Mejora del bienestar de los jerbos a través del entrenamiento de refuerzo positivo en entornos de investigación

Resumen

El entrenamiento con clicker sirve como una técnica de refuerzo positivo para los jerbos de laboratorio. Este método tiene como objetivo reducir el estrés y mejorar la eficiencia del manejo a través del refuerzo positivo, contribuyendo así al bienestar de los animales de experimentación.

Resumen

Mejorar el bienestar de los animales de laboratorio minimizando el estrés y promoviendo el manejo apropiado para la especie es un objetivo central de la investigación biomédica contemporánea en todo el mundo. El entrenamiento con clicker, una forma ampliamente reconocida de entrenamiento de refuerzo positivo, utiliza un sonido de clic como un reforzador condicionado para unir el comportamiento deseado y la recompensa, lo que permite a los animales aprender más rápidamente y con menos estrés. Nuestro grupo de investigación ha demostrado previamente que el entrenamiento con clicker funciona como una forma de enriquecimiento cognitivo en ratones y ratas. En el presente estudio, adaptamos con éxito este enfoque de entrenamiento para jerbos mongoles (Meriones unguiculatus), adaptando el protocolo a las características de comportamiento específicas de la especie de jerbos. Una cohorte de 43 jerbos endogámicos (27 hembras y 16 machos) se sometió a un protocolo estandarizado de entrenamiento con clicker de 10 días, durante el cual aprendieron a acercarse e interactuar voluntariamente con la mano del experimentador a cambio de una recompensa de comida. Después del período de entrenamiento, los animales fueron sometidos a evaluaciones de comportamiento, incluida una prueba de campo abierto y una prueba estandarizada de interacción humana, para evaluar los efectos del entrenamiento en el comportamiento exploratorio y la interacción humano-animal. Nuestros hallazgos demuestran que la implementación del entrenamiento con clicker en jerbos es rápida, eficiente y bien tolerada. Los animales entrenados, particularmente las hembras, mostraron una mayor interacción voluntaria con la mano del experimentador y redujeron los comportamientos similares a la ansiedad. Estos resultados sugieren que los protocolos de entrenamiento con clicker adaptados a la especie pueden facilitar el desarrollo de la confianza entre el experimentador y el animal, disminuyendo en última instancia el estrés y mejorando tanto el bienestar animal como la fiabilidad de los resultados experimentales.

Introducción

Refinar el uso de animales en la investigación biomédica para reducir el estrés y mejorar el bienestar es un objetivo internacional ampliamente reconocido ^1,2,3. En 2022, la Comisión Europea informó que de los 838.539 animales utilizados en la Unión Europea (Alures), 3.440 eran jerbos⁴. En Alemania, aproximadamente 1,46 millones de vertebrados y cefalópodos se utilizaron en experimentos con animales en 2023 en virtud del artículo 7 (2) de la Ley de Bienestar Animal (TierSchG)⁵. Combinado con los animales sacrificados con fines científicos, el número total de animales de laboratorio utilizados en Alemania en 2023 alcanzó aproximadamente los 2,1 millones⁶. Estos números resaltan la relevancia del uso de jerbos en la investigación biomédica, enfatizando la necesidad de mejoras continuas en los protocolos para el bienestar animal.

Las necesidades de comportamiento de los animales de laboratorio y la importancia de las estrategias de manejo que apoyan el bienestar específico de la especie han sido ampliamente reconocidas como esenciales para la práctica ética y científica⁷. Las interacciones entre humanos y animales en la cría a menudo se limitan a la tarea esencial de transferir animales de jaulas sucias a limpias, sin fomentar un vínculo entre el manejador y el animal. Esta falta de interacción social puede conducir al estrés, que afecta negativamente el comportamiento y la fisiología de los animales, influyendo en última instancia en los resultados experimentales⁸. El manejo inadecuado es una fuente bien conocida de variabilidad en los datos de investigación⁹. Por ejemplo, levantar a los ratones por la cola aumenta la ansiedad y el estrés, mientras que los métodos de túnel o de mano abierta promueven un enfoque voluntario y reducen el comportamiento similar a la ansiedad^10,11. El manejo incluso se usa como un factor estresante agudo estandarizado en estudios de pequeños mamíferos debido a sus efectos consistentes sobre marcadores fisiológicos como los niveles de glucocorticoides¹². Estos hallazgos resaltan el impacto sustancial de las interacciones humanas breves y la necesidad de técnicas refinadas de manejo de bajo estrés¹³.

El refinamiento basado en el entrenamiento ha ganado un reconocimiento cada vez mayor como un método eficaz para mejorar tanto el bienestar animal como la calidad de la investigación^10,14. Uno de los métodos de entrenamiento más efectivos utilizados en la investigación con animales es el entrenamiento con clicker, que a menudo se combina con recompensas de alimentos^15,16. En las últimas décadas, se han publicado 34 estudios sobre el entrenamiento con clicker, lo que refleja el creciente interés científico en este enfoque de entrenamiento¹⁷. Los estudios muestran que los perros (47%) y los caballos (30%) son los animales de laboratorio más comúnmente entrenados, seguidos de gatos, ganado, peces, cabras y monos (cada uno 3%)¹⁷. Los animales entrenados pueden participar voluntariamente en los procedimientos, reduciendo el estrés y minimizando la necesidad de restricción física¹⁸.

También se han aplicado protocolos de refuerzo positivo a pequeños mamíferos. Estudios recientes informan un entrenamiento exitoso en conejos para procedimientos de cría y jerbos para la investigación del comportamiento^19,20. En algunos trabajos anteriores, mostramos que los ratones entrenados con clicker exhibieron un mayor contacto con los experimentadores y menos indicadores de comportamiento asociados con el estrés, como orinar, defecar, vocalizar y flotar 21,22,23. Esto es consistente con los hallazgos del campo veterinario, donde se ha demostrado que el entrenamiento de pequeños mamíferos, como conejos, roedores y hurones, reduce las respuestas de miedo y facilita el manejo a través de técnicas de refuerzo positivo²⁴. En particular, también observamos una diferencia específica por sexo en el rendimiento del entrenamiento: los ratones hembra mostraron una mayor motivación y una mayor frecuencia de respuesta que los machos en las sesiones de entrenamiento. Esto sugiere que los ratones hembra pueden participar más fácilmente en tareas de entrenamiento voluntario en condiciones estandarizadas²¹.

Si bien son prometedores, los enfoques de entrenamiento existentes para jerbos generalmente están vinculados a paradigmas de comportamiento específicos y no están diseñados para uso general en las rutinas diarias de cría²⁵. Aún no se ha establecido un protocolo estandarizado y ampliamente aplicable para los jerbos mongoles (Meriones unguiculatus), independiente de una configuración experimental particular. Para abordar esta brecha, el presente estudio tuvo como objetivo desarrollar y validar un protocolo simple de entrenamiento con clicker adaptado a las características específicas de la especie de jerbos. El protocolo se centra en la reducción del estrés a través de un manejo suave y un compromiso voluntario con el experimentador. Nuestra hipótesis es que este enfoque mejorará el bienestar animal, establecerá líneas de base de comportamiento más consistentes y aumentará la confiabilidad de los resultados experimentales. Debido a su simplicidad y flexibilidad, podría implementarse fácilmente en una amplia gama de entornos de laboratorio.

Para evaluar la efectividad y aplicabilidad del protocolo de entrenamiento propuesto, formulamos las siguientes predicciones específicas y comprobables:
Los jerbos entrenados realizarían de manera confiable el comportamiento objetivo, sentándose voluntariamente en la mano del experimentador, dentro de un período de entrenamiento de 10 días.
Los animales entrenados mostrarían una mayor interacción voluntaria con el experimentador en una prueba estandarizada, en comparación con los controles no entrenados.
Los animales entrenados exhibirían indicadores de comportamiento consistentes con un comportamiento similar a la ansiedad reducido, específicamente al pasar más tiempo en la zona central de una prueba de campo abierto.
Los jerbos hembras pueden mostrar respuestas conductuales más fuertes al entrenamiento que los machos, lo que podría reflejar las diferencias sexuales en la adaptación a la interacción humana.
Estas predicciones guiaron el diseño de las evaluaciones de comportamiento e informaron los criterios de evaluación para el protocolo.

Protocolo

El manejo de los jerbos y los procedimientos experimentales se llevaron a cabo de acuerdo con las pautas europeas, nacionales e institucionales para el cuidado de los animales. Aprobado por la licencia de las autoridades locales G 21-1-100. El protocolo incluye 10 días de entrenamiento (de lunes a viernes), con descansos los fines de semana (sábado y domingo). El protocolo se puede adaptar fácilmente para satisfacer necesidades específicas. Todos los materiales necesarios se enumeran en la Tabla de materiales.

1. Preparación de animales

1. Obtener el número requerido de animales del establecimiento de cría institucional. Mantenga a los animales bajo un ciclo de luz/oscuridad de 12 h en un sistema de alojamiento abierto.
2. Destete de la descendencia a las 5 semanas de edad. Etiquete a los animales después del destete y colóquelos en grupos del mismo sexo de 2-3 individuos por jaula.
3. Criar y alojar a todos los jerbos en jaulas Tipo 4 (590 x 380 x 200 mm; 1.815 m²). Equipa cada jaula con al menos tres túneles y mastica madera para enriquecerla. Proporcione alimentos y agua ad libitum (consulte la Tabla de materiales).
4. Asigne aleatoriamente animales a grupos entrenados (hembras: n = 27; machos: n = 16) y no entrenados (hembras: n = 16; machos: n = 5) para minimizar el sesgo de selección y garantizar condiciones basales comparables entre los tratamientos. Habituar a los animales tanto a la recompensa de comida como a la mano del experimentador dentro del entorno de la jaula de reproducción, como se describe en el paso 2.2. del protocolo. Al inicio del entrenamiento, los animales (hembras y machos) tenían aproximadamente 8 semanas de edad.

2. Habituación animal

NOTA: Si no se transportaron jerbos, se puede reducir el tiempo de habituación. La descripción general gráfica del protocolo se muestra en la Figura 1. En los animales criados internamente, el período de habituación de los juveniles puede acortarse drásticamente si los animales progenitores están bien habituados y la habituación manual continúa al menos una vez por semana desde el momento en que los cachorros se vuelven móviles. Esta fase preparatoria está diseñada para reducir la neofobia y establecer una asociación positiva con la manipulación de alimentos, asegurando una transición sin problemas al entrenamiento basado en clicker.

Figura 1: Descripción general del protocolo de habituación y entrenamiento para animales de origen externo y criados internamente: Esta figura describe la línea de tiempo y los pasos clave del procedimiento del protocolo de habituación y entrenamiento utilizado para jerbos de origen externo y jerbos criados internamente. El protocolo incluye el manejo inicial, la habituación a los alimentos, la introducción del clicker y el entrenamiento con clicker, ajustados según el origen y la preexposición de los animales. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

1. Semana 1: Habituación para animales de origen externo
   1. A su llegada, albergue jerbos en grupos del mismo sexo de 2-3 animales por jaula. Agregue material de anidación y ropa de cama de la caja de transporte, junto con una pequeña cantidad de gránulos de comida familiares para apoyar la aclimatación.
   2. Proporcione a cada jaula al menos 3-4 túneles (por ejemplo, tubos de cartón o refugios de plástico) y llene la ropa de cama a una profundidad de aproximadamente 8-10 cm para permitir el comportamiento de excavación típico de la especie.
   3. Evite levantar a los jerbos por la cola, ya que esto puede causar estrés y correr el riesgo de lesiones en la cola²⁶. En su lugar, use el manejo con cojines para transferir suavemente a los animales cuando sea necesario (véase la Figura 2A).
   4. Inicie la habituación basada en los alimentos inmediatamente esparciendo ~ 5 g de semillas de calabaza o girasol en la ropa de cama (consulte la Tabla de materiales). Esto fomenta la excavación y familiariza a los animales con la recompensa.
   5. Al día siguiente, introduce una mano que contenga ~10 semillas de recompensa en la jaula durante 2-3 min. Si los animales no toman las semillas directamente, coloque ~ 5 g de semillas en la ropa de cama.
   6. Repita este procedimiento una vez al día hasta que los animales tomen la comida de la mano. Esto suele tardar alrededor de una semana. Si tiene éxito antes, continúe con el entrenamiento con clicker (consulte el paso 3).
   7. Durante la habituación, evalúe las preferencias alimentarias ofreciendo diferentes tipos de semillas en la mano y contando las semillas restantes después de 2-3 minutos.
      NOTA: Proporcione alimentos en porciones pequeñas únicamente como recompensa para reforzar el comportamiento deseado. Asegúrese de que la recompensa alimentaria cumpla con las pautas nutricionales para animales de laboratorio. Si bien este protocolo utiliza semillas de calabaza y girasol, se pueden usar otras recompensas adecuadas si cumplen con los requisitos de higiene de las instalaciones. También se aceptan golosinas disponibles comercialmente diseñadas para animales de laboratorio.
2. Semana 1: Habituación para animales criados internamente
   1. Comience la habituación a la recompensa de comida directamente en la jaula de cría colocando ~ 5 g de semillas de calabaza o girasol en la ropa de cama, como se describe en el paso 2.1.3. Este paso debe iniciarse con la pareja reproductora antes del parto para establecer familiaridad con la recompensa.
   2. Una vez que los animales reproductores consuman semillas de la cama de manera confiable, ofrezca la recompensa de la mano del experimentador siguiendo el procedimiento descrito en el paso 2.1.4. Permita que los animales exploren y tome la recompensa voluntariamente durante 2-3 minutos al día.
   3. Después de que la hembra dé a luz, suspenda la habituación manual durante un mínimo de 1 semana. Durante este tiempo, continúe proporcionando recompensas de alimentos directamente en la ropa de cama de la jaula de 1 a 5 veces por semana para mantener la exposición.
   4. Reanude la habituación manual una vez que los cachorros se muevan (aproximadamente el día 18-21 después del parto). Permita que los animales exploren la mano con recompensa durante 2-3 minutos por sesión. Esto apoya la familiarización temprana de la descendencia con el contexto de entrenamiento.
   5. A las 5 semanas de edad, destete a los juveniles y alójelos en grupos del mismo sexo de 2-3 animales por jaula. Continúe la habituación colocando la recompensa de comida en la nueva ropa de cama de la jaula el día de la transferencia.
   6. Al día siguiente del destete, reintroducir la entrega manual de alimentos como se describe anteriormente (pasos 2.1.4 y 2.1.5).
   7. Repita este procedimiento una vez al día hasta que los animales tomen la comida de la mano.
   8. Una vez que los juveniles tomen la recompensa de la mano de manera constante, continúe con el protocolo de entrenamiento (consulte el paso 3). Esto suele tardar alrededor de 1 semana. Si tiene éxito antes, continúe con el entrenamiento con clicker (consulte el paso 3).

Figura 2: Manejo y habituación de un jerbo mediante refuerzo positivo. (A) Manejo ahuecado de un jerbo: Un jerbo se recoge suavemente con ambas manos de manera ahuecada para minimizar el estrés. (B) Inicio del entrenamiento: La mano del experimentador se coloca en el piso de la jaula con recompensas de comida en la palma. El jerbo recibe una recompensa y se usa un clic para marcar el comportamiento. (C) El jerbo se sienta voluntariamente en la mano del experimentador, lo que indica un entrenamiento exitoso. La recompensa de comida se coloca visiblemente en la palma de la mano. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

3. Entrenamiento con clicker

NOTA: Comience a entrenar solo si el jerbo acepta comida de la mano del experimentador. Si no es así, prolongue la fase de habituación a los alimentos más allá de la duración descrita en el paso 2.1. o 2.2.

1. Descripción general de la formación
   1. Realice una sesión de entrenamiento por jerbo por día, cada una de 4 minutos. Realice el entrenamiento directamente en la jaula del hogar del animal para reducir el estrés y mantener un entorno familiar. No es necesario retirar todos los elementos de enriquecimiento, pero asegúrese de que al menos un tubo o túnel permanezca en la jaula y que haya suficiente espacio para la mano del experimentador en el piso de la jaula.
      NOTA: Idealmente, la capacitación debe realizarse en una sala tranquila dedicada. Si esto no es factible, se puede usar un gabinete blindado dentro de la instalación de animales, siempre que reduzca efectivamente la exposición al ruido y las perturbaciones ambientales.
   2. Para evitar que las señales auditivas se conviertan en variables de confusión, evite estrictamente la comunicación verbal o los sonidos vocales durante las sesiones de entrenamiento. Limite cualquier interacción vocal con los animales a períodos fuera del contexto de entrenamiento.
   3. Utilice la repetición del comportamiento objetivo (p. ej., sentarse voluntariamente en la mano del experimentador) como un indicador práctico de habituación y aprendizaje exitosos durante el entrenamiento. Considere que el entrenamiento es exitoso cuando este comportamiento se observa al menos 5 veces por sesión durante tres días consecutivos (consulte el paso 3.4.4).
2. Preparación para la formación
   1. Prepare todos los materiales necesarios: corte las semillas de girasol por la mitad o las semillas de calabaza en tercios como recompensa. Proporcione un clicker de pie, una aplicación de temporizador que use señales de color (sin sonido) o cualquier otro temporizador silencioso (digital o analógico) y una jaula secundaria limpia (consulte la Tabla de materiales).
   2. Mueva la jaula de la casa a un área tranquila y libre de distracciones donde se llevará a cabo el entrenamiento para minimizar los factores estresantes ambientales. Evite ruidos repentinos o fuertes como hablar, portazos o sonidos de equipos durante la sesión, ya que los jerbos son muy sensibles a los estímulos auditivos.
   3. Elimine todos los elementos de enriquecimiento excepto un túnel. Asegúrese de que el túnel restante no obstruya el acceso al área de entrenamiento. Asegúrese de que haya suficiente espacio para acomodar una mano.
   4. Transfiera cualquier animal de compañía a la jaula secundaria limpia, incluida una pequeña cantidad de ropa de cama y enriquecimiento de la jaula doméstica para reducir el estrés durante la separación.
   5. Coloque el clicker de pie (un dispositivo mecánico que produce un sonido de clic cuando se presiona con el pie; consulte la Tabla de materiales) debajo de la mesa o superficie de entrenamiento. Esto permite al entrenador marcar el comportamiento deseado sin usar las manos, lo que garantiza un tiempo constante mientras mantiene ambas manos disponibles para interactuar con el animal.
3. Día de entrenamiento 1-5: Introducción al clicker
   1. Iniciar el temporizador: toca Iniciar en la aplicación o presiona el botón del temporizador silencioso.
   2. Párese o siéntese frente a la jaula. Coloque cinco piezas de la semilla seleccionada en la palma y coloque la mano plana sobre el sustrato en una esquina de la jaula.
   3. Haga clic en el momento en que el jerbo toma una semilla de la mano (Figura 2B). Si se toman varias semillas en secuencia, haga clic después de cada una. Use el sonido de clic para asociar la recompensa de comida con el comportamiento de alimentarse de la mano.
   4. Finalice el entrenamiento cuando el animal realice el comportamiento deseado 5 veces o cuando el temporizador llegue a cero (después de 4 min).
   5. A partir del día 3, dependiendo del comportamiento del jerbo, comience a ofrecer las semillas una a la vez. Sostenga la mano justo por encima del piso de la jaula para alentar al animal a estirarse o hacer un breve contacto con sus patas delanteras (Figura 2C). Esto ayuda a moldear el comportamiento gradualmente y prepara al animal para la siguiente fase de entrenamiento (ver paso 3.4).
4. Día de entrenamiento 6-10
   NOTA: Consejo de entrenamiento opcional: Si un jerbo es reacio a subirse a la mano, divida la tarea en pasos más pequeños que generen confianza. Primero, refuerce el comportamiento de tocar la mano antes de esperar que el animal trepe. Utilice esta estrategia de modelado para reducir el estrés y apoyar a los animales que requieren más tiempo para habituarse al manejo.
   1. Ofrezca solo una semilla a la vez. Sostenga la mano ligeramente elevada sobre el sustrato para alentar al jerbo a subirse completamente a la mano para acceder a la recompensa. Este paso se basa en el proceso de modelado anterior y representa la transición al comportamiento de destino final.
   2. Una vez que el jerbo se suba constantemente a la mano, haga clic para reforzar el comportamiento. Comience a ofrecer la semilla con la segunda mano (véase la figura 3). Mantenga la mano de entrenamiento por encima del piso de la jaula para que el jerbo deba trepar completamente sobre ella. Use una mano para sostener la semilla entre el pulgar y el índice (Figura 3A) o use una mano para presentar la recompensa sobre la palma de la otra mano, a la que se anima al animal a trepar (Figura 3B).
   3. Evalúe el éxito del entrenamiento como el jerbo que se sienta voluntariamente en la mano del experimentador 5 veces por sesión y acepta la recompensa de la palma o de la segunda mano.
   4. Concluir el entrenamiento después de una duración máxima de 3 semanas (5 días a la semana) o cuando el objetivo del entrenamiento se demuestre consistentemente durante un período de 3 días consecutivos.
      NOTA: Aunque el protocolo define una fase de entrenamiento estructurada de hasta 3 semanas, las sesiones de refuerzo pueden continuar más allá de este período si es necesario, particularmente cuando se espera un retraso entre el final del entrenamiento y el inicio de los procedimientos experimentales. El refuerzo positivo continuo puede ayudar a mantener el comportamiento aprendido y garantizar la confiabilidad a lo largo del tiempo. Recomendamos continuar el refuerzo una vez por semana después de completar con éxito la fase de entrenamiento. Sin embargo, para garantizar la consistencia y la comparabilidad entre los animales, se debe documentar un criterio de valoración de entrenamiento claro, definido por el rendimiento estable y repetido del comportamiento objetivo, antes de pasar a las tareas experimentales.

Figura 3: Ejemplos de posicionamiento de la mano durante la entrega de recompensas. (A) La recompensa se sostiene entre los dedos pulgar e índice de la misma mano, mientras el animal se sienta en la palma. (B) La recompensa se sostiene con los dedos índice y medio, mientras el animal se sienta en la palma de la otra mano. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

4. Realización de pruebas de comportamiento después del entrenamiento (día 10+)

1. Prueba de interacción
   NOTA: Variables dependientes: La principal variable dependiente es la duración de la interacción voluntaria entre el animal y la mano del experimentador durante el segundo minuto de la prueba. La interacción se define como el contacto físico directo, como olfatear, trepar o tocar la mano con las patas delanteras¹⁰. La puntuación del comportamiento se basa en grabaciones de video y se puede realizar manualmente o utilizando un software de análisis del comportamiento.
   1. Coloque una cámara montada en un trípode sobre la mesa donde se realizará la prueba de interacción.
   2. Si los animales están alojados en grupos, transfiera a los animales a una jaula secundaria limpia que contenga un puñado de ropa de cama de la jaula de la casa.
   3. Retire todos los túneles o refugios de la jaula de la casa y colóquelos en la jaula limpia. Deje solo la ropa de cama en la jaula de prueba (= jaula casera). Coloque la jaula de la casa, que ahora solo contiene ropa de cama, debajo de la cámara.
   4. Use un manejo ahuecado para devolver suavemente al animal de prueba a la jaula de su casa.
   5. Comienza a grabar. Permanezca quieto frente a la jaula durante 1 minuto. Después de 1 minuto, coloque una mano enguantada dentro de la jaula cerca del borde frontal durante 1 minuto más.
   6. Cambie los guantes entre animales de diferentes sexos.
2. Prueba de campo abierto
   NOTA: Variables dependientes: Las variables medidas incluyen la distancia total recorrida, el tiempo pasado en la zona central versus la periferia, el número de entradas centrales y los eventos de cría. Estos indicadores reflejan la actividad locomotora general y el comportamiento similar a la ansiedad. El aumento del tiempo en el centro generalmente se interpreta como una reducción de la ansiedad. El comportamiento se registra por video y se analiza mediante un software de seguimiento automatizado (consulte la Tabla de materiales).
   1. Coloque una cámara sobre la arena de campo abierto (100 cm x 100 cm x 40 cm).
   2. Comience a grabar el video, luego coloque suavemente al animal en el centro de la arena usando un manejo ahuecado. Registre el comportamiento durante 7 min.
   3. Después de la prueba, devuelva al animal a su jaula de origen. Limpie la caja y las paredes del campo abierto con etanol al 70% después de cada animal. Espere hasta que el etanol se haya evaporado por completo antes de colocar al siguiente animal en la arena.

5. Análisis estadístico

1. Si bien el cegamiento total del experimentador no fue factible durante las sesiones de entrenamiento debido a la naturaleza de la interacción directa con los animales, realice un análisis de datos de comportamiento de manera ciega para reducir el sesgo del observador.
2. Tanto para la interacción como para las pruebas de campo abierto, grabe todas las sesiones en video. Recopile variables dependientes manualmente por observadores entrenados (prueba de interacción) o automáticamente utilizando software de análisis de comportamiento (ver Tabla de materiales) para registros de campo abierto (tiempo pasado en la zona central).
3. Antes del análisis estadístico, pruebe todos los datos para determinar su distribución normal utilizando la prueba de Shapiro-Wilk. Identifique valores atípicos y excluya mediante el método de regresión robusta y eliminación de valores atípicos (ROUT) con una tasa de descubrimiento falso (Q) establecida en 10%. Para analizar los efectos del entrenamiento y el sexo en los resultados conductuales, realice un ANOVA de medidas repetidas de dos vías para la prueba de interacción y un ANOVA mixto de dos vías para evaluar el tiempo pasado en el centro de la prueba de campo abierto.
4. Categorizar la prueba de interacción y el tiempo acumulado en la zona central del campo abierto como las principales variables dependientes. Realice comparaciones post hoc utilizando la prueba de diferencia significativa honesta (HSD) de Tukey. Un valor de p de < 0,05 se consideró estadísticamente significativo. Todos los análisis estadísticos se realizaron utilizando software estadístico (ver Tabla de materiales).

Resultados

Todos los jerbos entrenados aprendieron la tarea asignada en 10 días, lo que demuestra la viabilidad del entrenamiento con clicker en esta especie. La Figura 4 presenta el éxito del entrenamiento de jerbos hembras (n = 27) y machos (n = 16) desde el día 1 hasta el día 10. El ANOVA de medidas repetidas que analizó el rendimiento en el día 1 de entrenamiento versus el día 10 en jerbos machos y hembras no reveló ningún efecto de interacción significativo entre el tiempo y el sexo (F _{(1, 41)} = 0.003; p = 0.955), lo que indica que la mejora a lo largo del tiempo fue similar para ambos sexos. Se observó un efecto altamente significativo del tiempo (F_{(1, 41}) = 38.83, p < 0.0001), mostrando que los jerbos de ambos sexos cumplieron plenamente con el protocolo de entrenamiento al día 10.

El hecho de que los jerbos entrenados cumplieran con la tarea asignada en 10 días valida la efectividad de la metodología de entrenamiento con clicker en esta especie. Esta tasa de éxito se alinea con los principios fundamentales del condicionamiento operante, donde el clicker funciona como un reforzador secundario que cierra la brecha entre el comportamiento deseado y la recompensa primaria (semillas de girasol / calabaza). El clicker sirve como puente entre el comportamiento y la recompensa, lo que permite al entrenador marcar el momento exacto en que ocurre el comportamiento deseado con un tiempo preciso. Esto ayuda a crear una asociación clara e inmediata entre la acción y su consecuencia positiva.

Las pruebas de comportamiento se realizaron después de completar el protocolo de entrenamiento, específicamente después del día 10 de entrenamiento. El análisis de ANOVA mixto de dos vías mostró que los jerbos entrenados aumentaron la interacción voluntaria con la mano del experimentador (Figura 5A). Se detectó un efecto significativo del entrenamiento (F _{(1, 60)} = 22,89; p < 0,0001), y los animales entrenados se involucraron con mayor frecuencia con el experimentador. El análisis post hoc reveló las diferencias específicas de entrenamiento en mujeres (p < 0,0001, n = 27) y hombres (p = 0,049, n = 16). No se observó el efecto sexual (F _{(1, 60)} = 0,621, p = 0,434), lo que sugiere que los jerbos machos y hembras se desempeñaron de manera similar en general. El análisis no reveló interacción significativa entre el sexo y el entrenamiento (F _{(1, 60)} = 0,078, p = 0,781).

El aumento de la interacción voluntaria de los jerbos indica que el entrenamiento con clicker redujo efectivamente las respuestas de miedo innatas a través del refuerzo positivo. Esto puede ayudar a minimizar el estrés durante el manejo y los procedimientos experimentales, mejorando tanto el bienestar animal como la calidad de los datos.

Se llevó a cabo una evaluación del comportamiento similar a la ansiedad después del entrenamiento utilizando la prueba de campo abierto. La Figura 5B ilustra la duración acumulada en la zona central. No se observó interacción entre el sexo y el entrenamiento en la duración acumulada en la zona central de la prueba de campo abierto (F _{(1, 60)} = 0,101, p = 0,751). Además, no se encontró un efecto principal significativo del sexo (F_{(1, 60)} = 0,001, p = 0,969. Se observó un efecto principal altamente significativo del entrenamiento (F _{(1, 60)} = 17.26, p < 0.0001; Prueba de Tukey HSD: p = 0,003 y p = 0,052 en hembras y machos, respectivamente), lo que indica que los jerbos entrenados pasaron significativamente más tiempo en el centro en comparación con los no entrenados. Estos resultados reflejan las respuestas conductuales medidas después de que los animales completaron el período de entrenamiento de 10 días.

La OFT explota el conflicto natural de acercamiento-evitación que experimentan los roedores cuando exploran nuevos entornos²⁷. Los jerbos pueden equilibrar su impulso innato de explorar con su tendencia natural a evitar espacios abiertos potencialmente peligrosos. Por lo tanto, el hecho de que los jerbos entrenados pasaran más tiempo en la zona central que provoca ansiedad indica que el entrenamiento con clicker mejoró su disposición conductual general de exploración, lo que puede indicar mejoras en el bienestar general.

Figura 4: Validación del entrenamiento con clicker. Éxito del entrenamiento el día 1 versus el día 10 para sujetos masculinos y femeninos: El éxito del entrenamiento se evaluó en jerbos femeninos (barras blancas, n = 27) y machos (barras grises, n = 16) el día 1 y el día 10 del protocolo de entrenamiento. Un ANOVA de medidas repetidas de dos vías reveló un efecto principal significativo del día de entrenamiento (p < 0,0001). Las comparaciones múltiples utilizando la prueba HSD de Tukey mostraron un aumento significativo en el éxito del entrenamiento desde el día 1 hasta el día 10 tanto en mujeres (p < 0,0001, n = 27) como en hombres (p < 0,0001, n = 16). Los datos se presentan como media ± SD. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5: Evaluación del comportamiento. (A) Prueba de interacción: La duración de la interacción con la mano del experimentador (en s) se midió en jerbos hembras y machos entrenados (barras grises) y no entrenados (barras blancas) después de que los animales completaron el período de entrenamiento de 10 días. El ANOVA mixto de dos vías reveló un efecto principal significativo del entrenamiento (p < 0,05) y un efecto de interacción significativo (p < 0,05). El análisis post hoc utilizando la prueba HSD de Tukey mostró que los ratones entrenados interactuaron significativamente más tiempo con la mano del experimentador en comparación con los ratones no entrenados (hembras: p < 0,0001, machos: p = 0,0497). Los datos se presentan como media ± DE. Mujeres entrenadas: n = 27; mujeres no entrenadas: n = 16; machos entrenados: n = 16; Hombres no entrenados: n = 5. (B) Prueba de campo abierto: La prueba se realizó después de completar el protocolo de entrenamiento, específicamente después del día 10 de entrenamiento. La duración acumulada en la(s) zona(s) central(es) se midió en jerbos hembras y machos entrenados (barras grises) y no entrenados (barras blancas). Se realizó un ANOVA mixto de dos vías para analizar los efectos del entrenamiento en la exploración de la zona central. Múltiples comparaciones utilizando la prueba HSD de Tukey revelaron que las hembras entrenadas pasaron significativamente más tiempo en la zona central en comparación con las hembras no entrenadas (p = 0,003). Los datos se presentan como media ± DE. Mujeres entrenadas: n = 27; mujeres no entrenadas: n = 16; machos entrenados: n = 16; Hombres no entrenados: n = 5. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discusión

Los hallazgos muestran la efectividad del protocolo propuesto para habituar a los jerbos a la interacción humana en entornos experimentales. La capacidad de todos los animales entrenados para completar la tarea deseada en 10 días destaca la eficiencia de este método.

Un paso crítico en el protocolo es la habituación gradual a la mano del experimentador, asegurando que los jerbos asocien la interacción humana con un estímulo positivo. El uso de recompensas específicas de la especie optimiza aún más el proceso de entrenamiento. Las modificaciones, como ajustar la duración de las sesiones de entrenamiento o cambiar el tipo de recompensa, podrían adaptar aún más el protocolo a las diferencias individuales entre los jerbos y optimizarlo para los requisitos específicos del experimento.

Nos centramos en las notables diferencias específicas de la especie en el comportamiento y la dinámica de aprendizaje entre ratones y jerbos mongoles. Tales diferencias deben tenerse en cuenta al diseñar protocolos de capacitación. Por ejemplo, los ratones tienden a ser más neofóbicos y sensibles al estrés, y a menudo requieren más tiempo para habituarse a nuevos entornos e interacción humana²⁸. Por el contrario, los jerbos exhiben un mayor impulso exploratorio y curiosidad social, lo que puede facilitar un compromiso más rápido con las tareas de entrenamiento²⁹. En el presente estudio, los jerbos se acercaron fácilmente a la mano del experimentador y aprendieron a asociar el clicker con una recompensa en menos sesiones de lo que normalmente se informa para los ratones^21,22. Sin embargo, los jerbos también mostraron una mayor variabilidad individual, particularmente en los machos, lo que puede reflejar el estrés específico del sexo o factores motivacionales que son menos pronunciados en los modelos de ratón. Estas distinciones resaltan la importancia de las estrategias de entrenamiento adaptadas a las especies y sugieren que los jerbos pueden beneficiarse de sesiones más cortas centradas en recompensas con mayor énfasis en la interacción voluntaria, mientras que los ratones pueden requerir una desensibilización más gradual y una repetición constante. Comprender estas diferencias conductuales y cognitivas es crucial para refinar los protocolos de entrenamiento y maximizar su efectividad en todas las especies.

Los jerbos mongoles pueden beneficiarse sustancialmente del entrenamiento con clicker no específico o generalizado, que se centra en la interacción positiva entre humanos y animales y en el condicionamiento conductual básico en lugar de la preparación para una configuración experimental particular. Este entrenamiento generalizado mejora la tolerancia al manejo, reduce los niveles de estrés basal y promueve un comportamiento más^predecible. El entrenamiento no específico promueve la flexibilidad conductual y la interacción voluntaria constante con el experimentador, lo que hace que los animales sean más adaptables a diferentes entornos, configuraciones o paradigmas de prueba 16,31,32. Esto es particularmente beneficioso en estudios a largo plazo o experimentos de varias fases, donde los animales están expuestos a una variedad de procedimientos. En el presente estudio, aunque el entrenamiento no estaba directamente relacionado con un solo protocolo de prueba, los jerbos mostraron una mejor interacción con el experimentador y un comportamiento reducido relacionado con el estrés, lo que respalda la idea de que la habituación general a través del refuerzo positivo puede mejorar la resiliencia experimental general y el bienestar animal.

Además de una mayor interacción con el experimentador, las hembras entrenadas pasaron mucho más tiempo en la zona central de la prueba de campo abierto. Este patrón de comportamiento se interpreta comúnmente como una reducción en el comportamiento similar a la ansiedad en roedores, particularmente en respuesta a entornos novedosos o levemente aversivos³³. Estos hallazgos sugieren que el entrenamiento con clicker puede contribuir a disminuir los indicadores conductuales de ansiedad, mejorando así la capacidad de los animales para hacer frente a los procedimientos experimentales. Esto respalda la conclusión más amplia de que los protocolos de habituación basados en el refuerzo positivo pueden mejorar la resistencia al estrés y la estabilidad del comportamiento en jerbos de laboratorio. Más allá de la reducción del estrés, el entrenamiento con clicker tiene implicaciones más amplias para los resultados experimentales³⁴. Los jerbos entrenados demostraron una mayor tolerancia al manejo, lo que minimiza las variaciones fisiológicas inducidas por el estrés que podrían confundir los resultados de la investigación. Se han reportado hallazgos similares en otras especies, incluidos conejos y ratones de laboratorio, donde los animales entrenados con clicker exhibieron una mayor interacción con el experimentador y menos comportamientos relacionados con la ansiedad y la depresión, como reducción de la micción, la defecación, la vocalización y el comportamiento flotante^19,21.

Estos resultados resaltan el potencial del entrenamiento con clicker para mejorar tanto el bienestar animal como la consistencia de los datos de comportamiento al reducir la variabilidad en las respuestas relacionadas con el estrés. Es importante aclarar que el objetivo de este protocolo no es condicionar a los animales para que asocien procedimientos inherentemente aversivos, como las extracciones de sangre, con estímulos positivos como el clicker. Más bien, el objetivo es reducir el estrés inicial, habituar a los animales a la interacción humana y promover la participación voluntaria en tareas neutrales o levemente desafiantes. Si bien algunos estudios han explorado el uso del refuerzo positivo para preparar a los animales para procedimientos más invasivos³⁵, esto requiere un proceso de desensibilización cuidadosamente estructurado y está fuera del alcance del protocolo actual. La aplicación incorrecta de las señales de clicker en contextos asociados con la incomodidad podría resultar en asociaciones negativas no deseadas. Sin embargo, cuando se aplican correctamente, las técnicas de refuerzo positivo pueden ayudar a los animales a hacer frente a procedimientos potencialmente aversivos al mejorar la previsibilidad y permitir un grado de control³⁶. Se necesitan más estudios para determinar si los jerbos pueden ser entrenados de manera confiable para tales contextos, como se ha demostrado con éxito en otras especies como perros y primates no humanos^37,38.

A pesar de su éxito, el método tiene limitaciones. Algunos jerbos requirieron períodos de habituación más largos, lo que indica variabilidad individual en la velocidad de aprendizaje. Además, el número relativamente bajo de jerbos machos no entrenados limita el poder estadístico del análisis, lo que dificulta sacar conclusiones sólidas. Aumentar el tamaño de la muestra en este grupo probablemente mejoraría la confiabilidad y la interpretabilidad de los resultados. Los estudios adicionales deben explorar las posibles diferencias sexuales en las respuestas al estrés y los mecanismos de aprendizaje.

Las implicaciones más amplias de este estudio se extienden más allá de la reducción del estrés. La implementación de protocolos de entrenamiento estructurados como parte de la cría estándar puede reducir la variabilidad causada por las respuestas fisiológicas inducidas por el estrés y mejorar la confiabilidad de los resultados experimentales^39,40. Esto es especialmente relevante en disciplinas como la neurociencia o la investigación metabólica, donde el estrés es un factor de confusión crítico. La notificación cuidadosa y la estandarización de los procedimientos de capacitación son esenciales para evitar efectos de enriquecimiento no deseados.

En el futuro, la investigación futura debería explorar programas de refuerzo alternativos, automatización de procedimientos de entrenamiento y efectos a largo plazo en todas las especies. Con un apoyo científico cada vez mayor, el entrenamiento con clicker representa una valiosa estrategia de refinamiento que puede mejorar tanto la calidad de los datos como el bienestar animal. La estandarización de los protocolos de capacitación y manejo en todos los laboratorios podría ayudar a mejorar la reproducibilidad y apoyar una adopción más amplia de prácticas humanas y efectivas en la investigación biomédica.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Jaulas	Zoonlab GmbH	3010006	590 x 380 x 200 mm; 1.815 m2
Cámara	Sony	HDR-CX240E	digital HD Cámara Grabadora
Pellets de comida	Ssniff	V1644-000	Art. Nr. I-Clicker-Blau
Foot Clicker		https://www.hundeschulen.com
GraphPad Prism	GraphPad Software, Inc	https://www.graphpad.com/features	Versión 10 para ventanas
Campo abierto Caja	Noldus	MXO1S-M001	ópalo 100 x 100 x 40 cm
Semillas de calabaza	REWE	8820911	visor de
pilón	Basler	https://www.baslerweb.com/de-de/software/pylon/
Semillas de girasol	Trípode
	Manfrotto	GT- mkbfra4gtxp bh	Befree GT
Túneles	Plexx	14179	152 x 76 x 3 mm