Artículo de método

Aclaramiento óptico transitorio mediante moléculas absorbentes para la obtención de imágenes ex vivo e in vivo

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DOI:

10.3791/68629

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11 de julio de 2025

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1Department of Physics, The University of Texas at Dallas, 2Department of Electrical and Computer Engineering, The University of Texas at Dallas

En este artículo

Resumen

Las técnicas de aclaramiento óptico, como las soluciones de moléculas absorbentes, reducen temporalmente la dispersión de la luz para mejorar la obtención de imágenes biológicas y ofrecen estrategias de imagen in vivo biocompatibles y reversibles para órganos profundamente integrados. Este protocolo presenta procedimientos experimentales detallados, así como procesamiento avanzado de imágenes para lograr imágenes dinámicas de alta calidad para la dinámica en tiempo real en animales vivos.

Resumen

Las imágenes dinámicas son una herramienta fundamental en biología y medicina, pero están limitadas por la dispersión de la luz en los tejidos vivos causada por los desajustes del índice de refracción, lo que reduce la profundidad de penetración y la resolución en los tejidos biológicos. Trabajos anteriores introdujeron un enfoque novedoso para lograr la transparencia óptica en animales vivos mediante la utilización de moléculas fuertemente absorbentes. Cuando estas moléculas absorbentes, como la tartrazina, un colorante aprobado por la FDA que se usa comúnmente en los alimentos, se disuelven en agua, modifican el índice de refracción del medio acuoso a través de las relaciones Kramers-Kronig. Esta modulación permite reducir el desajuste del índice de refracción entre componentes separados en el tejido con índices de refracción distintos, mitigando así la dispersión. Este artículo reporta la metodología detallada de la técnica de limpieza de tejidos utilizando una solución acuosa a base de Tartrazina, aplicada tanto a muestras ex vivo como in vivo . Este enfoque hace que los cuerpos de los ratones vivos sean transparentes en el espectro visible, lo que permite obtener imágenes más claras y profundas de los procesos y estructuras internas. A continuación, se utilizó un algoritmo avanzado de procesamiento de imágenes para mejorar el contraste y la segmentación de los órganos de interés. Además, se muestra una alta transparencia en muestras ex vivo , como la pechuga de pollo, tratada con una solución a base de tartrazina. Este método ofrece un enfoque versátil y accesible para mejorar las capacidades de obtención de imágenes en diversas modalidades y allana el camino para avanzar en la comprensión de sistemas biológicos complejos.

Introducción

La imagen biológica ha sido desafiada durante mucho tiempo por la dispersión de la luz, que oscurece las estructurasde interés. Las técnicas de limpieza óptica tienen como objetivo reducir la dispersión de la luz y mejorar la claridad visual, lo que permite la visualización de estructuras previamente ocultas2. El desarrollo de estas técnicas ha dado lugar a una amplia gama de métodos diseñados para mejorar la imagen óptica de tejidos biológicos ex vivo, incluso animales enteros, sin disección física de las muestras3. Sin embargo, el desarrollo de técnicas similares para aplicaciones in vivo ha sido un desafío. Técnicas como CLARITY Clear Lipid-intercambiado Acrilamida-hybridized Rigid Imaging / Immunostaining / in situ-hybridization-compliant Tissue hYdrogel), ofrecen imágenes de alta resolución pero carecen de reversibilidad, lo que las hace inadecuadas para estudios con animales vivos4. Constantini et al. han mostrado un progreso más lento en la obtención de imágenes in vivo en comparación con la claridad de las imágenes ex vivo, lo que se debe a la complejidad de mantener la viabilidad de los tejidos y evitar los niveles tóxicos de agentes necesarios para la transparencia de los tejidos5. Genina hace hincapié en el futuro de la limpieza óptica de tejidos, ya que depende de métodos no invasivos y reversibles6. Estudios recientes han demostrado la eficacia de los colorantes absorbentes solubles en agua para el aclarado óptico in vivo. Por ejemplo, Miller et al. demostraron que la aplicación tópica de tartrazina mejoró significativamente la profundidad de la imagen tanto en OCT como en microscopía fotoacústica (PAM) de piel de ratón vivo, al reducir la dispersión y aumentar el índice de refracción de los componentes del tejido intersticial7. Jia et al. utilizaron una solución de tartrazina al 15% p/p para mejorar las imágenes PAM in vivo del oído y el tejido abdominal del ratón, revelando estructuras microvasculares finas con resolución subcelular que de otro modo estarían oscurecidas8. Zuo et al. demostraron además la obtención de imágenes cerebrales a través del cuero cabelludo y el cráneo intactos en ratones vivos utilizando tartrazina 0,6 M, logrando una intensidad de señal cuatro veces mayor y una resolución 3,5 veces mejor en comparación con el tejido no tratado9. En otra aplicación, Narawane et al. permitieron la obtención de imágenes OCT transesclerales profundas en ojos porcinos mediante la aplicación de tartrazina, logrando una visualización clara del espacio supracoroideo, que antes era inaccesible debido a la fuerte dispersión escleral10. Aunque los métodos de limpieza de tejidos ex vivo como CLARITY e iDISCO (Immunolabel-enabled three-identification imaging of solvent-cleared organs) logran una alta transparencia óptica y resolución subcelular a través de la eliminación de lípidos o el aclaramiento a base de solventes, a menudo no son adecuados para la obtención de imágenes in vivo con animales vivos 4,11,12. Esta limitación afecta a las imágenes dinámicas, que son cruciales para la obtención de imágenes biomédicas de procesos dinámicos dentro de animales vivos, como el desarrollo de enfermedades y la terapéutica.

Las moléculas absorbentes con alta solubilidad acuosa y formas de bandas de absorción distintivas, como la tartrazina, un colorante de grado alimenticio, ofrecen ventajas prometedoras para lograr transparencia óptica en animales vivos13. Al introducir específicamente tartrazina, el tejido absorbe selectivamente las longitudes de onda ultravioleta y azul debido a las características espectrales únicas del tinte, lo que da como resultado un perfil de índice de refracción modificado que reduce la dispersión en longitudes de onda más largas. Esta técnica de limpieza óptica de tejidos contraintuitiva está optimizada para la obtención de imágenes in vivo, y las relaciones Kramers-Kronig proporcionan una base científica para la transparencia observada cuando se utilizan moléculas fuertemente absorbentes como la tartrazina14,15. Para la obtención de imágenes in vivo, la tartrazina se combina con partículas de agarosa calentadas y agua para crear una solución cohesiva que se adhiere mejor a la piel. La naturaleza soluble en agua de la tartrazina también facilita la fácil eliminación de la solución a base de colorante de los animales vivos, lo que reduce los efectos potenciales de la exposición prolongada a las soluciones de colorante. Además, el método se ha adaptado a diversas aplicaciones biomédicas para mejorar la profundidad, la resolución y la sensibilidad de las imágenes, incluida la tomografía de coherencia óptica 7,16 y las imágenes fotoacústicas 7,9, lo que demuestra su potencial para la comunidad de imágenes biomédicas en general.

Con el creciente interés en la aplicación de moléculas absorbentes en imágenes biomédicas17,18, el protocolo presenta un procedimiento detallado de utilización de colorantes alimentarios para aplicaciones ex vivo e in vivo, junto con el procesamiento de imágenes y la obtención de imágenes in vivo reversibles. Este protocolo se aplica al tejido de la pechuga de pollo para demostrar la transparencia ex vivo y luego se modifica para obtener imágenes in vivo de la cabeza y el abdomen de ratones, mostrando reversibilidad. Una solución aplicada a la piel de ratón in vivo crea una transparencia temporal y reversible sin dañar la integridad de la piel o el tejido. Esta técnica se puede integrar con una línea de procesamiento de imágenes, incluida la eliminación de ruido, para crear un protocolo de imagen optimizado para la obtención de imágenes ópticas in vivo de órganos internos. Cuando se combinan, estas técnicas permiten obtener mejores imágenes longitudinales no invasivas para observaciones en tiempo real de los procesos biológicos. El uso de agentes más seguros que demuestren reversibilidad supera las limitaciones anteriores y proporciona un método más adecuado para la obtención de imágenes biológicas dinámicas.

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Protocolo

Todos los experimentos con animales realizados fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad de Texas en Dallas de acuerdo con la Guía de los NIH para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio. Los reactivos y el equipo utilizado se enumeran en la Tabla de Materiales. El código de procesamiento de imágenes está disponible en Github: https://github.com/ou-group-utd/JoVE-2025-Image-Processing

1. Preparación de la solución de tartrazina

  1. Para muestras ex vivo
    1. Para preparar soluciones de colorante, calcule la masa requerida de polvo de tinte (tartrazina) para preparar el volumen deseado de la solución. Usa la fórmula:
      Masa (g) = Molaridad (M) × Peso molecular (g/mol) × Volumen (L)
      NOTA: Para calibrar la molaridad real, mida la absorbancia de las soluciones preparadas utilizando un espectrómetro UV-VIS y aplique la Ley de Beer-Lambert19.
      PRECAUCIÓN: Utilice una balanza analítica para pesar la cantidad precisa de polvo. Use EPP (equipo de protección personal) adecuado, incluida una bata de laboratorio, guantes y gafas de seguridad, cuando trabaje con tintes en polvo. Evite la inhalación o el contacto con la piel.
    2. Transfiera el polvo de tinte a un vial de vidrio limpio y agregue el volumen requerido de agua desionizada (DI) usando una pipeta volumétrica para garantizar la precisión volumétrica.
    3. Si el polvo no se disuelve completamente a temperatura ambiente, coloque el frasco de vidrio en un horno de laboratorio o en un horno precalentado a 40 °C y caliente durante 10 minutos o hasta que el polvo se disuelva por completo (Figura 1A).
      NOTA: Las soluciones de baja molaridad son completamente solubles a temperatura ambiente y permanecen en forma líquida, mientras que las soluciones de alta concentración (>0,37 M) requieren calentamiento.
      PRECAUCIÓN: El calentamiento excesivo evaporará el agua y alterará la concentración real de la solución.
    4. Revuelva en el mezclador de vórtice durante 30 s a 1 min para asegurar una disolución completa.
    5. Para preparar una solución de 0,65 M, disuelva 427,5 mg de polvo de tartrazina en 1 ml de agua desionizada19. Para otras concentraciones, consulte la Tabla 1.
      NOTA: Deseche las soluciones de tinte no utilizadas y los materiales contaminados de acuerdo con los procedimientos estándar de eliminación de desechos químicos.
  2. Para muestras in vivo
    1. Calcule la masa requerida de micropartículas de agarosa a baja temperatura de fusión y tartrazina para preparar una concentración de 0,65 M con una solución de hidrogel de agarosa al 0,4% (4 mg/mL).
      NOTA: Siga las precauciones de seguridad estándar descritas en el paso 1.1.1 cuando manipule todos los reactivos.
    2. Transfiera los polvos pesados a un frasco de vidrio limpio. Agregue agua desionizada con una pipeta volumétrica.
    3. Coloque el vial en un horno de laboratorio o en un horno precalentado a 75 °C durante aproximadamente 10-15 minutos o hasta que las partículas de agarosa se hayan disuelto por completo.
    4. Mezcle ocasionalmente con un mezclador de vórtice durante el proceso de calentamiento para una disolución uniforme.
    5. Deje que la solución se enfríe a temperatura ambiente antes de usarla. Si se solidifica en forma de gel, use el mezclador de vórtice durante 30 s para volver a licuarlo.
    6. Para preparar una solución de hidrogel de 0,65 M, disuelva 427,5 mg de polvo de tartrazina y 4 mg de agarosa en 1 ml de agua desionizada. Para preparar soluciones de otras concentraciones, mantenga la concentración de agarosa al 0,4% (4 mg/mL) y consulte la Tabla 1 para la masa de tartrazina correspondiente17.

2. Depuración óptica de tejidos ex vivo

  1. Preparación de la muestra
    1. Para preparar el tejido ex vivo , corte el tejido de la pechuga de pollo hasta el grosor deseado paralelo a las fibras de colágeno.
    2. Limpie el pañuelo en rodajas suavemente con agua.
    3. Mida el grosor colocando el tejido entre dos portaobjetos de microscopio limpios. Presione suavemente los portaobjetos y use un calibrador Vernier para medir la distancia entre los portaobjetos en el centro del tejido.
    4. Remoja el pañuelo en la solución de tinte.
      PRECAUCIÓN: Asegúrese de que el volumen de la solución sea mayor que el volumen de la muestra y que el tejido esté completamente sumergido.
    5. Coloque el recipiente en un agitador orbital y agite a 100 revoluciones por minuto durante 10 min.
    6. Deje que el tejido permanezca en la solución durante 60 minutos a temperatura ambiente para concentraciones bajas ≤0,4 M y a 40 °C para concentraciones más altas >0,4 M.
  2. Imagenológico
    1. Retire el tejido de la solución de tinte con pinzas limpias.
    2. Coloque la muestra entre dos portaobjetos de vidrio transparente y capture las imágenes con una cámara digital o científica con la resolución y los ajustes de aumento adecuados.
    3. Lleve a cabo el proceso de obtención de imágenes en un entorno de luz controlada para minimizar la interferencia de luz externa.
    4. Repita el proceso de obtención de imágenes para muestras de tejido con diferentes espesores y concentraciones de solución de colorante (Figura 2B).
      NOTA: Utilice una fuente de luz LED para la retroiluminación. Sin embargo, también funciona exactamente de la misma manera para una fuente de luz de iluminación superior.
  3. Mediciones de transmisión óptica
    1. Para medir la transmisión óptica, coloque el tejido de pollo entre dos portaobjetos de vidrio transparente y mida la transmisión utilizando un espectrómetro UV-Visible-NIR (Figura 2C).
    2. Asegúrese de que el sistema esté correctamente alineado y que el haz de luz pase a través de la misma región del tejido antes y después de tratarlo con soluciones de tinte para mantener la consistencia.
      NOTA: Registre los espectros de transmisión en un rango de longitud de onda de 400 nm a 2000 nm, utilizando una velocidad de escaneo media y un intervalo de datos de 1,0 nm. El escaneo espectral completo tarda aproximadamente 5 minutos por muestra.

3. Transparencia óptica en animales vivos

  1. Preparación animal
    1. Antes del experimento, mida el peso del animal y anote el nivel de actividad general para establecer una línea de base fisiológica.
    2. Utilice una almohadilla térmica con la temperatura ajustada a 37 °C para mantener la temperatura corporal del animal durante el experimento.
      PRECAUCIÓN: Vigile continuamente al animal para evitar el sobrecalentamiento.
    3. Administrar anestesia (siguiendo los protocolos aprobados institucionalmente) para la obtención de imágenes ópticas de animales vivos en función de los sitios de obtención de imágenes. Para las imágenes abdominales, use anestésicos inhalatorios para una recuperación rápida y anestesia inyectable para las imágenes cerebrales.
    4. Para la anestesia inhalatoria, inducir con isoflurano al 1,5%-3% y un caudal de 0,8 L/min durante aproximadamente 5 min antes del experimento de imagen y mantenerlo al 1%-2% durante todo el experimento.
      PRECAUCIÓN: Controle continuamente el patrón y la profundidad de la respiración del animal. Use un área bien ventilada para minimizar la exposición anestésica del personal.
    5. Para la anestesia inyectable, prepare un cóctel que contenga Ketamina HCL (16 mg/mL) y Dexmedetomidina HCL 0,2 mg/mL. Dosis de acuerdo al peso del animal y protocolos institucionales aprobados.
    6. Recorte el pelaje con tijeras para animales pequeños del área de imagen deseada.
    7. Aplique la crema depilatoria en el área de la piel recortada durante menos de 60 segundos para eliminar el vello residual. Retire inmediatamente la crema y limpie la piel con toallitas con alcohol para evitar la irritación de la piel.
    8. Use Atipamezol como un medicamento de reversión para la anestesia inyectable después del experimento. Monitoree al animal durante la recuperación y asegúrese de que vuelva a la respiración y la movilidad normales antes de regresar a su jaula de origen.
  2. Procedimiento para hacer transparente el tejido
    1. Prepare la configuración de la imagen colocando una almohadilla térmica a 37 °C debajo del animal para evitar la hipotermia. Alinee la fuente de luz y la cámara para capturar las imágenes.
    2. Utilice una solución de hidrogel de tartrazina 0,65 M mezclada con gel de agarosa al 0,3%-0,4% para la aplicación (paso 1.2).
    3. Aplique la solución sobre la piel (vientre o cabeza, dependiendo de la naturaleza del experimento) con un gotero y déjela reposar durante unos segundos para iniciar la absorción (Figura 3A).
    4. Frote suavemente el área con un hisopo de algodón para una distribución uniforme de la solución de tinte y facilitar la absorción dérmica.
    5. Masajee el área suavemente con un hisopo de algodón limpio y aplique más solución hasta que la piel comience a mostrar transparencia y los órganos internos sean visibles. Durante la absorción, la piel primero mostrará la apariencia de puntos rojo anaranjado, que gradualmente se fusionan en un color uniforme. Este cambio de color es un indicador visual clave de la penetración adecuada del tinte y el inicio del aclarado óptico.
      PRECAUCIÓN: Asegúrese de que la solución no se cristalice sobre el área de aplicación: la cristalización puede bloquear los pasajes de la piel, lo que dificulta la absorción de las moléculas de tinte en la piel, lo cual es muy crucial para lograr la transparencia. La absorción suficiente de las moléculas de colorante convierte el color de la piel en rojo anaranjado.
    6. Continúe masajeando el área suavemente hasta que la piel comience a mostrar transparencia y los órganos internos se vuelvan visibles. Este proceso suele durar aproximadamente 3-5 minutos de masaje en una zona pequeña, pero la duración puede variar según el tamaño del animal y el grosor de la piel.
    7. Captura imágenes con la cámara alineada. Ajusta el enfoque, la exposición y el balance de blancos para optimizar la calidad de la imagen.
    8. Coloque suavemente un portaobjetos de vidrio o un cubreobjetos sobre la piel para minimizar el brillo y reducir los reflejos para obtener imágenes de mejor calidad.
      PRECAUCIÓN: Manipule todas las soluciones químicas con el equipo de protección personal adecuado (bata de laboratorio, guantes y protección para los ojos) y deseche los materiales usados de acuerdo con los protocolos de eliminación de desechos químicos de la institución.

4. Aumentar la visibilidad de los órganos con el procesamiento de imágenes

  1. Pasos de procesamiento de imágenes
    1. Python con OpenCV se utiliza para el procesamiento de imágenes. Importe OpenCV, numpy, matplotlib y PyWavelets.
    2. Cargue y normalice la imagen original. Cargue la imagen .tif original de alta profundidad de bits. Si algún valor de píxel supera 255, normalice todos los píxeles al rango [0, 255].
    3. Recorte la región de interés (ROI). Invoque el selector de ROI de OpenCV para dibujar un cuadro delimitador alrededor del área del órgano. Proceda utilizando únicamente la versión recortada para todos los pasos posteriores.
      NOTA: Asegúrese de que el cuadro delimitador encierre herméticamente el área de destino sin cortar ninguna estructura relevante.
    4. Dividir en canales LAB. Convierta la imagen en color recortada al espacio de color LAB y divídala en los canales L (luminosidad), A y B.
      NOTA: Las imágenes se procesan en color, por lo que se utilizó el espacio de color de laboratorio y las técnicas de procesamiento de imágenes se aplicaron solo al canal L, donde se encuentran las intensidades de píxeles.
    5. Analice la distribución de la intensidad de los píxeles. Traza un histograma del canal L para evaluar el contraste y la dispersión de la intensidad.
      NOTA: Utilice el histograma para verificar si es necesario mejorar el contraste y para guiar la selección de parámetros para mejorar el contraste. Desea que el histograma se extienda a través de [0, 255].
    6. Aplique CLAHE (Ecualización de histograma adaptativo con contraste limitado) para mejorar el contraste local. Cree un objeto CLAHE con clipLimit = 5.0 y tileGridSize = (16,16). Ejecute CLAHE en el canal L y combine el canal L mejorado con CLAHE con los canales A y B originales. Convierta CLAHE de LAB a RGB para su visualización si es necesario.
      NOTA: Si el histograma muestra ruido sobreamplificado (picos), ajuste 'clipLimit' o 'tileGridSize' y vuelva a aplicar para lograr un contraste local equilibrado.
    7. Elimine el ruido de la imagen con contraste mejorado. Realice una descomposición de ondículas discretas de 2 niveles en el canal CLAHE L normalizado (escalado [0, 1]) con un umbral suave de 0,1. Vuelva a construir el canal L sin ruido, vuelva a escalar a [0, 255] y combine el canal L sin ruido con los canales A y B originales. Muestra la imagen original en color recortada en comparación con el resultado sin ruido de ondículas.
      NOTA: La eliminación de ruido de ondículas reduce las pequeñas fluctuaciones que podrían malinterpretarse como primer plano en regiones uniformes.
    8. Segmente los órganos de interés a través del umbral adaptativo de Otsu. Calcule el umbral de Otsu en el canal L sin ruido. Reste un sesgo de 15 del umbral para incluir regiones de órganos de baja intensidad.
      1. Aplique un umbral binario con el valor de sesgo para obtener una máscara de los píxeles del órgano. Combine la máscara con los canales A y B originales y conviértala a RGB para su visualización.
        NOTA: El ajuste del sesgo obliga a la inclusión de regiones de órganos debajo de los vasos. Vuelva a ajustar el sesgo si es necesario para un conjunto de datos diferente.
    9. Proceda al análisis según lo desee.

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Resultados

Demostración de transparencia óptica en tejido de pechuga de pollo ex vivo
Para investigar la propagación de la luz a través de tejido ex vivo , utilizamos trozos de pechuga de pollo cruda deshuesada en rodajas con grosores de 1,5 mm, 2,5 mm y 3,5 mm (Figura 2B). Los tejidos se cortaron en paralelo a las fibras de colágeno, lo que garantizó una orientación consistente de las fibras muscu...

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Discusión

Este trabajo presenta un método de protocolo completo y reproducible para lograr transparencia óptica en tejidos biológicos que utilizan moléculas absorbentes, específicamente el colorante alimentario Tartrazine aprobado por la FDA (aprobado para su uso en productos alimenticios, no en aplicaciones médicas). Este método minimiza eficazmente la dispersión intrínseca en el tejido al alterar el índice de refracción dentro del microambiente del tejido, lo que mejora la transparencia óptica. ...

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Divulgaciones

Todos los autores declaran no tener conflicto de intereses.

Agradecimientos

ZO agradece el apoyo de la Universidad de Texas en Dallas.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Balanza analíticaHZKFA220S
Máquina de anestesia animalEmpresa de ciencias de la vida RWDTAIJI-IEAnestésicos por inhalación
Atipamezol HCL inyectable 5 mg/mlCovertus82124Anestesia inyectable
Cámara CMOSLaboratorios ThorCS165CU/M, Zelux
Dexmedetomidina HCL inyectable 5 mg/10 mLCovertus72960Anestesia inyectable
Iluminador de luz de fibraEmpresa de ciencias de la vida RWD76301Fuente de luz para iluminación superior
Portaobjetos de vidrioCravitySci0303-2122Portaobjetos de microscopio de grado superior
Manta homeotérmicaEmpresa de ciencias de la vida RWD69027Controlador de temperatura para animales
Tratamiento de imágenesAbrir CVPitónSoftware
Jeringa de insulina 0,5 ml 29 gPunto de confort26028Anestesia inyectable
IsofluranoCovertus029405 SKUAnestésicos por inhalación
Inyección de cemina HCL 100 mg/mlDechra20042240Anestesia inyectable
Fuente de luz LEDGGE corpTLB-01Fuente de luz para iluminación superior
LenteLaboratorios ThorMVL4WADistancia focal de 3,5 mm y apertura f/1,4
NairIglesia y DwightL 1224Crema depilatoria
PBS ph 7.4 (1x)Gibco2902869Anestesia inyectable
HisopoEmpresa puritana de productos médicosHospital 806-WC
Agarosa SeaPlaqueLonza50101Químico
TartrazinaMilliporeSigmaNúmero CAS: 1934-21-0Químico
Pipeta de transferenciaMarca de pescador13-711-9AMMD
Espectrofotómetro UV-VIS-NIRShimadzuEspecificaciones sólidas-3700iInstrumento
VialesQorpak242633
Pipetas volumétricasInvestigación de Eppendorf plus3123000063100-1000µ L
Sistema de purificación de aguaCiencia de la avidezSOLO SInstrumento

Referencias

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