de antígeno diana de CAR, el desarrollo de disfunción de células T (agotamiento), la inmunosupresión activa por el microambiente tumoral y el tráfico limitado de células T y la persistencia en el microambiente tumoral 3,4,5,6 . Si bien se han ideado soluciones de ingeniería individuales para intentar superar cada uno de estos mecanismos de resistencia de las células T con CAR3, la introducción de múltiples funciones de ingeniería en un producto de terapia celular para superar simultáneamente múltiples mecanismos de resistencia es un desafío debido a la limitada capacidad de empaquetado genético de los sistemas de vectores retrovirales y lentivirales7.

Para superar las limitaciones en la capacidad de empaquetado de vectores, se ha utilizado cada vez más la cotransducción de células T con múltiples vectores. La cotransducción vectorial se ha utilizado para estudiar estrategias de ingeniería de células T controladas lógicamente y reguladas por fármacos en estudios preclínicos 8,9,10 y en un ensayo clínico reciente que evaluó células T con doble CAR CD19 / CD22 para superar las limitaciones de empaquetamiento de vectores11. Sin embargo, la cotransducción genera productos celulares mixtos que contienen combinaciones de células T transducidas simples y dobles, lo que puede afectar la funcionalidad del producto si depende de componentes codificados por ambos vectores y también puede conducir a la competencia entre células T transducidas simples12.

Para superar estos desafíos, hemos desarrollado una metodología llamada Zip-sort, que utiliza cremalleras de leucina heterodimerizantes, cada una expresada a partir de uno de los dos vectores cotransducidos, para dirigir la purificación inmunomagnética de un solo paso de células de doble transducción13. En este protocolo, describimos métodos para construir vectores retrovirales incorporando nuestra metodología Zip-sort, producción y concentración de sobrenadante retroviral, activación y cotransducción de células T y purificación inmunomagnética de células de doble transducción (Zip-sort).

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Protocolo

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Los estudios en animales se llevaron a cabo en el Laboratorio de Investigación Animal Parvin de City of Hope (COH) bajo el protocolo # 23145 aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de COH y en el vivero Memorial Sloan Kettering Cancer Center (MSKCC) bajo el protocolo # 99-07-025 aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de MSKCC. Las células T humanas se aislaron de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) no identificadas que fueron purificadas por Ficoll-Paque a partir de filtros de reducción de leucocitos obtenidos del Centro de Donantes de Sangre de City of Hope y utilizados bajo el protocolo # 24427 según lo aprobado por la Junta de Revisión Institucional de City of Hope. Todos los procedimientos se llevaron a cabo de acuerdo con las normas institucionales de bioseguridad.

1. Diseño vectorial de clasificación zip

  1. Seleccione el vector de expresión de elección para modificar genéticamente las células de interés.
    NOTA: La metodología zip-sort comprende cremalleras secretadas y cremalleras de captura, las cuales se expresan a partir de diferentes vectores, y que se emparejan intracelularmente y se trafican a la superficie celular para permitir la purificación selectiva de células que incorporan ambos vectores (Figura 1A-D)13. Las cremalleras secretadas se expresan a partir del Vector 1 y contienen una etiqueta de afinidad. Las cremalleras de captura se expresan a partir del Vector 2 y retienen la cremallera secretada en la superficie de la célula. La modificación de la cremallera de bloqueo se compone de una segunda cremallera unida covalentemente, que bloquea el emparejamiento de cremallera extracelular no específico de la cremallera secretada. La modificación de la cremallera de bloqueo es necesaria para evitar el emparejamiento extracelular cuando se agrega una cremallera de captura a proteínas con dominios extracelulares alargados (típicamente dominios extracelulares más grandes que un dominio de bisagra corta).
  2. Seleccione un conjunto de cremalleras secretadas y de captura de la Tabla complementaria 1 y el Archivo complementario 1 para probar y crear vectores.
  3. Clone secuencias de cremallera en vectores de expresión emparejados utilizando técnicas estándar de biología molecular13- cada uno de los dos vectores codificará la cremallera secretada por la etiqueta de afinidad o la cremallera de captura (Figura 1D).
    1. Consulte la Tabla complementaria 1 y el Archivo complementario 1 para conocer las secuencias de construcción de cremallera. Las secuencias de cremallera se han colocado en el extremo 5 '(N) de un mensaje policistrónico para mejorar su expresión y, por lo tanto, aumentar el rendimiento de clasificación. Coloque los transgenes posteriores aguas abajo, separados por péptidos 2A que se escinden automáticamente (Figura 1D). Sin embargo, experimentos anteriores han tenido éxito colocando las cremalleras en una configuración de 3 'si se mantiene una alta expresión.

2. Producción de retrovirus

  1. Prepare células Phoenix-Eco (ATCC CRL-3214, virus trópico de ratón) o células Phoenix-Eco ɑ-V β-313 (adición de ɑ-V β-3 diseñada para mejorar la adhesión de Phoenix-Eco) o células 293Vec-RD11414 (virus trópico humano) o células 293Vec-RD114 ɑ-V β-3 (adición de ɑ-V β-3 diseñada para mejorar la adhesión de 293Vec-RD114) 1 día antes de la transfección.
    NOTA: Este protocolo no requiere la modificación de las líneas de envasado con integrinas ɑ-V β-3, pero esta modificación mejora la adhesión de esta línea celular a los matraces de cultivo de tejidos y facilita la recolección de sobrenadante retroviral.
    1. Tripsinizar las células en el matraz T175 que contiene células Phoenix o 293Vec-RD114 en una confluencia de ~80% con tripsina-EDTA al 0,25%.
      1. Retire el medio, lave las células adherentes con 10 ml de PBS, manteniendo las células intactas para eliminar los componentes séricos que inhiben la tripsina, agregue 5 ml de tripsina-EDTA al 0,25% e incube las células a 37 ° C durante 5 min.
      2. Disociar y recolectar las células en 5 ml de DMEM suplementado con 10% de suero fetal bovino (FBS), 1% de penicilina/estreptomicina y 1% de GlutaMAX (denominado DMEM completo).
      3. Granular las células en un tubo cónico de 15 ml centrifugando a 340 x g durante 5 min a 4 °C. Decantar los medios.
    2. Vuelva a suspender las células granuladas por centrifugación en 10 ml de DMEM completo y coloque una placa en una placa de cultivo de tejidos de 10 cm de aproximadamente 1,5 x 106 células Phoenix-Eco, Phoenix-Eco ɑ-V β-3, 293Vec-RD114 células o 293Vec-RD114 ɑ-V β-3 contadas con un hemacocitómetro.
    3. Agite o gire suavemente la placa para distribuir las células de manera uniforme e incube durante la noche a 37 ° C para permitir que las células se adhieran a la placa.
  2. Aproximadamente 18-24 h después, verifique que las células sean 60%-70% confluentes, con células sanas y adherentes que exhiban proyecciones dendríticas.
  3. Células Phoenix-Eco, Phoenix-Eco ɑ-V β-3, células 293Vec-RD114 o 293Vec-RD114 ɑ-V β-3 con construcciones de vectores LZRS retrovirales (plásmido Addgene #31601, transfección estable episomal basada en EBNA) o construcciones de vectores PB13 (integración genómica estable basada en transposones piggyBac, archivo complementario 1) utilizando el kit de transfección (Tabla de materiales) como se describe a continuación.
    1. Combine 2 μg de ADN vectorial LZRS o ADN vectorial PB y 16 μl de reactivo potenciador en 300 μl de tampón EC en un tubo de microcentrífuga para cada reacción de transfección.
    2. Para una integración estable de las construcciones de vectores PB, agregue también 1 μg del vector transposasa piggyBac hiperactivo pCMV-hyPBasa15 (Instituto Sanger).
    3. Agite suavemente durante 5 s e incube a temperatura ambiente durante 5 min. Agregue 20 μL de reactivo de transfección, vórtice durante 10 s e incube a temperatura ambiente durante 10 min para generar complejos micelares de ADN.
    4. Agregue 300 μL de DMEM completo al tubo, pipetee varias veces para mezclar bien y agregue la suspensión de micela gota a gota a las celdas de la línea de envasado con una pipeta de 1 ml.
    5. Agite suavemente para asegurar una deposición uniforme de micelas. Después de 24 h, tripsinizar las células transfectadas y evaluar la expresión inicial del constructo codificado retroviral mediante citometría de flujo.
    6. Transfiera las células tripsinizadas a un matraz T75 con 20 ml de DMEM completo y agregue 2 μg/ml de puromicina o 10 μg/ml de blasticidina, según los genes de resistencia a los antibióticos, para seleccionar las células transfectadas. Una vez que las células alcanzan una confluencia del 70% al 75%, tripsinizar y transferir a un matraz T175 con 40 ml de DMEM completo. Mantener la selección de antibióticos en el medio durante la expansión de la línea de envasado.
    7. Cuando las células son 80%-85% confluentes, tripsinizar nuevamente y confirmar la expresión de constructos mediante citometría de flujo. Congele una alícuota de células utilizando medios de congelación (50% DMEM completo, 40% FBS, 10% DMSO) y pase las células a dos matraces T175 (relación de división 1:10-1:12) con 40 ml de DMEM completo.
  4. Recolecte y concentre el sobrenadante retroviral de líneas de envasado estables completamente seleccionadas cultivadas en matraces T175 cuando las células alcancen una confluencia del 80% al 85%.
    1. Elimine los antibióticos del medio antes de la primera cosecha sustituyendo el medio en T175 por 40 ml de DMEM fresco y completo 24 h antes de la primera recogida prevista.
    2. Recoger y filtrar los sobrenadantes 24 h después de la sustitución del medio pasando el sobrenadante recogido a través de jeringas de 50 ml equipadas con filtros de jeringa (0,45 μm, fluoruro de polivinilideno). Recoger en un tubo cónico de 50 ml.
    3. Agregue 5 concentrados de solución de polietilenglicol (PEG) (40% (peso / vol) PEG 8,000 MW que contienen 2.4% (peso / vol) NaCl) sobrenadante filtrado e invierta el tubo varias veces para mezclar bien (paso de precipitación de PEG).
    4. Agregue 40 ml de DMEM completo nuevamente al matraz T175 recolectado original, incube durante otras 24 h y recolecte sobrenadante viral diariamente durante otros 2 días consecutivos en total.
    5. Precipitar el virus durante 1-2 días a 4 °C. El virus precipitado aparecerá como material floculante, flotante o sedimentado.
    6. Centrifugar la suspensión de virus precipitada por PEG a 2.100 x g durante 15 min a 4 °C. Deseche el sobrenadante no precipitado.
    7. Vuelva a suspender cada gránulo viral precipitado por PEG en 500 μL de RPMI suplementado con 10% de FBS, 1% de penicilina/estreptomicina, 1% de GlutaMAX, 1% de piruvato de sodio, 1% de aminoácidos no esenciales y 0,1% de β-mercaptoetanol (denominado RPMI completo).
    8. Utilice el virus resuspendido inmediatamente para la transducción o la transferencia a un tubo de microcentrífuga y guárdelo a -80 °C.

3. Día 0: Enriquecimiento y activación de células T de ratón

  1. Cubra una placa de 6 pocillos tratada con cultivo de tejidos con 1,5 ml de PBS por pocillo que contenga 2 μg/ml de anti-CD3 (clon 145-2C11) y 2 μg/ml de anti-CD28 (clon 37,51). Incubar durante 2 h a 37 °C.
  2. Recolecte bazo de ratón donante, disocie células a través de un filtro de 40 μm y recolecte esplenocitos en RPMI completo. Pellet esplenocitos centrifugando a 340 x g durante 5 min a 4 °C.
    NOTA: En este estudio se utilizaron ratones hembra BALB/cJ de entre 6 y 8 semanas como donantes.
  3. Deseche el sobrenadante, el gránulo de vórtice suave, agregue 1 ml de tampón de lisis de glóbulos rojos, pipeta 3x-5x para mezclar, incube a temperatura ambiente durante 1 min, enfríe con 10 ml de RPMI completo y centrifugue las células centrifugando a 340 x g durante 5 min a 4 °C.
  4. Deseche el sobrenadante, agregue 800 μL de PBS con 0.5% de BSA y 2 mM EDTA (denominado tampón MACS) y agregue 200 μL de microperlas de ratón-CD19. Pipetear para mezclar e incubar durante 15 min a 4 °C.
  5. Prepare 1 columna LD por bazo del ratón. Fije la columna LD a un separador MACS. Coloque un tubo cónico de 15 ml debajo para recolectar esplenocitos agotados en CD19. Humedezca la columna con 2 ml de tampón MACS.
  6. Después de la incubación con microperlas CD19, lave las células con 5 ml de tampón MACS frío, las células de pellets centrifugando a 340 x g durante 5 min a 4 °C y deseche el sobrenadante. Vuelva a suspender en 1 ml de tampón MACS y agregue celdas a la columna LD. Espere a que pase la suspensión antes de lavar con 1 ml y luego 2 ml de tampón MACS.
  7. Recolecte el flujo de los esplenocitos agotados en CD19 para usarlos aguas abajo. Deseche la columna LD, reduzca los esplenocitos agotados en CD19 centrifugando a 340 x g durante 5 min a 4 °C. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender en 18 ml de RPMI completo. Agregue IL-2 humana recombinante (rhIL-2) a una concentración final de 50 UI / ml.
  8. Deseche la solución de anticuerpos de la placa de 6 pocillos recubierta de anticuerpos. Agregue 3 ml de esplenocitos resuspendidos con agotamiento de células B a cada pocillo de la placa de 6 pocillos recubierta de anticuerpos.

4. Día 1: Transducción retroviral de células T de ratón

  1. Cubra una placa de 6 pocillos no tratada con cultivo de tejidos con 1,5 ml de PBS por pocillo que contenga 2 μg/ml de anti-CD3 (clon 145-2C11), 2 μg/ml de anti-CD28 (clon 37,51) y 20 μg/ml de RetroNectin.
    NOTA: Las placas sin cultivo de tejidos se utilizan durante el recubrimiento con RetroNectin de acuerdo con las recomendaciones del fabricante.
  2. Incubar durante 2 h a 37 °C. Deseche la solución de recubrimiento o guárdela para reutilizarla (puede reutilizarse una vez). Bloquee la placa con 1 mL de PBS con BSA al 2% por pocillo, incube durante 10 min a 37 °C y deseche la solución de bloqueo.
  3. Mientras tanto, descongele el sobrenadante viral precipitado por PEG en un baño de agua a 37 °C.
    NOTA: 500 μL de cada retrovirus concentrado en PEG cotransducido generado a partir de un matraz T175 deberían ser suficientes para transducir dualmente hasta 2 x 106 células T activadas por pocillo con > eficiencia de transducción dual del 20%.
  4. Agregue sobrenadantes virales de cotransducción al pocillo de la placa de 6 pocillos de acuerdo con las condiciones deseadas, lleve el volumen final hasta al menos 2 ml con RPMI completo y 50 UI/ml de rhIL-2, y centrifugue durante 1 h a 2.100 x g y 32 °C.
  5. Añadir 0,5-2 x 10 6 célulasT activadas por pocillo y centrifugar la placa a 340 x g durante 10 min a 32 °C. Si las células no son adherentes, repita el centrifugado a 340 x g durante otros 10-20 min a 32 °C. Incubar a 37 °C durante la noche.

5. Día 2: Evaluación de la expresión vectorial y retransducción opcional

  1. Interrumpa 100-200 μL de células adherentes por condición de la placa de transducción para citometría de flujo. El usuario debe identificar un marcador detectable por citometría de flujo para cada vector individual y etiqueta de afinidad y usarlos para evaluar la eficiencia de la transducción de un solo vector, la eficiencia de la transducción de doble vector y la presentación de la etiqueta de afinidad mediante citometría de flujo.
  2. Realice citometría de flujo en células cotransducidas como se describe a continuación.
    1. Configure los ejes de parámetros de adquisición para mostrar reporteros vectoriales para Vector 1 y Vector 2 (Figura 1C).
    2. Represente histogramas para la tinción con cremallera de etiquetas de afinidad (p. ej., FLAG o CD34) para cada uno de los cuatro cuadrantes de expresión del Vector 1 y el Vector 2 para garantizar que la tinción de la etiqueta de afinidad se limite a las células que coexpresan los indicadores de transducción del Vector 1 y el Vector 2.
  3. Si las células tienen suficiente transducción dual para garantizar suficientes células para experimentos posteriores (generalmente 20% o más de transducción dual), realice los siguientes pasos.
    1. Cubra el doble del número de pocillos iniciales utilizados para transducir cada línea de células T con PBS que contiene 2 μg/ml de anticuerpos anti-CD3 y anti-CD28 para mantener la estimulación de las células T. Incubar durante 2 h a 37 °C.
    2. Transfiera las células a nuevos pocillos con RPMI completo con 50 UI/ml de rhIL-2 (mantiene la estimulación de las células T).
  4. Si las células no tienen suficiente transducción dual para garantizar suficientes células para experimentos posteriores (generalmente < 20% de transducción dual), realice los siguientes pasos.
    1. Vuelva a transducir utilizando el mismo protocolo que el día 1, pero aumentando al doble del número de pocillos utilizados inicialmente para tener en cuenta la expansión de las células T.
    2. Incubar a 37 °C durante la noche. Repetir la citometría de flujo 24 h después.
      NOTA: Las construcciones codificadas por vectores, incluida la cremallera de la etiqueta de afinidad, muestran la expresión máxima 2 días después de la transducción inicial.

6. Día 3: Selección inmunomagnética de células T (Zip-sort)

  1. Agrupe los pocillos de las células generadas utilizando las mismas condiciones de co-transducción en un tubo cónico de 15 ml.
  2. Centrifugar celdas a 340 x g durante 5 min a 4 °C. Deseche el sobrenadante e incube las células en 500 μl de tampón MACS que contenga 30 μl de microperlas (DYKDDDDK (FLAG) o CD34 humano) por 1 x 107 células durante 30 min a 4 °C.
  3. Después de la incubación, lave las células con 5 ml de tampón MACS frío. Centrifugar celdas a 340 x g durante 5 min a 4 °C. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el sedimento en 1 ml de tampón MACS.
  4. Seleccione positivamente las células T transducidas utilizando una columna LS como se describe a continuación.
    1. Humedezca la columna con 2 ml de tampón MACS. Aplique la suspensión celular a la columna LS en el soporte magnético.
    2. Lave secuencialmente con tampón MACS (1 ml, 2 ml, 3 ml). Eluya las células retenidas de la columna retirando la columna del soporte magnético, agregando 5 ml de RPMI completo a la columna e insertando el émbolo de la celda.
    3. Capture las células en un tubo cónico de 15 ml o directamente en un matraz T25. Equilibre las células a 0,5 x 106 células/ml en RPMI completo con 50 UI/ml de rhIL-2.
    4. Si comienza desde < transducción dual del 20%, opcionalmente eluya las células en una segunda columna LS para una selección positiva secuencial para aumentar la pureza posterior a la clasificación.
  5. Cultive células T con CAR en matraces T25 o T75 a aproximadamente 0,5 x 106 células/ml de RPMI completo y 50 UI/ml de rhIL-2.
  6. Opcional: Si se van a utilizar células T para experimentos in vivo, considere el cultivo en dasatinib de 1 μM para atenuar la disfunción inducida por la señalización tónica de las células T con CAR encontrada durante el período de cultivo inicial13,16.
  7. Realice citometría de flujo según los pasos 2.1 y 2.2 anteriores para células T preclasificadas y posclasificadas para evaluar el rendimiento y la pureza posteriores a la clasificación Zip (% transducido dualmente).
    Rendimiento = 100 x total de células de doble transducción recuperadas / total de células de doble transducción presentes en la población de preclasificación)

7. Día 4: Cultivo continuo de células T

  1. Agregue RPMI completo fresco y 50 UI/ml de rhIL-2 para todo el volumen de cultivo para mantener la concentración de células T en 0.5-1 x 106 células/ml.
  2. Opcional: Si se van a utilizar células T para experimentos in vivo , añadir 1 μM de dasatinib nuevo.

8. Día 5: Caracterización de las células T clasificadas por zip

  1. Opcional: Prepare 100-200 μL de suspensión de células T por condición teñida con anticuerpos para detectar CAR u otros productos proteicos codificados por los vectores de clasificación Zip mediante citometría de flujo.
  2. Realizar experimentos in vitro o in vivo con células T con CAR.
  3. Opcional: Si se van a utilizar células T para experimentos in vivo , lave las células para eliminar dasatinib. Resuspender las células a la concentración requerida para la inyección retroorbital o en la vena de la cola de acuerdo con las pautas institucionales.

9. Día 0: Purificación y estimulación de las células T humanas

  1. Descongele rápidamente un vial de células mononucleares de sangre periférica humana (PBMC) criopreservadas en un baño de agua (o use PBMC recién aisladas). Agregue PBMC descongelados a un tubo cónico de 15 ml que contenga 5 ml de tampón MACS, prepare una alícuota para el recuento y las células de pellets centrifugando a 340 x g durante 5 min a 4 °C.
  2. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender las células en el tampón MACS (use 40 μl de tampón por 1 x 107 células en total). Proceda con el aislamiento de células T utilizando el kit de aislamiento de células Pan T, humano, según las instrucciones del fabricante.
    1. Brevemente, agregue 10 μL de cóctel de biotina-anticuerpo de células Pan T por 1 x 107 células en total. Incubar durante 5 min a 4 °C.
    2. Agregue 30 μL de tampón MACS por 1 x 107 celdas en total. Agregue 20 μL de Pan T Cell MicroBead Cocktail por 1 x 107 células en total.
    3. Incubar durante 10 min a 4 °C. Llene el volumen de suspensión celular con tampón MACS hasta al menos 500 μL.
    4. Proceda a la separación magnética de las células utilizando una columna LS y recoja el flujo a través de las células T enriquecidas (intactas) que contienen.
  3. Cuente el rendimiento de células T y las células en pellets centrifugando a 340 x g durante 5 min a 4 °C. Deseche el sobrenadante. Resuspender las células T humanas en RPMI completo a 1 x 106 células/ml con rhIL-2 a 50 UI/ml.
  4. A un tubo cónico de 15 ml que contenga 2 ml de PBS, agregue el volumen requerido de Dynabeads Human T-Activator CD3 / CD28 para la expansión y activación de células T (25 μL de perlas por 1 x 106 células, utilizando una proporción de perlas de 1: 1 a células T) y centrifugue a 340 x g durante 5 min a 4 ° C para lavar las perlas. Deseche el sobrenadante.
  5. Mezcle las células T resuspendidas con perlas lavadas y transfiéralas a un matraz T25 para su cultivo.

10. Día 3: Transducción retroviral de células T humanas

  1. Cubra una placa de 6 pocillos sin cultivo de tejidos con 1,5 ml de PBS por pocillo que contenga 20 μg/ml de RetroNectin.
  2. Incubar durante 2 h a 37 °C. Deseche la solución de recubrimiento o guárdela para reutilizarla (puede reutilizarse una vez).
  3. Mientras tanto, descongele los sobrenadantes virales precipitados por PEG para su cotransducción en un baño de agua a 37 °C.
  4. Agregue sobrenadante viral de cotransducción a los pocillos de la placa de 6 pocillos recubierta de retronectina de acuerdo con las condiciones de transducción deseadas, cuente y agregue la cantidad deseada de células T (generalmente 0,5 - 2 x 10 6 células T / pocillo), lleve el volumen hasta 3 ml con RPMI completo que contenga rhIL-2 y centrifugue durante 45 min a 340 x g a 32 ° C.
  5. Después de 24 h, mantenga las células T a 1 x 106 células/ml en RPMI completo con 50 UI/ml de rhIL-2.
  6. Transfiera las células de la placa de 6 pocillos al matraz T25 si el volumen necesario para mantener la concentración deseada de células T excede la capacidad de volumen de la placa de 6 pocillos.

11. Día 6: Clasificación de células T con CAR humanas

  1. Retire las Dynabeads de las células T antes de la purificación inmunomagnética basada en etiquetas de afinidad (Zip-sort) para evitar una posible retención asociada a Dynabead en la columna magnética y antes de la citometría de flujo para evitar posibles interferencias con el análisis de citometría de flujo.
  2. Agite brevemente para disociar Dynabeads y transferir células T a un tubo cónico de 15 ml e insertarlo en Dynabead Magnet. Invierta el tubo varias veces y espere 5 minutos hasta que las Dynabeads se unan al imán.
  3. Transfiera cuidadosamente la suspensión celular sin Dynabeads a un nuevo tubo cónico de 15 ml aspirando con una pipeta. Cuente la concentración celular recuperada y use el volumen para calcular el rendimiento celular total.
  4. Evalúe la expresión de CAR mediante citometría de flujo según el protocolo de transducción de ratón anterior.
  5. Centrifugar las células centrifugando a 340 x g durante 5 min a 4 °C e incubar en tampón MACS de 500 μL que contiene 30 μL de microperlas [DYKDDDDK (FLAG) o CD34 humano) por 1 x 107 células.
  6. Siga los pasos 6.3-6.5 para obtener células T con CAR humanas clasificadas por Zip.
  7. Evalúe la viabilidad posterior a la clasificación mediante la verificación de viabilidad del hemacitómetro utilizando la exclusión de azul de tripano. Se espera que la viabilidad previa a la clasificación sea > del 80%. Esto puede caer por debajo del 80% después de la clasificación Zip, pero se recupera en 4-5 días.
  8. Expanda las células T humanas en RPMI completo con 50 UI / ml de rhIL-2 y mantenga la concentración de células T en aproximadamente 1 x 106 células / ml. La expansión y el mantenimiento de las células T posteriores a la clasificación se pueden adaptar de acuerdo con los protocolos estándar de expansión y uso del usuario.
  9. Llevar a cabo pruebas experimentales posteriores, como ensayos de eliminación, producción de citoquinas, análisis in vivo utilizando células T generalmente después del día 8.

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Resultados

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En este protocolo, demostramos la cotransducción y la selección inmunomagnética de un solo paso de células T transducidas dualmente con dos vectores retrovirales distintos (denominados Zip-sort, Figura 1)13. Cada vector codifica una parte de un par de cremalleras de leucina heterodimerizantes que se muestra selectivamente en la superficie de las células T de doble transducción (Figura 1A). Una cremallera secretada por etiqueta de afinidad...

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Discusión

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Aquí, hemos descrito un protocolo para generar conjuntos de vectores de clasificación Zip, producir retrovirus, cotransducir células T de ratón y humanas, y purificar inmunomagnéticamente células de doble transducción (clasificación Zip). El protocolo anterior se optimizó para vectores retrovirales y para células T humanas y de ratón. Si bien la metodología de clasificación Zip no se evaluó con otros sistemas vectoriales, en principio, es probable que otros sistemas vectoriales sean comp...

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Divulgaciones

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A.R., S.C., S.E.J. y M.V.D.B. son coinventores de solicitudes de patentes relacionadas con la tecnología Zip-sort. A.P.B. proporciona consultoría para Abbvie y Bristol Myers Squibb. M.v.d.B. ha recibido apoyo para la investigación de Seres Therapeutics y opciones sobre acciones de Seres Therapeutics y ThymoFox; ha recibido regalías de Wolters Kluwer; ha sido consultor, ha recibido honorarios o ha participado en consejos asesores de Seres Therapeutics, Vor Biopharma, Rheos Medicines, Frazier Healthcare Partners, Nektar Therapeutics, Notch Therapeutics, Ceramedix, Lygenesis, Pluto Therapeutics, GlaskoSmithKline, Da Volterra, ThymoFox, Garuda, Novartis (cónyuge), Synthekine (cónyuge), Beigene (cónyuge), Kite (cónyuge), MustangBio (cónyuge) y Cellectar (cónyuge); tiene licencias de propiedad intelectual con Seres Therapeutics y Juno Therapeutics; tiene un papel fiduciario en la Junta de la Fundación de DKMS (una organización sin fines de lucro); y es el presidente del consejo asesor científico de Smart Immune.

Agradecimientos

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S.C. recibió el apoyo de la Fundación Alemana de Investigación (Beca de Investigación; Deutsche Forschungsgemeinschaft, DFG). S.E.J. recibe apoyo de un premio de desarrollo profesional del NCI (número de premio K08-CA252157). S.E.J. también recibió el apoyo de la Sociedad Estadounidense de Oncología Clínica (premio Young Investigator), el Programa Nacional de Donantes de Médula Ósea (premio del Programa Amy) y el Instituto Parker de Inmunoterapia contra el Cáncer (premio Bridge Scholar). La investigación en el laboratorio de van den Brink cuenta con el apoyo de los premios P01-CA023766, R35-CA284024, R01-CA228308 del Instituto Nacional del Cáncer; Premio del Instituto Nacional del Corazón, los Pulmones y la Sangre R01-HL164902 y premio del Instituto Nacional del Envejecimiento P01-AG052359. Esta investigación está respaldada en parte por la dotación de la Cátedra Distinguida Médica Ejecutiva Principal de Deana y Steve Campbell.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
relacionado con la línea celular tumoral
C1498ATCCTIB-49
BM185-CD19Referencia 13
BM185-CD20Referencia 13
Unidad central de nucleofector 4DLonzaAAF-1003B
Unidad 4D-Nucleofector XLonzaAAF-1003X
Kit de amortiguador Lonza SF
Producción de virus
Placa de cultivo celular tratada con cultivo de tejidos (TC) de 10 cmCorning353003
Tubo cónico de 50 mlThermo Scientific339652
EffecteneQiagen301425
plásmido pENTR1aAddgene17398
LZRS-RFAAddgene31601
PB MMLV puro (vector viral para células T de ratón)Referencia 13
PB SFG blastR (vector viral para células T humanas)Referencia 13
pCMV-hyPBasaInstituto Sanger
Fénix-EcoATCCCRL-3214
Phoenix-Eco alfa V beta 3Referencia 13Phoenix-Eco modificado para adherirse a matraces de cultivo con mayor avidez
Intrón PB-EF1a WPRE mCD4 P2A MCS integrina beta 3Referencia 13opcional para mejorar la adhesión de las células de la línea de envasado a los matraces de cultivo
Intrón PB-EF1a WPRE hCD8a 2A integrina alfa VReferencia 13opcional para mejorar la adhesión de las células de la línea de envasado a los matraces de cultivo
Biovec-RD113Biovec Pharma
Biovec-RD113 alfa V beta 3Biovec PharmaEste estudio, transfectado con vectores alfa V beta 3
Filtros de jeringa Millex-HV (0.45 μ m)MilliporeSLHVR33RRS
Polietilenglicol 8000 (PEG)Fisher ScientificBP233-1
Cloruro de sodioFisher ScientificS271-500
PuromicinaSanta Cruz Biotechsc-108071B
BlasticidinaSanta Cruz BiotechSC-204655
Matraces tratados con TC T175 Corning353112
Tripsina-EDTA (0,25%), rojo de fenolGibco25200056
Medios celulares
2-mercaptoetanolGibco21985023
RPMI1640Gibco11-875-119
DMEMGibco11-965-118
FBSSigmaF2442
GlutamaxGibco35050061
Aminoácidos no esenciales MEMGibco11140050
Penicilina-estreptomicinaGibco15140-163
Piruvato de sodioGibco11360070
células T fuertes
Tubo cónico de 15 mlThermo Scientific339650
Placa de 6 pocillos sin TCGibco351146
Placa TC de 6 pocillosGibco353046
microperlas anti-CD19 Miltenyi Biotec130-121-301
InVivoMab anti-ratón CD28 (clon 37.51)BioXCellBE0015-1
InVivoPlus anti-ratón CD3&épsilon; (Clon 145-2C11)BioXCellBE0001-1
Albúmina de suero bovinoSigma AldrichA4737-1G
DasatinibQuímico de las Islas Caimán11498
Dynabeads Activador T humano CD3/CD28Gibco11131D
EDTA (0,5 M), pH 8,0, sin ARNasaInvitrogenAM9260G
Tampón de lisis de glóbulos rojos HybriMaxSigmaR7757-100ML
Columna LDMiltenyi Biotec130-042-901
Kit de aislamiento de células Pan T, humanoMiltenyi Biotec130-096-535
Imán Dynamag-15Invitrogen12301D
Solución salina tamponada con fosfato (1X)Corning21040CV
RetonectinaTakaraT100B
rhIL-2Proleucina (aldesleucina)
Matraz de cultivo celular T25Corning353109
Zip-sort
y micro; Kit de aislamiento MACS DYKDDDDKMiltenyi Biotec130-101-591
Kit de microperlas CD34, humanoMiltenyi Biotec130-046-702
QuadroMACSMiltenyi Biotec130-090-976
MACS MultiStandMiltenyi Biotec130-042-303
Columna LSMiltenyi Biotec130-042-401
Flow Cytometry y monitorización celular
Anti-CD90.1 Thy1.1 APC (clon OX-7)BD BiocienciasGato# 561409; RRID:AB_10683163
Anticuerpo de la etiqueta Anti-V5, (clon 4C12E11) iFluor 488GenScriptCat# A01803, RRID:AB_2925231
Myc PETecnología de señalización celularCategoría # 2233; RRID:AB_823474
Myc Alexa 647Tecnología de señalización celularCategoría # 2233; RRID:AB_823474
Etiqueta anti-DYKDDDK de APC (clon L5)BioLeyendaCat# 637307; RRID:AB_2561496
Anticuerpo anti CD34 para ratones, Alexa Fluor 647, (clon QBEnd/10)Novus BiologicalsCat# NBP2-34713AF647; RRID:AB_2925234
Estreptococo FITCGenScriptCat# A01736; RRID:AB_2622221
Incucyte SX5Sartorio
Citómetro de flujo PenteonAgilent

Referencias

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