Method Article

Microscopía multiarmónica de autofluorescencia simultánea sin etiquetas

DOI:

10.3791/68637

⸱

August 29th, 2025

 ,  ,  ,  , 
1Beckman Institute for Advanced Science and Technology, University of Illinois Urbana-Champaign, 2Department of Bioengineering, University of Illinois Urbana-Champaign, 3Department of Electrical and Computer Engineering, University of Illinois Urbana-Champaign, 4NIH/NIBIB Center for Label-free Imaging and Multiscale Biophotonics, University of Illinois Urbana-Champaign

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este protocolo presenta una guía paso a paso para la técnica microscópica de autofluorescencia multiarmónica sin etiquetas simultáneas (SLAM), que incluye detalles sobre cómo generar la fuente de luz láser, preparar una muestra de tejido, realizar imágenes y analizar los datos. SLAM avanza en la microscopía no lineal midiendo cuatro contrastes complementarios sin etiquetas para investigar el microambiente tisular.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La microscopía óptica no lineal toma imágenes de muestras biológicas mediante la detección de señales de la interacción no lineal de pulsos láser ultracortos con moléculas endógenas. Este método permite una rápida identificación química y estructural a resolución subcelular de una manera no destructiva y sin etiquetas o etiquetas, lo que permite un enfoque poderoso para investigar células y tejidos. Estos contrastes no lineales distintivos incluyen la autofluorescencia excitada por multifotones y la generación de armónicos. Debido a que cada uno de estos contrastes ofrece ventajas y limitaciones únicas, su combinación y su co-registro espaciotemporal proporcionan una paleta de contraste complementaria que mejora las capacidades analíticas de la microscopía óptica no lineal. Por lo tanto, nuestro grupo desarrolló la microscopía multiarmónica de autofluorescencia sin etiquetas simultáneas (SLAM), una técnica de imagen que mide cuatro o más señales ópticas no lineales generadas simultáneamente, con el objetivo de identificar distintas características morfológicas, metabólicas y funcionales en muestras biológicas. Aquí, presentamos un protocolo para la obtención de imágenes SLAM de tejidos, centrándonos en los componentes esenciales de la técnica, incluida la fuente láser, la compresión de pulsos y el microscopio. Además, analizamos la preparación de muestras y describimos la canalización de procesamiento de datos para datos SLAM. El flujo de trabajo presentado es adecuado para investigar el estado metabólico, la disposición, las respuestas celulares y la composición de los tejidos humanos y animales sin depender de etiquetas exógenas.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La microscopía óptica no lineal aprovecha la respuesta de una muestra a la radiación óptica intensa (luz con campos eléctricos mayores de 3 × 103 V / cm) para derivar el contraste de la imagen, donde la polarización inducida (y, por lo tanto, la señal generada) depende de forma no lineal de la intensidad incidente 1,2,3. Debido a que estos múltiples contrastes están mediados por diferentes interacciones luz-materia, la microscopía no lineal proporciona acceso simultáneo a información única sobre la morfología y el paisaje químico de un espécimen 1,2,3. Mientras que las técnicas tradicionales de microscopía que implican una interacción lineal con la luz de iluminación también permiten obtener imágenes cuantitativas, la microscopía no lineal permite un enfoque más multimodal, a menudo con una profundidad de imagen y un corte óptico mejorados, al tiempo que causa menos fotodaño a la muestra4. En el contexto de aplicaciones biomédicas, como la evaluación intraoperatoria de tejidosimilar a la histología 5,6, esta técnica permite el sondeo directo de biomoléculas nativas, lo que facilita investigaciones sin problemas de células vivas sin necesidad de marcadores o modificaciones externas. Este enfoque evita el uso de etiquetas, etiquetas7, moléculas exógenas, proteínas fluorescentes expresadas genéticamente o nanopartículas, que no solo requieren una gran cantidad de mano de obra, sino que también tienen el potencial de alterar la bioquímica nativa de la muestra y afectar negativamente a las células o tejidos diana 8,9,10. Por lo tanto, el microscopio no lineal sirve como una herramienta analítica poderosa y genuina que proporciona imágenes continuas de estructuras microscópicas sin alterar la integridad química y estructural de la muestra. Esta capacidad abre una amplia gama de aplicaciones, que van desde el diagnóstico y el descubrimiento de fármacos hasta la señalización celular y la biología de sistemas.

Los contrastes multifotónicos, como la autofluorescencia de dos fotones (2PAF), la autofluorescencia de tres fotones (3PAF), la generación de segundos armónicos (SHG) y la generación de terceros armónicos (THG), confieren ventajas analíticas en la caracterización de muestras. La 2PAF es generada por flavinas endógenas, siendo el flavina adenosina dinucleótido (FAD) el más abundante en los sistemas biológicos11. 3PAF aprovecha la excitación del infrarrojo cercano para visualizar cromóforos intrínsecos como NAD (P) H y permite imágenes metabólicas al tiempo que evita los problemas de fototoxicidad y atenuación relacionados con los rayos UV12. SHG revela específicamente estructuras moleculares no centrosimétricas como el colágeno fibrilar (tipos I, II y III) y matrices de proteínas 13,14,15,16,17, proporcionando información estructural 1. Por último, THG, sensible a las interfaces y pequeñas características estructurales, sobresale en la obtención de imágenes de distribuciones lipídicas y vesículas extracelulares 18,19,20,21,22.

Cada una de estas señales de contraste ha sido explorada de forma independiente por grupos de investigación, estableciendo el nicho para la microscopía no lineal multifotónica como una herramienta confiable y versátil para aplicaciones biológicas 23,24,25,26. Estos esfuerzos fueron encabezados por los inventores del microscopio 2PAF, quienes aprovecharon su tecnología innovadora para obtener nuevos conocimientos sobre la morfología de los tejidos, el metabolismo celular e incluso las características morfofuncionales de patologías como la enfermedad de Alzheimer y el cáncer23. Su trabajo ha impulsado en última instancia aplicaciones innovadoras en neurociencia 27,28. En los años siguientes, varios investigadores destacaron la sensibilidad del SHG a los cambios en la matriz extracelular, el andamio que proporciona soporte estructural a las células y que sufre alteraciones sustanciales durante la patogénesis del cáncer29. En particular, Campagnola et al.14,24,30,31 demostraron que la microscopía SHG permite la visualización de ensamblajes macromoleculares y supramoleculares, revelando detalles como la disposición, concentración y tipo de colágeno que no son detectables con las técnicas convencionales basadas en fluorescencia. Estos resultados subrayaron el potencial de la microscopía SHG como una herramienta de diagnóstico viable en entornos clínicos. Finalmente, la microscopía THG se aplicó con éxito para visualizar las capas de la retina en roedores a resolución subcelular25, mapear estructuras cerebrales32 y capturar la topografía multiinterfacial de la invasión de células de melanoma33.

Estas implementaciones históricas de microscopía no lineal generalmente involucraron un láser de femtosegundo (fs) de modo bloqueado acoplado a un objetivo de alta apertura numérica (NA) para generar y recolectar las señales no lineales, que luego se dirigieron con un espejo dicroico a un filtro de paso de banda y se recolectaron con un tubo fotomultiplicador (PMT)34. A pesar de implementaciones similares, la mayoría de las aplicaciones se centraron en adquirir solo uno, o, como máximo, dos contrastes, mientras se pasaban por alto los demás. Para aprovechar al máximo el potencial del microscopio multifotónico, Boppart et al. primero implementaron la adquisición secuencial de múltiples contrastes no lineales 21,35,36,37, seguida de su detección simultánea 4,22,38,39,40,41. La técnica resultante, conocida como microscopía multiarmónica de autofluorescencia sin etiquetas simultáneas (SLAM), co-registra espacial y temporalmente las señales no lineales 2PAF, 3PAF, SHG y THG a través de la excitación de un solo disparo y la detección múltiplex, logrando así un poder analítico superior. La colocalización espaciotemporal de estos cuatro canales proporciona datos altamente clasificados y ricos en funciones42 que ofrecen ventajas sobre los datos adquiridos secuencialmente al eliminar los artefactos de movimiento y garantizar un mejor registro de imágenes. En consecuencia, SLAM permite la generación de características compuestas, como las relaciones ópticas de reducción-oxidación, que caracterizan eficazmente las propiedades metabólicas 43,44,45. Además, el análisis combinado de señales a través de modalidades facilita la ingeniería de características adicionales basadas en la correlación y colocalización de canales. Por ejemplo, Shi et al. demostraron la importancia de las características de colocalización de la microscopía SLAM para clasificar con precisión las células de ovario de hámster chino (CHO) utilizadas en la producción farmacéutica42. De esta manera, SLAM sienta las bases para lo que ahora se considera el estado del arte en microscopía multifotónica, allanando el camino para futuros avances en el campo46.

En este protocolo, describimos los componentes clave de un microscopio SLAM (Figura 1) y describimos una metodología paso a paso para su implementación. Esto incluye la generación y conformación de los pulsos de excitación, la preparación de muestras de tejido representativas, los procedimientos de obtención de imágenes y el procesamiento, así como la visualización de los datos resultantes. Al utilizar tecnología comercial y técnicas establecidas, este protocolo es universal, transferible y se puede reproducir fácilmente utilizando sistemas ópticos similares en diferentes laboratorios.

figure-introduction-1
Figura 1: El diseño óptico de un microscopio multiarmónico de autofluorescencia (SLAM) sin etiquetas simultáneas. El láser de femtosegundo emite luz de 1040 nm en pulsos de 370 fs a una tasa de repetición de 10 MHz. La intensidad y la polarización del láser se controlan cuidadosamente antes de bombear un cristal fotónico para generar un supercontinuo. Luego, los pulsos se comprimen con un formador de pulsos y se dirigen a un microscopio de escaneo láser personalizado (caja discontinua). Los espejos dicroicos y los filtros de paso de banda aíslan las señales no lineales generadas por la muestra antes de que sean detectadas por detectores de fotones de alta sensibilidad, como los tubos fotomultiplicadores (PMT) o los fotodetectores híbridos (HPD). El diseño óptico se basa en un sistema descrito anteriormente41. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Todos los estudios en animales se realizaron según el protocolo UIUC # 23031 aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Illinois y siguieron estrictamente todas las pautas y regulaciones relevantes.

1. Escisión y alineación de fibra de cristal fotónico (PCF)

  1. Con cortadores de fibra o cortadores de alambre, corte una sección de fibra de cristal fotónico (PCF, Tabla de materiales) a una longitud de poco más de 15 cm.
    NOTA: Se cortarán longitudes de al menos 1,5 cm de cada extremo del PCF, ya que esta longitud es necesaria para sujetar firmemente el PCF durante la hendidura. La longitud final del PCF (12 cm) utilizado en este estudio se determinó en base a una simulación previa utilizando la ecuación no lineal generalizada de Schrödinger47 y pruebas empíricas. En general, la mejor longitud de PCF puede variar según el tipo de PCF, la entrada del láser de la bomba y el supercontinuo deseado.
    PRECAUCIÓN: Mientras corta PCF, use equipo de protección personal (EPP) para proteger los ojos y la piel del experimentador. Deseche inmediatamente los restos de fibra en el recipiente de eliminación de objetos punzantes.
  2. Quite unos 3 cm del revestimiento de plástico de cada extremo del PCF con un decapante de fibra (Tabla de materiales) o una cuchilla de afeitar, y limpie cualquier plástico residual con papel de seda (Tabla de materiales) y metanol al 100%.
  3. Coloque un extremo del PCF en el soporte de una cuchilla de fibra óptica de precisión (Tabla de materiales) y alinee la cuchilla a 1,5 cm del extremo del PCF. Cierre con cuidado las abrazaderas y presione el botón de hendidura .
    NOTA: Siga cuidadosamente el manual del usuario de la cortadora de fibras, incluidas las pautas específicas para cortar PCF. Los ajustes, como la tensión de la fibra, pueden requerir un ajuste fino para obtener escisiones consistentes y de alta calidad para cada tipo de PCF.
  4. Inspeccione la cara y el costado hendidos del PCF utilizando el microscopio integrado (aumento del 10×) en una estación de trabajo de procesamiento de fibra de vidrio (Tabla de materiales), asegurándose de que la hendidura sea de buena calidad (Figuras 2A, C). Vuelva a cortar si hay escombros (Figura 2D), rasguños (Figura 2E) o la superficie cortada no es plana y perpendicular a la longitud del PCF (Figura 2B).
    NOTA: Se debe tener mucho cuidado en este paso y en los pasos posteriores para evitar tocar los extremos hendidos del PCF con cualquier superficie para evitar causar daños.
  5. Cortar el segundo extremo del PCF, asegurando la longitud final deseada.
    NOTA: El PCF utilizado en este protocolo se corta a 12 cm.
  6. Al igual que con los pasos anteriores, inspeccione el extremo recién cortado del PCF (consulte el paso 1.4). Si la hendidura parece defectuosa o inconsistente, deseche el PCF actual y repita el proceso con uno nuevo.
  7. Sujete el extremo de entrada del PCF en una platina de 3 ejes (Tabla de materiales) aproximadamente a la distancia focal de la lente de acoplamiento de fibra medida con una regla. Apoye de forma segura el otro extremo del PCF con un poste o soporte temporal.
    NOTA: No sujete la salida todavía para evitar romper el PCF durante el ajuste bruto.
    PRECAUCIÓN: Es necesario apoyar el extremo de salida y rodearlo con suficientes bloques de haz para reducir el riesgo de exposición al láser.
  8. Coloque un medidor de potencia óptica (Tabla de materiales) en la trayectoria del haz justo antes del PCF para medir la potencia de entrada. Asegúrese de que el láser de femtosegundo (tabla de materiales) esté bloqueado por el obturador 1 antes de encender el láser.
    NOTA: Complete siempre los programas de capacitación en seguridad láser requeridos para comprender los riesgos asociados con el uso del láser.
    PRECAUCIÓN: Cuando opere el láser, use gafas de seguridad láser adecuadas específicamente clasificadas para la longitud de onda y la potencia del láser en uso. Antes de operar el láser, quítese todas las joyas, relojes y otros artículos reflectantes que puedan causar reflejos perdidos peligrosos.
  9. Encienda el láser y deje que se caliente durante el "tiempo de calentamiento en frío" especificado por el láser. Abra el obturador 1 y ajuste la potencia con la placa de media onda (HWP1) justo antes del divisor de haz polarizador hasta que el medidor de potencia marque 260 mW o menos.
    NOTA: El uso de 260 mW para la alineación se determinó empíricamente como lo suficientemente bajo como para evitar dañar el PCF (incluso cuando está desalineado) y al mismo tiempo proporcionar un haz brillante para la visualización en un visor IR o un objetivo fluorescente.
  10. Bloquee el láser con el obturador 1 y mueva el medidor de potencia al extremo de salida de la PCF.
  11. Desbloquee el láser y ajuste el eje óptico de la cara de entrada del PCF usando la etapa de 3 ejes hasta que aparezca una señal en el medidor de potencia, lo que indica que hay algo de luz acoplada en el núcleo, el revestimiento o el revestimiento de plástico del PCF. Si la colocación de la entrada PCF en el foco del haz está más allá del alcance de la etapa de 3 ejes, bloquee el láser, luego ajuste y vuelva a sujetar el PCF.
    NOTA: Se puede usar un visor infrarrojo (IR) o un objetivo fluorescente para visualizar dónde se enfoca el haz.
  12. Usando la etapa de 3 ejes, ajuste una dimensión del eje óptico del PCF para encontrar el rango en el que se acopla la luz, calcule el medio de ese rango y mueva la etapa allí. Repita esto para la segunda dimensión para centrar aproximadamente el haz en el núcleo del PCF.
    NOTA: Las marcas de graduación de μm en la platina de 3 ejes pueden ayudar a medir distancias y encontrar el centro del PCF.
  13. Ajuste iterativamente las tres dimensiones de la etapa de 3 ejes en una secuencia repetitiva mientras optimiza la eficiencia del acoplamiento para centrar y enfocar con precisión el haz en el núcleo del PCF.
    NOTA: Si la eficiencia máxima de acoplamiento, medida por el medidor de potencia, es notablemente inferior al 80% de la potencia de entrada, cierre el obturador 1, suelte la PCF e inspecciónela en busca de daños. Si está dañado, reinicie desde el paso 1.1, de lo contrario, bloquee el láser, vuelva a sujetar el PCF y reinicie la alineación desde el paso 1.11.
  14. Bloquee el haz con el obturador 1 y aumente la potencia del láser a 1,6 W.
    NOTA: El uso de 1,6 W se determinó mediante simulación y pruebas empíricas para generar un supercontinuo suficientemente amplio, mientras se mantenía por debajo del umbral de daño del PCF.
  15. Abra el obturador 1 y una vez más ajuste iterativamente la etapa de 3 ejes para ajustar la ubicación de entrada PCF para optimizar la eficiencia del acoplamiento.
    NOTA: Empíricamente, la eficiencia máxima suele ser de alrededor del 80%.
  16. Cierre el obturador 1 y sujete la salida del PCF aproximadamente a la distancia focal del espejo parabólico. Coloque un bloque de vigas a la salida del espejo parabólico.
  17. Reduzca la potencia del láser nuevamente a 260 mW o menos.
  18. Abra el obturador 1 y use la platina de 3 ejes del espejo parabólico para alinear el eje óptico del espejo parabólico para minimizar la distorsión del haz. A continuación, ajuste el enfoque y colime el haz en el campo lejano.
    NOTA: Utilice un visor IR o un objetivo fluorescente para ver el haz de salida.
  19. Ajuste los espejos después del espejo parabólico para asegurarse de que el haz esté alineado con el resto del sistema óptico.
    NOTA: Instale objetivos o iris de alineación de volteo permanentes para que este paso sea reproducible.
  20. Cierre el obturador 1 y aumente la potencia del láser a 1,6 W. Abra el obturador 1 y verifique que la trayectoria del haz no haya cambiado.
  21. Mida la potencia de salida del formador de pulsos (Tabla de materiales) utilizando un medidor de potencia. Gire la placa de media onda delante del formador de pulsos (HWP3) para optimizar la eficiencia de transmisión del formador de pulsos.

figure-protocol-1
Figura 2: Extremos escindidos de la fibra de cristal fotónico (PCF). (A, B) Imágenes del lado de la hendidura. (C-F) Imágenes de la cara de la hendidura. (A) Un PCF bien cortado tiene una cara plana y perpendicular. (B) Un PCF mal cortado con una cara angulosa y astillada. (C) Un PCF bien cortado con una cara limpia. (D) Un PCF mal manejado que tiene suciedad en su superficie. (E) Un PCF mal cortado con rasguños en su superficie. (F) Un PCF antiguo que fue reemplazado. Hay un daño visible en el núcleo del PCF como se ve en la mancha oscura en el centro del PCF. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

2. Caracterización y optimización de pulsos

  1. Usando un espectrómetro o analizador de espectro óptico (OSA, Tabla de materiales), mida el láser después del espejo parabólico para verificar la generación de supercontinuo del PCF.
  2. Gire la placa de media onda después del divisor de haz polarizador (HWP2) para optimizar el ancho del supercontinuo.
  3. Encienda el autocorrelacionador de microscopía (Tabla de materiales). Usando el software, configure el detector en el detector interno y configure el rango de escaneo en 5 ps para asegurarse de que se capture todo el ancho de la autocorrelación de pulsos.
    NOTA: Para configuraciones con anchos de pulso más largos (por ejemplo, debido a la dispersión en un PCF largo), el rango de escaneo debe aumentarse adecuadamente. Tenga en cuenta que el ancho de pulso medido por un autocorrelacionador de intensidad no es la verdadera duración del pulso, pero aún puede servir como una referencia útil para la compresión de pulsos. Para una caracterización precisa y completa tanto de la amplitud como de la fase del pulso, se deben utilizar técnicas resueltas espectralmente como la compuerta óptica resuelta en frecuencia (FROG)48 .
  4. Desbloquee el láser y alinee el autocorrelador con el haz que sale del formador de pulsos hasta que aparezca una señal.
    NOTA: La colocación de espejos temporales (dos a la entrada y dos a la salida del autocorrelador) permitirá la alineación del haz con el autocorrelador sin afectar al resto del sistema óptico.
  5. Asegúrese de que el obturador 2 esté cerrado y aplique los medios de inmersión adecuados (como agua o aceite) a la lente del objetivo (Tabla de materiales). Coloque el detector externo autocorrelacionador en la platina del microscopio (tabla de materiales) y ajuste la platina para colocar el detector directamente sobre el objetivo.
    NOTA: A diferencia de los objetivos de microscopio típicos, los objetivos recomendados utilizados para la microscopía SLAM son transmisivos ultravioleta para mejorar la detección de THG38.
  6. Encienda los espejos del galvanómetro de barrido (Tabla de materiales) para poner su voltaje a cero. Abra el obturador y use un visor IR o un objetivo fluorescente para verificar que el haz llegue al detector externo.
  7. Configure el detector de autocorrelacionador para que sea el detector externo. Ajuste la posición del escenario hasta que aparezca la señal.
    NOTA: Si el detector se satura, reduzca la potencia con el filtro de densidad neutra.
  8. Ajuste los coeficientes polinómicos (órdenes de dispersión) del formador de pulsos para minimizar iterativamente el ancho de pulso medido por el autocorrelacionador. Reduzca el rango de escaneo del autocorrelacionador de manera adecuada a medida que disminuye el ancho del pulso para mejorar la precisión y la visualización de la función de autocorrelación.
    NOTA: El ancho de pulso óptimo medido con un ajuste gaussiano debe ser de unas pocas decenas de femtosegundos (fs).

3. Preparación de la muestra

NOTA: Para simplificar, este protocolo describe imágenes tisulares ex vivo . Sin embargo, debido a la naturaleza sin etiquetas de SLAM, los procedimientos de imagen in vivo se adaptan fácilmente38.

  1. Eutanasia al animal mediante asfixia por CO2 u otro método de eutanasia aprobado por IACUC.
  2. Extraiga los órganos de interés utilizando el procedimiento de necropsia estándar49 dentro de los 10 minutos post-mortem y enjuague con solución salina tamponada con fosfato (PBS) preenfriada para eliminar la sangre.
    NOTA: En este estudio, se recolectaron el hígado y los pulmones.
  3. Diseccionar el órgano vertical u horizontalmente con una cuchilla, dependiendo de la orientación requerida para el análisis. Asegúrese de que la disección se realice con precisión para mantener la integridad de la estructura del tejido.
  4. Coloque el trozo de tejido en una placa de cultivo de tejidos estéril llena de medios de cultivo celular completos sin rojo de fenol. Refrigere el tejido a 4 °C si no recoge las imágenes inmediatamente.
    NOTA: El medio de cultivo celular utilizado en este estudio fue el medio de Eagle modificado (DMEM) de Dulbecco tamponado con HEPES, suplementado con suero fetal bovino (FBS) al 10%, glutamina 4 mM y suplementos de medio de crecimiento de células endoteliales (Tabla de materiales). Este medio fue cuidadosamente elegido para mantener la viabilidad fisiológica de las células epiteliales y endoteliales que residen en la muestra de tejido renal durante la duración de la imagen50.
  5. Para preparar los estándares de calibración de fluorescencia, ponga a cero una báscula de precisión al peso de un bote de pesaje antiestático y mida aproximadamente 5 mg de sal disódica de dinucleótido de flavina y adenina (FAD, Tabla de materiales) o 5 mg de sal disódica de dinucleótido de adenina de nicotinamida reducida (NADH, Tabla de materiales).
  6. Utilice una pipeta monocanal para dispensar un volumen adecuado de tampón HEPES de 1 M en los recipientes de pesaje que contienen polvos FAD o NADH prepesados para preparar soluciones madre de 5 mM. Pipetea hacia arriba y hacia abajo repetidamente para disolver el polvo.
  7. Prepare soluciones de trabajo de 1 mM a partir de las soluciones madre mediante dilución 1:5 en el tampón HEPES.
    NOTA: La concentración de trabajo de 1 mM utilizada en este estudio se determinó empíricamente para producir una señal alta y evitar la saturación del detector.
  8. Almacene las soluciones de FAD y NADH en tubos de microcentrífuga a 4 °C.
    NOTA: Los estándares de solución pueden almacenarse refrigerados durante varios días, pero se recomienda preparar soluciones frescas para cada experimento.
  9. Justo antes de recolectar imágenes de microscopía SLAM, coloque las muestras de tejido en placas de imágenes con fondo de vidrio de 35 mm (Tabla de materiales). Alternativamente, use un cubreobjetos de vidrio. Alícuotas de las soluciones FAD y NADH en platos o cubreobjetos idénticos.
    NOTA: Se recomienda encarecidamente el vidrio sin recubrimiento o el vidrio recubierto de poli-D-lisina debido a la reducción de la señal de fondo. Asegúrese de que el grosor del vidrio sea apropiado para el objetivo del microscopio que se está utilizando (este estudio usó # 0).

4. Configuración y funcionamiento de SLAM

  1. Verifique que la entrada del láser a la PCF esté bloqueada por el obturador 1 y encienda el láser. Deje que el láser se caliente durante el "tiempo de calentamiento en frío" especificado del láser.
    NOTA: En este estudio se utiliza un tiempo de calentamiento en frío de 30 minutos para el láser.
  2. Verifique que la trayectoria del haz esté libre de obstrucciones y coloque un medidor de potencia óptica en la trayectoria del haz justo antes del PCF. Abra el obturador 1 y mida la potencia de entrada.
  3. Cierre el obturador 1 y mueva el medidor de potencia a la salida del PCF después del espejo parabólico. Abra el obturador 1 y maximice la salida de PCF utilizando la etapa de entrada de 3 ejes.
  4. Deje que el PCF se caliente durante 10 minutos, luego maximice la potencia de salida nuevamente. Registrar la transmisión del PCF. Si la transmisión cae por debajo del 50%, reemplace el PCF.
    NOTA: Durante el funcionamiento del microscopio SLAM (en los pasos siguientes), se recomienda medir la potencia de salida del PCF cada hora para garantizar datos consistentes.
  5. Mueva el medidor de potencia después del filtro de densidad neutra (ND) y gire el filtro para controlar la potencia del láser que llega a la muestra.
    NOTA: Multiplique la potencia medida por la transmitancia de los componentes ópticos restantes. La transmitancia se mide colocando el medidor de potencia después de la lente del objetivo. Para este estudio, se utilizó una potencia láser promedio de 20 mW en la muestra. La potencia del láser se determinó empíricamente para la muestra, la profundidad de imagen y el sistema de microscopio dados para generar imágenes de alta calidad y evitar daños en la muestra o no linealidad del detector. Si bien no existe un estándar definitivo, las imágenes multifotónicas típicas sin etiquetas se limitan a varias decenas a cientos de milivatios 7,32,33,51,52.
  6. Encienda los galvanómetros y el escenario. Abra el software de adquisición e ingrese los parámetros deseados para la imagen.
    NOTA: Este estudio utilizó 512 × 512 píxeles y un tiempo de permanencia de píxeles de 13,65 μs para obtener imágenes de un campo de visión de 360 × 360 μm2 . Se promediaron cinco fotogramas tomados a 0,333 Hz en un solo fotograma de alta calidad.
  7. Coloque la muestra en la platina utilizando los medios de inmersión adecuados para el objetivo, como se utilizó anteriormente en el paso 2.5.
  8. Apague las luces de la habitación y cierre las cortinas.
    NOTA: Para evitar dañar los detectores, nunca encienda las luces de la habitación mientras los detectores estén encendidos o las persianas del detector estén abiertas.
  9. Encienda las fuentes de alimentación y los amplificadores del detector.
  10. Cierre la caja de luz que rodea el escenario.
  11. Utilice los interruptores de control electrónico para abrir manualmente los obturadores detectores (S3, S4, S5, S6).
  12. En el software de adquisición del microscopio, haga clic en Haga clic para iniciar la adquisición para comenzar a recopilar imágenes SLAM. Ajuste el enfoque del microscopio girando la perilla del controlador de la platina del microscopio (tabla de materiales) hasta que la muestra se enfoque.
    NOTA: El cubreobjetos de vidrio genera una fuerte señal THG, que se puede utilizar para determinar con precisión la profundidad de la imagen utilizando la posición de la platina que se muestra en el controlador de la platina del microscopio. Por ejemplo, todas las imágenes de estándares de solución tomadas en este estudio se tomaron en un plano focal de 20 μm por encima del cubreobjetos.
  13. Utilice el joystick del controlador de la platina del microscopio para localizar el campo de visión deseado en la muestra y, a continuación, haga clic en Detener y restablecer.
    NOTA: Si la imagen se satura, vuelva al paso 4.5 y baje la potencia. Si la imagen tiene una relación señal/ruido inferior a 10, la potencia puede aumentarse cuidadosamente.
  14. En la pestaña Guardar , haga clic en Guardar datos para cambiarlo a Sí, luego haga clic en Haga clic para iniciar la adquisición. Espere hasta que finalice la adquisición antes de continuar.
  15. Para cambiar o manipular la muestra durante la obtención de imágenes, cierre los obturadores del detector y use una linterna o un faro para iluminar. Una vez que se modifica la muestra, regrese al paso 4.10.
    NOTA: Para permitir la repetibilidad y el análisis cuantitativo, recopile imágenes SLAM de los estándares de soluciones FAD y NADH. Asegúrese de que el campo de visión, el tamaño de la imagen y la potencia de excitación sean consistentes con lo que se utilizó para las muestras biológicas.
  16. Para finalizar la adquisición de imágenes SLAM, cierre los obturadores del detector y apague los detectores antes de encender las luces de la habitación.
  17. Bloquee el láser con el obturador 1 y, a continuación, apague el láser.
  18. Apague los galvanómetros y el escenario. Cierre el software de adquisición del microscopio.
  19. Deseche el pañuelo de papel de manera adecuada y limpie el lugar de trabajo.

5. Visualización de datos

NOTA: El siguiente análisis de imágenes puede ocurrir en un software de análisis de imágenes como ImageJ53 (Tabla de materiales) o en un lenguaje de programación con capacidades de análisis de imágenes, como Python o MATLAB. En los pasos siguientes se describe cómo realizar la visualización de datos mediante ImageJ.

  1. Asegúrese de que las imágenes de cada canal estén en un formato de imagen sin pérdidas (por ejemplo, TIFF o PNG).
    NOTA: El software de control de microscopio personalizado utilizado en este estudio guardó automáticamente las imágenes como TIFF. Para guardar una imagen como TIFF, ábrala en ImageJ y seleccione Archivo > Guardar como > Tiff.
  2. Para generar imágenes estándar de iluminación, abra las imágenes de los canales FAD y NAD(P)H de las soluciones FAD y NADH, respectivamente, en ImageJ. Para cada imagen, selecciona Procesar > filtros > Desenfoque gaussiano..., establece Sigma (Radio) en 41 y haz clic en Aceptar.
    NOTA: Ajuste el Sigma (Radio) del filtro gaussiano según sea necesario para suavizar suficientemente la imagen.
  3. Para corregir simultáneamente la iluminación desigual y normalizar la intensidad de la fluorescencia, abra las imágenes de los canales FAD y NAD(P)H de la muestra. Para cada imagen, seleccione Procesar > Calculadora de imagen..., para Imagen1 seleccione la imagen de muestra, para Operación seleccione Dividir y para Imagen2 seleccione la imagen estándar de iluminación que corresponda con el canal de la imagen de muestra y, a continuación, haga clic en Aceptar.
    NOTA: Este paso es fundamental para corregir la variabilidad del sistema y mantener la coherencia en las evaluaciones cuantitativas de la autofluorescencia, como la relación redox óptica (ORR).
  4. Si se toman varias imágenes para formar un campo de visión más grande o una pila en Z, una o combine las imágenes en una sola imagen o pila de imágenes.
  5. Para generar una imagen ORR, primero suma las imágenes FAD y NAD(P)H. Seleccione Procesar > Calculadora de imágenes..., para Imagen1 e Imagen2, seleccione las imágenes de los canales FAD y NAD(P)H respectivamente, para Operación seleccione Agregar y luego haga clic en Aceptar. Para calcular la imagen ORR, seleccione Procesar > Calculadora de imagen..., para Imagen1 seleccione la imagen del canal FAD, para Operación seleccione Dividir y para Imagen2 seleccione el resultado de la suma de FAD y NAD(P)H, luego haga clic en Aceptar.
  6. Para aplicar un mapa de colores a la imagen ORR, seleccione Imagen > Color > Editar LUT..., haga clic en Abrir, seleccione el archivo de tabla de búsqueda (.lut) deseado y haga clic en Aceptar. Selecciona Imagen > Ajustar > Brillo/Contraste y ajusta el contraste como desees.
    NOTA: Se recomienda utilizar un mapa de colores isoluminante como el mapa de colores CET-I254,55 (invertido) utilizado en este estudio. Para invertir un mapa de colores en ImageJ después de aplicarlo a una imagen, seleccione Imagen > Color > Invertir LUT.
  7. Para mejorar la claridad de las características en la imagen ORR, escale el brillo por la intensidad de los canales de fluorescencia. Primero, seleccione el resultado de la suma de FAD y NAD (P) H y seleccione Procesar > Mejorar contraste ..., asegúrese de que Normalizar esté marcado, luego haga clic en Aceptar. Seleccione Editar > Copiar para copiar este resultado en el portapapeles. A continuación, seleccione la imagen ORR y seleccione Tipo de > de imagen > Color RGB", luego seleccione Tipo de > de imagen > HSB (32 bits). Mueva el control deslizante en la parte inferior de la imagen completamente hacia la derecha para ver el canal Brillo , seleccione Editar > Pegar, luego seleccione Imagen > Tipo > Color RGB.
  8. Para visualizar la imagen SLAM como una composición, abra los cuatro canales SLAM en ImageJ y seleccione: Imagen > Color > Combinar canales... Para C2 (verde), seleccione la imagen del canal SHG, para C5 (cian) seleccione la imagen del canal NAD(P)H, para C6 (magenta) seleccione la imagen del canal THG y para C7 (amarillo) seleccione la imagen del canal FAD. Asegúrese de que Crear compuesto esté activado y haga clic en Aceptar.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El complejo enfoque multicanal y multimodal del microscopio SLAM (Figura 1) puede dificultar que los nuevos usuarios solucionen problemas y comprendan los resultados. Primero, un PCF bien cortado presenta una cara limpia (Figura 2C) con una superficie plana que es perpendicular a la longitud del PCF (Figura 2A). Una cara de hendidura en ángulo y astillada (Figura 2B) y la presencia de rasguños (

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Generar un supercontinuo adecuado es crucial para el éxito de las imágenes SLAM, pero puede ser un reto debido a la complejidad de la configuración de la PCF. Garantizar un corte preciso y un manejo cuidadoso del PCF es esencial para mantener las superficies limpias libres de escombros, suciedad o arañazos, todo lo cual puede interferir con el acoplamiento efectivo, la generación de supercontinuos e incluso acortar la vida útil del PCF. Dado que el PCF requiere un reemplazo regular, prac...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La financiación del equipo utilizado en este estudio fue proporcionada en parte por GSK a través del Centro de Imágenes Moleculares Ópticas del Instituto Beckman de Ciencia y Tecnología Avanzadas. Este trabajo también fue apoyado en parte por el Centro NIH / NIBIB para Imágenes sin Etiquetas y Biofotónica Multiescala (CLIMB) (P41EB031772) y el Centro de Ciencia y Tecnología de Biología Celular Cuantitativa de la NSF. K.K.D.T recibió el apoyo del Programa de Capacitación en Investigación en Toxicología y Salud Ambiental del NIEHS (5T32ES007326-25), A.D.C recibió el apoyo del programa de becarios postdoctorales del Instituto Beckman de Ciencia y Tecnología Avanzadas, y A.H. recibió el apoyo del Programa de Capacitación en Microambiente Tisular del NIBIB (T32EB019944). Los autores agradecen a Darold Spillman por su gestión de los espacios de laboratorio, el equipo y la tecnología y agradecen a los Dres. Janet E. Sorrells y Rishyashring R. Iyer por sus contribuciones pasadas al sistema de microscopio SLAM utilizado en este estudio.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Etapa de 3 ejesThorLabsMAX316Terminado.
Plato de imagen con fondo de cristal de 35 mmMatTekP35G-0-14-CCubreobjetos #0 sin recubrimiento.
DMEMGibco21063029Glucosa alta, HEPES, sin rojo fenólico.
Suplementos de medio de crecimiento de células endotelialesPromoCellC-39210Omita el suero fetal para terneros.
Láser de femtosegundo FemtoTrainEspectro-Física1040-5Potencia promedio: >5.0 W, Energía de pulso: >500 nJ, Longitud de onda: 1040 nm ± 8 nm, Tasa de repetición: 10 MHz, Ancho de pulso (FWHM): < 220 ss.
Suero fetal bovinoCytivaSH30071.03Caracterización de HyClone.
Pelacables de fibraThorLabsT10S13
Flavina adenina dinucleótido sal disódica hidratoSigma-AldrichF6625
Espejos galvanómetrosTecnología de Cambridge6215HTerminado.
Estación de trabajo de procesamiento de vidrioVytranGPX3800
ImagenJLaboratorio de Eliceiri en la Universidad de Wisconsin MadisonVersión 2.16.0Distribución FIJI.
Papel de seda KimwipeKimberly-Clark Profesional34120
L-GlutaminaCytivaSH30034.01
Platina de microscopioInstrumentación científica aplicadaFTP-2050
Controlador de platina de microscopioInstrumentación científica aplicadaMS-2000-500-UDSW
Autocorrelacionador de microscopíaAngewandte Physik und Elektronik GmbHCarpe
Lente del objetivoOlimpoXLPLN25XWMP2Inmersión en agua, aumento de 25X, 1.05 NA.
Medidor de potencia ópticaNewport919P-003-10600 - 1700 nm.
Analizador de espectro ópticoThorLabsOSA202C
Fibra de cristal fotónicoFotónica NKTLMA-PM-15 NKTGran área de modo, mantenimiento de polarización. Diámetro del núcleo: 15 µm.
Cortadora de fibra óptica de precisiónFujikuraCT-101
Modelador de pulsosSoluciones biofotónicas Inc.FemtoJock-DTerminado.
β-Dinucleótido de nicotinamida y adenina, reducido en hidrato de sal disódicaSigma-Aldrich10128023001

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Boyd, R. W. Nonlinear optics. , Academic Press. Amsterdam. (2008).
  2. Potma, E. O. Foundations of nonlinear optical microscopy. , John Wiley and Sons. (2024).
  3. Mukamel, S. Principles of nonlinear optical spectroscopy. , Oxford University Press. Oxford, New York. (1999).
  4. Boppart, S. A., You, S., Li, L., Chen, J., Tu, H. Simultaneous label-free autofluorescence-multiharmonic microscopy and beyond. APL Photonics. 4 (10), 100901(2019).
  5. Sun, Y., et al. Real-time three-dimensional histology-like imaging by label-free nonlinear optical microscopy. Quant Imaging Med Surg. 10 (11), 2177-2190 (2020).
  6. Yang, L., et al. Intraoperative label-free multimodal nonlinear optical imaging for point-of-procedure cancer diagnostics. IEEE J Sel Top Quantum Electron. 27 (4), 6801412(2021).
  7. Talone, B., et al. Label-free multimodal nonlinear optical microscopy reveals features of bone composition in pathophysiological conditions. Front Bioeng Biotechnol. 10, 1042680(2022).
  8. Liu, H. S., Jan, M. S., Chou, C. K., Chen, P. H., Ke, N. J. Is green fluorescent protein toxic to the living cells. Biochem Biophys Res Commun. 260 (3), 712-717 (1999).
  9. Tsoi, K. M., Dai, Q., Alman, B. A., Chan, W. C. W. Are quantum dots toxic? Exploring the discrepancy between cell culture and animal studies. Acc Chem Res. 46 (3), 662-671 (2013).
  10. Alford, R., et al. Toxicity of organic fluorophores used in molecular imaging: Literature review. Mol Imaging. 8 (6), (2009).
  11. Macheroux, P., Kappes, B., Ealick, S. E. Flavogenomics - a genomic and structural view of flavin-dependent proteins. FEBS J. 278 (15), 2625-2634 (2011).
  12. Xu, C., Webb, W. W. Multiphoton excitation of molecular fluorophores and nonlinear laser microscopy. Top Fluoresc Spectrosc. 5, 471-540 (2002).
  13. Ranjit, S., et al. Imaging fibrosis and separating collagens using second harmonic generation and phasor approach to fluorescence lifetime imaging. Sci Rep. 5 (1), 13378(2015).
  14. Mohler, W., Millard, A. C., Campagnola, P. J. Second harmonic generation imaging of endogenous structural proteins. Methods. 29 (1), 97-109 (2003).
  15. Cox, G. Biological applications of second harmonic imaging. Biophys Rev. 3 (3), 131(2011).
  16. Aghigh, A., Bancelin, S., Rivard, M., Pinsard, M., Ibrahim, H., Légaré, F. Second harmonic generation microscopy: A powerful tool for bio-imaging. Biophys Rev. 15 (1), 43-70 (2023).
  17. Williams, R. M., Zipfel, W. R., Webb, W. W. Interpreting second-harmonic generation images of collagen I fibrils. Biophys J. 88 (2), 1377-1386 (2005).
  18. Yelin, D., Silberberg, Y. Laser scanning third-harmonic-generation microscopy in biology. Opt Express. 5 (8), 169-175 (1999).
  19. Oron, D., et al. Depth-resolved structural imaging by third-harmonic generation microscopy. J Struct Biol. 147 (1), 3-11 (2004).
  20. Débarre, D., et al. Imaging lipid bodies in cells and tissues using third-harmonic generation microscopy. Nat Methods. 3 (1), 47-53 (2006).
  21. Tu, H., et al. Stain-free histopathology by programmable supercontinuum pulses. Nat Photonics. 10 (8), 534-540 (2016).
  22. You, S., et al. Label-free visualization and characterization of extracellular vesicles in breast cancer. Proc Natl Acad Sci U S A. 116 (48), 24012-24018 (2019).
  23. Zipfel, W. R., et al. Live tissue intrinsic emission microscopy using multiphoton-excited native fluorescence and second harmonic generation. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (12), 7075-7080 (2003).
  24. Campagnola, P. J., Loew, L. M. Second-harmonic imaging microscopy for visualizing biomolecular arrays in cells, tissues and organisms. Nat Biotechnol. 21 (11), 1356-1360 (2003).
  25. Masihzadeh, O., et al. Third harmonic generation microscopy of a mouse retina. Mol Vis. 21, 538-547 (2015).
  26. Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248 (4951), 73-76 (1990).
  27. Denk, W., Svoboda, K. Photon upmanship: Why multiphoton imaging is more than a gimmick. Neuron. 18 (3), 351-357 (1997).
  28. Maiti, S., Shear, J. B., Williams, R. M., Zipfel, W. R., Webb, W. W. Measuring serotonin distribution in live cells with three-photon excitation. Science. 275 (5299), 530-532 (1997).
  29. Winkler, J., Abisoye-Ogunniyan, A., Metcalf, K. J., Werb, Z. Concepts of extracellular matrix remodelling in tumour progression and metastasis. Nat Commun. 11 (1), 5120(2020).
  30. Campagnola, P. J., Dong, C. Y. Second harmonic generation microscopy: Principles and applications to disease diagnosis. Laser Photonics Rev. 5 (1), 13-26 (2011).
  31. Pavone, F. S., Campagnola, P. J. Second harmonic generation imaging. , CRC Press. Boca Raton. (2016).
  32. Witte, S., et al. Label-free live brain imaging and targeted patching with third-harmonic generation microscopy. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (15), 5970-5975 (2011).
  33. Weigelin, B., Bakker, G. J., Friedl, P. Intravital third harmonic generation microscopy of collective melanoma cell invasion: Principles of interface guidance and microvesicle dynamics. Intravital. 1 (1), 32-43 (2012).
  34. Carriles, R., et al. Imaging techniques for harmonic and multiphoton absorption fluorescence microscopy. Rev Sci Instrum. 80 (8), 081101(2009).
  35. Graf, B. W., Jiang, Z., Tu, H., Boppart, S. A. Dual-spectrum laser source based on fiber continuum generation for integrated optical coherence and multiphoton microscopy. J Biomed Opt. 14 (3), 034019(2009).
  36. Graf, B. W., et al. In vivo multimodal microscopy for detecting bone-marrow-derived cell contribution to skin regeneration. J Biophotonics. 7 (1-2), 96-102 (2014).
  37. Liu, Y., Tu, H., Benalcazar, W. A., Chaney, E. J., Boppart, S. A. Multimodal nonlinear microscopy by shaping a fiber supercontinuum from 900 to 1160 nm. IEEE J Sel Top Quantum Electron. 18 (3), (2012).
  38. You, S., et al. Intravital imaging by simultaneous label-free autofluorescence-multiharmonic microscopy. Nat Commun. 9 (1), 2125(2018).
  39. You, S., Chaney, E. J., Tu, H., Sun, Y., Sinha, S., Boppart, S. A. Label-free deep profiling of the tumor microenvironment. Cancer Res. 81 (9), 2534-2544 (2021).
  40. Cadena, A. D. L., Park, J., Tehrani, K. F., Renteria, C. A., Monroy, G. L., Boppart, S. A. Simultaneous label-free autofluorescence multi-harmonic microscopy driven by the supercontinuum generated from a bulk nonlinear crystal. Biomed Opt Express. 15 (2), 491-505 (2024).
  41. Lee, J. H., et al. Simultaneous label-free autofluorescence and multi-harmonic imaging reveals in vivo structural and metabolic changes in murine skin. Biomed Opt Express. 10 (10), 5431-5444 (2019).
  42. Shi, J., et al. Accelerating biopharmaceutical cell line selection with label-free multimodal nonlinear optical microscopy and machine learning. Commun Biol. 8 (1), 157(2025).
  43. Georgakoudi, I., Quinn, K. P. Label-free optical metabolic imaging in cells and tissues. Annu Rev Biomed Eng. 25, 413-443 (2023).
  44. Alhallak, K., Rebello, L. G., Muldoon, T. J., Quinn, K. P., Rajaram, N. Optical redox ratio identifies metastatic potential-dependent changes in breast cancer cell metabolism. Biomed Opt Express. 7 (11), 4364-4374 (2016).
  45. Ostrander, J. H., et al. Optical redox ratio differentiates breast cancer cell lines based on estrogen receptor status. Cancer Res. 70 (11), (2010).
  46. Cadena, A. D. L., Renteria, C. A., Aksamitiene, E., Boppart, S. A. Label-free hyperspectral multiphoton microscopy. Opt Lett. 50 (5), 1484-1487 (2025).
  47. Agrawal, G. Nonlinear fiber optics. , 5th ed, Academic Press. 553-612 (2013).
  48. Trebino, R., et al. Measuring ultrashort laser pulses in the time-frequency domain using frequency-resolved optical gating. Rev Sci Instrum. 68 (9), 3277-3295 (1997).
  49. Stewart, K., Schroeder, V. A. Diagnostic necropsy and tissue harvest in rodents. J Vis Exp. , e10294(2020).
  50. Akis, N., Madaio, M. P. Isolation, culture, and characterization of endothelial cells from mouse glomeruli. Kidney Int. 65 (6), 2223-2227 (2004).
  51. Huttunen, M. J., et al. Multiphoton microscopy of the dermoepidermal junction and automated identification of dysplastic tissues with deep learning. Biomed Opt Express. 11 (1), 186-199 (2020).
  52. Fung, A. A., et al. Label-free multimodal optical biopsy reveals biomolecular and morphological features of diabetic kidney tissue in 2D and 3D. Nat Commun. 16 (1), 4509(2025).
  53. Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  54. Kovesi, P. Good colour maps: How to design them. arXiv. , (2015).
  55. Kovesi, P. ColorCET perceptually uniform colour maps. , https://colorcet.com (2025).
  56. Tian, Z., Liang, M. Renal metabolism and hypertension. Nat Commun. 12 (1), 963(2021).
  57. Wang, G., Shi, J., Iyer, R. R., Sorrells, J. E., Tu, H. Fiber-optic nonlinear wavelength converter for adaptive femtosecond biophotonics. arXiv. , (2024).
  58. Lozovoy, V. V., Pastirk, I., Dantus, M. Multiphoton intrapulse interference. IV. Ultrashort laser pulse spectral phase characterization and compensation. Opt Lett. 29 (7), 775-777 (2004).
  59. Croce, A. C., Bottiroli, G. Autofluorescence spectroscopy and imaging: A tool for biomedical research and diagnosis. Eur J Histochem. 58 (4), (2014).
  60. Theodossiou, A., et al. Autofluorescence imaging to evaluate cellular metabolism. J Vis Exp. (177), e63282(2021).
  61. Yang, L., et al. Label-free multimodal polarization-sensitive optical microscope for multiparametric quantitative characterization of collagen. Optica. 11 (2), 155-165 (2024).
  62. Smith, H. E., et al. The use of NADH anisotropy to investigate mitochondrial cristae alignment. Sci Rep. 14 (1), 5980(2024).
  63. Dailey, M. E., Marrs, G. S., Kurpius, D. Maintaining live cells and tissue slices in the imaging setup. Cold Spring Harb Protoc. 2011 (4), (2011).
  64. Johnson, S., Rabinovitch, P. Ex vivo imaging of excised tissue using vital dyes and confocal microscopy. Curr Protoc Cytom. 61 (1), 9.39.1-9.39.18 (2012).
  65. Sorrells, J. E., et al. Label-free nonlinear optical signatures of extracellular vesicles in liquid and tissue biopsies of human breast cancer. Sci Rep. 14 (1), 5528(2024).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Label Free MicroscopyNonlinear Optical MicroscopyMultiphoton MicroscopyHarmonic GenerationAutofluorescence ImagingPhotonic Crystal FiberPulse CompressionTissue ImagingMetabolic ImagingRedox Ratio

Related Articles