Artículo de método

Aplicación de la optogenética combinada con el registro de fotometría de fibra en la regulación de los circuitos neuronales-funciones viscerales por electroacupuntura

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DOI:

10.3791/68667

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19 de septiembre de 2025

 ,  ,  ,  , 
1Institute of Acupuncture and Moxibustion, China Academy of Chinese Medical Sciences, 2Northeast Asia Research Institute of Traditional Chinese Medicine, Changchun University of Chinese Medicine

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

El propósito de este experimento es establecer un enfoque novedoso para la integración simultánea de la optogenética, el registro de señales de calcio intracerebrales y el monitoreo de la motilidad gástrica, ofreciendo un paradigma novedoso para el monitoreo en tiempo real de la relación entre la estimulación somática y las interacciones entre el circuito neuronal y la función visceral, que se aplica a la investigación de la acupuntura.

Resumen

Este protocolo describe una técnica para la manipulación optogenética de tipos específicos de neuronas y el registro en tiempo real de los efectos de la electroacupuntura en Zusanli (ST36) sobre las señales de calcio nuclear y la motilidad gástrica en ratones bajo anestesia in vivo. La exploración de los mecanismos centrales que subyacen a la eficacia de la acupuntura se ha visto limitada por limitaciones tecnológicas. Sin embargo, el avance de la tecnología de imágenes optogenéticas y ópticas ha impulsado el desarrollo de la neurociencia. El registro de fotometría de fibra, que inicialmente aprovecha los indicadores de calcio codificados genéticamente para visualizar los cambios en la dinámica del calcio indicativos de la actividad neuronal, se destaca como una tecnología clave para caracterizar las correlaciones cerebro-comportamiento in vivo. La aplicación de la optogenética permite la codificación genética de las neuronas, permitiendo su activación o inhibición en respuesta a la estimulación de la luz. Esta capacidad facilita el establecimiento de vínculos causales entre la función de los circuitos neuronales y los resultados conductuales. La fotometría de fibra simultánea, el registro de calcio y la estimulación optogenética proporcionan un método para el registro y la manipulación en tiempo real de la actividad neuronal, sirviendo como un enfoque eficaz para investigar los mecanismos centrales de la acupuntura. No obstante, sigue habiendo una escasez de estudios que documenten la utilización simultánea de fotometría de fibra, registro de calcio, optogenética y monitoreo de la función visceral en la investigación de acupuntura. Los resultados de este experimento muestran que EA-ST36 podría regular la motilidad gástrica relacionada con el circuito PBNGlu-NTS Glu-DMV ChAT . La estimulación optogenética de este circuito produce el mismo efecto. Después de la superposición de los dos, los cambios en la señal de calcio y la motilidad gástrica alcanzan su máximo. Este estudio estableció un enfoque novedoso para la integración simultánea de la monitorización optogenética, intracerebral de señales de calcio y la motilidad gástrica, ofreciendo un paradigma novedoso para la monitorización en tiempo real de la relación entre la estimulación somática y las interacciones entre el circuito neuronal-función visceral.

Introducción

En los últimos años, la proliferación de sensores fluorescentes biomoleculares ha impulsado la utilización de la fotometría de fibra en biología molecular, facilitando el registro in vivo 1. Este avance permite el monitoreo en tiempo real de las alteraciones de la actividad neuronal en el cerebro. La integración de la optogenética permite la manipulación neuronal, ofreciendo la ventaja de realizar inmediatamente el registro de optogenética y fibra óptica simplemente insertando la fibra óptica. Combinado con el registro de la función visceral, este método ofrece una buena resolución temporal y orientación a nivel de núcleo para observar cómo la acupuntura modula las funciones viscerales a través de modificaciones de la actividad neuronal.

Numerosos estudios han ilustrado el claro impacto regulador de la acupuntura en la función gastrointestinal 2,3,4, aunque los mecanismos centrales precisos siguen siendo difíciles de alcanzar. Muchos libros de medicina chinos antiguos, como HuangDiNeiJing, también registraron que el ST36 (en el lado lateral posterior a la articulación de la rodilla, aproximadamente 2 mm por debajo del peroné5) se usa a menudo para tratar enfermedades gastrointestinales. Estudios recientes han demostrado que los núcleos involucrados en procesos fisiológicos gástricos (p. ej., comportamiento alimentario6, cese de comer7, supresión del apetito8) y procesos patológicos (p. ej., dolor gástrico9, disfunción gástrica10) abarcan el núcleo parasubtalámico (PSTn), el núcleo dorsal del rafe (DRN), el núcleo parabraquial lateral (LPB), el núcleo del tracto solitario (NTS) y el núcleo motor dorsal del vago (DMV). Los estudios han demostrado que la electroacupuntura en ST36 puede aumentar el número de células c-Fos+ en el DMV, aumentando así la expresión de c-Fos+ en el subnúcleo caudal de NTS11. Además, se ha documentado que el núcleo paracentricular (PBN) está involucrado en la composición del complejo nuclear paracentricular, puede proyectarse hasta el NTS del bulbo raquídeo, que juega un papel importante en la integración de la información sensorial visceral, como las señales gastrointestinales12,13. La información anterior sugiere que la acupuntura podría modular potencialmente la motilidad gástrica y podría estar relacionada con el circuito neuronal PBN Glu-NTSGlu-DMV ChAT. Las neuronas glutamatérgicas están involucradas principalmente en el LPB y NTS14, mientras que las neuronas colinérgicas están involucradas principalmente en el DMV durante los procesos fisiológicos y patológicos gástricos15. La investigación de los efectos reguladores de la acupuntura en los circuitos neuronales y las funciones viscerales puede proporcionar una comprensión más clara de los mecanismos de la acupuntura y proporcionar un respaldo teórico para las intervenciones clínicas de acupuntura en enfermedades viscerales.

Sin embargo, debido a limitaciones técnicas, la investigación limitada ha profundizado en los mecanismos de los circuitos neuronales de la electroacupuntura en la modulación de las funciones viscerales. Por lo tanto, el presente estudio presenta pautas simplificadas para introducir el proceso detallado de inyección de virus. En particular, la metodología expuesta en este artículo se puede utilizar para dilucidar los mecanismos de circuitos implicados en la regulación de diversas funciones viscerales por parte de la acupuntura.

Por lo tanto, este estudio tiene como objetivo investigar los efectos reguladores de la acupuntura sobre la motilidad gástrica, que podrían estar relacionados con el circuito neuronal PBN Glu-NTSGlu-DMV ChAT mediante la combinación de optogenética con fotometría de fibra para el registro de imágenes de calcio. El objetivo es establecer un protocolo para la obtención de imágenes de calcio y la sincronización optogenética, introduciendo un nuevo marco de investigación para investigar la función visceral y los circuitos neuronales.

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Protocolo

Todos los procedimientos siguieron las pautas para el cuidado y uso de animales de laboratorio establecidas por los Institutos Nacionales de Salud y recibieron la aprobación del Comité de Ética de Uso y Cuidado de Animales del Instituto de Acupuntura y Moxibustión de la Academia China de Ciencias Médicas. Se emplearon ratones C57 machos adultos que pesaban 25 g para la inyección viral y la implantación de fibra óptica. El protocolo de experimentación con animales se adhirió estrictamente a los requisitos de la norma nacional "Directrices para la revisión ética del bienestar de los animales de laboratorio" (GB/T 35892-2018) y fue aprobado por el Comité de Ética de la institución.

NOTA: Mantenga el ambiente limpio durante el proceso de inyección de virus e implantación de fibra óptica. Use máscaras durante toda la operación. Después del período de alta expresión viral (21-28 días), se realizó electroacupuntura en ST36 y manipulaciones optogenéticas para registrar la motilidad gástrica. Los animales se alojaron en el animalario del Instituto de Acupuntura y Moxibustión de la Academia China de Ciencias Médicas, en condiciones controladas (temperatura: 22-24 °C, humedad: 50%-60%, ciclo de luz-oscuridad de 12 h), con libre acceso a alimentos y agua. Puede encontrar información específica sobre los reactivos y equipos utilizados en la Tabla de materiales.

1. Preparación preoperatoria

  1. Desinfecte el instrumento quirúrgico que ha sido sometido a esterilización a alta temperatura y limpie el área quirúrgica con etanol al 70%.
  2. Anestesia: Administrar una inyección intraperitoneal de tribromoetanol al 1,25% (0,2 ml/10 g de peso) al ratón. Evalúe la ausencia del reflejo de pellizco del dedo del pie para medir la profundidad de la anestesia.
  3. Afeitar el pelo de la cabeza y colocar a los ratones en un marco estereotáxico equipado con barras para las orejas y los dientes. Aplique ungüento de eritromicina en los ojos de los ratones para evitar daños causados por la luz quirúrgica.
  4. Remoje la férula de fibra óptica (tamaño de la férula: 1,25 mm férula blanca, tipo de fibra: 200/0,37, longitud de la fibra: 5,5 mm, modelo de aguja de la férula: V8475) en etanol al 75% durante 30 min y luego lave el etanol al 70% con solución salina.
  5. Cargue el microinyector (1 μL) con parafina (800-900 nL). Derrite el tubo de vidrio y dibújalo en dos secciones. Afile una sección en la punta con una máquina de moler con aguja para que sirva como aguja de inyección. Para garantizar la estanqueidad al gas del microinyector, llene el tubo con parafina y conéctelo al microinyector en la punta con una pistola de pegamento.

2. Cirugía de inyección viral

  1. Haga una incisión en el cuero cabelludo a lo largo de la línea media desde los ojos hasta la parte posterior del cuello para revelar el cráneo. Posteriormente, extirpe los músculos del cuello para exponer el hueso occipital. Limpie la superficie ósea con H2O2 durante 30 s y luego limpie con un hisopo de algodón seco para eliminar la fascia subcutánea y los tejidos conectivos (Figura 1A).
    NOTA: Este paso es para facilitar la cobertura del cemento dental sobre el hueso occipital, haciendo que la fibra óptica se fije de manera más estable.
  2. Nivela el cráneo.
    1. Nivelación del eje X: Marque dos puntos que estén a 3,5 mm del punto Bregema en la sutura coronal y conecte los dos puntos para formar una línea. El punto medio de esta línea es el cero. El valor absoluto de la diferencia del eje Z en la superficie ósea a 3,5 mm del origen debe ser ≤ 0,03 mm.
    2. Nivelación del eje Y: Marque dos puntos que estén a 3,5 mm del punto Lambda en la sutura lambdoidea, establezca el punto medio de los dos puntos y conecte este punto medio al punto Lambda para formar una línea. El punto medio de esta línea es otro cero. El valor absoluto de la diferencia del eje Z entre este cero y el cero en el que se ajustó la superficie ósea durante el eje X debe ser ≤ 0,03 mm.
  3. Marque las coordenadas estereotácticas de la inyección del virus con un rotulador. Para PBN: -1,1 mm Anterior-Posterior (AP, eje Y), -5,45 mm Medial-Lateral (ML, eje X), -3,3 mm Dorsal-Ventral (DV, eje Z) (con bregma como punto cero); Para NTS: -0,35 mm AP, 0,2 mm ML, -3,3 mm DV (con el punto más alto del hueso occipital como punto cero); Para DMV: -0.35 mm AP, 0.0 mm (el punto más alto del hueso occipital), -3.5 mm DV (con el punto más alto del hueso occipital como punto cero) (Figura 1B). Use un microtaladro de alta velocidad (diámetro de taladro de 0,8 mm) para penetrar el cráneo en los sitios designados para exponer la superficie del cerebro. Posteriormente, use pinzas finas para perforar suavemente la duramadre y retirarla, aplique solución salina a la abertura perforada para mantener la humedad en la superficie del cerebro.
  4. Aplique el adhesivo Single Bond Universal a la superficie del cráneo (excluyendo la región perforada) y expóngalo a la luz durante 30 s para su curado. Es importante mantener una superficie seca del cráneo antes de aplicar el adhesivo universal de unión simple para garantizar una fuerte adhesión. Además, se debe evitar el adhesivo en los músculos durante la aplicación.
  5. Fije el microinyector al brazo mecánico de un aparato estereotáctico. Llenar con 250 nL de virus (rAAV-CaMKIIα-CRE-WPRE-hGH polyA). Al entrar en contacto con la punta de la aguja con la superficie del cerebro, ajuste la profundidad (Z) a 0. Baje la aguja al sitio objetivo dentro del núcleo parabraquial (PBN) e inyecte el virus en la región PBN a una velocidad de 35 nL / min. Después de la inyección, mantenga la aguja en su lugar durante 10 min, luego retírela a una velocidad de 6 mm/min. Posteriormente, sumerja la aguja en un tubo de Eppendorf que contenga solución salina para su limpieza (Figura 1C, D).
    NOTA: Las dosis inyectables de todos los siguientes virus son de 250 nL; El DMV es de 100 nL16,17.
  6. Emplee el protocolo idéntico para inyectar rAAV-CaMKIIα-DIO-ChrimsonR-WPRE en el núcleo tractus solitarius (NTS) y rAAV-ChAT-GCamp6s-WPRE-hGH-polyA en el núcleo motor dorsal del vago (DMV) (Figura 1D). Todos los títulos de virus son ≥ 1 × 1012 VG/ml.

3. Cirugía de implante de fibra óptica

  1. Asegure la férula de fibra óptica con el soporte del optrodo y conéctela al brazo mecánico del aparato estereotáctico. Establezca las coordenadas de implantación correspondientes a una posición de unos 100 μm por encima del sitio de inyección viral del DMV (Figura 1E, F).
  2. Mezcle 1-3 g de cemento dental con 1 ml de resina endurecida a temperatura ambiente hasta que quede uniforme. Administre rápidamente la mezcla alrededor de la férula de fibra óptica y sobre la superficie del cráneo, dejando expuestos 5 mm de la sección superior de la férula de fibra óptica. Una vez que el cemento se haya solidificado, suelte el tornillo del soporte, levántelo y quítelo (Figura 1G).
  3. Use suturas quirúrgicas absorbibles (6-0) para suturar el cuero cabelludo occipital posterior de ratones. Retire los ratones del marco estereotáctico y colóquelos en un ambiente cálido para que se recuperen de la anestesia. Una vez que los animales exhibieron un movimiento sin restricciones, fueron reubicados en una jaula limpia y espaciosa para su alojamiento, con 4-5 ratones alojados juntos y se les permitió el libre acceso a comida y agua.
    NOTA: Durante el experimento, se observó que una jaula más grande es beneficiosa para el movimiento normal de los ratones y es crucial para mantener su peso. El mayor espacio también reduce la probabilidad de contacto accidental con la fibra implantada, minimizando así el daño potencial. Los ratones que pesaban 25 g o más mostraron cambios significativos en la presión intragástrica tras la acupuntura.

4. Cirugía de inserción de balón

  1. En el pico de expresión viral (21-28 días), ayunar a los ratones durante 4-5 h. Posteriormente, anestesiar a los ratones mediante inyección intraperitoneal de tribromoetanol al 1,25% (0,1 mL/10 g de peso). 15 min después, administrar una inyección intraperitoneal de solución de carbamato de etilo al 10% (0,15 ml/10 g de peso). Evalúe la profundidad de la anestesia confirmando la ausencia de un reflejo de pellizco en el dedo del pie.
  2. Afeitar el vello de las regiones abdominal y ST36. Encienda la almohadilla térmica y configúrela para mantener una temperatura de 37 ° C, con el animal en la almohadilla térmica durante toda la cirugía para garantizar una temperatura corporal constante.
  3. Conecte el globo de látex a la jeringa e inyecte aire en él para verificar que el globo de látex (BS4 73-2787) no tenga fugas de aire.
  4. Exponga el estómago y una parte del duodeno debajo del proceso xifoides. Hacer una pequeña incisión en el duodeno de aproximadamente 0,3 cm de longitud, 0,5-1 cm distal al píloro.
  5. Inserte el globo en el estómago a lo largo de la dirección intestinal a través de la incisión duodenal, con el nudo colocado en el seno pilórico.
  6. Retire la aguja de la jeringa, llene 5 ml de agua pura, descargue el aire y conecte el otro extremo del globo con la jeringa. Tire del luer lock de la jeringa hacia arriba para evacuar el gas del globo, luego baje el luer lock para inyectar el agua pura en el globo. Conecte el conjunto a una llave de paso de tres vías y un transductor de presión.

5. Registro sincrónico de la presión intragástrica y las imágenes de calcio

  1. Encienda el modelo Neurolog Digitimer, CED Micro1401-4, Inper Studio, sistema de grabación de fibra óptica multicanal, software Inper Signal y software Spike 2. Configure el software Inper, el registro de señales de calcio para que se active mediante el software Spike2 y el estimulador optogenético, asegurando que la estimulación láser y la adquisición de señales de calcio por el software Inper se alineen con el registro de la presión intragástrica mediante el software Spike2.
  2. Abra todas las llaves de paso de tres vías que se conectan al globo, gire la perilla ZERO en el modelo de dígitos Neurolog y observe en el software Spike 2 si la línea de base está ajustada al punto 0. Después de igualar la presión dentro del balón con la presión atmosférica, inyecte agua pura en el balón hasta que la presión intragástrica se muestre 15-35 cm H2O. Una vez que tanto la presión intragástrica como las señales de calcio alcancen un estado estable, registre una línea de base de 60 s de la presión intragástrica y las señales de calcio en el DMV (Figura 2A).

6. Electroacupuntura en ST36 y estimulación láser

  1. Inserte una aguja de acupuntura (0,25 mm × 25 mm) en el punto de acupuntura ST36 izquierdo y conéctelo a un aparato de electroacupuntura (10 Hz, 1 mA). Administre electroacupuntura durante 60 s mientras registra los cambios en la presión intragástrica y las señales de calcio.
  2. Después de la estabilización de la presión intragástrica basal y las señales de calcio, administre estimulación optogenética (635 nm, 5 ms, 5 Hz, 30 mW) a través de la fibra durante 60 s, monitoreando los cambios en la presión intragástrica y las señales de calcio.
  3. Una vez que la línea de base de la presión intragástrica y las señales de calcio se estabilicen nuevamente, combine la electroacupuntura en ST36 (10 Hz, 1 mA) con estimulación optogenética (635 nm, 5 ms, 5 Hz) durante 60 s y registre los cambios en la presión intragástrica y las señales de calcio.

7. Examen histológico de inyección viral y colocación de fibras

  1. Después de completar los protocolos antes mencionados, perfunda a los ratones con solución salina y fíjelos con paraformaldehído al 4% a través del corazón inmediatamente. Cosecha los cerebros de los ratones. Realice la deshidratación en gradiente con soluciones de sacarosa al 20% y al 30%, luego seccione después de la inclusión con un agente de inclusión de congelación rápida. Compare los cortes de cerebro con los mapas cerebrales de ratones para observar si las posiciones de la inyección del virus y la implantación de fibra óptica eran precisas. El posicionamiento preciso de las inyecciones virales y los implantes de fibra confirmó la validez de la presión intragástrica y los datos de la señal de calcio (Figura 1H, I).

8. Análisis de datos

  1. Analice los datos de señales de calcio utilizando el software Inper Data Analysis y los datos de motilidad gástrica del software Spike2. Compare las diferencias entre las señales de calcio o las amplitudes de la motilidad gástrica en el momento de la estimulación (60 s) y las anteriores a la estimulación (60 s) para observar los efectos reguladores de diferentes estímulos sobre la motilidad gástrica y las señales de calcio. Todos los datos que se muestran en la Figura 2 son los gráficos de datos originales.

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Resultados

Los virus se inyectaron en el núcleo parabraquial (PBN), el núcleo tractus solitarius (NTS) y el núcleo motor dorsal del vago (DMV) de ratones, con una fibra implantada en el DMV (Figura 1A-G). Durante el período de máxima expresión viral, se registraron variaciones en la presión intragástrica y las señales de calcio dentro del DMV después de la electroacupuntura en ST36 y la estimulación optogenética. El objetivo de este estudio es observar los efectos reguladores de la ele...

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Discusión

La investigación científica central de la acupuntura se refiere a la regulación de los órganos diana a través de la estimulación del punto de acupuntura de los nervios autónomos. Los hallazgos sugeridos por Q. Ma sugirieron que la influencia de la acupuntura en la modulación de la función orgánica remota surge de los reflejos autónomos somáticos que activan las vías simpáticas y/o parasimpáticas, especialmente las relacionadas con enfermedades gastrointestinales e inflamación sistémica

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Divulgaciones

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Agradecimientos

Este estudio fue financiado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (No. 82174518, 82474661), los Fondos de Investigación Fundamental para los Institutos Centrales de Investigación de Bienestar Público (ZZ-2023008) y el Proyecto de Innovación Científica y Tecnológica de la Academia China de Ciencias Médicas Chinas (CI2021A03402).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Virus
rAAV-CaMKIIα-CRE-WPRE-hGH polyA (AAV2/9)CerebroVTACategoría#PT-0020
rAAV-CaMKIIα-DIO-ChrimsonR-WPREs (AAV2/9)CerebroVTACategoría#PT-12637
rAAV-ChAT-GCamp6s-WPRE-hGH-polyA (AAV2/9)CerebroVTACategoría#PT-10973
Otro
1 μ Microinyector LHamilton80135
Adhesivo universal de unión simple EPSP de 3MOficial de Dental World41269
Aguja de acupunturaZhongYanTaiHe0.25/13s
CED Micro1401-4CED (Inglaterra)1401-4
Cemento dental / Resina endurecida a temperatura ambienteYAMAHACHI DENTALN/A
Pinzas finasRWDF11028-13
Tubo de vidrioInstrumentos de precisión del mundo504949
HANS-200AInstituto HANSHANS-200
Inper Signal (software)InperN/A
Inper Studio(Venus)InperB1502
Balón de látexAparato HarwardBS4 73-2787
Sistema de grabación de fibra óptica multicanal (Vista Pro)InperR5268
Modelo de Neurolog digitimerDigitimerNL900D
Virola de fibra ópticaInperV8475
Spike 2 (software)CED (Inglaterra)N/A
Instrumentos estereotáxicos (con calculadora de coordenadas)Instrumentos David KopfKOPF 942
TribromoetanolSigmaT48402
tribromoetanolSigma T48402

Referencias

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