Regulación de la transición epitelio-mesenquimal en el cáncer de ovario por LncRNA MALAT1 a través de SNAI2 y MiR-200c-3p

Resumen

Este protocolo describe métodos para evaluar el papel de MALAT1 en la promoción de la transición epitelial-mesenquimal en el cáncer epitelial de ovario a través de su regulación del eje miR-200c-3p / SNAI2.

Resumen

El ARN largo no codificante MALAT1 regula la transición epitelio-mesenquimal (EMT) y la metástasis en el cáncer epitelial de ovario (EOC) a través de un mecanismo de ARN endógeno competidor (ARNce) que implica la modulación del miARN. Este estudio tuvo como objetivo dilucidar la vía molecular por la cual MALAT1 influye en la EMT y el comportamiento metastásico a través de la interacción con miR-200c-3p y SNAI2. La expresión de MALAT1 se manipuló genéticamente en la línea celular EOC SK-OV-3 mediante sobreexpresión o eliminación. Los efectos funcionales sobre los niveles de proteínas relacionadas con la EMT, la migración celular y la invasión se evaluaron mediante Western blotting, cicatrización de heridas y ensayos Transwell, respectivamente. El análisis bioinformático identificó miR-200c-3p como un objetivo común de MALAT1 y SNAI2. El eje MALAT1 / miR-200c-3p / SNAI2 se validó aún más mediante ensayos reporteros de luciferasa dual y tinción de inmunofluorescencia para confirmar las interacciones moleculares directas. La sobreexpresión de MALAT1 mejoró la migración celular de SK-OV-3 en un 20% y la invasión en un 5%, acompañada de un aumento significativo en la expresión de SNAI2 (P < 0,01). Por el contrario, la eliminación de MALAT1 suprimió estos fenotipos. Los ensayos de luciferasa dual confirmaron que miR-200c-3p se une directamente tanto a MALAT1 como a SNAI2 (P < 0,001). La sobreexpresión de miR-200c-3p redujo la EMT impulsada por MALAT1 al regular a la baja SNAI2 (P < 0,05), mientras que la restauración de SNAI2 revirtió los efectos inhibidores del silenciamiento de MALAT1 en la metástasis. Este protocolo demuestra que MALAT1 promueve la EMT y la metástasis en EOC al funcionar como un ARNce que secuestra miR-200c-3p, lo que lleva a la desrepresión de SNAI2. Los hallazgos proporcionan una nueva visión mecanicista e identifican el eje MALAT1 / miR-200c-3p / SNAI2 como un objetivo terapéutico potencial para inhibir la metástasis del cáncer de ovario.

Introducción

El cáncer de ovario (OvCa) es una neoplasia maligna altamente insidiosa y diagnosticada tardíamente. Por lo general, progresa de forma asintomática hasta llegar a etapas posteriores, caracterizada por un crecimiento agresivo principalmente dentro de la cavidad peritoneal. Este proceso patológico generalmente se presenta con ascitis, respuesta terapéutica reducida y mal pronóstico¹. Las estadísticas epidemiológicas de 2018 revelaron alrededor de 295.000 nuevos casos diagnosticados en todo el mundo, con 185.000 eventos de mortalidad, lo que refleja una trayectoria ascendente persistente en la carga de enfermedad². Aunque los protocolos de tratamiento modernos incorporan la intervención quirúrgica y los regímenes farmacológicos, las limitaciones persistentes en la detección temprana combinadas con la metástasis y la resistencia terapéutica mantienen las tasas de supervivencia a largo plazo por debajo del 45%³. La recurrencia dentro de los 12-18 meses se observa comúnmente en muchos pacientes con enfermedad avanzada⁴. Estas realidades clínicas subrayan la necesidad urgente de identificar marcadores diagnósticos clínicamente relevantes y estrategias de seguimiento terapéutico. Por lo tanto, es valioso para identificar marcadores diagnósticos clínicamente relevantes.

Actualmente, los investigadores han descubierto que una proporción sustancial del genoma humano genera ARN largos no codificantes (lncRNAs⁾⁵. Los LncRNA no codifican proteínas, existen únicamente en forma de ARN y desempeñan funciones reguladoras en diversas funciones biológicas de las células. Los LncRNAs exhiben no conservación y muestran patrones de expresión altamente específicos del tejido⁶. En particular, se ha observado una sobreexpresión específica de lncRNAs en múltiples tejidos cancerosos⁷. El mecanismo de ARN endógeno competidor (ARNce) ha revelado un nuevo modo de interacción de ARN. Está bien establecido que los microARN (miARN) pueden silenciar genes a través de interacciones específicas de secuencia con regiones 3'no traducidas (UTR) de ARNm. Mientras tanto, los ARN no codificantes (ncRNA) pueden unirse competitivamente a miRNA, impidiendo así su capacidad para unirse a genes diana e influir en la expresión génica⁸. El mecanismo de ARNc es actualmente la hipótesis más aceptada para el papel regulador de los ARNlnc. La diafonía tripartita entre las transcripciones codificantes, los miARN y los ARN reguladores construye intrincadas redes moleculares que influyen en el inicio y la progresión del tumor⁹.

Identificado por primera vez en metástasis de cáncer de pulmón de células no pequeñas, MALAT1 ha surgido como un lncRNA ampliamente sobreexpresado en numerosas neoplasias malignas¹⁰. En nuestros estudios previos, identificamos un aumento de la expresión de MALAT1 en los tejidos de OvCa que se asocia directamente con la estadificación de OvCa¹¹. Aquí presentamos un protocolo para modular genéticamente la expresión de MALAT1 en la línea celular epitelial OvCa (EOC) SK-OV-3 y evaluar su impacto en la expresión de proteínas relacionadas con la transición epitelio-mesenquimal (EMT), la capacidad migratoria y el potencial invasivo a través de ensayos moleculares como qPCR, western blotting, ensayos reporteros de luciferasa dual y ensayos funcionales como ensayos de cicatrización de heridas y ensayos Transwell. El objetivo es dilucidar el mecanismo molecular por el cual MALAT1 regula la EMT y la diseminación metastásica en EOC a través de interacciones con miR-200c-3p y SNAI2.

Los métodos existentes para estudiar las interacciones lncRNA-miRNA a menudo emplean solo herramientas de predicción in silico , que pueden carecer de validación experimental. Para los estudios de regulación de EMT, los métodos histológicos tradicionales pueden no proporcionar información molecular detallada. Al emplear ensayos reporteros de luciferasa dual para la validación experimental, nuestro estudio supera estas limitaciones, ofreciendo una confirmación más confiable de las interacciones predichas. Además, la combinación de múltiples ensayos funcionales, como los ensayos de rayado y Transwell, junto con técnicas moleculares, permite una comprensión integral de la EMT tanto a nivel celular como molecular, superando la profundidad proporcionada por los enfoques de ensayo único.

Protocolo

Cultivo celular y transfección

La línea celular OvCa humana SK-OV-3 se cultivó en condiciones estándar. Las células se mantuvieron en un medio de cultivo que comprendía 89% de 5A de McCoy, 10% de suero bovino fetal y 1% de solución de penicilina-estreptomicina, en una incubadora humidificada a 37 °C con 5% de CO₂. El medio se reemplazó cada 2-3 días, y las células se pasaron al alcanzar una confluencia del 80-90% utilizando tripsina-EDTA al 0,25%. Se obtuvieron construcciones lentivirales para la sobreexpresión de MALAT1 y la eliminación de MALAT1 (ARNhc), así como controles imitadores, inhibidores y negativos de miR-200c-3p, junto con ARNip dirigido a SNAI2 y su correspondiente ARNip de control, de fuentes comerciales. Para la transfección, las células SK-OV-3 se sembraron en placas de 24 pocillos a una densidad de 5 × 10⁴ células/pocillo en 500 μL de medio completo y se dejaron adherir durante la noche. Las transfecciones se realizaron utilizando un reactivo de transfección a base de lípidos (RRID: AB_2548650) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Brevemente, los ácidos nucleicos (imitadores/inhibidores de miARN o ARNip) y un reactivo de transfección a base de lípidos se diluyeron en medio de suero reducido por separado, se incubaron durante 5 min, luego se mezclaron e incubaron durante 15 min adicionales a temperatura ambiente para permitir la complejación. Los complejos se agregaron gota a gota a las células. Después de 6 h, el medio se reemplazó con medio completo fresco. Las células se recolectaron 24-48 h después de la transfección para análisis posteriores.

PCR cuantitativa fluorescente en tiempo real (qPCR)

El ARN total se extrajo de células SK-OV-3 cultivadas utilizando el reactivo de extracción de ARN de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Brevemente, las células se lisaron en 1 ml de reactivo por pocillo de una placa de 6 pocillos, y el ARN se aisló utilizando un kit de extracción de ARN comercial siguiendo el protocolo proporcionado. La concentración y la pureza del ARN se determinaron utilizando un espectrofotómetro, y se utilizaron muestras con una relación A₂₆₀/A₂₈₀ entre 1,8 y 2,0 para aplicaciones posteriores. La transcripción inversa se realizó utilizando la mezcla maestra de RT (RRID: SCR_018597) con 500 ng de ARN total en un volumen de reacción de 20 μL. Las condiciones del ciclo térmico fueron las siguientes: 37 °C durante 15 min, seguido de 85 °C durante 5 s para inactivar la transcriptasa inversa. El ADNc resultante se almacenó a -20 °C hasta su uso. La PCR cuantitativa en tiempo real se realizó utilizando un kit comercial de detección de miRNA qRT-PCR en un instrumento de PCR en tiempo real. Cada reacción se realizó en un volumen de 20 μL que contenía 10 μL de mezcla maestra de qPCR 2x, 1 μL de cebadores específicos (hacia adelante y hacia atrás, 10 μM), 2 μL de plantilla de ADNc y 7 μL de agua libre de ARNasa. Las condiciones de ciclo térmico fueron: 95 °C durante 10 min, seguido de 40 ciclos de 95 °C durante 10 s y 60 °C durante 30 s. Se realizó un análisis de la curva de fusión para verificar la especificidad del producto. Los niveles de expresión se calcularon utilizando el método ΔΔCt, con GAPDH (para ARNm) o U6 (para miARN) como controles internos. Todas las reacciones se realizaron por triplicado y los datos se presentan como media ± DE.
NOTA: El reactivo de extracción de ARN es un químico peligroso. Debe manipularse en una campana extractora, ya que es corrosivo y puede causar irritación en la piel y los ojos. Los residuos que contienen el reactivo deben eliminarse de acuerdo con las normas locales de eliminación de residuos peligrosos.

Ensayo de rayado

Las células SK-OV-3 se sembraron en placas de 24 pocillos a una densidad de 5 × 10⁴ células/pocillo y se cultivaron hasta que alcanzaron aproximadamente un 90-100% de confluencia, formando una monocapa uniforme. Luego se usó una punta de pipeta estéril de 10 μL para crear un rasguño lineal a través de la monocapa celular en el centro de cada pocillo. Para garantizar la consistencia, se aplicó el mismo ángulo y presión durante la formación de rayado en todos los pozos. Después de rascar, se agregó PBS para eliminar las celdas desprendidas con dos lavados suaves. Luego, las células se cultivaron en medio 5A de McCoy sin suero para minimizar los efectos de proliferación. Las imágenes del área de rayado se capturaron inmediatamente (0 h) y nuevamente a las 24 h y 48 h utilizando un microscopio invertido con un aumento de 10x. El ancho del rasguño en cada punto de tiempo se midió utilizando el software ImageJ y el porcentaje de cierre de la herida en comparación con el ancho inicial utilizado para calcular la tasa de migración.

Ensayo Transwell

Las células SK-OV-3 se sembraron en las cámaras superiores de los insertos Transwell (la cámara superior contiene 200 μL de medio completo al 1%, la cámara inferior contiene 1 ml de medio completo al 5%) a una densidad de 5 × 10³ células por inserto, incubadas a 37 °C, ambiente humidificado al 5% de CO₂ durante 24 h antes de un análisis adicional. Después de la incubación durante 24 h, los insertos se retiraron y se lavaron 3 veces con PBS, seguido de la fijación en paraformaldehído (PFA) al 4% durante 15 min. Después del lavado con PBS, las células se tiñeron con una solución de violeta cristalina al 1%. Después de la tinción, las células se enjuagaron con PBS y se observaron bajo un microscopio invertido.
NOTA: El violeta cristal es una mancha biológica y puede ser dañina si se ingiere o entra en contacto con la piel. Debe manipularse con cuidado y los desechos deben eliminarse adecuadamente de acuerdo con las regulaciones locales.

Ensayo reportero de luciferasa dual

Las células transfectadas se incuban en condiciones de cultivo estándar (37 °C, ambiente humidificado al 5% de CO₂) durante 48 h antes de la lisis. Después de 48 h de incubación, las células se lisaron y centrifugaron a 5.000 × g durante 5 min a 4 °C. Se transfirió una alícuota de 50 μL del sobrenadante a una placa de 96 pocillos, seguida de la adición secuencial de 100 μL de reactivo de luciferasa de luciérnaga y 100 μL de reactivo de luciferasa Renilla a cada pocillo. Las actividades de luciferasa Firefly y Renilla se midieron utilizando el sistema de ensayo Dual-Luciferase Reporter en un luminómetro. La actividad de la luciferasa Renilla se normalizó a la actividad de la luciferasa Firefly para tener en cuenta las variaciones en la eficiencia de la transfección.

Ensayo de inmunofluorescencia

Las células SK-OV-3 se fijaron en PFA al 4% durante 15 min a temperatura ambiente y luego se lavaron 3 veces con PBS. Para bloquear la unión inespecífica, las células se incubaron con suero de cabra al 5% en PBS durante 1 h a temperatura ambiente. Después del bloqueo, las células se incubaron durante la noche a 4 ° C con anticuerpos primarios contra E-cadherina (RRID: AB_2833860), N-cadherina (RRID: AB_2837725) y Vimentina (RRID: AB_2835318), cada uno diluido 1:200. Al día siguiente, las células se lavaron 3 veces con PBS y se incubaron con anticuerpos secundarios conjugados con fluoróforos apropiados [anti-ratón IgG-FITC (RRID: AB_2843438) e IgG-FITC ANTI-CONEJO (RRID: AB_2843439)] diluidos 1:500 durante 1 h a 37 °C en la oscuridad.
NOTA: El paraformaldehído es tóxico y un carcinógeno potencial. Debe manipularse con cuidado, usando equipo de protección personal (EPP) adecuado, como guantes y gafas. Los desechos que contienen PFA deben eliminarse como desechos peligrosos.

Análisis estadístico

Para las comparaciones entre dos grupos, se utilizó una prueba t y para las comparaciones de múltiples grupos, se aplicó ANOVA. Los datos se presentan como media ± DE. La significación estadística se estableció en *p < 0,05, **p < 0,01 y ***p < 0,001. Todos los experimentos se realizaron con tres réplicas biológicas (n = 3).

Resultados

Capacidades migratorias e invasivas de células SK-OV-3 moduladas por MALAT1

El flujo de trabajo experimental se describe en la Figura 1. Para investigar el papel de MALAT1 en la migración e invasión de células OvCa, modulamos su expresión en células SK-OV-3. Tras la eliminación de MALAT1, la qPCR confirmó una supresión significativa de los...

Discusión

OvCa, el quinto cáncer ginecológico más importante, sigue siendo una preocupación importante para la salud de las mujeres². Sin embargo, la mayoría de los casos se identifican en etapas avanzadas, lo que limita significativamente las opciones de tratamiento efectivas, lo que resulta en una mejora mínima en las tasas de supervivencia general¹². La metástasis del cáncer se destaca como un importante contribuyente a la mortalidad de los pacien...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
0.22 μ m Membranas de PVDF	Tiempo de beyo.	FFP32
Kit de detección de qRT-PCR de miARN todo en uno	FulenGen	QP115
Albúmina sérica bovina	Tiempo de beyo.	ST025
Sustrato de quimioluminiscencia	Suzhou Haixing Bioscience Co., Ltd.	TCH-C335
Sustrato de quimioluminiscencia	Millipore	WBKLS0100
Kit de ensayo de gen reportero de luciferasa dual	beyotime	RG027
Suero fetal bovino	Suzhou Haixing Bioscience Co., Ltd.	FBP-C550
Cabra Anti-Ratón IgG FITC	Afinidad	S0007
Cabra Anti-Conejo IgG FITC	Afinidad	S0008
Lipofectamina 2500	Guangzhou Yingxin Biotechnology Co., Ltd.	SJ-LIP-2500
Lentivirus de interferencia MALAT1	SHANGHAI GENECHEM Co., Ltd.	LV-MALAT1-sh
Lentivirus de sobreexpresión de MALAT1	SHANGHAI GENECHEM Co., Ltd.	LV-MALAT1-OE
El 5A de McCoy	Suzhou Haixing Bioscience Co., Ltd.	GUMD-B305
miR-200c-3p imitador	SHANGHAI GENECHEM Co., Ltd.	micrófono-has-200c-3p
Analizador de inmunoensayo enzimático multifuncional	Perkin Elmer	Visión 2100
Solución de penicilina-estreptomicina	Suzhou Haixing Bioscience Co., Ltd.	GUSA-R002
Cóctel de inhibidores de la fosfatasa	GSbioth	GS1439A
Anticuerpo primario E-cadherina	Afinidad	BF0219
Anticuerpo primario N-cadherina	Afinidad	AF5239
Anticuerpo primario Vimentina	Afinidad	AF7013
Mezcla maestra PrimeScript RT	Takara	RR036A
Sistema de detección de PCR en tiempo real	Bio-Rad	CFX96
Centrífuga refrigerada	eppendorf	5810R
Tampón de lisis RIPA	GSbioth	GS504A
Geles de poliacrilamida SDS	Tiempo de beyo.	P0012A
Anticuerpo secundario Cabra Anti-Ratón IgG FITC	Afinidad	S0007
Anticuerpo secundario Cabra Anti-Conejo IgG FITC	Afinidad	S0008
ARNip SNAI2	Guangzhou Yingxin Biotechnology Co., Ltd.	si-tiene-caracol2
Base de datos StarBase	Universidad Sun Yat-sen	http://starbase.sysu.edu.cn
El kit de ensayo BCA	Dingguo Biotech	BCA02
La incubadora de cultivos celulares	Heraeus	Hera célula 150
El sistema de análisis de imágenes	Bio-Rad	GEL DOC 1000
El microscopio invertido	Mshot	MI152-N
El kit de extracción de ARN	ECOTOP	EK-1328-50T
Reactivo TRIzol	Guangzhou Yingxin Biotechnology Co., Ltd.	T751379
Fuente de alimentación universal para electroforesis	WixScientific	WIX-EP600