Method Article

Producción basada en microbioreactores de células estromales mesenquimales dependientes del anclaje, preparadas para el síndrome de dificultad respiratoria aguda

DOI:

10.3791/68650

⸱

December 12th, 2025

 ,  ,  , 
1Harvard-MIT Health Sciences and Technology, Massachusetts Institute of Technology, 2Departments of Materials Science & Engineering and Biomedical Engineering, Cornell University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Se describe un protocolo para la producción de microportadores-microbioreactores de células dependientes del anclaje como posibles terapias basadas en células. Al abordar un caso de uso del síndrome de dificultad respiratoria aguda, se ilustra un rendimiento celular comparable y una expresión génica favorable en relación con condiciones de proceso basadas en matraz. Este protocolo es extensible a otras celdas dependientes del anclaje e indicaciones de objetivos.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La terapia basada en células es un enfoque terapéutico emergente para una variedad de condiciones de salud. Sin embargo, producir cantidades suficientes de células de calidad sigue siendo un desafío científico y técnico activo. El producto celular final no puede ser esterilizado; Por lo tanto, la esterilidad y las consideraciones de calidad por diseño son primordiales. Para las células dependientes del anclaje, la expansión basada en matraz sigue utilizándose a escala de desarrollo e industrial, lo que requiere grandes huellas físicas, limita el control del entorno bioquímico (pH, CO2 yO2, gradientes difusivos de nutrientes y metabolitos) y proporciona señales físicas que pueden afectar la calidad celular final. Estos desafíos han motivado la adopción de enfoques de fabricación basados en biorreactores, pero estos suelen proceder a escalas volumétricas que conllevan desafíos y pueden ser costosos para la investigación exploratoria de laboratorio o el desarrollo de procesos. Se ha informado que la producción de terapia celular microbioreactor-microportador proporciona control bioquímico durante el cultivo para un caso de prueba de tipo de fuente celular: células estromales mesenquimales. Para la evaluación inicial de la calidad celular in vitro, se consideró el síndrome de dificultad respiratoria aguda como un posible caso de uso. El enfoque ilustrado aquí permite el desarrollo rápido de procesos a escala de laboratorio debido al pequeño volumen (2 mL) y al estricto control bioquímico en el microbioreactor. Para lograr esto en un tipo celular dependiente del anclaje, como las células estromales mesenquimales, se requirió una modificación sustancial del proceso microbioreactor y se utilizó una plataforma microportadora de gelatina producida internamente mediante un proceso microfluídico. Aquí se ilustra con detalles adicionales sobre los parámetros del método y proceso utilizados para cultivar estas células dependientes del anclaje en el microbioror, con la intención de permitir que otros investigadores adapten estas prácticas a sus propios casos de uso y tipos de fuentes celulares.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El uso de células vivas como producto terapéutico ha surgido recientemente como una prometedora opción de tratamiento para varios desafíos de salud. Por ejemplo, las células T del receptor de antígenos quiméricos (CAR) han provocado una remisión duradera en quienes padecen los llamados cánceres líquidos — leucemia, linfoma y mieloma múltiple — que eran refractarios a todos los tratamientos previamentedisponibles 1. Más recientemente, se aprobó un producto mesenquimalo-célula madre/célula estromala (MSC) (Ryoncil) para tratar a niños que sufren enfermedad aguda refractaria a esteroides del injerto contra huésped (SR-aGvHD), una condición con > mortalidad del 50%. Pero la extensión a otras necesidades clínicas no cubiertas requiere un desarrollo intensivo tanto de la terapia como de los medios para desarrollar y fabricar ese producto.

Una de estas necesidades clínicas no cubiertas se encuentra en personas que sufren el síndrome de dificultad respiratoria aguda (SDRA). El ARDS se discute aquí para proporcionar un caso de uso específico que ilustre el método, los resultados y la discusión sobre posibles extensiones a otros objetivos de enfermedades. Un indicador crítico (progresión en horas a días), prevalente (> 200.000 casos anuales en EE. UU.) y mortal (mortalidad del 27%-46%, dependiendo de la gravedad de la presentación), atrajo una atención renovada y generalizada durante la pandemia de COVID-19 como el mecanismo típico de muerte en pacientes infectados con SARS-CoV-2 3,4. El SDRA se caracteriza por un aumento de la permeabilidad vascular pulmonar, lo que conduce a edema intersticial, inundación alveolar e infiltración de componentes celulares, incluidos neutrófilos y glóbulos rojos, en el compartimentoalveolar 5. En la fase inicial de exudación del SDRA, la inflamación innata mediada por células inmunitarias provoca estos resultados patógenos dañando la integridad de la barrera endotelial y epitelial y promoviendo el reclutamiento y activación de células inmunitarias mediante la secreción de citocinas proinflamatorias; La resolución exitosa de la respuesta inflamatoria, la reparación de la integridad de la barrera y la evitación de fibrosis excesiva son fundamentales para lasupervivencia 3. Aunque las terapias antivirales como el Remdesivir han demostrado ser prometedoras en la lucha contra el SDRA mediado por el SARS-CoV-2, para otras etiologías actualmente no existen intervenciones farmacológicas aprobadas que reduzcan lamortalidad 5.

Las CMS pueden ofrecer un enfoque prometedor para tratar el SDRA, dado su tropismo específico pulmonar tras la inyección sistémica y su capacidad para secretar señales paracrinas inmunomoduladoras en el microambientecircundante 6,7. Los estudios mecanicistas han implicado la expresión de factores paracrinos como la interleucina-10 (IL-10)8, la indolelamina 2,3-dioxigenasa 1 (IDO1)9, la prostaglandina E2 (PGE2)10 y otros en el impulso de la supuesta potencia terapéutica de la MSC para múltiples indicaciones, incluyendo lesión pulmonar aguda (ALI)/SDRA 11; por lo tanto, los niveles de expresión de estos productos génicos representan atributos potenciales de calidad crítica (pCQAs) que pueden ser predictivos de la eficacia clínica, proporcionando criterios de liberación manejables para el producto celular final durante la fabricación. Sin embargo, producir cantidades suficientes de células para alcanzar una dosis terapéutica eficaz es un reto; Ryoncil, por ejemplo, está indicado para dosificar a 2 x 106 células/kg de masa del paciente, administrado dos veces por semana durante 4 semanas12. Para un paciente de 80 kg, esto equivale a > 1.200 millones de MSCs por un solo tratamiento, lo que requiere una gran superficie física para albergar suficiente superficie para esta condición de crecimiento 2D. Dado que este producto de células vivas no puede esterilizarse antes de la administración del paciente sin dañar el potencial terapéutico de las células, la utilización de las actuales directrices de Buenas Prácticas de Fabricación para la producción de forma estéril es fundamental, lo que añade complejidad logística a la fabricación celular y, por tanto, al coste de los bienes13.

Además, estudios previos han demostrado que la producción típica de MSC en matraces de poliestireno de cultivo de tejidos (TCPS) contribuye al inicio de la heterogeneidad fenotípica intrapoblacional. Para algunos usos finales, esto dificulta los esfuerzos de control de calidad entre lotes tanto en la investigación como en la traducciónclínica 14, 15, 16 y 17. Se especula que el limitado control bioquímico disponible en los frascos TCPS, incluyendo gradientes difusivos de gases, nutrientes y productos metabólicos de desecho, una mala regulación del pH, etc., contribuye a estos desafíos.

Estos problemas motivan la adopción de cultivos basados en biorreactores para aprovechar la superior regulación bioquímica y densidad celular disponibles en un formato de crecimiento tridimensional controlado con mezcladinámica 18. Sin embargo, el procesamiento o la fabricación en biorreactores conlleva sus propios desafíos: al ser un tipo celular dependiente del anclaje, los MSC requieren algún tipo de sustrato sobre el que crecer en un biorreactor, lo que requiere la adición de microportadores. Además, muchos biorreactores disponibles comercialmente operan a escalas volúmenes prohibitivamente intensivas en recursos (> 3 L de medios de crecimiento) para el tipo de investigación exploratoria de laboratorio necesaria para identificar y refinar parámetros de proceso desconocidos que afectan la expresión de indicadores medibles de la calidad celular. Estas características se describen como atributos de calidad crítica potenciales opCQAs 19.

Krupczak et al. informaron previamente de un enfoque microportador-microbiorador que produjo MSCs con mejor expresión de pCQA para el SDRA, limitado a evaluaciones in vitro 20. Este enfoque combinaba el uso de una plataforma de microtransportadores de gelatina disoluble producida internamente con una plataforma de microbioreactor comercialmente disponible, el microbioactor MobiusBreez 21. Este microbioactor utiliza cámaras desechables de un solo uso de 2 mL e incorpora muchas características deseables para mejorar el control bioquímico, incluyendo la regulación de temperatura, pH, CO2 yO2 en un sistema alimentado por perfusión de circuito cerrado y mezclado dinámicamente, pero no fue diseñado pensando en células dependientes del anclaje como las MSC. De hecho, los canales microfluídicos estándar usados para inyectar contenidos de reactores son demasiado pequeños para permitir el paso de microportadores, lo que requiere una adaptación sustancial para permitir la producción exitosa de MSCs en esta plataforma.

Aquí se describe e ilustra un protocolo detallado con el propósito de adaptar este microbioactor para el cultivo dependiente del anclaje de las CSM. Los parámetros del proceso aquí reportados se identificaron con la intención de informar el desarrollo y fabricación de procesos de MSC para una evaluación preclínica e in vitro de la eficacia terapéutica del SDRA. Sin embargo, en principio, este protocolo puede adaptarse para otras aplicaciones de usuario final, otras condiciones inflamatorias o inmunomoduladoras, y otros tipos celulares dependientes del anclaje que podrían beneficiarse de un mejor control bioquímico en un entorno de laboratorio. La Figura 1 esquematiza el protocolo descrito en el vídeo adjunto, y las Figuras 2, 3 y 4 ilustran resultados clave.

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Montaje y preparación de microbioreactores

  1. Preparación del número requerido de consumibles para microbioactores
    1. Asegúrate de que el armario de bioseguridad (BSC) esté encendido y estéril. Retira la bolsa de aluminio que cubre el nuevo consumible perforando la parte superior de la bolsa y conserva la bolsa hasta la conclusión de este experimento (para registrar los detalles del lot# en caso de defecto). Abre el embalaje blíster exterior y desecha el paquete de hidratación que contiene dentro. Descarta el embalaje blíster exterior.
    2. Rocía el embalaje blíster interior con etanol al 70% y mételo en el BSC. Abre el embalaje blíster interior y deséchalo.
    3. Usando una jeringuilla estéril, quita el émbolo y conecta la boquilla a un filtro estéril de 0,22 μm. Vierte 50 mL de agua ultrapura sin esterilizar en el barril de la jeringuilla. Mientras sostienes la jeringuilla sobre un tubo estéril de 50 mL en espera, vuelve a insertar el émbolo en la jeringuilla e inyecta el agua filtrada estéril en el tubo de recogida en espera.
    4. Quita la tapa de plástico transparente que conecta a la botella LL en el estante. Usando una jeringuilla nueva estéril de 50 mL, quita el émbolo y conecta la boquilla a la botella LL. Vierte el agua filtrada estéril en el barril de la jeringuilla e inyecta en la botella LL.
      NOTA: Los puertos de conexión sin aguja pueden quedar atascados durante el procedimiento de esterilización del fabricante, por lo que puede que necesites conectar y desconectar la jeringuilla varias veces para romper el sello del frasco e inyectar con éxito el contenido. Alternativamente, puedes usar un soldador de tubos para conectar una botella fuente al tubo soldable de forma estéril para la botella adecuada.
    5. Siguiendo este mismo procedimiento, llena el frasco L con 25 mL de DMEM bajo de glucosa no suplementado con FBS, el frasco R con 25 mL de PBS estéril y el frasco RR con 8 mL de solución de enjuague antiadherente. Usa una jeringuilla estéril nueva para cada líquido.
    6. Repite este procedimiento para tantos consumibles como sea necesario en el experimento.
  2. Realiza una autoprueba POD en cada POD que se utilice para este experimento.
    NOTA: La autoprueba debería completarse sin problemas; Si un componente de la autoprueba falla, se corrige el fallo antes de continuar.
  3. Retira las casetes de autoprueba en sus bolsas de almacenamiento protegidas contra la luz.
  4. Monta el consumible en el biorreactor como se describe a continuación.
    1. Quita la cinta verde de las válvulas del consumible y móntala en su posición en el POD. Reinstala las abrazaderas y asegúrate de que no se oye gas ni aire sisear al salir.
    2. Conecta la línea de presión blanca del rack de botellas, la línea de presión de aire rojo y la línea azul de vacío entre los consumibles y la estación base/POD. Asegúrate de que el puerto lateral de inyección esté cerrado con una pinza blanca en forma de lágrima.
    3. Sigue los pasos del software para iniciar un nuevo experimento. Estas culminan con la función de autocebador y calibración, que tarda ~4-5 horas y puede funcionar durante la noche.
  5. Etiqueta cada estantería de botellas con su ubicación en el POD para que sea fácil distinguir a qué POD devolver el consumible después de haberlo retirado del biorreactor. Usa cinta de colores para indicar la posición: Pod0 = rojo, Pod1 = naranja, Pod2 = amarillo, Pod3 = verde. Escribe el nombre del experimento y la fecha en la cinta.
  6. Deja que los consumibles se calibren durante la noche. Asegúrate de que los medios puedan entrar en el reactor y salir por la línea de residuos.
  7. Si planeas usar células almacenadas en nitrógeno líquido, descongélalas y emplatázalas para que tengan > 24 horas para recuperarse del almacenamiento criogénico antes de la inyección.

2. Recalibración y preparación de microportadores

  1. Asegúrate de que los pasos de autocebado y calibración se hayan completado correctamente.
    1. Si la calibración no se ha completado con éxito, identifica y corrige cualquier problema de la causa raíz y luego intenta una recalibración. Los problemas comunes incluyen no quitar la abrazadera blanca del estante de botellas, no retirar la cinta verde del consumible antes de colocarlo en el POD, y un volumen de medio insuficiente en la botella de medios.
  2. Asegúrate de que los sensores de oxígeno disuelto estén estables.
    1. Casi el 10% de los consumibles presentarán deriva del sensor en el sensor DO tras la calibración. Realizar la acción correctiva preferida, que es volver a ejecutar la calibración completa. Si es necesario, realiza una de las siguientes acciones.
      1. Asegúrate de que no haya aire en el casete, luego desmarca la casilla de Gráficos de visualización para mostrar los controles, y después haz clic en Autocalibrar DO y pH.
        1. Si había aire presente en el reactor cuando se necesita una recalibración, vuelve a la primera página del panel MBS haciendo clic en la flecha azul izquierda en la esquina superior izquierda de la ventana para el POD específico en cuestión. Haz clic en el botón para activar operaciones manuales. Marca la casilla Tubo de residuos listos e introduce W en la caja de texto para seleccionar la botella de residuos. Haz clic en el botón Expulsar-lavado y luego haz clic en Sí en la ventana emergente. Esto vaciará las cámaras del reactor y las rellenará con medios de la botella fuente de medio.
  3. Prepara el número correcto de microportadores en tubos cónicos de 15 mL, uno para cada condición.
    NOTA: El número de microportadores, la superficie agregada y la densidad de siembra de células dependerán de tu aplicación. Para este protocolo, se recomienda inyectar un número absoluto de microportadores que resulte en 75cm2 de área disponible de crecimiento de microportadores para comparar con un matraz T75.
  4. Permitir que los microportadores se asienten en el tubo; aspira la mayor cantidad posible de sobrenadante sin eliminar microportadores para dejar espacio a las células y a los medios frescos.

3. Inyección de células y microportadores

  1. Asegúrate de que las funciones de autoprime y calibración se hayan completado correctamente.
  2. Haz clic en la ventana del software como si el reactor estuviera siendo inoculado según el flujo de trabajo estándar de las celdas de suspensión.
  3. Introduce una nota en la ventana emergente para indicar que no se ha producido ninguna inyección de células en esta fase.
  4. Activa las operaciones manuales para pausar la mezcla del reactor y añadir una pinza en C blanca a las líneas del rack de botellas.
  5. Retira cada consumible y transfiere al BSC. Retira el material usado de los botes de desechos y perfusión y deséchalo.
    1. Asegúrate de eliminar todos los residuos del frasco grande de perfusión, así como del tubo más pequeño de 1,5 mL que contiene si planeas extraer medios acondicionados en cualquier momento del estudio.
  6. Retira el medio de cultivo que no esté suplementado con suero de la botella L y deséchalo. Enjuaga la botella L con ~20 mL de PBS estéril y deséchala. Añade 25 mL de medio de cultivo suplementado con sérum a la botella L.
  7. Devuelve los consumibles a sus respectivos PODs. Coloca las botellas de la fuente de medio en hielo durante el resto del experimento. Renova el hielo a diario.
    NOTA: El hielo húmedo puede complementarse con paquetes congeladores para prolongar la duración del control de temperatura.
  8. Lava los reactores con PBS y lava las líneas.
    1. Haz clic en el botón Vaciar botellas , activa el botón de Radio para la botella L, selecciona Salida a Residuos y luego haz clic en Iniciar Vaciar MSCserum.
      NOTA: Esto limpiará el nuevo medio hMSC añadido a través de la línea para asegurar que no entre más medios no suplementados con FBS en el reactor.
    2. Haz clic de nuevo en el botón Flush bottles, selecciona el botón Radio para Bottle RR y empieza a tirar de la cadena. Esto limpiará la solución de enjuague antiadherente a través de la tubería y asegurará que esté preparada para la entrada en el reactor.
    3. En la ventana de Contenido de la botella, indica en el software que MSCserum está ubicado en la botella R, que en realidad contiene PBS.
    4. Ve a operaciones manuales y realiza tres ciclos de expulsión y lavado en la botella de residuos.
  9. Añade solución de enjuague antiadherente al reactor.
    1. Vuelve a la ventana de Contenido de la botella e indica que MSCserum está en la botella RR, que en realidad contiene una solución de enjuague antiadherencia.
    2. Ve a operaciones manuales y realiza un ciclo de expulsión-lavado en la botella de residuos.
      NOTA: El lavado anterior PBS servía para evitar que componentes del DMEM interfirieran con el lavado antiadherencia; ahora, el reactor debe estar lleno de solución de enjuague antiadherente con PBS en trazas.
  10. Después de 30 minutos con la solución antiadherencia, enjuaga el consumible con PBS.
    1. En la ventana de Contenido de la botella, indica en el software que MSCserum está ubicado en la botella R, que en realidad contiene PBS.
    2. Ve a operaciones manuales y realiza tres ciclos de expulsión y lavado en la botella de residuos.
    3. Vuelve a la ventana de Contenido de la Botella e indica en el software que MSCserum está ubicado en la Botella L, que contiene medios hMSC.
  11. Vacía el reactor esperando la inyección de células y microportadores. En el panel de operaciones manuales, haz clic en Reinocular y deja el sistema en la fase donde el panel indica inocular el reactor.
    NOTA: Aquí, el término inocular simplemente significa la inyección de las células destinadas a la expansión en el microbioractor.
  12. Añadir las resistencias adicionales para modular la velocidad de mezcla en línea con la resistencia R0 por defecto.
  13. Saca las células de su matraz y cuéntalas en un hemocitómetro. Realizar todas las operaciones abiertas en un BSC para asegurar la esterilidad.
    1. Aspira el medio y luego lava con 5-10 mL de PBS precalentado. Aspira el PBS y añade 5 mL de tripsina + EDTA al frasco.
    2. Incubar a 37 °C durante 5 minutos o hasta que todas las células se hayan levantado visiblemente de la superficie del matraz.
    3. Añadir 10 mL de medio hMSC precalentado para neutralizar la actividad de tripsina. Retira el contenido líquido y detéñelo en un tubo centrífuga de 15 mL.
    4. Centrifuga las celdas a 300 x g durante 5 minutos. Descarta el sobrenadante y vuelve a suspender la célula en un volumen adecuado de medios hMSC para el contar. Para un matraz T75 completamente confluente, un volumen adecuado suele ser de 2-4 mL, lo que dará una concentración celular de ~1-2E6 células por mL.
    5. Mezcla una muestra de las células resuspendidas con una parte igual de tinte de viabilidad Trypan Blue y carga la mezcla en un hemocitómetro para el contar. Cuenta las células según las instrucciones del fabricante.
  14. Calcular el volumen de solución celular necesario para alcanzar las 150.000 células y pipetear esa cantidad en el tubo cónico de 15 mL que espera que contiene microportadores para cada condición. Recarga el volumen del tubo para que esté entre 2,2 y 2,5 mL con medios hMSC frescos y calientes.
    NOTA: El volumen en cada cónica de 15 mL debe ser ligeramente superior a 2 mL, de modo que la inyección resulte en una condición de reactor ligeramente sobrelleno para evitar burbujas, que se igualarán en un paso posterior.
  15. Añade el volumen adecuado de celdas al control del matraz T75.
  16. Trabajando con uno o dos consumibles a la vez, retira los consumibles del POD y acércalos al BSC.
  17. Extrae células y microportadores en una jeringuilla de 5 mL usando agujas romas verdes de 4 pulgadas. Inyecta las células y microportadores en el reactor.
  18. Devuelve el consumible a la estación base y repite hasta que se hayan inyectado todos los consumibles.
  19. Haz clic en las ventanas del software para indicar que la inoculación ha tenido lugar. Cuando el software regrese a la página principal normal, retira la pinza blanca de las líneas de salida de los consumibles.
  20. Entra en operaciones manuales y realiza una función de Expulsar exceso con el puerto de salida configurado a P para perfusión. Activa el modo de mezcla estática, usando 1680 s encendidos y 120 segundos apagados. Mantén la frecuencia de mezcla en 5 Hz para la mezcla estática.
  21. Desactiva la medición de referencia de densidad óptica.
    1. Abre el cliente MBS y haz clic en Conectar. Introduce el siguiente comando contenido en las comillas: "dmem_write 0,1,2,3 F_measure_ODref_skip 1"
    2. Haz clic en enviar, espera confirmación de que el comando se ha enviado correctamente y cierra el cliente MBS.
  22. Después de 24 horas, desactiva el modo de mezcla estática y vuelve a activar la mezcla normal. Reduce la frecuencia de mezcla a 1,5 Hz.

4. Funcionamiento del microbioactor

  1. Monitoriza el microbioactor a diario para asegurarte de que ningún problema interrumpa el experimento. Asegúrate de que las botellas fuente de medio mantengan >5 mL de medios para perfundir el reactor sin problemas.
  2. Cambia los cubos de hielo según sea necesario para mantener el control de temperatura de la botella fuente de medio. Mantén la cortina protectora de luz sobre la parte frontal del microbioreactor para evitar la degradación por luz de los componentes del medio volátil.
  3. Asegúrate de que no se introduzcan burbujas en el reactor. No olvides cambiar periódicamente el medio en el control del matraz TCPS.

5. Extracción de microbioactores

  1. Asegúrate de que el BSC sea estéril y esté listo para su uso.
    1. Calienta los siguientes reactivos necesarios en una perla o baño maria a 37 °C: ~25 mL de medio hMSC caliente, 10 mL de PBS tibio y 1,5 mL de Pronasa 10 mg/mL necesaria para la cosecha.
  2. Prepara el estante para la cosecha.
    1. Activa el modo de operaciones manuales para cada POD en el software.
    2. Sujeta las líneas de entrada de los consumibles usando una pinza blanca en C a lo largo de la parte libre de la línea.
    3. Quita los consumibles del BSC. Retira el contenido de la botella de residuos y deséchala.
    4. Enjuaga el bote de residuos con ~20 mL de PBS y deséchalo. Evalúa el volumen restante en la botella de medio y recarga con medios hMSC frescos (fríos) si es necesario.
      NOTA: Aquí se requieren > 4 mL de medio para completar los tres ciclos de expulsión y lavado necesarios para la cosecha.
    5. Forra la botella de residuos con ~5 mL de medio hMSC frío para amortiguar el líquido extraído.
  3. Extrae las células del microbioreador.
    1. Con una jeringuilla de 1 mL, extrae 200 μL de 10 mg/mL de Pronasa en la jeringuilla y ~300-400 μL de aire.
    2. Desatornilla la tapa de la línea de inyección del puerto lateral y rocía el conector de la válvula sin agujas con etanol al 70%. Quita la cinta que sujeta la línea de inyección del puerto lateral anudado y desata el nudo. Desabrocha la pinza blanca en forma de gota.
    3. Conecta la jeringuilla de 1 mL e inyecta suavemente la Pronasa en el reactor. Seguir el líquido por la línea de inyección con aire para asegurar que todo el contenido líquido se entregue al reactor.
    4. Reenganche la abrazadera en forma de lágrima y vuelve a tapar la línea de inyección del puerto lateral. Devuelve el consumible a su POD, reconecta todas las líneas, quita la abrazadera blanca en C y reanuda la mezcla.
    5. Asegúrate de que la botella de residuos y la botella de la fuente de medios se mantengan en hielo. Inicia un temporizador de 5 minutos y deja que la Pronasa digiera los microportadores dentro del reactor.
    6. Tras 5 minutos, comprueba si los microportadores se han degradado comprobando que ya no estén visibles en el reactor. Si los microportadores aún son visibles, permite un minuto adicional para la digestión. Si no se ven microportadores, procede.
    7. Cosecha las células. Activa el modo de operaciones manual, pon el # de los ciclos en 3 y el puerto de salida a W para residuos, y haz clic en Expulsar Lavado.
    8. Una vez finalizados los ciclos de lavado de expulsión, retirar el consumible de nuevo al BSC y extraer el contenido del frasco de desechos usando una jeringuilla de 10 o 20 mL.
    9. Dispensa el contenido de la botella de residuos en un tubo cónico de centrífuga de 15 mL. Centrifuga las células a 300 x g durante 5 minutos, aspira el sobrenadante y evalúa el tamaño del pellet celular.
    10. Resuspende el pellet celular en 1-5 mL de medio de crecimiento o PBS y cuenta las células en un hemocitómetro. Repite este paso para todos los consumibles.
  4. Extrae la(s) condición del matraz utilizando tus protocolos habituales de cultivo celular. Un protocolo típico para los MSC se describe en la versión 3.13.

6. Analizar las células de las condiciones del microbioactor y las condiciones de los matrazes para su aplicación posterior

NOTA: Los métodos analíticos utilizados para producir los resultados destacados se presentan brevemente a continuación y se describen con más detalle en Krupczak, Farruggio y Van Vliet (2024)20.

  1. Control ambiental: Utilizar la interfaz gráfica proporcionada por el microbioactor para acceder y mostrar datos de cada uno de los sensores integrados de un consumible durante el periodo de cultivo. Estos datos se proporcionan en el software Breez Explorer, que viene instalado en el portátil que viene junto con el microbioactor.
  2. Rendimiento de las celdas: Extrae las MSC como se ha descrito anteriormente y pelleta las células a 300 x g durante 5 minutos. Retirar cuidadosamente el sobrenadante y resuspender completamente el pellet celular en un volumen adecuado de medios PBS o hMSC (1-2 mL). Toma una muestra de la mezcla de celdas resuspendidas y mézclala con un volumen igual de tinte Trypan Blue. Micropipetear la mezcla de muestra teñida en un chip de hemocitómetro y medir el número y la viabilidad celular en un hemocitómetro automático o manual.
  3. Comprobar la expresión génica mediante la reacción en cadena cuantitativa de la polimerasa mediante transcripción inversa en dos pasos, como se describe a continuación.
    1. Purificación de ARN: Utiliza un kit RNeasy Mini para aislar y purificar ARN de cada muestra siguiendo las instrucciones del fabricante. En resumen, lisar las células, transferir el contenido celular a un tubo de spin de purificación y lavar las muestras con cada tampón para eliminar componentes celulares innecesarios, ácidos nucleicos y proteínas que podrían interferir con la PCR posterior.
    2. Conversión de cADN: Utilice un kit de transcripción inversa de alta capacidad y un ciclador térmico para convertir el ARN purificado en ADN complementario (cDNA) según las instrucciones del fabricante. En resumen, descongela los componentes del kit y crea una mezcla maestra combinando componentes en los volúmenes apropiados para el número de muestras. Carga partes iguales de ARN purificado y mezcla maestra preparada (10 μL cada una) en cada pozo de una placa PCR, cuidando de rastrear la ubicación de la identidad de cada muestra. Sigue el protocolo del fabricante en el ciclador térmico para completar la reacción de transcripción inversa.
    3. qPCR: Utilizando cebadores específicos de secuencia que abarcan exones y validados para evitar el dimérito de cebadores, carga una placa qPCR de 384 pozos con cebador directo, cebador inverso, cDNA plantilla, agua sin nucleasa y mezcla maestra en volúmenes apropiados (típicamente, 1 μL, 1 μL, 1 μL, 7 μL, 10 μL, respectivamente) utilizando múltiples pozos de replicación técnica para cada gen y muestra. Divide el contenido entre varias placas si es necesario para capturar todos los genes objetivo. Asegúrate de que todas las muestras de un genio objetivo concreto se carguen en la misma placa para evitar la variabilidad de los resultados entre placas, y que cada placa tenga un gen de mantenimiento adecuado y controles sin plantilla. Mide la intensidad de fluorescencia en una máquina qPCR adecuada y utiliza el método ΔΔCt para la cuantificación relativa y así calcular la expresión génica.

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El microbioactor permitió monitorizar y regular factores ambientales durante aproximadamente 10 días en cultivo. Los factores ambientales, incluyendo el pH (Figura 2A), la temperatura (Figura 2B), el oxígeno disuelto (Figura 2C) y el dióxido de carbono (Figura 2D), se midieron y mantuvieron con precisión en las condiciones del microbiore...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

En este protocolo, se describe un método para expandir, cebar y cosechar células utilizando un enfoque microportador-microbioreador. Este proceso permite que células dependientes del anclaje, como las MSC, aumenten el número celular bajo el control bioquímico superior de una plataforma de biorreactor (en comparación con los matrazos TCPS convencionales) a escala de laboratorio, adecuada para el desarrollo rápido de procesos. Además, se demuestra que la producción de microportadores-micro...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores revelan un acuerdo de colaboración con el fabricante de microbioreadores, MilliporeSigma.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Agradecemos a la instalación Genomics Core (Weill Cornell Medicine) la consulta sobre el análisis y la resolución de problemas de qPCR. Agradecemos mucho la ayuda de Evan Gates y Eric Shiue (MilliporeSigma) en el soporte técnico para el microbioactor.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Solución de enjuague antiadherenteTecnologías de células madre7010
Armario de bioseguridad
Microbioactor BreezMilliporeSigma
Centrifugadora
Tubo cónico, 15 mL
Tubo cónico, 50 mL
Dulbecco's Modified Eagle Medium, baja glucosaGibco11885084
Etanol
Suero fetal bovinoGibcoA5670701
Hemocitometro
Cinta de laboratorio
Microportadores
Tubo microcentrífuga, 1,5 mL
Microscopio
Aguja, roma, calibre 18AmazonB0D663ZR6D
Solución salina tamponada con fosfatoCorning21-040-CM
Pronase, de Streptomyces griseusMilliporeSigma10165921001
Pipeta serológica, 10 mLVWR75816-100
Agua desionizada estéril
Filtro de jeringuilla, 0,22 mmm, estérilProductos Científicos Celltreat229762
Jeringuilla, 1 mLBD309628
Jeringuilla, 20 mLBD302830
Jeringuilla, 5 mLBD309646
Jeringuilla, 50 mLBD309653
Matraz de poliestireno para cultivo de tejidos, T75Thermo Fisher Scientific130190
Trippan BlueSigmaAldrichT8154-100ML

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