Desarrollo, caracterización y evaluación de sistemas de líquidos iónicos basados en CAGE para administración transdérmica

Resumen

Este protocolo analiza la estandarización para la preparación de sistemas de líquidos iónicos basados en CAGE para garantizar la reproducibilidad y optimizar el flujo de trabajo general en diferentes laboratorios científicos.

Resumen

Los líquidos iónicos han ganado recientemente un notable reconocimiento por sus aplicaciones en la administración de fármacos, en particular su potencial para permitir la penetración cutánea de los fármacos y mejorar la permeabilidad de los fármacos. Además de mejorar la permeabilidad de la barrera, los líquidos iónicos tienen excelentes propiedades de solvatación, lo que aborda el desafío de disolver medicamentos poco solubles. Debido a la gran asimetría entre los cationes orgánicos y los aniones, estas sales funcionales permanecen líquidas a temperatura ambiente. Desde el punto de vista de la aplicación, los líquidos iónicos proporcionan un enfoque prometedor y altamente sintonizable para servir a múltiples áreas terapéuticas. Un líquido iónico biocompatible compuesto de colina y ácido geránico (CAGE), en una relación de iones estequiométricos de 1:2, tiene un inmenso potencial para la administración transdérmica de una amplia gama de ingredientes farmacéuticos activos, incluidas moléculas pequeñas, péptidos, proteínas y ácidos nucleicos. Esto tiene un impacto mínimo en la función de barrera de la piel. En este documento, compartimos nuestros métodos para la preparación, caracterización y evaluación de CAGE. Se muestran resultados representativos para la caracterización de CAGE mediante espectroscopia de RMN, calorimetría diferencial de barrido, valoración de Karl-Fischer para el análisis del contenido de agua y estudios de interacción de barrera ex vivo en piel porcina.

Introducción

La piel es el órgano más grande y vital del cuerpo, ya que sirve como barrera protectora contra sustancias nocivas y al mismo tiempo previene la pérdida de agua¹. Al mismo tiempo, la aplicación de medicamentos sobre y a través de la piel ofrece una amplia gama de ventajas. En comparación con los inyectables y la administración oral, la administración cutánea aumenta el cumplimiento del paciente y evita el metabolismo de primer paso en el hígado². Especialmente para las afecciones de la piel, las formulaciones administradas por vía cutánea se destacan por proporcionar un efecto localizado, disminuyendo la exposición sistémica³. Sin embargo, la naturaleza casi impermeable de la piel desafía significativamente el éxito del parto^{cutáneo 4}. La piel humana consta de tres capas diferentes: la epidermis, la dermis y la hipodermis⁴. La epidermis es la capa externa de la piel y se puede dividir en diferentes subcapas, siendo el estrato córneo la capa más externa, compuesta principalmente de queratinocitos. El estrato córneo actúa como una barrera de permeación prominente para la mayoría de las moléculas, inhibiendo su transporte a capas más profundas de la piel⁵. Esta función de barrera surge de la presencia de corneocitos incrustados en una disposición lipídica muy compacta, que comprende principalmente fosfolípidos, esteroles y ceramidas, a menudo denominada estructura de ladrillo y mortero⁶. Para superar esta barrera cutánea, se han desplegado potenciadores químicos de la permeación (CPE) para administrar macromoléculas, ya que alteran la estructura del estrato córneo al interactuar con los lípidos y proteínas presentes en él⁷.

Los líquidos iónicos (IL) se han convertido en los CPE de próxima generación⁸. Estos consisten en cationes y aniones orgánicos voluminosos, dispuestos de manera asimétrica y coordinados por interacciones iónicas débiles y no direccionales⁹. Debido a estas débiles fuerzas intermoleculares, los IL existen como líquidos por debajo de 100 °C y no pueden empaquetarse en una estructura cristalina bien definida¹⁰. Los IL son altamente sintonizables, ya que su eficacia depende en gran medida de la elección de cationes o aniones y de la relación estequiométrica entre estos iones. Por lo tanto, tienen alta capacidad solubilizante y estabilizadora para fármacos con hidrofobicidades variadas¹¹. Los IL sirven a las propiedades únicas de los lípidos y polímeros al proporcionar una liberación sostenida y encapsulación de macromoléculas, respectivamente¹².

Los IL biocompatibles basados en colina y ácido geránico (CAGE), presentes en una relación molar estequiométrica de 1:2, tienen aplicaciones significativas en la administración transdérmica de compuestos hidrófilos e hidrofóbicos. Se ha informado que CAGE mejora significativamente la administración transdérmica de proteínas (insulina¹³) y ácidos nucleicos (ARNip¹⁴). CAGE se prepara mediante una reacción de metátesis salina entre bicarbonato de colina y ácido geránico, con CO₂ como subproducto¹⁵. La reacción de metátesis salina ofrece la formación de nuevos compuestos mediante intercambio iónico en condiciones suaves de manera directa, rápida y altamente selectiva. En general, hay una falta de flujos de trabajo fáciles de seguir para el desarrollo y la evaluación de CAGE IL. Por lo tanto, aquí proporcionamos uno de esos flujos de trabajo, detallando cada etapa de la preparación de CAGE para permitir que los investigadores de diferentes orígenes ingresen a este espacio de investigación.

Protocolo

Todos los procedimientos experimentales se llevaron a cabo de conformidad con la Directiva de la Unión Europea 2010/63 y fueron aprobados por la Administración Veterinaria y de Alimentos de Dinamarca (Licencia No. DK-13-oth-931833).

1. Preparación de la jaula mediante reacción de metátesis salina

1. Recristalización del ácido geránico (85% de pureza, peso mol 168,23 g/mol)
   1. Tome un matraz de fondo redondo de 500 ml y mida su peso.
   2. Pesar 40,0 g de ácido geránico en el matraz. Esto corresponde a 0,2 moles de ácido geránico.
   3. Recristalizar el ácido geránico en un 70:30% (p/p) de ácido geránico:acetona: Añadir (40 g*0,85*0,30)/(0,70*0,784 g/mL) = 18,42 mL de acetona al matraz de fondo redondo.
   4. Tome un vaso de precipitados de 5 L y prepare aproximadamente 0,5 L de hielo seco y etanol.
   5. Coloque el matraz de fondo redondo en la mezcla fría de hielo seco y etanol sin girar para permitir el enfriamiento externo. Decantar acetona e impurezas del ácido geránico sólido/recristalizado cuando la cristalización ha alcanzado el equilibrio (correspondiente aproximadamente al volumen de la acetona agregada, generalmente dentro de 0.5-2 horas). Repita este paso 5-6 veces para garantizar una pureza suficiente.
   6. Retire la acetona restante por evaporación rotatoria al vacío a 40 rpm durante al menos 20 min o hasta que el matraz de fondo redondo ya no se sienta frío al tocarlo (la acetona tiene una presión de vapor de 240 mbar a 20 °C).
   7. Pesar y anotar la masa del matraz y el ácido geránico recristalizado. Calcule el rendimiento en función del peso inicial del matraz vacío. El rango de rendimiento esperado es del 60-80%.
2. Reacción de metátesis salina
   1. Para una relación molar de 2:1 de ácido geránico:colina, calcule el número de moles de colina, teniendo en cuenta el rendimiento de la recristalización del ácido geránico. Por ejemplo, con un rendimiento del 70% se debe agregar 0,07 mol de colina (0,2 * 70 / 100 = 0,14, 0,14 / 2 = 0,07).
   2. El bicarbonato de colina tiene una pureza del 80% y un peso molecular de 165,19 g/mol. En consecuencia, agregue 14,45 g (0,07 * 165,19 = 11,56 g; 100/80 * 11,56 g = 14,45 g) de bicarbonato de colina gota a gota para evitar el derrame.
   3. Revuelva la muestra durante la noche a una velocidad de 300 rpm (o apropiada) a temperatura ambiente (18 ± 3 h) o hasta que cese la evaporación de CO₂ .
   4. Seque la muestra por evaporación rotatoria a 60 °C, 30 mbar durante 40 min. Primero, aumente la temperatura, luego reduzca lentamente la presión para evitar la formación de espuma.
   5. Alícuotas CAGE en viales de vidrio en volúmenes apropiados para la aplicación prevista (por ejemplo, 2 ml de CAGE en viales de vidrio de 4 ml).
   6. Seque los viales al vacío a 60 °C durante 48 h.

2. Caracterización de CAGE

1. Espectroscopia de resonancia magnética nuclear (RMN)
   1. Disuelva CAGE a una concentración de 25 mg/ml en dimetilsulfóxido deuterado (d-DMSO), asegurando un volumen final de al menos 500 μl.
      NOTA: Los disolventes deuterados son esenciales en la RMN para evitar la interferencia de los átomos de hidrógeno en el disolvente.
   2. Transfiera 500 μL de la solución preparada a un tubo de RMN limpio y seco (normalmente de 5 mm de diámetro, según el instrumento). Selle el tubo con una tapa para evitar la evaporación y la contaminación.
      NOTA: Evite introducir burbujas de aire, ya que pueden afectar la homogeneidad del campo magnético.
   3. Utilice un espectrómetro de RMN (por ejemplo, 400 MHz) con los siguientes parámetros:
      -Número de exploraciones: 8-16 para ^{RMN de 1}H; 1.000-5.000 para RMN ^{de 13}C (dependiendo de la concentración y la relación señal/ruido (S/N) deseada.
      -Retardo de relajación (D1): 1-2 s para ^{RMN de 1}H y ¹³C.
   4. Procese los datos utilizando el software adecuado.
      1. Ajuste las formas óptimas de los picos mediante la corrección de fase y de línea de base.
         NOTA: Esto se realiza normalmente en el software de RMN dentro de la pestaña Procesamiento o Corrección (según el software utilizado), donde están disponibles herramientas automáticas para el ajuste de fase y la corrección de la línea de base.
      2. Utilice el pico de disolvente residual (d-DMSO) como referencia: ~ aproximadamente 2,50 ppm durante ¹h, ~ aproximadamente 39,52 ppm para ^{RMN de 13}C. Consulte Fulmer et ^al.15para referencias de impurezas.
   5. Integre picos y asígnelos a protones en la estructura (ver Figura 1).
2. Contenido de agua determinado por la valoración de Karl Fischer
   1. Disuelva 300 mg de CAGE en 300 μL de metanol. Cargue en una jeringa de 1 ml y pese antes y después de la inyección.
   2. Determine el contenido de agua utilizando un valorador coulométrico Karl Fischer según las instrucciones del fabricante.
      1. Inyecte la muestra en la celda de valoración a través del tabique con una jeringa, introduzca el peso vacío de la jeringa y pulse Intro. El resultado aparecerá como % p/p.
      2. Ajuste el contenido de agua del metanol para obtener el contenido real de agua en CAGE (generalmente 1-2% p / p). (W_muestra =_{W muestra + diluyente}*(m_muestra+_{m diluyente}) - (_{W diluyente}*m_diluyente)/_{m muestra}).
3. Estabilidad térmica de CAGE por calorimetría diferencial de barrido (DSC)
   1. Coloque 3-5 mg de cada muestra en bandejas de aluminio Tzero y selle con una tapa hermética.
   2. Analice las muestras utilizando un DSC en el rango de temperatura de 80 °C a - 80 °C con un período isotérmico de 10 min antes de enfriar a - 80 °C.
   3. Utilice una velocidad de calentamiento/enfriamiento constante de 5 °C/min y una purga de nitrógeno de 50 mL/min.
   4. Procese los datos utilizando el software adecuado.

3. Evaluación ex vivo de la interacción de la barrera cutánea

1. Procesamiento del dermatoma de la piel porcina
   1. Corte poliestireno expandido (EPS) para que se ajuste a la hoja del dermatoma y envuélvala con cinta de injerto. Utilice la piel recolectada de la región del lomo de los cerdos con un bisturí. Aquí, la piel se obtuvo de cerdos Danish Landrace o Yorkshire hembras de 3,5 meses de edad (30-40 kg).
   2. Retire el músculo y el tejido graso. Para facilitar la dermatosificación del tejido, es importante asegurar un lado basolateral plano y uniforme.
   3. Elimine la mayor cantidad de vello posible de la piel con una recortadora de cabello.
   4. Enjuague la piel con solución salina tamponada con fosfato (PBS, pH 7.4) para eliminar la sangre y el vello suelto.
   5. Corta la piel en trozos más pequeños (5 cm x 15 cm) con un cuchillo para encajar los bloques de EPS.
   6. Fije la piel al bloque de EPS con agujas.
   7. Ajuste el dermatoma a 0,5 mm de grosor y seccione la piel.
   8. Guarde la piel dermatomeda entre dos capas de cinta de injerto y guárdela a -70 °C.
2. Pérdida de agua transepidérmica (TEWL)
   1. Prepare PBS (pH 7,4) disolviendo 1 tableta en 200 ml de agua ultrapura. Desgasificar durante 20 min en un baño ultrasónico.
   2. Encienda el baño de agua conectado a las celdas de difusión Franz. Agregue aproximadamente 12 ml de PBS desgasificado y una perla magnética a cada celda. Encienda la agitación magnética (por ejemplo, a 600 RPM) asegurando una distribución uniforme en el medio receptor sin crear turbulencias. Tenga en cuenta que no todas las configuraciones de celdas Franz permiten un control preciso de la velocidad de agitación. Ajuste la fuente de calor para alcanzar una temperatura de 37 °C en el medio receptor.
   3. Cortar la piel dermatomed en trozos de aproximadamente 3 cm de diámetro (o tamaño adecuado) con un bisturí y montar cuidadosamente la piel dermatomed en las células de difusión de Franz con pinzas y anillos de sellado, con el estrato córneo hacia arriba.
   4. A continuación, llene completamente las cámaras receptoras con PBS con una pipeta Pasteur de vidrio, asegurándose de que estén llenas hasta la marca que indica el volumen conocido del medio receptor. Elimine las burbujas de aire invirtiendo cuidadosamente las celdas. Hidratar durante 30 min.
   5. Encienda el dispositivo TEWL y equilibre durante 20 minutos hasta que esté estable de acuerdo con las pautas del fabricante.
   6. Coloque la sonda TEWL en cada celda Franz y presione Inicio en el software. Mantenlo presionado hasta que se muestre una lectura.
   7. Añadir 300 μL de muestra sobre la piel (por triplicado, n=3) y ocluir colocando cinta de injerto encima de la célula de Franz. Incubar durante 24 h a 37 °C (temperatura del medio receptor).
   8. Retire la muestra limpiando el pañuelo con toallitas sin pelusa. Dejar actuar 30 min.
   9. Mida TEWL para cada célula para examinar el efecto de las muestras en la barrera cutánea. Calcule los valores de TEWL en relación con los valores previos a la exposición y ajústelos en relación con el control de PBS (TEWL relativo = (TEWL post-TEWL-pre_/TEWL_pre)/(TEWL(PBS_)post-TEWL(PBS)pre/TEWL(PBS)_pre))*100.

Resultados

Espectros de RMN
El objetivo de esta técnica es confirmar la formación exitosa de CAGE mediante el análisis de los entornos químicos de los átomos de hidrógeno y carbono utilizando espectroscopia de RMN ^{de 1}H y ¹³C. Los espectros resultantes proporcionan cambios químicos característicos, patrones de división y valores de integración que reflejan la estructura molecular y la composición de la IL sintetizada. El espectro de RMN de protones en la Figura 1

Discusión

El método de preparación de CAGE descrito en este trabajo fue adoptado de la literatura¹⁵. Sin embargo, es importante reconocer que el proceso de síntesis es sensible a varios factores externos, que pueden influir en las propiedades del producto final. Por lo tanto, una vez preparado, el sistema CAGE debe caracterizarse utilizando técnicas como la espectroscopia de RMN para confirmar la formación de CAGE.

Como se muestra en la

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Tubos RMN de 5 mm	Sigma Aldrich	41121705
Acetona	VWR	23L064039
Sartenetas Tzero de aluminio	TA Instruments	90,16,83,901
Dispositivo de Flujo Aqua	Sistemas Biox
Bruker Avance III RMN	Bruker		Instrumento para espectroscopía de RMN
Bicarbonato de colina	Sigma Aldrich	C7519
Dermatome	Zimmer Biomet
Calorímetro de barrido diferencial	TA Instruments
Etanol	VWR	23J314009
Poliestireno expandido	Unicel
Celdas de difusión de Franz	PermeGear
Ácido geránico	Sigma Aldrich	427764
Cinta de injerto	Parafilm
Karl Fischer Titrator	Mettler Toledo	30252662
Metanol	VWR	85681.32
PBS	Fischer Scientific	10388739
Software de análisis universal TA 2000	TA Instruments		Software para el análisis de datos DSC
TopSpin Software	Bruker		Software para el análisis de datos de RMN