Reducción de escala para un gran impacto: producción optimizada de virus adenoasociados recombinantes de alto rendimiento

Resumen

A pesar de ser ampliamente utilizados en la administración de genes, los vectores virales adenoasociados recombinantes (rAAV) enfrentan notables desafíos de producción. Este protocolo describe los métodos de producción a microescala y miniescala utilizando células adherentes y en suspensión. Los métodos agilizan la generación, purificación y optimización de vectores, acelerando así la investigación preclínica y facilitando el progreso dentro de la línea de terapia génica.

Resumen

En los últimos años, los vectores virales adenoasociados recombinantes (rAAV) se han convertido en una plataforma líder para las aplicaciones de la terapia génica. Sin embargo, los engorrosos procesos de producción y purificación siguen siendo importantes cuellos de botella en el desarrollo de fármacos. La producción de rAAV de alto rendimiento y a pequeña escala sin procedimientos de purificación que requieren mucho trabajo y tiempo ofrece una valiosa estrategia alternativa para acelerar la investigación preclínica y el cribado terapéutico en etapa temprana. Este enfoque permite la generación rápida de diversas variantes de rAAV o construcciones terapéuticas con calidad suficiente para la evaluación inicial in vitro e in vivo . Este protocolo introduce dos métodos que se distinguen por tipo de célula y escala de producción: producción de rAAV a microescala y a miniescala. La producción a microescala se lleva a cabo en un formato de 6 pocillos utilizando células 293T de riñón embrionario humano adherentes (HEK) (micro-6 pocillos), mientras que la producción a miniescala utiliza células en suspensión en placas de 24 pocillos (mini-HT24). Los vectores generados a través de estos métodos se someten a análisis posteriores para optimizar las condiciones de cultivo celular y/o se utilizan para evaluar la actividad biológica de los transgenes. Las lecturas analíticas clave incluyen la titulación del genoma del vector (vg/mL), la determinación del título de la cápside (vp/mL), el análisis de Western blot y los ensayos de transducción celular. Además, los vectores producidos a miniescala y semipurificados con resinas de afinidad se comparan con las preparaciones a mediana escala purificadas mediante gradientes de densidad de cloruro de cesio. Los métodos simplificados descritos aquí demuestran un potencial significativo para refinar los parámetros de cultivo celular, identificar candidatos principales durante las pruebas de detección (es decir, casetes transgénicos optimizados o cápsidas AAV superiores) y mejorar la expresión transgénica. En conjunto, los flujos de trabajo presentados respaldan el establecimiento de una plataforma sólida y eficiente para el desarrollo iterativo en la línea de terapia génica que se puede implementar fácilmente en cualquier laboratorio de investigación.

Introducción

El desarrollo de fármacos es un proceso complejo y que requiere muchos recursos y requiere la integración de datos de alta calidad de varias etapas, incluida la identificación de objetivos, la validación preclínica y los ensayos clínicos¹. En respuesta a las crecientes demandas de plazos más rápidos y costos reducidos², la industria farmacéutica ha adoptado cada vez más ensayos a pequeña escala de alto rendimiento (HT) en combinación con inteligencia artificial (IA) avanzada como piedra angular de las estrategias de desarrollo modernas ^3,4,5. Los ensayos de HT permiten el cribado y la evaluación rápidos de un gran número de candidatos a fármacos o variables de ensayo en una fracción del tiempo y el coste en comparación con los métodos tradicionales ^5,6.

En las aplicaciones de terapia génica, particularmente aquellas que utilizan vectores virales adenoasociados (AAV), el alto costo de los bienes y los largos plazos de fabricación plantean desafíos significativos⁷. El proceso de desarrollo comienza con la producción del material plásmido necesario para la transfección, seguido del crecimiento celular a altas densidades suficientes para la producción de vectores virales. Después de la transfección, se necesita un período de incubación de dos a cinco días antes de la cosecha, y el proceso concluye con la purificación y caracterización del lote ^8,9. En conjunto, este flujo de trabajo puede tardar hasta un mes y, por lo general, se limita a un número limitado de preparaciones que pueden ejecutarse en paralelo cuando se utilizan columnas de afinidad o ultracentrifugación en gradiente 9,10,11,12.

Reconociendo la necesidad de protocolos de producción de AAV a pequeña, mini o microescala, el campo ha adaptado varios enfoques para producir AAV recombinante (rAAV) en pequeñas configuraciones a escala de laboratorio. Estos enfoques generalmente implican el uso de múltiples placas de 15 cm para células adherentes^13,14 o 50-2000 ml¹⁵ matraces de agitación para cultivos en suspensión. En el pasado, se empleaban métodos de purificación de AAV, como la ultracentrifugación en gradiente (por ejemplo, yodixanol¹⁶, cloruro de cesio (CsCl)¹⁷ o gradientes de sacarosa¹⁸). Este método económico e independiente del serotipo era muy adecuado para producir rAAV a escala de laboratorio, pero su naturaleza intensiva en mano de obra y su limitada capacidad de ultracentrífuga lo hacen menos propicio para aplicaciones de alto rendimiento^19,20.

La demanda continua de un mayor rendimiento llevó a la exploración de enfoques alternativos para reducir la producción de rAAV. Utilizando células adherentes, se han investigado formatos como 6 pocillos ^13,21,22, 96 pocillos²³ e incluso placas de 384 pocillos²⁴. Más recientemente, se han adoptado células en suspensión, dada su escalabilidad mejorada y la potencia comparable, o incluso superior, de las preparaciones vectoriales⁸.

Sin embargo, la producción de alto rendimiento de rAAV en células en suspensión con volúmenes de cultivo inferiores a 15 ml sigue siendo un área especializada, con protocolos publicados limitados ^7,25,26. La mayoría de los estudios se centran en volúmenes más grandes para lograr rendimientos suficientes para aplicaciones posteriores ^8,9,27, pero al igual que con las células adherentes, los formatos a miniescala ofrecen reducciones significativas en el consumo de recursos y el tiempo de procesamiento, satisfaciendo así una necesidad crítica en el campo. Es importante destacar que los protocolos a pequeña y microescala a menudo utilizan "lisados crudos", o cosechas de cultivos celulares no purificados que contienen partículas vectoriales, para la caracterización y los análisis posteriores.

Este estudio describe dos protocolos que utilizan células adherentes y productoras de suspensión (Figura 1). Los lisados crudos de rAAV producidos a partir de células HEK293T adherentes se utilizan directamente para aplicaciones posteriores, como la transducción de células diana. Por el contrario, los rAAV generados en celdas de suspensión se someten a un procesamiento adicional mediante purificación de resina de afinidad de alto rendimiento. Estos métodos se desarrollaron específicamente para mejorar el rendimiento, evaluar la calidad del vector y monitorear la expresión de transgenes, todo mientras se minimiza el consumo de reactivos y materiales costosos. Los resultados presentados aquí muestran que tanto los lisados crudos (de células adherentes) como el material purificado por afinidad (de células en suspensión) son adecuados, dependiendo del alcance de la aplicación. Además, el rAAV obtenido utilizando resinas de afinidad se comparó directamente con sus homólogos purificados mediante ultracentrifugación tradicional de cloruro de cesio en términos de rendimiento, pureza y eficiencia de transducción en cocultivos neuronales de origen humano.

La adopción de ensayos de alto rendimiento y a pequeña escala en el desarrollo de fármacos de terapia génica representa un avance indispensable, que acelera la innovación y cierra la brecha entre el descubrimiento científico y la realidad terapéutica. Estos métodos no solo reducen los costos y los plazos, sino que también permiten realizar pruebas paralelas de numerosas afecciones, lo que en última instancia contribuye al desarrollo eficiente de terapias transformadoras.

Protocolo

1. Producción de micro-6 pocillos de vectores rAAV en células adherentes

NOTA: La producción de micro-6 pocillos de rAAV es una versión adaptada de un protocolo publicado previamente por Fakhiri et ^al.21.

1. Siembra y transfección de células HEK293T
   1. Descongelar un vial de HEK293T células²⁸ en un baño de agua a 37 °C.
   2. Transfiera las células a 30 ml de medios de cultivo celular adherente en matraces T175 y manténgalas en el medio Eagle modificado (DMEM) de Dulbecco + 10% de suero fetal de ternero (FCS), a 37 °C y 5% de CO₂.
   3. Dividir HEK293T cada 2-3 días: Aspirar el medio de cultivo celular y añadir cuidadosamente 10 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS) para lavar las células.
      NOTA: En este protocolo solo se utilizaron pasajes celulares por debajo del número de pasaje 15 para garantizar la integridad y la salud de las células, lo que afecta directamente la producción de rAAV.
   4. Añadir 2 ml de tripsina al 0,025% / ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) a las células e incubar durante 2 min a 37 °C (o hasta que las células se desprendan).
   5. Detenga la reacción añadiendo 20 ml de medio fresco y suspendiendo las células en el medio con una pipeta de 25 ml. Dependiendo de la confluencia, las células se pueden diluir 1:10 o 1:20 en 24 ml de medio de glucosa alto en DMEM. Para obtener una densidad celular suficiente para la transfección, siembre 7 × 10⁶ células HEK293T en un matraz T175.
   6. Después de 72 h a 37 °C, recolectar las células por tripsinización (como se describe en los pasos 1.1.3-1.1.5), volver a suspender en 20 ml de medio y contar las células.
      NOTA: Las celdas se pueden contar utilizando varios métodos, según la precisión deseada, el rendimiento y el equipo disponible. Principalmente, se utilizan dos enfoques: recuento manual (cámara de Neubauer) y contadores de células automatizados. Este protocolo emplea un analizador de células totalmente automatizado y basado en imágenes para medir parámetros críticos de la celda, como la viabilidad, la densidad celular y la tasa de agregación.
   7. Células semilla a una densidad de 0,5 × 10⁶ células/pocillo en una placa de 6 pocillos. Para distribuir las células de manera uniforme, agite suavemente la placa y colóquela en la incubadora de_CO2 .
   8. Después de 24 h, las células alcanzan una confluencia del 60-70% y pueden transfectarse tres veces.
   9. Para cada pocillo, mezcle 90 μL de medio sin suero con un total de 2,6 μg de ADN plasmídico, incluidos pTransgene, pRep/Cap y pHelper en una proporción molar de 1:1:1.
   10. En un segundo tubo, agregue 5 μL de polietilenimina (PEI) a 90 μL de medio sin suero justo antes de la transfección.
   11. Después de combinar las dos soluciones, agite la mezcla en vórtice e incube a temperatura ambiente (RT) durante 10 min.
   12. Agregue la mezcla de transfección gota a gota a cada pocillo. Agite suavemente las placas antes de volver a colocarlas en la incubadora.
       NOTA: Se puede realizar un cambio de medio después de la transfección, pero no se aplicó como práctica estándar, ya que las células mantuvieron una buena viabilidad durante todo el experimento.
2. Recolección y lisis de células
   1. 72 h después de la transfección, aspire cuidadosamente el medio celular de la(s) placa(s).
   2. Separe las celdas agregando 500 μL de PBS en cada pocillo y pipetee con cuidado hacia arriba y hacia abajo.
   3. Transfiera la suspensión celular a tubos de microcentrífuga de 1,5 ml.
   4. Mida la viabilidad y densidad celular de forma manual o automática siguiendo las instrucciones del fabricante.
   5. Transfiera 50 μL de la suspensión a una placa inferior en U de 96 para determinar la eficiencia de la transfección mediante la cuantificación de poblaciones indicadoras positivas mediante citometría de flujo.
      NOTA: Siempre se recomienda realizar un control de transfección en paralelo, es decir, una transfección de 1-2 pocillos con un transgén portador de una proteína fluorescente (por ejemplo, proteína verde fluorescente (GFP), mCherry, etc.) para controlar la eficiencia de la transfección en la placa. Los pocillos con células no transducidas sirven como control negativo.
   6. Centrifugar la suspensión celular restante a 800 × g durante 10 min a RT para alimentar las células de pellets, que contienen la parte principal de los vectores producidos.
   7. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender las células en 100 μL de PBS. La suspensión celular se puede almacenar a -80 °C.
      NOTA: Para obtener un lisado crudo de las células recolectadas, use uno de los dos enfoques que se describen a continuación.
   8. En el primer enfoque, las células se pueden someter a cinco ciclos de congelación y descongelación, cada uno de 5 minutos, utilizando un baño de agua precalentado a 37 °C y nitrógeno líquido. Agite brevemente las muestras entre los ciclos durante 2-3 s.
   9. La segunda opción, y la más utilizada en este protocolo, es la sonicación. Aquí, transfiera la suspensión celular a placas o tubos de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) de paredes delgadas y colóquelos a 4 ° C en un sonicador al baño de agua.
      1. Sonicar muestras durante un total de 3 min con incrementos de encendido y apagado de 30 s al 25% de amplitud (intensidad).
   10. Después de la sonicación, granular las células con una centrífuga de mesa (16.100 × g durante 10 min a 4 °C) para eliminar los restos celulares y obtener una suspensión vectorial libre de células.
   11. Transfiera los sobrenadantes a tubos de 1,5 ml y pipetee 10 μl de cada muestra en una placa de 96 pocillos de baja unión para el análisis digital de (dd)PCR en gotas o (d)PCR digital.
   12. Almacene los tubos y las placas de 96 pocillos a -80 °C hasta su uso posterior.
3. Transducción de células HEK293A utilizando lisados crudos
   NOTA: Es posible que HEK293A células no sean adecuadas para todos los serotipos de AAV. Para identificar una línea celular apropiada, consulte bases de datos como SPIRIT²⁹ (consulte la Tabla de materiales para obtener un enlace a la base de datos SPIRIT) o artículos de investigación originales relevantes^30,31.
   1. Semillas HEK293A células en tres placas de 96 pocillos un día antes de la transducción a densidades de 1,5 × 10^{6 células} por placa.
   2. Al día siguiente, mezcle 10 μL de los vectores producidos con diferentes volúmenes de PBS para generar diluciones 1:2, 1:10 y 1:100.
   3. Con una pipeta multicanal, transduzca las células en placas de 96 pocillos por triplicado técnico.
   4. Incubar células con los rAAV sin intercambio de medio durante 72 h. Después de eso, realice los experimentos posteriores según el transgén expresado, como mediciones de nivel de proteínas, análisis de citometría de flujo para la expresión de proteínas fluorescentes, análisis de derribo / eliminación, etc.
   5. Para la citometría de flujo estándar como la realizada en este protocolo, aspire el medio y separe las células agregando 25 μL de tripsina / EDTA al 0,025%.
   6. Incubar a 37 °C durante 3 min.
   7. Detenga la reacción agregando 175 μL de albúmina sérica bovina (BSA) al 1% en PBS en cada pocillo.
   8. Utilice 100 μL de la suspensión celular para el análisis de citometría de flujo.

2. Producción Mini-HT24 de vectores rAAV en celdas en suspensión

NOTA: En la configuración mini-HT24, a diferencia de la producción de micro-6 pocillos descrita anteriormente, las preparaciones purificadas de vectores rAAV se generan utilizando celdas de suspensión. Los cultivos en suspensión producen mayores cantidades de rAAV debido al aumento de las densidades celulares que se pueden lograr dentro del mismo volumen de cultivo. En este protocolo, se empleó un formato de pocillos de 24 profundidades. Los lisados de células crudas se purifican en resinas de afinidad AAVX de alto rendimiento con el objetivo de generar productos más limpios necesarios para ciertas aplicaciones en las que los lisados crudos no son adecuados (consulte la sección de discusión).

1. Cultivo y triple transfección de células en suspensión en placas de 24 pocillos de profundidad
   1. Descongelar un vial de células de producción viral (VPC) en suspensión en un baño de agua a 37 °C. Celdas de paso menos de 30 veces para garantizar la calidad constante de los vectores producidos.
   2. Transfiera las células a 30 ml de medios de cultivo en suspensión en un matraz de agitación y cultívelas durante 2-3 días en condiciones de cultivo de mantenimiento: 37 °C, 8% de CO₂, 95% de humedad y 140 rpm (radio de la plataforma de agitación 25 mm).
   3. Determinar la densidad celular viable después de 2-3 días (ver NOTA en el paso 1.1.6). Continúe con el subcultivo y la expansión hasta que se alcance el número deseado de células viables requeridas para la producción de AAV.
      NOTA: Subcultivo de células a una densidad viable de > 4 × 10⁶ células/ml y < 6 × 10⁶ células/ml o de acuerdo con las instrucciones del fabricante según la línea celular individual utilizada. Sembrar a una densidad viable de 6 × 10⁵ células/mL durante 3 días, dividir o 3 × 10⁵ células/mL durante 4 días. Dividir según las instrucciones del fabricante.
   4. Siembre 3 × 10⁶ células/ml en 2,5 ml de cada pocillo de la placa de 24 pocillos de profundidad y cubra la placa con una tapa de membrana estéril.
   5. Prepare la mezcla de triple transfección para cada construcción de rAAV de la siguiente manera:
      1. Prepare la mezcla de ADN de los plásmidos de producción (pHelper, pRep / Capside, pTransgene) en una proporción molar de 1: 1: 1 a una masa final de 600 ng de ADN por 1 ×^{10 6} células viables.
      2. Preparar la mezcla en medio de cultivo en suspensión a un volumen final del 2,5% del volumen de cultivo a transfectar.
      3. Preparar el PEI-Mix en medio de cultivo en suspensión a un volumen final del 2,5% del volumen de cultivo a transfectar. Use una masa final de 1 ng de PEI por 1 ng de ADN.
      4. Combine DNA-Mix y PEI-Mix transfiriendo todo el volumen de la PEI-Mix individual a la DNA-Mix correspondiente, lo que da como resultado un volumen de mezcla de transfección del 5% del volumen de cultivo.
      5. Mezclar pipeteando hacia arriba y hacia abajo 10 veces.
         NOTA: No agite la mezcla de transfección después del tiempo de incubación para evitar la interrupción de los complejos PEI-ADN que se han formado durante la incubación³².
      6. Incubar a temperatura ambiente durante 10 min.
   6. Agregue las mezclas de transfección gota a gota a los pocillos correspondientes mientras agita la placa de pocillos profundos con cuidado.
   7. Selle la placa con una película de rayón transpirable estéril y cúbrala adicionalmente con la tapa de membrana correspondiente para minimizar la evaporación.
   8. Asegúrese de que la placa esté colocada en una bandeja agitadora de pocillos profundos adecuada y fíjela firmemente.
   9. Incubar las células a 37 °C, 8% CO₂, 95% de humedad y 225 rpm durante 72 h.
      NOTA: Los diferentes formatos de placas de pocillos profundos requieren una evaluación individual de la velocidad de agitación para permitir un intercambio eficiente de gases y el cultivo de células en una suspensión homogénea sin que las células se depositen en el fondo con el tiempo. Esto requiere pruebas iniciales que dependen del equipo y la configuración individuales del laboratorio, así como de las líneas celulares utilizadas para la producción. Considere especialmente el radio de agitación, el formato de la placa y la forma del fondo del pozo para mantener la suspensión celular homogénea y evitar que las células se asienten en el fondo.
2. Cosecha y lisis
   1. Coseche las células transfiriendo el volumen completo de cultivo de cada pocillo a tubos de 5 ml etiquetados individualmente y centrifugue a 800 × g durante 20 min a 4 °C.
   2. Aspire el sobrenadante y vuelva a suspender el sedimento en 550 μL de (D)PBS de Dulbecco y transfiera la suspensión a un tubo con tapón de rosca de 1,8-2,0 ml para evitar aerosoles y gotas al abrir los tubos.
      NOTA: Los pellets también se pueden almacenar en este punto para continuar con el proceso de purificación más adelante. Almacene los gránulos resuspendidos de solución salina tamponada con fosfato (DPBS) de Dulbecco a -80 °C y asegúrese de tenerlo en cuenta durante los pasos del ciclo de congelación y descongelación.
   3. Preparar lisados colocando los tubos en nitrógeno líquido durante aproximadamente 2 min y descongelándolos en un baño de agua a 37 °C. Repita este ciclo de 3 a 5 veces.
   4. Centrifugar lisados durante 5 min a 1000 × g a 4 °C. Cubra los cubos de centrífuga con tapas herméticas a los aerosoles.
   5. Retire con cuidado los tubos de la centrífuga.
      NOTA: Los lisados deben ser transparentes y libres de residuos visibles o turbidez para evitar obstruir la resina utilizada en el proceso de purificación. Evite agitar o alterar los gránulos. Repita el paso de centrifugación en caso de que los sobrenadantes no sean transparentes. Considere una velocidad de centrifugación más alta o una mayor duración en caso de muestras altamente concentradas o muestras con grandes cantidades de desechos.
3. Purificación rAAV de alto rendimiento a base de resina Affinity
   1. En un vaso de precipitados, prepare el tampón de elución agregando 720 mg de ácido cítrico a 50 ml de agua ultrapura para alcanzar una concentración final de 75 mM de ácido cítrico.
   2. Revuelva el tampón hasta que el polvo se haya disuelto por completo.
      NOTA: Asegúrese de que el volumen del pocillo sea suficiente para acomodar los volúmenes de tampón y las puntas de pipeta sin derramar ni arriesgar la contaminación cruzada de los pocillos vecinos.
   3. Ajuste el pH a 3,0 añadiendo ácido clorhídrico (HCl) 1 M mientras agita continuamente el tampón y mide con un electrodo de pH.
   4. Ejecute una filtración estéril en el tampón utilizando un tamaño de poro de 0,22 μm.
   5. Prepare columnas de una placa de 96 pocillos profundos con un volumen de pocillos de 2-2,2 ml para la purificación de acuerdo con el esquema descrito en la Tabla 1.
      NOTA: Las muestras aquí se purificaron utilizando una configuración de pipeta electrónica multicanal. El proceso es compatible con los sistemas automatizados de manipulación de líquidos y puede ampliarse para obtener un mayor rendimiento de las muestras.
   6. Ejecute la purificación en un gabinete de bioseguridad en RT utilizando los parámetros que se muestran en el esquema de purificación (consulte la Tabla 1) u optimice los parámetros de acuerdo con los requisitos individuales, según el volumen de resina o muestra, el título esperado, etc.
   7. Después de la elución, agregue 1/4 del volumen de elución del tampón de neutralización a cada muestra.
   8. Mezclar pipeteando el 80% del volumen 10x hacia arriba y hacia abajo.
   9. Prepare las placas de diálisis retirando los casetes de membrana y agregando 1600 μL de tampón de diálisis a cada pocillo.
      NOTA: Asegúrese de no poner las membranas en contacto con líquido antes de realizar la diálisis, ya que volver a secar puede afectar la integridad y la función de la membrana.
   10. Transfiera el volumen completo de la muestra (300 μl como máximo) a un casete de diálisis con un formato de volumen y un tamaño de poro de membrana adecuados (≥ de 20.000 pesos moleculares (MWCO)). Asegúrese de que las membranas estén cargadas homogéneamente y que no haya burbujas de aire.
   11. Coloque los casetes en los pocillos cargados de la placa de diálisis y selle la placa con una lámina de sellado.
   12. Transfiera la placa de diálisis a una plataforma vibratoria e incube a 300 rpm, 4 °C durante 30 min.
   13. Reemplace el tampón de diálisis y repita la incubación a 300 rpm, 4 °C durante 30 min.
   14. Repita el intercambio de tampones y la incubación 3 veces en total.
   15. Transfiera el volumen completo de las muestras dializadas a tubos de almacenamiento marcados y guárdelos a 4 °C si posteriormente se utilizan para la caracterización u otros experimentos.
   16. Almacenar a -80 °C para almacenamiento a largo plazo. Evite los ciclos de congelación y descongelación, ya que esto puede afectar la potencia de los AAV y prepare alícuotas de pequeño volumen si es necesario.
4. Valoración del título genómico de rAAV a partir de lisados crudos y purificación a base de resina mediante PCR digital (dPCR)
   1. Para determinar el título genómico de los lisados crudos, es decir, genomas virales por ml (vg / ml), descongele las muestras de vectores recolectadas a temperatura media y luego pipetee 10 μl en un tubo.
      NOTA: Hay varios métodos disponibles para determinar el título del genoma viral (vg/mL) de una preparación de vector, y la cuantificación absoluta generalmente se basa en dos enfoques principales: el método basado en gotas o emulsiones (ddPCR) y el método basado en microplacas, representado por PCR digital (dPCR)^33,34. Además de estos métodos digitales, también se puede lograr la cuantificación absoluta mediante PCR cuantitativa (qPCR). Si bien la qPCR es tradicionalmente un método de cuantificación relativa, se puede adaptar para la cuantificación absoluta mediante el uso de una curva estándar de plásmidos. Esto implica un plásmido que contiene la secuencia diana a una concentración conocida, que sirve como referencia para extrapolar el título del genoma viral^21,33. Aunque la qPCR es más rápida y menos costosa que la ddPCR o la dPCR, es menos precisa y depende en gran medida de la exactitud del estándar plasmídico¹⁶. Independientemente del método de cuantificación, las muestras deben tratarse previamente para liberar los genomas virales de las partículas. Este protocolo sigue un método previamente descrito por Dobnik, D. et al³⁵.
   2. Trate las muestras de rAAV con una nucleasa a 37 °C durante 30 min para degradar el ADN plasmídico libre del proceso de transfección.
      NOTA: Opcional, dependiendo de la enzima utilizada: calentar muestras a 95 °C durante 15 min para inactivar la enzima y lisar la cápside del vector.
   3. Después de enfriar a temperatura ambiente, agregue proteinasa K durante 15 minutos para digerir los fragmentos de la cápside.
   4. Para la inactivación de la proteinasa K, vuelva a calentar las muestras a 95 °C durante 15 min.
   5. Prepare las mezclas maestras de ddPCR o dPCR siguiendo las instrucciones del fabricante.
   6. Use sondas de ADN marcadas, ya que proporcionan una señal más específica que los tintes intercalados. Diseñar sondas para unirse "centralmente" en el genoma viral, es decir, en el transgén (ver NOTA), en lugar del promotor o la cola de poliA, y seleccionar un fluoróforo como hexacloro-6-carboxifluoresceína (HEX) o 6-carboxifluoresceína (FAM) que sea compatible con el sistema de PCR respectivo.
      NOTA: Recientemente, se ha utilizado ddPCR o dPCR multiplex, que emplean conjuntos de cebadores/sondas dirigidos a diferentes regiones del genoma viral, para mejorar la precisión de la determinación del título^36,37. Este enfoque permite la cuantificación de genomas intactos mediante la aplicación de fórmulas descritas en los estudios referenciados o el uso de soluciones de software integradas.
   7. Realice una dilución en serie de 10 veces de las muestras posprocesadas en ddH₂O utilizando placas de 96 pocillos de baja unión al ADN. Por último, transfiera 5,5 μl (para ddPCR) o 2 μl (para dPCR) de la plantilla (diluciones 10⁴ y 10⁵) a la placa de 96 pocillos de ddPCR, que ya contiene la mezcla maestra ddPCR/dPCR, incluido el cebador/sondas. Ajuste el rango de dilución en función de la eficiencia de producción de construcciones individuales para garantizar que las mediciones se encuentren dentro del rango de detección lineal.
      NOTA: Como la cuantificación de dPCR/ddPCR es un método altamente sensible, se necesitan diluciones de 10⁴ y 10⁵ de las muestras.
   8. Siga los pasos que se describen a continuación para ddPCR.
      1. Para la amplificación por PCR, siga las instrucciones del fabricante para optimizar las condiciones del ensayo, incluidos los ajustes de los tiempos de recocido y amplificación en función de los juegos de cebadores/sondas utilizados. El protocolo de ciclado estándar utilizado en este estudio fue el siguiente: desnaturalización inicial a 9 °C durante 10 min (rampa °C/s); 35 ciclos de desnaturalización a 9 °C durante 30 s y amplificación a 6 °C durante 60 s; seguido de un paso final de elongación a 9 °C durante 10 min (rampa °C/s).
      2. Después de la amplificación por PCR de las dianas del genoma viral rAAV, transfiera la placa al lector de gotas y siga las instrucciones del fabricante para medir la intensidad de fluorescencia en cada pocillo. El lector de gotas permite la cuantificación absoluta del número de copias del genoma viral de la reacción pe μL.
   9. Siga los pasos que se describen a continuación para la dPCR.
      1. Como se describe para la cuantificación basada en ddPCR, siga las instrucciones del fabricante para optimizar las condiciones del ensayo.
      2. Como punto de partida, siga el perfil térmico preestablecido en el dispositivo de dPCR, que incluye un paso de desnaturalización inicial a 9 °C durante 2 min, seguido de 40 ciclos de desnaturalización a 9 °C durante 15 s y recocido/extensión a 5 °C durante 30 s.
         NOTA: Este protocolo se llevó a cabo utilizando las velocidades de rampa recomendadas y los volúmenes de reacción especificados por el fabricante.
   10. Analice los datos de ddPCR y dPCR utilizando varias soluciones de software, generalmente proporcionadas por el fabricante del instrumento (por ejemplo, QX manager y QIAcuity Software Suite 1.2, respectivamente). Para ambos métodos, seleccione solo diluciones de muestra con una proporción adecuada de particiones/gotas positivas y negativas para la cuantificación.
       NOTA: Para la determinación de títulos de partículas rAAV (vp/ml; vp = partículas virales) a partir de lisados crudos y material purificado con resina AAVX, se puede utilizar un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA)., Se encuentran disponibles varios kits ELISA sándwich estándar disponibles comercialmente para la cuantificación de AAV (los kits utilizados en este trabajo se enumeran en la Tabla de materiales). Realice el ensayo de acuerdo con los manuales del fabricante. Asegúrese de que el kit ELISA utilizado sea compatible con el serotipo AAV que se está produciendo.
5. Análisis de la relación VP de rAAV purificados
   NOTA: Para determinar la proporción de proteína de la cápside viral (VP) de cada muestra de los pocillos individuales de la configuración de 24 pocillos profundos, se pueden realizar protocolos estándar de western blot o automatizados basados en capilares.
   1. Para detectar las proteínas de la cápside AAV2 VP1, VP2 y VP3, use un anticuerpo monoclonal primario anti-AAV VP1 / VP2 / VP3. Asegúrese de que el anticuerpo primario funcione con el serotipo o la variante de la cápside respectivos.
   2. Utilice controles positivos adecuados, como VP1, VP2 y VP3 recombinantes o un estándar de referencia AAV.
   3. Prepare el control positivo en una proporción molecular de 1:1:10 (VP1:VP2:VP3) para imitar la relación VP esperada. Esto también sirve como referencia para la cuantificación de la relación VP mediante la integración del área de señal.
   4. Seleccione un kit capilar con un rango adecuado que abarque las proteínas de la cápside que se van a detectar, incluidas las más pequeñas (VP3 con ~ 60 kDa) y las más grandes (VP1 con ~ 82 kDa). Esto puede variar según el serotipo y la variante de cápside utilizada.
   5. Prepare los reactivos y la escalera biotinilada provistos en el kit de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
   6. Preparar una serie de diluciones de las muestras (ya sea basada en el título genómico a partir de 1 × 10¹² vg/ml a 1 ×^{10 10} vg/ml o diluciones 1:2 a partir de la muestra sin diluir a 1:64) en el tampón de dilución suministrado por el kit para garantizar un buen rango de detección para cada muestra.
   7. Diluya el anticuerpo primario en el tampón de dilución de anticuerpos provisto de acuerdo con las instrucciones del fabricante o según las pruebas anteriores. Comience con 1:100.
   8. Utilice un kit de detección correspondiente dependiendo de la fuente del anticuerpo primario.
   9. Cargue la placa de acuerdo con el esquema provisto con el kit.
   10. Asegúrese de llenar las columnas vacías con agua o tampón de dilución de muestras también para no dañar los capilares del instrumento al secarse.
   11. Cubra la placa con una lámina de sellado y centrifugue a 1200 × g, 5 min, a 4 °C.
   12. Transfiera la placa y los capilares al instrumento y utilice condiciones estándar preestablecidas para la ejecución.
   13. Analice la carrera utilizando un software de análisis de datos, como Compass (versión 6.3.0)³⁸.
       NOTA: Para analizar la integridad de las partículas, la monodispersión y la pureza, se recomienda la microscopía electrónica de transmisión de tinción negativa (ns-TEM). El análisis TEM se puede realizar como se describe en Steininger et. al²⁵. Sin embargo, otros métodos, como la fotometría de masas³⁹, SEC-MALS⁴⁰ y la tinción en astilla⁴¹ también pueden proporcionar lecturas complementarias para evaluar la calidad de las preparaciones de rAAV.
6. Transducción con partículas virales purificadas
   NOTA: Para transducir células con vectores virales purificados, se debe determinar una multiplicidad de infección (MOI). El MOI se define como el número de genomas que contienen partículas agregados por célula. Es importante tener en cuenta que este es un valor teórico; el número real de genomas de rAAV administrados por célula depende de la capacidad de la cápside para transducir con éxito las células diana. Por lo tanto, el MOI óptimo siempre debe determinarse experimentalmente. En esta sección, el objetivo fue comparar dos stocks de vectores virales, que se produjeron utilizando diferentes métodos de purificación (ultracentrifugación de cloruro de cesio y resina de afinidad AAVX). Con este fin, se transdujeron cocultivos neuronales derivados de humanos con las dos preparaciones y se evaluó la eficiencia de transducción mediante microscopía de fluorescencia.
   1. Cubra una placa inferior óptica negra de 96 pocillos con PLO al 0,1% (poli-L-ornitina) durante la noche a 4 °C o incube a 37 °C durante ≥ 1 h.
   2. El día de la siembra, aspire el reactivo de recubrimiento de PLO y cúbralo con la matriz de membrana basal de factor de crecimiento reducido e incube a 37 °C durante ≥1 h.
   3. Cultive neuronas motoras con astrocitos en una proporción de 1: 6 o por recomendación del proveedor.
   4. A los 2 días in vitro (DIV), transducir el cocultivo a un MOI de 50.000.
   5. Descongelar las alícuotas virales a 4 °C.
   6. Preparar medios de transducción (vectores virales a MOI deseados basados en genomas virales por célula + medios de cultivo celular en volúmenes apropiados para sustituir el 50% de los medios de cultivo por pocillo).
   7. Realice un intercambio de medios del 50% con medios de transducción.
   8. A las 5 DIV, realice un intercambio completo de medios con medios de cultivo regulares.
   9. Mantenga las células con intercambio regular de medios de cultivo cada 2-3 días o según la recomendación del proveedor.
   10. Monitorice los niveles de expresión con un microscopio de imágenes en vivo equipado con la excitación correcta para el transgén indicador. Para las neuronas derivadas de humanos, la expresión de meseta se observa entre 10 y 14 días después de la transducción (ver Figura 4A).

Paso	Tampón / Material	Volumen del pocillo [μL]	Volumen de trabajo [μL]	Ciclos	Gasto [μL/min]
1. Equilibrio	Equilibrado/ Lavado I Tampón	1100	950	2	500
2. Cargando / Captura	Sobrenadante de muestra	550	500	4
3. Lavar I	Equilibrado/ Lavado I Tampón	1100	950	2
4. Lavado II	Tampón Wash II	1100	950	2
5. Elución	Tampón de elución	70 μL (20 μL Puntas de resina) 250 μL (80 μL Puntas de resina)	60 μL (20 μL Puntas de resina) 240 μL (80 μL Puntas de resina)	4
6. Neutralización	Tampón de neutralización	Agregue 1/4 del volumen de elución directamente a cada muestra Muestra eluida de 70 μL → Añadir 17,5 μL Muestra eluida de 250 μL → Añadir 62,5 μL		-	-

Tabla 1: Disposición de la placa y parámetros de purificación para la purificación con resina de afinidad de rAAV.

Resultados

En los últimos años, la demanda de producción de vectores AAV a escala de laboratorio ha aumentado significativamente, lo que ha llevado al establecimiento de numerosas organizaciones de investigación por contrato que ofrecen este servicio⁴². Dados los altos costos y los plazos retrasados que a menudo se asocian con la subcontratación, la producción interna de rAAV sigue siendo una opción atractiva. En particular, los protocolos de alto rendimiento que minimizan el consumo de material y las horas de trabajo al tiempo que integran los pasos de purificación son muy beneficiosos en la línea de desarrollo de fármacos.

Este protocolo describe dos configuraciones de alto rendimiento para la producción de rAAV: un enfoque de micro-6 pocillos que utiliza celdas adherentes y un protocolo mini-HT24 para celdas en suspensión (consulte la descripción general en la Figura 1). La configuración de micro-6 pocillos utiliza células de HEK293T adherentes para producir rAAV en un formato de 6 pocillos. Este material se utilizó para evaluar los efectos de dos reactivos de transfección de PEI disponibles comercialmente y cloruro de sodio (NaCl) en la producción de rAAV2 (Figura 2A). Aquí, se monitorearon diferentes parámetros al mismo tiempo: (i) viabilidad de la célula productora y eficiencia de transfección utilizando un transgén GFP (Figura 2B y Figura complementaria 1), y (iii) porcentaje de células GFP positivas (GFP+) después de la transducción con lisados crudos (Figura 2C). El experimento de transducción sirvió como una lectura indirecta rápida y económica de los títulos y funcionalidades de los vectores. Curiosamente, las proporciones más bajas de reactivo de transfección a ADN fueron suficientes para promover la producción eficiente de vectores (Figura 2B) mientras se mantenía una buena viabilidad celular. Además, la adición de 150 mM de NaCl pareció beneficiosa, particularmente cuando se usa el reactivo PEIpro. Realizar este experimento a microescala ofreció varias ventajas: (i) un flujo de trabajo rápido, con la siembra celular, la transfección y la recolección de vectores completadas en una semana; ii) compatibilidad con ensayos analíticos estándar posteriores; y (iii) amplia aplicabilidad a todos los serotipos de AAV.

Para aplicaciones que requieren mayores cantidades de vectores rAAV, como experimentos in vivo o estudios cinéticos in vitro (donde se aplica una gama más alta o más amplia de MOI), es necesario ampliarlos. Para establecer un protocolo mini-HT24 que proporcione suficiente material para la purificación de alto rendimiento, se utilizaron celdas de suspensión. En comparación con las células adherentes, los cultivos en suspensión ofrecen una mejor escalabilidad y son más eficientes en cuanto al espacio, ya que no están limitados por el área de superficie. Dado que las células en suspensión crecen libremente en el medio, pueden ocupar todo el volumen de cultivo, lo que facilita el escalado en tres dimensiones. Esto permite lograr densidades celulares más altas en comparación con los cultivos de capas. Además, los sistemas de suspensión son más fáciles de mantener y procesar, ya que no se necesitan pasos de desprendimiento durante el paso o la cosecha. La uniformidad de la producción de rAAV en el formato de 24 pocillos se evaluó analizando tres parámetros clave en la placa (Figura 3): (A) Título de partículas (vp/mL); (B) Ratio de VP en la cápside; (C) Título genómico (vg/mL) y (D) Proporción de vacío a lleno.

Si bien se observó cierta variabilidad entre estos parámetros, se mantuvo en gran medida dentro de un rango doble, que está dentro del margen de error de medición. La expresión de la proteína VP también se evaluó mediante análisis automatizado de western blot (Figura 3E). Finalmente, se presenta una comparación de los rendimientos totales obtenidos de la producción de micro-6 pocillos, mini-HT24 y mediana escala (matraz de agitación) para guiar la selección de la escala apropiada en función de los requisitos experimentales y las necesidades analíticas posteriores (Figura 3F).

Un aspecto crítico de cualquier protocolo de purificación de AAV es la evaluación de la pureza y potencia del vector. Aquí, los vectores purificados con resina se compararon uno al lado del otro con los purificados utilizando un método de ultracentrifugación (UC) basado en cloruro de cesio (CsCl) de dos pasos (Figura 4). Se observó una potencia comparable entre las dos preparaciones mediante microscopía de fluorescencia, como lo demuestra la transducción exitosa de neuronas motoras y astrocitos (Figura 4A). El análisis de microscopía electrónica no reveló diferencias significativas en la forma de las partículas o el estado de agregación. Sin embargo, hubo una ligera tendencia que indica que la purificación de CsCl produjo preparaciones más limpias de manera más consistente (Figura 4B).

Figura 1: Descripción general de los enfoques de producción y preparación de rAAV. Esta figura ilustra los métodos de producción de rAAV, que van desde matraces de agitación a escala media hasta cultivos en suspensión mini-HT24 y cultivos adherentes de micro-6 pocillos. Estos enfoques permiten la generación de rAAV a varias escalas, utilizando diferentes estrategias de lisis celular y purificación de vectores. La caracterización final de los rAAV generalmente incluye qPCR / dPCR para la cuantificación del genoma viral (vg / mL), ELISA para la determinación del título de la cápside (vp / mL) y ensayos de transducción celular para evaluar la actividad biológica. Creado en BioRender. Ohland, P. (2025) https://BioRender.com/x3sfbdd. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Optimización del protocolo de transfección para la producción de rAAV de micro-6 pocillos. (A) Descripción general esquemática del experimento con parámetros probados y lecturas analíticas. (B) HEK293T células se sembraron en placas de 6 pocillos a una densidad de 0,5 × 10⁶ células/pocillo 24 h antes de la transfección. Se probaron diferentes cantidades de ADN, tipos de PEI (Pro o Max), proporciones y concentraciones de NaCl. (C) Porcentaje de células HEK293A positivas para GFP (GFP+) 72 h después de la transducción con volúmenes iguales de lisados del panel A (10 μL cada una). Para simplificar, solo se muestra la condición de ADN que resultó en los rendimientos de vector más altos (2650 ng). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Caracterización analítica de rAAV producida en una configuración mini-HT24 y comparación de títulos en diferentes escalas. (A) Análisis ELISA de títulos de cápside de rAAV purificados en cada pocillo. Los valores se representan como variaciones por encima del título medio de partículas de la placa después de la purificación. Los títulos esperados dependen de la cápside de AAV utilizada y del transgén empaquetado. Los títulos de partículas para diferentes vectores AAV oscilaron entre 10¹¹ y 10¹² VP / ml altos. (B) Análisis de la relación VP por WES de rAAV purificado de los pocillos indicados. Se utilizaron AAV2 recombinantes VP1, VP2 y VP3 como controles positivos en una relación molar de 1:1:10. (C) análisis de dPCR de rAAV purificado de cada pocillo. Los valores se muestran como variaciones por encima del título genómico promedio de la placa después de la purificación. Los títulos esperados dependen de la cápside de AAV utilizada y del transgén empaquetado. Los títulos genómicos para diferentes vectores de AAV oscilaron entre 10¹⁰ (rAAV2) y 10¹¹ vg/ml (rAAV9, no se muestra aquí). (D) Relación entre vacío y lleno (E/F) de los pocillos indicados, basada en los resultados genómicos y de títulos de partículas de los paneles A y C. Los valores se normalizan al promedio de la placa. La media de E/F en formato mini-HT24 para rAAV2 mostrada es del 10,6% ± del 3,0% después de la purificación de la resina de afinidad AAVX. (E) Análisis capilar de Western blot de proteínas VP en muestras purificadas de rAAV2 de cada pocillo. (F) Comparación de los rendimientos totales del genoma viral considerando los volúmenes finales de muestra y la concentración de cada método. Los datos se muestran como diferencia de pliegue medio sobre el formato más pequeño (micro-6 pocillos), con barras de error que indican la desviación estándar (DE) de las réplicas biológicas. Para la producción de 24 pocillos profundos de alto rendimiento con purificación de resina de afinidad AAVX, SD = ±0,176 (n = 24); para sonicación de micro-6 pocillos; DE = ±0,349 (n = 6); y para la producción estándar de mediana escala con purificación en gradiente de CsCl, DE = ±134,70 (n = 2). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Comparación de potencia y pureza entre rAAV purificado con resina de alto rendimiento (HT) y muestras estándar purificadas con CsCl. (A) Las neuronas motoras y los astrocitos derivados de humanos se transdujeron con la misma construcción de rAAV que expresa el reportero de fluorescencia mRuby3 bajo el promotor de sinapsina humana como reportero a un MOI de 50,000. Las imágenes de microscopía de fluorescencia se capturaron en un microscopio de imágenes en vivo siete días después de la transducción (DPT). Los rAAV se purificaron utilizando el método de gradiente estándar de CsCl (arriba) o el enfoque basado en puntas de resina de afinidad HT AAVX (abajo). Las muestras purificadas con CsCl se expusieron a un ciclo adicional de congelación-descongelación antes de realizar la transducción y se compararon con los rAAV purificados con resina. (B) Análisis de microscopía electrónica de transmisión (TEM) de variantes basadas en serotipos rAAV2 purificadas mediante gradiente de CsCl (arriba) y métodos de punta de resina HT (abajo). Se pueden comparar dos lotes de muestras de rAAV2 purificadas con resina HT sin diálisis (abajo a la izquierda) y con diálisis (abajo a la derecha). Se determinaron las proporciones de vacío a lleno (E / F) utilizando TEM para estar > 90% de lleno para muestras purificadas por ultracentrifugación de gradiente de CsCl y < 40% de lleno para muestras purificadas con resina de afinidad AAX. Barra de escala = 100 nm. El panel B muestra imágenes representativas de lotes purificados utilizando los métodos indicados. Tenga en cuenta que estas imágenes no pertenecen a las mismas preparaciones utilizadas para los experimentos de transducción que se muestran en el panel A. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura complementaria 1: Transfección de células de HEK293T para la producción de rAAV2-GFP utilizando la configuración de micro-6 pocillos. Para la transfección se utilizaron varias cantidades de ADN, concentraciones de NaCl (en mM), productos de PEI y proporciones de PEI a ADN (como se describe en la Figura 2). Las imágenes se tomaron 72 h después de la transfección utilizando el mismo tiempo de exposición (320 ms). En esta figura se muestran imágenes representativas de microscopía de fluorescencia y campo claro. Aumento: 10X. No se muestra la barra de escala; La imagen es solo para fines ilustrativos y de evaluación cualitativa. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Discusión

Este documento de protocolo describe métodos eficientes para producir rAAV en entornos de alto rendimiento y pequeña escala utilizando celdas adherentes y en suspensión. Estas metodologías abordan la creciente demanda de procesos de producción de rAAV escalables y flexibles que respalden la investigación preclínica al tiempo que minimizan el consumo de tiempo, costos y recursos.

Tanto los sistemas de celdas adherentes como los de suspensión ofrecen distintas ventajas y desafíos para la producción de rAAV a pequeña escala. Los sistemas de células adherentes, como las células^{HEK293T 28} cultivadas en formatos de placas de pocillos múltiples, son particularmente adecuados para el diseño de vectores en etapa temprana y estudios comparativos. Su compatibilidad con los protocolos de cultivo y transfección establecidos permite una implementación sencilla en la mayoría de los laboratorios. Por ejemplo, Grosse et al. utilizó la producción a pequeña escala en placas de 6 pocillos para investigar la funcionalidad de AAP, una proteína crucial para el ensamblaje de la cápside viral²². Drittanti et al. produjeron vectores rAAV en placas de 96 pocillos para evaluar la cinética de la replicación de rAAV y probar los efectos de diferentes ayudantes de adenovirus en la producción de rAAV²³. En particular, en este último estudio, se describió un ensayo de replicación utilizando células HeLa especializadas que expresan AAV Rep y Cap para amplificar aún más la señal. Más recientemente, Quan et al. aplicaron un protocolo de producción de alto rendimiento de 384 pocillos en el contexto de un cribado de ARNip, informando títulos relativos²⁴. Sin embargo, dada la cantidad limitada de material, aún no está claro cuántos ensayos y lecturas se pueden realizar, o si se pueden lograr suficientes MOI en experimentos de transducción celular más allá de la medición de proteínas fluorescentes, lo que podría afectar la reproducibilidad.

En este trabajo, se utilizó la producción basada en micro-6 pocillos en células HEK293T adherentes para optimizar las condiciones de cultivo para rAAV2 (Figura 1 y Figura 2). En línea con estudios e informes técnicos anteriores ^43,44, las proporciones más bajas de PEI a ADN y la adición de NaCl durante la transfección tuvieron un impacto positivo en la producción de rAAV. Esto se reflejó indirectamente en las eficiencias de transducción de los vectores producidos en HEK293A células. Las sorprendentes diferencias observadas con las proporciones más bajas de PEI: ADN se atribuyeron principalmente al estrés celular, como lo indica la baja viabilidad celular, particularmente con PEIpro. Aunque los efectos fueron menos evidentes en condiciones de PEImax, las imágenes de microscopía revelaron áreas libres de células en la capa celular, lo que indica estrés o desprendimiento celular (Figura complementaria 1).

Es importante destacar que estos hallazgos no fueron directamente aplicables a la producción de vectores en cultivos en suspensión, lo que enfatiza que las condiciones experimentales que mejoran la producción de rAAV en células HEK293T adherentes no siempre se traducen en células en suspensión, incluso cuando el tipo de célula subyacente sigue siendo el mismo. Esta discrepancia podría atribuirse a las diferencias a nivel transcriptómico y proteómico entre estos dos sistemas⁴⁵. En consecuencia, una alineación más estrecha con los procesos de producción clínica puede requerir el uso de cultivos en suspensión en las primeras fases de desarrollo. Sobre la base de estas observaciones y la ventaja de lograr densidades celulares más altas en suspensión, se adoptó un sistema de 24 pocillos profundos para producir rAAV en cultivos en suspensión a miniescala (mini-HT24). Este sistema se sometió a una amplia validación, demostrando títulos consistentes de vg/mL y vp/mL en toda la placa, junto con una expresión y proporciones uniformes de la proteína VP (Figura 3A-E). De hecho, las densidades celulares más altas logradas en la configuración mini-HT24 (3 × 10⁶ células/ml) en comparación con el formato micro-6 pocillos (5 × 10⁵ células por pocillo) dieron como resultado títulos de rAAV más altos, como se muestra en la Figura 3F. Esto destaca una ventaja clave de los sistemas basados en suspensión, que no están limitados por el área de superficie del recipiente de cultivo. Sin embargo, la implementación de tales sistemas requiere equipos especializados que pueden no estar disponibles en todos los laboratorios. Finalmente, se recomienda validar aún más las moléculas de plomo identificadas o las condiciones de cultivo superiores del sistema mini-HT24 utilizando sistemas de minibiorreactores como AMBR15 o AMBR250, ya que se ha demostrado que estos sistemas imitan más de cerca las condiciones de producción en grandes biorreactores^46,47.

La elección del nivel de purificación juega un papel crucial en la determinación de la idoneidad de las preparaciones de rAAV para aplicaciones posteriores específicas. Los lisados crudos, derivados de cultivos adherentes (micro-6 pocillos) y en suspensión (mini-HT24), proporcionan una opción rápida y eficiente en recursos para los ensayos de detección preliminares. Estos lisados contienen una mezcla de partículas virales, desechos celulares y componentes de medios, lo cual es aceptable para aplicaciones como el título genómico / de partículas de vectores, la detección de la eficiencia de la transducción y el análisis de Western blot. Especialmente aplicable en estudios que abordan cuestiones biológicas fundamentales (como se ejemplificó anteriormente en la investigación de la funcionalidad de AAP), optimización de la condición de cultivo celular y detección y selección preclínica de candidatos. Sin embargo, la presencia de impurezas puede requerir diluciones más altas, lo que resulta en sensibilidades de ensayo más bajas. Además, las impurezas pueden afectar negativamente la viabilidad de los tipos de células sensibles, como las células primarias.

A diferencia de los lisados crudos, las preparaciones purificadas con resina de afinidad AAVX, utilizadas exclusivamente en el protocolo basado en suspensión, logran un mayor nivel de pureza al aislar selectivamente las cápsidas intactas. Esto supera las limitaciones de los lisados celulares crudos, lo que hace que estas preparaciones sean más adecuadas para aplicaciones como estudios in vivo , así como análisis in vitro detallados de la cinética de expresión transgénica y lecturas funcionales precisas, que a menudo requieren mayores cantidades de material (consulte la comparación de rendimiento en la Figura 3F). Para aplicaciones in vitro , los rendimientos de los vectores rAAV producidos en el entorno mini-HT24 generalmente fueron suficientes para la mayoría de las lecturas, dependiendo del número de células y los MOI requeridos. Por el contrario, las aplicaciones in vivo generalmente requieren producción a escalas de matraz midi-shake o más grandes, según la dosis, la vía de administración y el modelo animal. A pesar del aumento del costo y el tiempo requerido para la purificación, la consistencia y confiabilidad del material resultante a menudo justifican la inversión para casos de uso críticos. En particular, los resultados que se muestran en la Figura 4 demuestran que los vectores rAAV purificados mediante métodos de resina de afinidad funcionan de manera comparable a los purificados mediante ultracentrifugación tradicional de cloruro de cesio (CsCl). Esto está en línea con observaciones previas de que las cápsidas vacías no tienen ningún efecto sobre la transducción o incluso pueden mejorarla, dependiendo de las especies de AAV presentes⁴⁸. Sin embargo, es importante tener en cuenta que solo se utilizaron un MOI y un punto de tiempo en este experimento, y las condiciones óptimas deben determinarse individualmente para cada tipo de célula. Mientras que la purificación de CsCl generalmente produce un fondo más limpio, los AAV purificados con punta de resina HT muestran una mayor variabilidad en la pureza (ver imágenes TEM en la Figura 4). En conjunto, estos hallazgos respaldan aún más la adopción de flujos de trabajo de alto rendimiento y pequeña escala.

El uso de puntas rellenas de resina de afinidad a pequeña escala en la purificación de alto rendimiento proporciona una solución práctica para el cribado rápido de rAAV, pero varios aspectos técnicos requieren atención para garantizar resultados fiables. Debido al volumen limitado del lecho de resina, estas puntas son particularmente propensas a obstruirse, especialmente cuando se procesan lisados crudos. Por lo tanto, la clarificación de los lisados mediante centrifugación a alta velocidad es esencial para eliminar los desechos celulares antes de la carga, ya que una clarificación insuficiente puede reducir los caudales y comprometer el rendimiento. Para la configuración mini-HT24, se recomienda optimizar los protocolos de transfección y mantener un volumen de trabajo máximo de 2,5-3 ml por pocillo. Cuando se trabaja con varios serotipos o bibliotecas de cápside, es aconsejable probar diferentes tipos de resinas de afinidad, ya que la eficiencia de unión y la recuperación pueden variar según la estructura de la cápside⁴⁹. El sistema de pipeteo electrónico multicanal portátil permite una fácil integración de este flujo de trabajo en laboratorios pequeños, ofreciendo flexibilidad sin necesidad de automatización. Sin embargo, la manipulación manual puede introducir variabilidad y diferencias de lote a lote. Para una mayor consistencia, las plataformas automatizadas de manejo de líquidos pueden ser beneficiosas. Se debe prestar especial atención para evitar la contaminación cruzada durante la adición de muestras y tampones, y el uso de formatos de placa apropiados con un volumen de pocillo adecuado es esencial para evitar el desbordamiento. Al abordar estas consideraciones, incluida la clarificación de muestras, la optimización del protocolo, la selección de resinas y el pipeteo cuidadoso, los investigadores pueden minimizar los problemas técnicos y mejorar la solidez y la reproducibilidad de los flujos de trabajo de purificación por afinidad de alto rendimiento y pequeña escala.

En conclusión, la combinación de métodos de producción de rAAV de alto rendimiento y pequeña escala con estrategias de purificación específicas de la aplicación proporciona una plataforma versátil para avanzar en la investigación de la terapia génica. Estos protocolos abordan la creciente demanda de flujos de trabajo rentables y eficientes, al tiempo que mantienen la flexibilidad para cumplir con diversos requisitos experimentales. Al equilibrar las compensaciones entre pureza, escalabilidad y consumo de recursos, los investigadores pueden acelerar el desarrollo preclínico y facilitar la transición a las aplicaciones clínicas.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
0,9% de solución salina no tamponada	B. Braun, Melsungen, Alemania	7647-14-5	Tampón Wash II
1 M Ácido hidroclorhídrico	Merck Millipore, Burlington, Massachusetts, EE. UU.	1099700050	Ajuste del pH de los tampones
10x Tampón DNasa I	Thermo Fisher Scientific, Waltham, EE. UU.	AM8170G	ddPCR/dPCR
Tris-HCl de 1M, pH 9.0	Thermo Fisher Scientific, Waltham, EE. UU.	J60707. AP	Tampón de neutralización
Microplacas de 24 pocillos profundos	Enzyscreen, Heemstede, Países Bajos	CR1424cl	Equipos de cultivo en suspensión
Matraz Erlenmeyer de policarbonato de 250 ml con tapa de ventilación	Corning, Nueva York, NY, Estados Unidos	431144	Equipos de cultivo en suspensión
Separación de 66 - 440 kDa 8x25 cartuchos capilares	BioTechne, Minneapolis, MN, EE. UU.	SM-W008	Kit de Western blot automatizado
96 pocillos 2.2 mL Polipropileno DeepWell	Thermo Fisher Scientific, Waltham, EE. UU.	AB0661	Placa de procesamiento y almacenamiento de muestras
Placa inferior negra/transparente de 96 pocillos, superficie TC	Thermo Fisher Scientific, Waltham, EE. UU.	165305	Ensayos de transducción
AAV2 VP1, proteína recombinante	PROGEN, Heidelberg Alemania	640823	Reactivo Wes
AAV2 VP2, proteína recombinante	PROGEN, Heidelberg Alemania	640824	Reactivo Wes
AAV2 VP3, proteína recombinante	PROGEN, Heidelberg Alemania	640825	Reactivo Wes
AAV2 Xpress ELISA	PROGEN, Heidelberg Alemania	PRAAV2XP	Se utiliza para muestras purificadas con resina HT.
Módulo de detección anti-ratón para Wes	BioTechne, Minneapolis, MN, EE. UU.	DM-002	Kit de Western blot automatizado
Manual directo específico del ensayo/plantilla	Costumbre	Costumbre	ddPCR/dPCR
Sonda específica de ensayo/plantilla	Costumbre	Costumbre	ddPCR/dPCR
Imprimación inversa específica de ensayo/plantilla	Costumbre	Costumbre	ddPCR/dPCR
BalanCD HEK293 - Líquido	FUJIFILM IRVINE SCIENTIFIC INC, Santa Ana, CA, Estados Unidos	NC1192689	Medio para cultivo celular en suspensión
Albúmina de suero bovino	Electroforesis SEVA, Heidelberg, Alemania	Albúmina de suero bovino	Suplemento para el medio celular adherente
Película de rayón transpirable, estéril	VWR International LLC, Radnor, PA, EE. UU.	391-1262	Equipos de cultivo en suspensión
Termociclador C1000	Laboratorios Bio-Rad, Hércules, EE. UU.	1851096	ddPCR
Kit ELISA de fuga de ligando AAVX CaptureSelec	Thermo Fisher Scientific, Waltham, EE. UU.	8113522000	ELISA
Analizador HiRes de Cedex	Roche Holding AG, Basilea, Suiza	5650216001	Contador de células
Microplaca de cultivo celular, 96 pocillos	Greiner Bio-One, Kremsmü nster, Austria	655162	Equipos de cultivo celular adeheciente
Ácido cítrico	Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, Estados Unidos	5949-29-1	Reactivo de purificación; CAUTELA
Cámara TEM basada en CMOS TVIPS XF416	Tietz Video and Image Processing Systems GmbH, Gilching, Alemania	XF416	Sistema de procesamiento de video e imágenes
Software Compass (versión 6.3.0)	BioTechne, Minneapolis, MN, EE. UU.		WES Software
Placas de pocillos múltiples tratadas con TC transparente de 6 pocillos Costar	Corning, Nueva York, NY, Estados Unidos	3516	Equipos de cultivo celular adeheciente
Aceite generador de gotas ddPCR	Laboratorios Bio-Rad, Hércules, EE. UU.	#1864110	Reactivo ddPCR
Aceite lector de gotas ddPCR	Laboratorios Bio-Rad, Hércules, EE. UU.	#1863004	Reactivo ddPCR
ddPCR Supermix para sondas (sin dUTP)	Laboratorios Bio-Rad, Hércules, EE. UU.	#1863023	Reactivo ddPCR
DMEM, glucosa alta	Thermo Fisher Scientific, Waltham, EE. UU.	11960044	Medio para cultivo celular adherente
DMEM, bajo nivel de glucosa	Thermo Fisher Scientific, Waltham, EE. UU.	11885084	Medio para cultivo celular adherente
Placas de 96 pocillos de baja unión de ADN	Eppendorf, Hamburgo, Alemania	30129504	ddPCR/dPCR
Tubos de baja unión de ADN	Eppendorf, Hamburgo, Alemania	30108051	ddPCR/dPCR
DPBS	Thermo Fisher Scientific, Waltham, EE. UU.	14190094	Tampón de lavado
Rejillas EM (T600H-Cu 698 l/pulg. Malla hexagonal Barra delgada; EMS)	Ciencias de la microscopía electrónica, Hatfield, PA, EE. UU.	FFTH600-Cu-UL	Análisis de microscopía electrónica
Sistema de imágenes EVO M5000	Thermo Fisher Scientific, Waltham, EE. UU.	AMF5000	Microscopio de imágenes en vivo para ensayos de transducción
Paquete estándar EZ 3	BioTechne, Minneapolis, MN, EE. UU.	PS-ST03EZ-8	Kit de Western blot automatizado
Tubos de centrífuga cónicos Falcon de 15 ml	Fisher Scientific, Schwerte, Alemania	11507411	Procesamiento de muestras
Tubos de centrífuga cónicos Falcon de 50 ml	Fisher Scientific, Schwerte, Alemania	10203001	Procesamiento de muestras
Matriz de membrana basal de factor de crecimiento reducido sin Geltrex LDEV	Thermo Fisher Scientific, Waltham, EE. UU.	A1413201	Recubrimiento de placas de cultivo
Suplemento GlutaMAX (L-Alanil-L-Glutamina)	Thermo Fisher Scientific, Waltham, EE. UU.	35050061	Suplemento para el medio celular adherente
HEK293A	Thermo Fisher Scientific, Waltham, EE. UU.	R70507	Ensayos de transducción (solo para uso en investigación)
HEK293T	ATCC, Manassas, Virginia, EE. UU.	CRL-3216	Cultivo celular adeheciente, utilizado para la producción de rAAV (solo para uso en investigación)
Solución HEPES, 1M	Merck, Darmstadt, Alemania	#H0887	Suplemento para el medio celular adherente
Nucleasa activa de sal HL, SAN (25 U/µ L)	ArcticZymes Technologies, Troms, Noruega	70910-202	ddPCR/dPCR
Lavadora de microplacas HydroSpeed	Tecan, Mä nnedorf, Suiza	30190101	ELISA
Kit de astrocitos iCell, 01434	FUJIFILM Cellular Dynamics, Inc., Madison, WI, EE. UU.	R1092	Ensayos de transducción
Kit de neuronas motoras iCell, 01279	FUJIFILM Cellular Dynamics, Inc., Madison, WI, EE. UU.	Referencia R1051	Ensayos de transducción
Infinito 200 PRO	Tecan, Mä nnedorf, Suiza	30213617	ELISA
JEM-1400Plus es un microscopio electrónico de transmisión	JEOL Ltd., Akishima, Tokio, Japón	JEM-1400Plus	microscopio electrónico de transmisión
Cubierta sándwich de baja evaporación con pasadores	Enzyscreen, Heemstede, Países Bajos	CR1224c	Equipos de cultivo en suspensión
Lector de microplacas  SpectraMax i3	Molecular Devices, San José, CA, EE. UU.	i3x	ELISA
Anticuerpo monoclonal anit-AAV2 VP1/VP2/VP3 de ratón	PROGEN, Heidelberg Alemania	690058	Reactivo Wes
Agua libre de nucleasas	Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Alemania	3036430103	ddPCR/dPCR
Opti-MEM, Medio sérico reducido	Thermo Fisher Scientific, Waltham, EE. UU.	#31985070	Medio para la formación de complejos PEI-ADN
PBS	Thermo Fisher Scientific, Waltham, EE. UU.	#10010023	Tampón de lavado
PEI-MAX, polietilenomina, 1 mg/ml de caldo	Policiencias Europa,  Hirschberg an der Bergstraß e, Alemania	24765 o 24765	Reactivo de transfección
PEIpro	Polyplus, Illkirch-Graffenstaden, Francia	101000033/10 ml	Reactivo de transfección
Placa de microdiálisis Pierce, 96 pocillos, 0,3 ml, 20K MWCO	Thermo Fisher Scientific, Waltham, EE. UU.	A50472	Equipos de purificación
Poloxámero 188	Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, Estados Unidos	P5556-100mL	Reactivo de cultivo celular; CAUTELA
Solución de poli-L-ornitina (0,01%)	Sigma-Aldrich	A-004-M	Ensayos de transducción
Solución de proteinasa K (20 mg/ml)	Thermo Fisher Scientific, Waltham, EE. UU.	25530049	ddPCR/dPCR
ProteinSimple " Wes"	BioTechne, Minneapolis, MN, EE. UU.	004-600	Dispositivo para Western Blot automatizado
Sistema de ocho plataformas QIAcuity	Qiagen, Hilden, Alemania	911052	dPCR
QIAcuity Nanoplate 8.5k 96-well	Qiagen, Hilden, Alemania	250021	ddPCR/dPCR
Kit de PCR de sonda QIAcuity	Qiagen, Hilden, Alemania	250101, 250102 o 250103	ddPCR/dPCR
QIAcuity Software Suite 1.2	Qiagen, Hilden, Alemania		Software de dPCR
Gerente de QX	Laboratorios Bio-Rad, Hércules, EE. UU.		Software ddPCR
Lector de gotas QX200	Laboratorios Bio-Rad, Hércules, EE. UU.	1864003	ddPCR
Microtubo con tapón de rosca, 1,5 ml, rendimiento probado por PCR	Sarstedt, Nü mbrecht, Alemania	72.703.416	Equipos de cultivo en suspensión
Tapón de rosca, DNA LoBind, 5.0 mL	Eppendorf, Hamburgo, Alemania	30122348	Equipos de cultivo en suspensión
Incubadora Shaker	Infors AG, Bottmingen, Suiza	Multitron	Equipos de cultivo en suspensión
Piruvato de sodio (100 mM)	Thermo Fisher Scientific, Waltham, EE. UU.	11360070	Medio para cultivo celular adherente
Sistema de bocina de microplaca Sonicator	QSonica, Newtown, CT, Estados Unidos	Q700MPXC	Sonicador utilizado para la generación de lisado crudo
ESPÍRITU			Enlace a la base de datos SPIRIT: https://spirit.cladiac.com/aav.html
Unidad de filtro superior de tubo de centrífuga estéril Steriflip-GP	Merck Millipore, Burlington, Massachusetts, EE. UU.	SCGP00525	Equipo de preparación de tampones
T-175, MATRAZ DE CULTIVO CELULAR, 550 ML, 175 CM²	Greiner Bio-One, Kremsmü nster, Austria	660175	Equipos de cultivo celular adeheciente
Tripsina/EDTA 0,025%	Thermo Fisher Scientific, Waltham, EE. UU.	R001100	Reactivo de cultivo celular
Células de producción de virus 2.0 (VPC2.0)	Thermo Fisher Scientific, Waltham, EE. UU.	A49784 o A51218	Producción de rAAV
		J63596. K2	Diluir 1:10 para la solución de trabajo PBST