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Artículo de método

Generación de mutantes maternos usando pez cebra zpc:cas9 knock-in

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DOI:

10.3791/68642

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22 de julio de 2025

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1Shandong Provincial Key Laboratory of Animal Cell and Developmental Biology, School of Life Sciences Qilu Hospital (Qingdao), Cheeloo College of Medicine, Shandong University, 2Institut de Biologie Paris-Seine (IBPS), UMR CNRS 8263, INSERM U1345, Development, Adaptation and Ageing, Sorbonne Université, 3College of Marine Life Sciences, Ocean University of China, 4Key Laboratory for Experimental Teratology of the Ministry of Education, Shandong University, 5State Key Laboratory of Microbial Technology, Shandong University, 6Shandong University-Yuanchen Joint Biomedical Technology Laboratory

En este artículo

Resumen

Aquí, describimos un protocolo para generar mutantes maternos que acopla una línea knock-in zpc:cas9 estable con la entrega mediada por Tol2 de casetes de expresión de sgRNA.

Resumen

La ovogénesis y el desarrollo embrionario temprano dependen críticamente de los ARNm y las proteínas derivados de la madre. La eliminación de estos factores maternos requiere mutaciones homocigóticas en las hembras de pez cebra, que a menudo dan lugar a fenotipos letales o infértiles, que impiden la adquisición de embriones mutantes maternos. Nuestro trabajo anterior introdujo un enfoque rápido para evitar la letalidad cigótica a través de la edición del genoma específico del ovocito. Sin embargo, el transgén cas9 previamente reportado exhibe inestabilidad y sufre un silenciamiento gradual a lo largo de generaciones sucesivas. Además, la presencia de elementos transponibles Tol2 flanqueando el casete zpc:cas9 en esta línea dificulta el potencial de una mayor transgénesis de sgRNA utilizando el sistema Tol2, que actualmente es el sistema transgénico más eficiente en el pez cebra. En consecuencia, existe una necesidad crítica de una línea de pez cebra libre de Tol2 que garantice una expresión estable y robusta de Cas9 específica para ovocitos. Aquí, presentamos una línea con knock-in zpccas9 en el locus rbm24a que aborda este requisito. Con el uso de esta herramienta mejorada, proporcionamos una vía para la generación rápida de mutantes maternos de genes con fenotipos mutantes cigotamente letales dentro del modelo de pez cebra.

Introducción

El desarrollo embrionario temprano de los vertebrados depende en gran medida del ARN y las proteínas almacenadas dentro del óvulo, denominados colectivamente factores maternos. Estos productos maternos se sintetizan predominantemente durante la etapa de diploteno de la meiosis I 1,2,3. Para investigar sus roles funcionales, es esencial generar individuos femeninos mutantes homocigóticos, ya que solo la mutación homocigota en los ovocitos puede agotar completamente estos factores maternos. Sin embargo, la obtención de estas hembras mutantes homocigóticas se vuelve un desafío cuando las mutaciones homocigóticas homocigóticas resultan en letalidad o esterilidad 4,5. Esto plantea una barrera significativa para dilucidar las funciones de los productos maternos codificados por genes cigóticos, letales o estériles. Para superar esta limitación técnica, se han desarrollado varios enfoques innovadores 6,7,8. Sin embargo, estas técnicas a menudo sufren plazos experimentales prolongados o desafíos técnicos sustanciales.

En nuestro trabajo previo, también desarrollamos una estrategia de knockout condicional que permite la generación de mutantes maternos dentro de una sola generación 9,10. El sistema consta de dos componentes clave: el pez cebra transgénico Tg(zpczcas9) y un sistema de plásmidos transgénicos I-SceI que alberga 3-4 casetes de expresión de sgRNA. Aprovechando este sistema, logramos con éxito el knockout condicional de los factores maternos en los ovocitos 9,10, pero aún queda margen de mejora. En primer lugar, la eficiencia de edición del genoma de la línea transgénica Tg(zpczcas9) previamente reportada no fue estable en el mantenimiento de la expresión transgénica de Cas9. Además, dado que esta línea transgénica se generó utilizando el sistema de transposones Tol2, la transposición de Tol2 no puede utilizarse más para la integración del casete de expresión de sgRNA; en su lugar, se requiere una transgénesis mediada por I-SceI. Sin embargo, este enfoque es menos eficiente que Tol2 y también es más susceptible al silenciamiento transgeneracional.

Para superar estas limitaciones, buscamos establecer una línea de knock-in que permitiera una expresión robusta y estable de Cas9 específica del ovocito. Esta línea permite el uso del sistema de transposones Tol2 para la entrega altamente eficiente de plásmidos de expresión de sgRNA en pez cebra. Utilizando una estrategia de edición del genoma basada en intrón11, generamos con éxito una línea knock-in zpccas9 con el sitio integrado en el último intrón del gen rbm24a (Figura 1A,B). Elegimos este locus como un puerto seguro genómico candidato para la expresión de transgenes maternos sobre la base de dos observaciones independientes. 1) Integración inofensiva: en nuestro reciente estudio12, los peces knock-in homocigotos portadores de ADN exógeno en este sitio permanecieron completamente viables y fértiles. 2) Expresión robusta: cuando se insertó un casete de zpccas9 en el mismo locus, Cas9 se expresó en niveles altos, lo que produjo eficiencias de edición del genoma consistentemente fuertes a lo largo de las generaciones (Figura 1C). Como componente central del germoplasma, la proteína de unión al ARN Rbm24a se asocia con Buc para incorporar ARN de germoplasma en gránulos germenales. En consecuencia, la deficiencia materna de Rbm24a conduce a una ausencia completa de células germinales primordiales (PGCs)12. Aquí, al enfocarnos en rbm24a como ejemplo en nuestro trabajo reciente, proporcionamos un protocolo de video mejorado para generar y caracterizar mutantes maternos para genes letales cigóticos.

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Protocolo

Los experimentos se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices de ARRIVE y fueron aprobados éticamente por el Comité Institucional de Cuidado de Animales de la Universidad de Shandong (Aprobación No. SYDWLL-2021-15). La descripción general de este protocolo se muestra en la Figura 2.

1. Generación de la línea de knock-in rbm24a-RFP zpc:cas9

  1. Cribado de sgRNA para knock-in
    1. Selección y síntesis de candidatos a sgRNA knock-in
      1. Envíe la secuencia del último intrón de rbm24a a CRISPRscan (http://www.crisprscan.org) para identificar candidatos óptimos de sgRNA que exhiban puntuaciones CRISPRscan altas (indicativas de eficiencia en el objetivo) y puntuaciones bajas de CFD (que reflejan efectos fuera del objetivo). Sintetizar el oligonucleótido largo para cada sgRNA (oligonucleótido de sgRNA).
        NOTA: CRISPRscan genera oligonucleótidos de ARNs que contienen elementos funcionales esenciales, incluida la secuencia promotora T7, la secuencia diana de sgRNA de 20 nucleótidos y una secuencia de andamio de ARNg de 16 nucleótidos. Aquí, seleccionamos un sgRNA con la siguiente secuencia: 5′-taatacgactcactataGGGCTGCTGTCATGTTGG
        GTgttttagagctagaa-3′ (minúscula del promotor T7, mayúscula de la guía de 20 nt, minúscula del andamio parcial).
      2. Para obtener la plantilla de ADN para la síntesis de sgRNA, prepare 50 μL de reacción de PCR de relleno: 2x Taq Master mix 25 μL; cebador de sgRNA (10 μM) 2 μL; Imprimación universal (10 μM) 2 μL; H2O 21 μL desionizado.
        NOTA: Las secuencias de todas las imprimaciones se muestran en la Tabla de Materiales.
      3. Mezcle bien y transfiera la mezcla de reacción a un termociclador preprogramado e inicie el protocolo de amplificación utilizando los parámetros de ciclo de la siguiente manera: 1 ciclo a 94 °C durante 3 min, 35 ciclos (94 °C durante 15 s, 50 °C durante 15 s, 72 °C durante 30 s) y 1 ciclo a 72 °C durante 5 min.
      4. Preparar la mezcla de reacción para la síntesis de sgRNA en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL; combine todos los componentes a temperatura ambiente en el siguiente orden: 11 μL de agua destilada, 2 μL de ATP/GTP/CTP/UTP (10 mM cada uno), 10 μL de producto PCR, 4 μL de tampón de reacción de ARN polimerasa 10x, 2 μL de ARN polimerasa T7 y 1 μL de inhibidor de ARNasa. El volumen total de reacción es de 40 μL. Mezcle bien agitando y realice una centrifugación breve.
      5. Incubar a 37 °C durante 1,5 h. Añadir 1 μL de DNasa I, mezclar agitando y centrifugar brevemente. Incubar a 37 °C durante 15 minutos para garantizar la eliminación completa de la plantilla de ADN.
      6. Añadir 5 μL de perlas magnéticas de sílice, seguidas de 120 μL (4x volumen) de tampón de unión al ARN (Gu-HCl 1 M 9,55 g, Tween-20 0,05%, etanol 100 mL). Mezclar bien pipeteando. Incubar en una termobatidora a 1.500 rpm durante 10 min a temperatura ambiente.
      7. Coloque el tubo en un soporte magnético y retire con cuidado el sobrenadante con una pipeta o un sistema de vacío.
      8. Agregue 400 μL de etanol al 90% y vórtice para resuspender las perlas. Coloque el tubo en el soporte magnético y deseche el sobrenadante.
      9. Repita los pasos de lavado con etanol para completar un total de dos ciclos de lavado.
      10. Retire el sobrenadante residual y seque al aire el tubo abierto en un bloque calefactor a 50 °C durante 10 min.
      11. Añadir 15 μL de agua libre de nucleasas e incubar en una termobatidora a 1.500 rpm durante 5 min a temperatura ambiente.
      12. Coloque el tubo en el soporte magnético y transfiera el eluido a un tubo de microcentrífuga nuevo.
      13. Confirmar la banda de sgRNA de 98 pb mediante electroforesis de agarosa. Cuantifique la concentración de ARN mediante microespectrofotómetro y electroforesis de agarosa, etiquételo claramente y almacene a -20 °C.
    2. Pruebe la eficiencia del sgRNA
      1. Para determinar la eficiencia real de los sgRNAs, prepare el complejo de ribonucleoproteína (RNP) para la microinyección. Mezcle 1 μL de cada sgRNA (concentración final de 50 ng/μL) con 1 μL de proteína Cas9 (concentración final de 100 ng/μL) en hielo mediante pipeteo. Administrar 2 nL del complejo RNP en cada embrión en la etapa de una célula mediante microinyección.
      2. A las 24 h después de la fertilización (hpf), recoja 10 embriones por cada Cas9 RNP inyectado en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL y retire cuidadosamente el exceso de medio. Añadir 100 μL de 50 mM de NaOH (10 μL por embrión) e incubar a 95 °C durante 15 min utilizando un bloque calefactor o termociclador. Neutralizar el lisado añadiendo 10 μL de Tris-HCl 1 M (pH 7,0).
      3. Utilice el lisado de embriones neutralizados directamente como molde para la amplificación por PCR. Diseñe cebadores para amplificar un fragmento que contenga el sitio objetivo con secuencias de flanqueo de ≥100 pb en ambos lados. Verificar los productos de PCR mediante electroforesis en gel de agarosa y purificar mediante extracción en gel cuando sea necesario. Realizar la secuenciación Sanger de los productos amplificados.
      4. Cuantificación de la eficiencia de la edición CRISPR: analice los cromatogramas de secuenciación utilizando la herramienta de análisis ICE (Inference of CRISPR Edits) (https://ice.synthego.com/#/). Normalice la eficacia de la edición con respecto a las muestras de control no inyectadas siguiendo los protocolos recomendados por el sitio web.
  2. Construcción de un plásmido donante para knock-in
    1. Utilice la metodología establecida TEDA (ensamblaje de ADN exonucleasa T5) para realizar la reacción de ligadura13.
    2. Emplee una estrategia de ensamblaje de Gibson de tres fragmentos para la construcción del plásmido donante knock-in rbm24a-RFP KIzpc:cas9 . El primer fragmento incluye un brazo de homología de 1.704 pb 5' que abarca la región genómica inmediatamente aguas arriba del codón de parada rbm24a . La segunda es la secuencia de codificación GFP. El tercero contiene un brazo de homología de 2.274 pb 3' aguas abajo del codón de parada rbm24a , seguido por el casete de expresión zpccas9 colocado en la dirección 3' distal al rbm24a 3'-UTR.
    3. Ensamble los tres fragmentos en el sitio ApaI del vector pBluescript SK- utilizando el ensamblaje de Gibson.
    4. Verifique el plásmido final a través de la digestión de restricción y la secuenciación de Sanger.
  3. Microinyección y selección de embriones con integración precoz
    1. Prepare la mezcla inyectable que contiene 12 pg de plásmido de donante knock-in rbm24a-RFP KIzpc:cas9 , 200 pg de sgRNA y 600 ng de proteína Cas9 recombinante en agua sin nucleasas. Administrar 1-2 nL de la mezcla en el blastodisco de embriones en etapa unicelular utilizando técnicas estándar de microinyección. A 30 hpf, se examinan los embriones en busca de patrones de expresión de RFP que imiten la expresión endógena de rbm24a, lo que indica la integración del plásmido donante ya en la etapa de escisión. Seleccione estos embriones con integración temprana para la reproducción, que mostraron señal RFP en las células ciliadas del cristalino, el corazón, el músculo esquelético y el oído interno (Figura 3A, B).
      NOTA: Purifique el plásmido mediante extracción de fenol-cloroformo antes de la inyección para eliminar cualquier RNasa residual introducida durante la preparación del plásmido.
    2. Analizar los patrones de expresión de Rbm24a-RFP materno en embriones de generación F1 derivados de cruzamientos rbm24a-RFP KIzpc:cas9 (Figura 4A,B).
  4. Evaluación de la expresión de la proteína Cas9 y eficiencia de edición
    1. Para evaluar la eficiencia de la edición de Cas9, microinyecte 200 pg de sgRNA bmp2b en embriones rbm24a-RFP KIzpc:cas9 de 1 célula (Figura 1C, D).
    2. Para evaluar la estabilidad de la edición de Cas9, se cuantificó el número de embriones que exhiben fenotipos de dorsalización y se realizó un análisis de secuenciación de Sanger para evaluar la eficiencia de la edición (Figura 5A-D).
      NOTA: Aunque no hemos detectado ninguna reducción en la expresión de Cas9 a lo largo de tres generaciones, recomendamos verificar la eficiencia de edición en cada generación de esta línea knock-in.

2. Transgénesis de sgRNA en la línea rbm24a-RFP KI zpc cas9

  1. Seleccione y sintetice sgRNAs para el knockout de rbm24a .
    1. Seleccione y sintetice los candidatos a sgRNA como se describe en el paso 1.1.1.
      NOTA: Es crucial seleccionar sgRNAs que se dirijan a la mitad anterior de la región codificante para garantizar una pérdida de función altamente eficiente. Además, si se identifican dominios de proteínas críticas en la región C-terminal, también son aceptables los sgRNAs dirigidos al extremo 3' de la secuencia codificante. CRISPRscan genera oligonucleótidos de ARNg que contienen elementos funcionales esenciales, incluida la secuencia promotora T7, la secuencia diana de ARNg de 20 nucleótidos y una secuencia de andamio de ARNg de 16 nucleótidos. Para lograr un knockout efectivo del gen materno, es recomendable diseñar 6-8 candidatos para identificar de manera confiable 3-4 sgRNAs altamente eficientes. Un protocolo detallado se puede encontrar en un documento anterior9.
    2. Pruebe la eficiencia del sgRNA en embriones tempranos de pez cebra como se describe en el paso 1.1.2.
      NOTA: se prefieren los sgRNAs con una eficiencia de edición superior al 50%.
  2. Construcción de plásmido transgénico que expresa sgRNA
    NOTA: Para maximizar la eficiencia de la edición, recomendamos utilizar cuatro sgRNAs distintos que no se superpongan, cada uno separado por al menos 36 pb. Estos sgRNAs se ligan individualmente en vectores pU6x:sgRNA (pU6x:sgRNA #1, #2, #3, #4), cada uno de los cuales alberga un promotor U6 único junto con el andamio 3'14. Posteriormente, estos cuatro vectores U6, cada uno de los cuales contiene un casete de expresión de sgRNA, se ensamblan en el vector de destino pGGDestISceIEB-4sgRNA mediante ligadura Golden Gate.
    Los vectores pU6x:sgRNA deben seleccionarse secuencialmente. Por ejemplo, si clona tres sgRNAs, use los vectores #1 a #3; si clona cuatro sgRNAs, use los vectores #1 a #4.
    1. Subclonación de la secuencia diana de sgRNA en vectores pU6x:sgRNA
      1. De acuerdo con la secuencia de sgRNA seleccionado, sintetice los cebadores de recocido: Imprimador directo: TTCGN(19); Imprimación inversa: AAAC[N(19)]*. Donde GN(19) es la secuencia diana de 20 nt del sgRNA. [N(19)]* representa la secuencia inversa del complemento de los 19 nt de la diana de sgRNA en la dirección 3'.
      2. Para recocer los cebadores, prepare la mezcla de la siguiente manera: 1 μL de cebador directo (100 μM), 1 μL de cebador inverso (100 μM), 2 μL de tampón 10x y 16 μL de H2O desionizado para alcanzar un volumen total de 20 μL. Mezclar bien.
        NOTA: Las secuencias de todos los cebadores se mostraron en la Tabla de Materiales.
      3. Coloque la mezcla en un termociclador y ejecute el programa de la siguiente manera: 1 ciclo a 95 °C durante 15 minutos, luego enfríe gradualmente a 50 °C a una velocidad de rampa controlada de 0,1 °C/s, y mantenga esta temperatura durante 10 minutos; mantener a 4 °C durante 10 min.
      4. Prepare la mezcla de reacción para clonar la secuencia diana de sgRNA recocida en vectores pU6x-sgRNA como se describe: 1 μL de tampón de enzima de restricción 10x, 1 μL de tampón de ligasa T4 10x, 0,3 μL de ligasa T4, 0,3 μL de BsmBI, 0,2 μL de PstI, 0,2 μL de SalI, 1 μL de cebador de sgRNA recocido, 5 μL de pU6x:sgRNA#x (20 ng/μL), y 1 μL de H2O desionizado, ajustando el volumen de reacción final a 10 μL.
      5. Mezcle bien los componentes de la reacción y ejecute el siguiente programa de termociclador: 6 ciclos (37 °C durante 20 min, 16 °C durante 15 min), 1 ciclo a 37 °C durante 10 min, 1 ciclo a 55 °C durante 15 min, 1 ciclo a 80 °C durante 15 min.
      6. Para la transformación, descongele las células competentes DH5α en hielo, mezcle suavemente 50 μL de las células con la mezcla de ligadura moviendo el tubo e incube la mezcla en hielo durante 30 minutos. Realice un choque térmico a 42 °C durante 60 s, luego vuelva a transferir el tubo inmediatamente a hielo durante 2 minutos. Extienda las células transformadas en una placa LB que contenga 100 μg/mL de espectinomicina e incube la placa boca abajo a 37 °C durante al menos 16 h para permitir la formación de colonias.
      7. Para la PCR de colonias, elija cada colonia bacteriana con una punta de pipeta y transfiérala a 10 μL de H2O desionizado. Vuelva a suspender la colonia a fondo pipeteando hacia arriba y hacia abajo para garantizar una dispersión completa para el análisis de PCR posterior. Prepare la mezcla de reacción de PCR combinando 5 μL de 2x Taq Mix, 2 μL de líquido de colonia, 0,4 μL de cebador directo M13 (10 μM) y cebador inverso (10 μM), y 2,2 μL de H2O desionizado, lo que produce un volumen total de reacción de 10 μL.
      8. Ejecute el programa como se muestra a continuación: 1 ciclo a 94 °C durante 3 minutos, 23 ciclos (94 °C durante 15 s, 55 °C durante 15 s, 72 °C durante 30 s) y 1 ciclo a 72 °C durante 5 minutos.
      9. Someter los productos de PCR a electroforesis. Seleccione la colonia positiva con el tamaño esperado de 482 pb (Figura 6).
      10. Inocular el líquido restante de la colonia en 3 mL de medio LB suplementado con 100 μg/mL de espectinomicina. Incubar a 37 °C con agitación a 200 rpm durante 14 h.
      11. Extraiga los plásmidos del cultivo bacteriano utilizando el kit de minipreparación de plásmidos de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Mida la concentración de plásmidos con un microespectrofotómetro.
      12. Someta los plásmidos extraídos a la secuenciación Sanger utilizando el cebador directo M13. Alinee los resultados de la secuenciación con el mapa vectorial U6 esperado para verificar la inserción correcta de la diana de sgRNA.
    2. Ensamblaje del vector pGGDestEB-4sgRNA
      NOTA: Como se ilustra en la Figura 7, cuatro casetes de expresión de sgRNA impulsados por U6 se pueden ligar de manera eficiente en el vector de columna vertebral pGGDestEB-4sgRNA utilizando el ensamblaje Golden Gate. El número de sgRNAs a ligar determina el uso de vectores. Por ejemplo, al ensamblar cuatro casetes de sgRNA, use pU6a:sgRNA#1, pU6a:sgRNA#2, pU6b:sgRNA#3, pU6c:sgRNA#4 y pGGDestEB-4sgRNA.
      1. Prepare los 20 μL de la mezcla de la reacción Golden Gate que contienen: 2 μL de tampón de enzima de restricción al 10×, 2 μL de tampón de ADN ligasa T4 10x, 100 ng de cada construcción pU6x:sgRNA#x, 50 ng de vector de destino pGGDestIEB-4sgRNA, 1 μL de BsaI, 1 μL de ADN ligasa T4 y agua desionizada para ajustar el volumen final a 20 μL.
      2. Ejecute la reacción de ensamblaje Golden Gate a través de 3 ciclos de 20 minutos a 37 °C seguidos de 15 minutos a 16 °C, luego complete con una incubación final de 15 minutos a 80 °C para la inactivación de enzimas.
      3. Para transformar, transfiera 5 μL de la mezcla de reacción a células competentes y coloque una placa en un medio LB suplementado con ampicilina.
      4. Realice la PCR de colonias mediante el cribado de las colonias utilizando cebadores Dest hacia adelante y hacia atrás (consulte la Tabla de materiales) para confirmar la presencia de inserto (Figura 8).
        NOTA: La banda principal de 2.415 pb y un patrón de escalonamiento deben estar presentes para un clon positivo.
      5. Extraiga plásmidos de colonias positivas y secuenciarlos utilizando cebadores Dest hacia adelante y hacia atrás para cada objetivo de sgRNA.
      6. Alinee los resultados de la secuenciación de Sanger con la secuencia vectorial predicha para su verificación.
  3. Microinyección y preselección de fundadores transgénicos
    1. Recoja embriones desovados por peces homocigotos rbm24a-RFP KIzpc:cas9 .
    2. Prepare la mezcla de inyección combinando 1 μL de pGGDestEB-rbm24a-4sgRNA (12 ng/μL) con 1 μL de ARNm de la transposasa Tol2 (50 ng/μL).
      NOTA: Purifique el plásmido mediante la extracción de fenol-cloroformo antes de la inyección para eliminar cualquier RNasa residual que pueda haberse introducido durante el proceso de extracción del plásmido. El plásmido y el ARNm de Tol2 se diluyeron directamente en agua pura.
    3. Coloque un cubreobjetos de vidrio en un plato de 15 cm. Alinee los embriones a lo largo del borde del cubreobjetos y elimine cuidadosamente el exceso de agua con una pipeta. Inyecte 2 nL de la mezcla en el blastodisco de cada embrión en etapa de 1 célula. Después de la inyección, enjuague suavemente los embriones con agua azul y transfiéralos a un plato fresco. Finalmente, coloque el plato en una incubadora a 28 °C para el cultivo.
      NOTA: Prepare la solución de trabajo azul de metileno (agua azul) de la siguiente manera: Disuelva 180 g de sal marina en 2,7 L de agua destilada y esterilice para hacer 100 veces el caldo de agua de mar. Diluya este caldo 200 veces con agua destilada estéril para obtener 1/100x de agua de mar. Añada 10 μL de solución madre de azul de metileno al 5% (m/v) a 1 L de esta agua de mar 1/100x para preparar la solución de trabajo final.
    4. A 24 hpf, se seleccionan embriones que exhiben una expresión robusta y ubicua de BFP. A 4 dpf, eleve solo aquellos que mantienen fuertes señales fluorescentes transgénicas (Figura 9).

3. Caracterización de embriones transgénicos dobles

  1. Fenotipado de embriones transgénicos dobles
    1. Recoja embriones de hembras fundadoras transgénicas del mosaico que se aparean con machos de tipo salvaje.
    2. Recoger los embriones BFP positivos (BFP+) en la etapa de una célula bajo un estereomicroscopio de fluorescencia.
    3. Identificar los defectos de desarrollo que emergen en los embriones BFP+ , pero no en los embriones BFP- .
    4. Fijar los embriones en paraformaldehído (PFA) al 4% a 4 °C durante la noche. Realice hibridación in situ de montaje completo, tinción de inmunofluorescencia u otros análisis histológicos cuando sea necesario.
      NOTA: Solo los fenotipos defectuosos que surgen exclusivamente en embriones que expresan sgRNA positivos para GFP o BFP son fiables. Las conclusiones deben extraerse con cautela, y los fenotipos mutantes maternos deben estar respaldados por más de 10 casos.
  2. Genotipado de embriones mutantes maternos
    NOTA: Para la identificación de Mrbm24a embriones, pueden ser fácilmente detectados por la ausencia de Rbm24a-RFP bajo un microscopio de fluorescencia. Por el contrario, la identificación de mutantes maternos de otros genes se basa principalmente en una estrategia de aspiración celular previa a la activación del genoma cigótico, seguida del análisis RT-PCR de los ARNm maternos en las células recolectadas (Figura 10).
    1. Aspiración celular
      1. Prepare una solución de agarosa al 1,5% disolviéndola en 1/3x tampón de Ringer y hirviendo hasta que se derrita. Vierta la solución en una placa de Petri de 90 mm e inserte un molde (WPI, z-molds) en la agarosa fundida. Una vez solidificado, retire suavemente el molde, dando como resultado una placa lista para usar.
      2. Utilice capilares de vidrio y un extractor para crear agujas selladas por fusión. Para obtener agujas de aspiración celular óptimas, ajuste dos pesos ligeros y la potencia de calentamiento a Lv1: 60 y Lv2: 90, y seleccione el procedimiento Step2. Recorte las puntas capilares con pinzas puntiagudas (consulte la tabla de materiales) para lograr un diámetro de apertura de 30-40 μm. Posteriormente, crea una espiga en la punta de la aguja con un microforja, que ayuda a la penetración y minimiza el daño al embrión.
      3. Aparea a las hembras fundadoras putativas con peces cebra de tipo salvaje y recoge los embriones. Aislar embriones BFP positivos en la etapa de una célula.
      4. A 3 hpf, descorionar los embriones mediante incubación en 1 mg/mL de Pronase en 1/3x tampón de Ringer durante 10 min y pipeteo suave, y colocar cuidadosamente los embriones en la placa de agarosa inundada con 1/3x tampón de Ringer suplementado con 1x penicilina-estreptomicina. Reoriente los embriones para que el blastómero se dirija hacia la punta del capilar.
        NOTA: Es crucial transferir los embriones con cuidado, ya que son extremadamente frágiles sin la protección del corion. ¡No dejes que toquen la superficie del medio!
      5. Emplee un microinyector para aspirar 20-40 células de cada embrión reduciendo cuidadosamente la presión de equilibrio que compensa la fuerza de aspiración de la acción capilar15. Libere estas células en 2 μL de H2O desionizado en el borde de apertura de los tubos de PCR aumentando la presión de equilibrio.
        NOTA: Para evitar la contaminación cruzada, la aguja de vidrio debe limpiarse aspirando y expulsando H2O 3 veces desionizado antes de cada aspiración.
      6. Agregue 200 μL de reactivo de extracción de ARN para lavar las células y almacene temporalmente los tubos en hielo. Posteriormente, analizar los genotipos de células de embriones con o sin defectos de desarrollo.
        NOTA: Las células conservadas en el reactivo de extracción pueden almacenarse a -20 °C hasta que los embriones correspondientes presenten fenotipos aberrantes.
      7. Deje los embriones después de la aspiración celular en la placa de agarosa o colóquelos individualmente en placas de 24 pocillos inundadas con 1/3x de la solución de Ringer que contiene 1x penicilina-estreptomicina.
        NOTA: ¡Se debe tener cuidado al transferir los embriones decorionados! Por lo general, examinamos de 20 a 40 embriones en un experimento, que dura aproximadamente 1 h.
    2. Análisis de ARNm materno de interés en células aspiradas
      1. Añadir 40 μL de cloroformo a las células en el reactivo de extracción y mezclar suavemente. Centrifugar la mezcla a 12.000 × g durante 1 min a 4 °C.
      2. Recoja cuidadosamente el sobrenadante. Añadir 1 μL de solución de glucógeno (20 mg/mL) y un volumen igual de isopropanol (si el volumen del sobrenadante es de 100 μL, añadir 100 μL de isopropanol) y mezclar bien. Incubar la mezcla a -20 °C durante 30 min para facilitar la precipitación.
        NOTA: Debido a la pequeña cantidad de ARN total en las células aspiradas, se debe agregar glucógeno para mejorar la eficiencia de la precipitación y facilitar la visualización del precipitado.
      3. Centrifugar la muestra a 12.000 × g durante 10 min a 4 °C y desechar el sobrenadante.
      4. Lavar el pellet 2 veces mediante la adición de 500 mL de etanol al 70% y centrifugar a 12.000 × g durante 1 min.
      5. Deseche el líquido y abra la tapa para permitir que el pellet se seque a temperatura ambiente durante 5 minutos.
      6. Añadir 7 μL de agua para disolver el pellet. Realice la transcripción inversa utilizando el kit de síntesis de ADNc de primera cadena, siguiendo el protocolo detallado proporcionado en el manual de instrucciones.
      7. Amplifique toda la región de codificación con cebadores apropiados (consulte la Tabla de materiales) y ejecute la electroforesis de agarosa.
      8. Clonar los productos de PCR y secuenciar al menos 30 clones para cada embrión para analizar la mutación surgida en los ARNm.
        NOTA: Para confirmar que la presencia de un fenotipo defectuoso es causada por una mutación dirigida del factor materno interesado, todos los embriones (n > 5) con fenotipos defectuosos deben mostrar la ausencia de transcripciones maternas de tipo salvaje. Por el contrario, los ARNm maternos de tipo salvaje deben estar presentes en todos los embriones que expresan ARNs en desarrollo normal (n > 5). Al mismo tiempo, en los embriones con sgRNAs negativos, solo los ARNm de tipo salvaje son detectables (n > 5).

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Resultados

Rápida generación de mutantes maternos rbm24a
Construimos un vector transgénico que permite la expresión de un marcador materno de BFP y cuatro sgRNAs altamente eficientes dirigidos a la secuencia codificante rbm24a. Tras la introducción de este vector en embriones homocigotos rbm24a-RFP KIzpc:cas9 mediante la transposición de Tol2, Mrbm24a se identificó fácil y rápidamente entre los embriones F1 positivos para ...

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Discusión

Las mutaciones cigóticas letales dificultan el análisis de la contribución materna de un gen. Las estrategias alternativas, sobre todo el reemplazo de la línea germinal y la microinyección in situ de ovocitos (OMIS), son técnicamente exigentes 6,8. En el proceso de trasplante celular de reemplazo de la línea germinal, el embrión receptor recibe muy pocas PGC, lo que a menudo impide el desarrollo normal de la mujer 16,17,18.

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Divulgaciones

Este protocolo ha sido concedido como patente por la Administración Nacional de Propiedad Intelectual de China, que aliviará el uso restringido del método después de obtener el permiso de los autores. Los autores declaran que no tienen otros intereses contrapuestos o financieros.

Agradecimientos

Agradecemos a Jianlin Shen, Yiteng Xu y Qingqing Wei de la Plataforma Central de Instalaciones y Servicios de la Facultad de Ciencias de la Vida. Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (subvenciones 32170816, 32370860, 32450630 y 31871451), el Programa de Académicos Destacados de Mediana Edad y Jóvenes de la Universidad de Shandong, los Becarios de Taishan de la Provincia de Shandong.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
2x mezcla de PCR M5 HiPer TaqMei5bioCategoría#MF001-BD-100
AgarosaBiografía de MDbioCategoría#A006L
Kit de minipreparación de plásmidos AxyPrepAxygenCategoría#AP-MN-P-4
Instrumento de electroforesis capilar (Qsep400)BiopticN/A
Mezcla de etiquetado DIGRocheGato#11277073910
ADNasa IRocheGato#4716728001
TDTThermo Fisher ScientificCategoría#R0861
Kit de síntesis de ADNc de primera cadenaTransGen BiotechCategoría#AT301
Nucleasa GenCrispr NLS-Cas9-NLSGenScriptCategoría#Z03389
Capilares de vidrio (1,0 x 100 mm)Fábrica de equipos educativos RantaiCat#OS-2B
GlucógenoBBI Ciencias de la VidaCategoría#28985
GraphPad Prisma 9Teclado gráficohttps://www.graphpad.com/
ImagenJCódigo abiertohttps://imagej.net/software/fiji/
Agarosa de bajo punto de fusiónBiotecnologíaCategoría#CA1351
Microforja (MF2)NARISHIGEN/A
Microespectrofotómetro (Nano-300)ALLSHENGN/A
OlyVIAOLIMPON/A
Penicilina-estreptomicinaGibcoGato#15140122
Inyector de picolitros (PLI-100A) Aparato de HarvardN/A
Pinzas puntiagudasWPIGato#500341
Pinzas puntiagudas  WPI 500341
Extractor (PC-100)NARISHIGEN/A
Inhibidor de la ARNasa RiboLockThermo Fisher ScientificCategoría#EO0381
rNTPThermo Fisher ScientificCategoría#R0481
Perlas magnéticas de hidroxilo de silicioSangon BiotechCategoría # B518720-0001
ARN polimerasa T7NEBGato#M0251L
ZoldWPIMoldes Z Cat#

Referencias

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