Artículo de método

Un modelo ratón de la administración continua de presión positiva en las vías respiratorias neonatal y el método de corte pulmonar de precisión para medir la contractilidad de las vías respiratorias

DOI:

10.3791/68643

⸱

13 de marzo de 2026

 ,  ,  ,  , 
1Department of Pediatrics, UH Rainbow Babies & Children's Hospital, 2Department of Pediatrics, Case Western Reserve University School of Medicin, 3Department of Anesthesiology & Perioperative Medicine, Mayo Clinic, 4Department of Physiology and Biomedical Engineering, Mayo Clinic

En este artículo

Resumen

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Demostramos un método no invasivo para administrar diferentes niveles de CPAP a ratones neonatales no anestesiados. La técnica pretende imitar parcialmente la administración de CPAP en muchos bebés prematuros para evaluar sus efectos en el desarrollo pulmonar. También demostramos los efectos del CPAP sobre la contractilidad de las vías respiratorias utilizando el método de corte pulmonar de precisión.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Las fuerzas mecánicas asociadas al soporte respiratorio a presión positiva utilizado en la atención intensiva de bebés prematuros pueden tener consecuencias tanto positivas como inadvertidas para el desarrollo pulmonar. El soporte de presión positiva mejora el intercambio gaseoso pulmonar, limita la atelectasia y mejora la oxigenación sistémica, pero también se conocen bien los efectos dañinos de modalidades invasivas, como la ventilación mecánica, sobre el desarrollo pulmonar. Sin embargo, existen grandes lagunas en nuestra comprensión de los efectos adversos de formas menos invasivas de ventilación. Aquí, la presión positiva continua en las vías respiratorias (CPAP) es una de las modalidades de soporte respiratorio más comunes, representando la menos invasiva del espectro de presión positiva. Una limitación importante en el estudio del desarrollo de las vías respiratorias humanas es la falta de modelos adecuados para la edad y la capacidad de administrar CPAP a pequeños animales neonatales. Resolvimos este problema desarrollando un modelo murino de CPAP neonatal administrado diariamente a ratones recién nacidos despiertos y sin anestesia, un modelo que utiliza niveles clínicamente relevantes de CPAP en una etapa del desarrollo pulmonar de ratón que corresponde a los bebés prematuros cuando es probable que reciban CPAP en la UCI. Aquí demostramos nuestro modelo de CPAP, que incluye un sistema cómodo y diseñado a medida que puede administrar CPAP de forma no invasiva al recién nacido no anestesiado con niveles fácilmente ajustables. También ofrecemos una demostración del método de corte pulmonario cortado con precisión para la medición de la hiperrreactividad de las vías respiratorias ex vivo. El PCLS se describe aquí porque proporciona una lectura funcional conveniente del sistema pulmonar, lo cual puede ser técnicamente complicado en modelos animales pequeños (neonatales), y también tiene amplia aplicabilidad a otros modelos no relacionados con el CPAP. Mostramos datos que demuestran que el CPAP provoca hiperreactividad en las vías respiratorias, lo que puede tener importantes implicaciones clínicas para la elección de la modalidad de soporte respiratorio en la atención intensiva de bebés prematuros.

Introducción

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Las preocupaciones respiratorias, como la apnea y la dificultad respiratoria, requieren para muchos bebés prematuros modos de soporte respiratorio que salvan vidas, lo que, lamentablemente, contribuye a la morbilidad infantil y a estancias hospitalarias prolongadas. El soporte respiratorio suplementario enO2 y presión positiva, incluyendo la ventilación mecánica (MV) y el CPAP menos invasivo, son modalidades comunes de soporte respiratorio. Sin embargo, el principal problema a corto y largo plazo para los supervivientes del periodo crítico de la prematuridad sigue siendo la enfermedad crónica de las víasrespiratorias 1,2,3,4, manifestada como sibilancias/asma de por vida, mala función pulmonar y disminución de la capacidad de ejercicio. Aunque los efectos dañinos delO2 suplementario y la MV han estado ampliamente implicados en la patogenia de la displasia broncopulmonar (TLP) y las morbilidades respiratorias a largo plazodurante décadas 5,6,7,8, algunas evidencias sugieren que formas no invasivas de soporte respiratorio, como el CPAP, también podrían tener efectos no deseados en el pulmónen desarrollo 6,9,10,11,12. Sin embargo, se sabe muy poco sobre los efectos adversos del CPAP, principalmente debido a los desafíos técnicos asociados a su administración no invasiva en animales neonatales.

Dado el aumento general de la tasa de asmapediátrica 13 y el incremento de las tasas de supervivencia de los bebés prematuros más allá de la estancia en la UCIN, comprender los mecanismos que inician cambios estructurales y funcionales adversos en las vías respiratorias traqueobronquiales inmaduras y cómo contribuyen a trastornos pulmonares de por vida independientemente de la vitaminaO2 suplementaria es una necesidad clínica y de investigación importante no cubierta. La evidencia emergente sugiere que el CPAP neonatal puede tener efectos adversos a largo plazo sobre la función de las vías respiratorias y contribuir a trastornos de sibilancia, lo cual es significativo dado que el CPAP se ha convertido en la modalidad preferida de soporte respiratorio en los esfuerzos por evitar la toxicidad porO2 por el suplementoO2. Los desafíos técnicos asociados a la administración de CPAP a animales neonatales pequeños y adecuados para su edad han obstaculizado el progreso en nuestra comprensión de los efectos del CPAP (ya sean beneficiosos o perjudiciales) en el desarrollo pulmonar. Resolvimos este problema desarrollando el primer modelo neonatal de CPAP 10,11,12,14,15 administrado diariamente (con niveles variables de CPAP durante 3 horas al día) a ratones despiertos y sin anestesia desde el nacimiento, permitiendo así el estudio de niveles clínicamente relevantes de CPAP en una etapa de desarrollo pulmonar comparable a los bebés muy prematuros (~24-28 semanas de feto) que probablemente recibiránCPAP 16. 17. Hemos realizado resonancias magnéticas en el modelo neonatal murino y hemos confirmado que la CPAP provoca una inflación pulmonar11 y que la CPAP durante la primera semana posnatal provoca un aumento a largo plazo (3 semanas de edad) en la reactividad de las vías respiratorias (es decir, 2 semanas después de la CPAP)10,11,12,14, lo que coincide con la sibilancia en niños pequeños (3-4 años). Aquí ofrecemos una demostración detallada de nuestro sistema CPAP diseñado a medida para ratones recién nacidos y describimos un método conveniente para evaluar la contractilidad de las vías respiratorias utilizando el método de corte pulmonar de precisión ex vivo (PCLS).

El PCLS ofrece una excelente y conveniente oportunidad para investigar los mecanismos de hiperrreactividad de las vías respiratorias y sus respectivas vías. Utilizando el método PCLS, se fotografían en tiempo real las vías aéreas individuales para medir el estrechamiento de las vías respiratorias en respuesta a un broncoconstrictor como la metacolina tras pretratar las vías respiratorias con inhibidores específicos de receptores/canales. Estos estudios son importantes para comprender las consecuencias fisiopatológicas de la CPAP en la prematuridad, proporcionando intervenciones dirigidas y accionables que permitan optimizar la atención clínica necesaria mientras mitigan las posibles consecuencias de por vida.

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Protocolo

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Se realizan experimentos en ratones que están preñados durante el tiempo, que se monitorizan diariamente para determinar el día de nacimiento. Los ratones son tratados con o sin CPAP en un 21% deO2 durante la primera semana de vida postnatal. Normalmente, los pulmones se extraen en preparación para la medición de la reactividad de la AW utilizando el método de corte pulmonar de precisión (PCLS) 2 semanas después de la CPAP, aunque dichas mediciones son posibles desde los días P8 (inmediatamente después de la CPAP) o hasta la edad adulta. Todos los procedimientos se llevaron a cabo conforme a las directrices del Instituto Nacional de Salud (NIH) para el cuidado y uso de animales de laboratorio y fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad Case Western Reserve.

1. Montaje de la mascarilla CPAP

  1. Construye una máscara individual a partir del extremo cortado de una jeringuilla de 5 mL que contiene la sección de bloqueo de Luer para la conexión de los tubos que permitan la entrega de flujo de aire y presión positiva a las vías respiratorias del ratón (Figura 1A).
  2. Pretaladra el componente de jeringuilla de la máscara para acomodar un Luer-Lock roscado conectado a un codo, un adaptador Luer a manguera y un tubo estándar de acuario (3/8" de diámetro).
  3. Utiliza el tubo lateral para permitir que el flujo de aire corriente pase a través de una fuga ajustable aguas abajo para ajustar la contrapresión en los pulmones del ratón y un manómetro personalizado para monitorizar el nivel del CPAP en tiempo real.

2. Diseño del cuello

  1. Construye el cuello con secciones cortadas en las yemas de los dedos de guantes de laboratorio estándar de tamaño pequeño. Úsalo para conectar el ratón a la unidad de máscara.
  2. Utiliza un perforador (1/4 de pulgada) para crear un agujero en el ápice de la punta del dedo cortado, que forma una abertura de tamaño uniforme y consistente para acomodar la cara y la cabeza del ratón.
    NOTA: El perforador asegura un tamaño de máscara consistente, pero se necesitan perforadores más grandes alrededor de P4 para acomodar el crecimiento del ratón.

3. Construcción del manómetro

  1. Construye un manómetro con dos pipetas serológicas desechables conectadas mediante tubos curvos de acuario (Figura 1A). Asegúrate de que el manómetro esté medio lleno con agua que contenga una gota de colorante para ayudar a visualizar el nivel del CPAP.
  2. Conecta el manómetro en serie con, y aguas abajo, de un controlador de flujo (caudal ~600-700 mL/min) y la máscara.

4. Ajustar el collar y la máscara al ratón

  1. Para colocar el collar en el ratón (de 1 día), primero colócalo sobre el extremo abierto de la máscara, que, mediante maniobras cuidadosas, debe estirarse para que pueda acomodar la cara y la cabeza del ratón.
  2. Introduce la cara del ratón por la abertura del collar, que está suavemente relajada desde su posición estirada sobre la cara o la cabeza. A los ~4 días de edad, corta pequeñas aberturas en la abertura del collar para acomodar el crecimiento y la cabeza más grande del ratón, aunque también se recomienda un punzón entero de mayor tamaño.

5. Administrar CPAP a varios ratones simultáneamente

  1. Crear un sistema capaz de administrar CPAP a varios ratones neonatales (hasta 10) utilizando una serie de controladores de flujo y manómetros (Figura 1B). Proporciona el flujo de aire aguas arriba mediante un depósito de aire normal con un regulador estándar y hazlo pasar por un controlador de flujo que proporciona el flujo total a todos los dispositivos CPAP y unidades de máscara/collar.
  2. Haz burbujear el aire en un depósito de agua para la humidificación antes de pasarlo directamente a las unidades CPAP y administra el CPAP a cada animal de forma independiente.
    NOTA: Un ratón de control recibe una máscara, el mismo flujo de aire, pero sin contrapresión ni CPAP.
  3. Realiza todos los experimentos en una almohadilla térmica con agua recirculada a ~38 °C para mantener una temperatura corporal estable.

6. Cronología

  1. Monitoriza a diario a los ratones embarazados para determinar la fecha de nacimiento y luego realiza la sesión inicial de CPAP al día siguiente (P1 días de edad) durante 2 horas (Figura 2) para minimizar el tiempo que las crías están lejos de una madre lactante.
  2. Para los días siguientes (P2-P7), realiza cada sesión de CPAP durante una duración de 3 horas. Realizar la CPAP durante más de 7 días, si es necesario, y a cualquier nivel dado de CPAP, aunque se utiliza habitualmente 7 días de CPAP a 6 cmH2O.
  3. Luego, evaluar los efectos del CPAP en la reactividad de las vías respiratorias, ya sea inmediatamente después (P8) del final del CPAP (P7) o efectos a largo plazo (por ejemplo, P21 o adultez) utilizando la preparación precisa del corte pulmonar (sección 8).

7. Extracción de tejido y contractilidad de las vías respiratorias

  1. Extraer pulmones para técnicas moleculares o fisiológicas (por ejemplo, reacción en cadena de la polimerasa (PCR), western blots, inmunohistoquímica, RNASeq, proteómica, metabolómica, etc.).
    NOTA: El enfoque principal está en los efectos del CPAP sobre la contractilidad de las vías respiratorias, que pueden evaluarse in vivo (anestesiado y ventilado mecánicamente, P21 días o más) para la mecánica del sistema respiratorio o ex vivo usando el PCLS (P8 días o más). Este último tiene grandes ventajas para investigar compuestos o agentes que atacan vías específicas que pueden no ser adecuadas para su uso en estudios in vivo .

8. Extracción/preparación de pulmón completo para el método de corte pulmonar de precisión (PCLS)

  1. Eutanasiar al ratón mediante sobredosis anestésica (inyección intraperitoneal de una mezcla de ketamina y xilazina; 100 mg/kg/10 mg/kg, respectivamente) para preparar los pulmones para mediciones ex vivo de la reactividad de las vías respiratorias a metacolina aplicada en baños.
  2. Coloca el ratón en posición supina para la canulación de la tráquea usando una jeringuilla rellena de agarosa. Inserta la cánula a través de una pequeña incisión ventral en el cuello y avanza ~3 mm antes de asegurarla con sutura.
  3. Inyecta suavemente agarosa licuada (40 °C) para inflar los pulmones (0,4 mL para ratones P8; 0,8 mL para ratones P21) y coloca el ratón en la nevera durante 30 minutos para que la agarosa se enfríe y se gelifique.

9. Cesións pulmonares para el método PCLS

  1. Una vez que la agarosa se haya enfriado, incrusta un lóbulo pulmonar (que elijas) en agarosa al 2%, colócalo sobre un vibratomo, corta en secciones de 300 μm y sumerge en la solución DMEM + Pen/Strep para incubación nocturna (5% CO2, 37°C).
  2. Al día siguiente, enjuaga las láminas de pulmón con HBSS y colócalas en una cámara de grabación para obtener imágenes en directo de las respuestas de las vías respiratorias al desafío de la metacolina.
    NOTA: Los resultados presentados representan solo tratamiento ingenuo (control, es decir, sin CPAP) y solo CPAP, y no se utilizan agonistas ni antagonistas/inhibidores.
    1. Realiza imágenes de las vías respiratorias.
      1. Coloca las rodajas pulmonares en una cámara de perfusión hecha a medida y cúbrelas con una lámina fina y ligera de malla y una funda, que se sujetan con grasa de silicona.
      2. Luego, monta la cámara de grabación que contiene la sección en un microscopio y perfunde (7 mL/min) de forma continua con HBSS a temperatura ambiente usando una bomba de perfusión.
      3. Utiliza un microscopio montado con una cámara para identificar las vías respiratorias individuales. Tras un periodo inicial de 3 minutos de registro basal, perfundir la cámara con concentraciones crecientes de metacolina (2 minutos en cada concentración) y registrar continuamente cambios en el área de lumen de las vías respiratorias.
    2. Cuantifica el tamaño de las vías respiratorias.
      1. Identificar una única imagen (software ImageJ) de una vía aérea para una concentración dada de metacolina (y línea base) y cuantificar el área de lumen seleccionando el umbral de ajuste para asegurar que el área de lúmen esté completamente capturada (Figura 3A).
      2. Luego, aplica estos ajustes a imágenes posteriores de la misma vía aérea en diferentes concentraciones (es decir, se usa el mismo umbral para una vía aérea dada).
      3. Luego, selecciona el área de lúmenes para medir usando la herramienta de trazado de varita (Figura 3B) y pulsa Ctrl + M (Figura 3C) para cuantificar automáticamente el área de lúmenes en píxeles. Repite esto para cada concentración de metacolina; los datos están disponibles numéricamente para su representación gráfica con la reactividad de las vías respiratorias expresada como una fracción del tamaño basal del lúmen (Figura 3).
    3. Tamaño de la muestra
      1. Elige las vías respiratorias al azar y realiza la respuesta a la metacolina en una sola zona de respiración orbital, aunque normalmente se pueden evaluar varias secciones por animal. Así, los grupos de tratamiento pueden estar formados por múltiples vías respiratorias/animales de varias camadas.
      2. Categorizar las vías respiratorias en grandes (>0,05 mm2) o pequeñas (<0,05 mm2), ya que se ha determinado previamente que el CPAP afecta a las vías respiratorias de diferentes tamaños.

10. Administración de medicamentos

  1. Analizar utilizando secciones expuestas (o incubadas con) siRNA que se dirigan a vías específicas durante 48 horas tras ser extirpadas y seccionadas.
    NOTA: Los agonistas y antagonistas específicos para varios receptores también pueden aplicarse de forma aguda en las secciones pulmonares, lo cual es una ventaja si estos compuestos no son apropiados o seguros para la administración in vivo .
  2. Alternativamente, los pulmones pueden fijarse con inflación (formalina) a presiones de inflación estandarizadas (25 cmH2O), preservarse y prepararse para inmunohistoquímica y tinción para análisis posteriores mediante microscopía confocal.

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Resultados

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Análisis por resonancia magnética del volumen pulmonar durante el CPAP neonatal
Se utilizó el análisis de resonancia magnética para visualizar cambios en el volumen pulmonar en ratones de 3 días, sin anestesia y que respiraban espontáneamente (n = 4 ratones). El volumen pulmonar aumentó con el aumento de las presiones de inflación (es decir, CPAP) hasta 9cmH 2O (Figura 4A). También se muestran imágenes representativas de un rat...

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Discusión

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El CPAP es una modalidad necesaria de soporte respiratorio para bebés prematuros con dificultades respiratorias. El CPAP se superpone a la respiración espontánea y sirve para mejorar la oxigenación sistémica manteniendo elevado el volumen pulmonar y previene el colapso alveolar y la atelectasia. Por tanto, la CPAP tiene importantes beneficios que salvan vidas, y se ha demostrado que mejora el desarrollo alveolar, aunque los beneficios pueden depender de la gravedad y duración de la

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Divulgaciones

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Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los estudios fueron financiados por subvenciones del Instituto Nacional de Salud R01 HL177837 y R01 HL056470.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Jeringuilla de 5 mLFisher Scientific149556458
Jeringuilla de 1 mLFisher Scientific309659Inyectar agarosa a través de la cánula
Perforadora de 1/4"McMaster Carr3427A57
Moldes de incrustación de 22 x 22 x 20Fisher Scientific22-19
Agujas de 23 gFisher Scientific305193Para unir la cánula a la jeringuilla, se requerirían otros tamaños para edades distintas a P21 y nbsp;
2 mL de pipetas serológicasFisher Scientific13-678-12CPara fabricar un moanómetro
Válvulas de fuga ajustablesCualquier tienda de mascotashttps://www.petco.com/shop/
en/petcostore/producto/imagi
válvula de control de tario-aire-
Tubos de acuarioCualquier tienda de mascotashttps://www.petsmart.com/fish/
filtros-y-pumps/aire-y-water
-bombas/top-fin-aquarium-airline
-tubing-5291863.html
CámaraAmscopeMU300
Tubo de cánulaFisher Scientific427411Para ratones P21. Se necesitarán otros tamaños para otras edades. El tubo debe encajar perfectamente en la tráquea
CubiertasFisher Scientific12-541-01418 mm x 18 mm
DMEM:F12Invitrogen11039-021
Controladores de flujoInstrumentos claveGS10510AVBPara el flujo de aire a ratones individuales
CaudalímetroAvantorMFLX68560-04Para el flujo de aire a todo el sistema
Bomba T GaymarBraintree ScientificTP-700Para mantener la temperatura corporal durante el CPAP
Solución salina balanceada de HanksFisher ScientificMT-20023cvDiluir a 1x para usarlo
ImageJNIHdescarga gratuitahttps://imagej.net/ij/download.html
Guantes de látex tamaño pequeñoFisher ScientificMF-300-SPara fabricar mascarillas CPAP
Punto de encuentro bajo agarosaInvitrogen165200-100
MallaAmazonhttps://www.amazon.com/Top-
Recorte-Poliéster-Crina de caballo
-vender/dp/B01AC93LJ0/ref=sr
_1_fkmr2_1?palabras clave=dritz%2
Bpoliéster%2Bbr
ayuda& qid=1562072725& s=gatew
ay& sr=8-1-fkmr2&; th=1
MetacolinaMilliporeA2251
MicroscopioLeicaDMLFS
Pen/estreptococoInvitrogen15140-148
Bomba de perfusiónAparato de Harvard70-2027
Cámara de grabaciónInstrumentos WarnerRC-27O algo similar
Almohadilla eléctrica reutilizableBraintree ScientificTP-RPara usar con bomba T Gaymar
Grasa de silicona (Molykote111)Amazonhttps://www.amazon.com/Molykote
-Componentes Lubricantes-Resistentes-
Volatilidad/dp/B0DYDFLXGZ/ref=sr_1
_1_sspa?crid=2D4LQC7SRX07P&;
dib=eyJ2IjoiMSJ9.HcWWXlt8ThxcB
eGCZ6iH5jwumyClyFGkW141klcjnn
OH3hc60r0hy53Ji-9HDW0TtH33nJ-
7UmalEzJGg59qB2gzsGNzFMelw
Placas estériles de 6 pozosFisher Scientific3516Para cultivar cortes
Hilo de sutura 3-0Fisher Scientificsp117Unir la cánula a la tráquea
Conexiones de tuberíaAparato de Harvard72-1406
Vibratome (pelco eaislicer)Ted Pella11000O equivalente

Referencias

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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