Decodificando el comportamiento natural a partir de la incrustación neuroetológica

Summary

Este protocolo proporciona un marco integrado basado en métodos neuroetológicos computacionales avanzados para comprender la codificación cerebral en contextos naturalistas.

Abstract

Los animales se relacionan con su entorno natural a través de una actividad cerebral rica y dinámica. Comprender cómo la dinámica de la población neuronal codifica el comportamiento naturalista sigue siendo un desafío fundamental en la neurociencia de sistemas. Los avances recientes en el análisis del comportamiento basado en el aprendizaje profundo y las imágenes de fluorescencia en miniatura han abierto nuevas vías para investigar cómo el cerebro codifica el comportamiento natural. Aquí, este estudio presenta un marco experimental y computacional integrado que combina el Atlas de Comportamiento Social (SBeA), la Microscopía de Dos Fotones en miniatura (mTPM) y las Incrustaciones Consistentes de Grabaciones de alta dimensión utilizando variables auxiliares (CEBRA) para decodificar comportamientos complejos de la dinámica cerebral. Este estudio utiliza interacciones sociales naturalistas entre ratones que se mueven libremente como sistema modelo, lo que permite la anotación de comportamiento de alta resolución junto con imágenes neuronales simultáneas. Este marco incluye una estimación precisa de la pose de comportamiento, seguimiento sincronizado de doble mouse, alineación de incrustación neuronal y decodificación de características de comportamiento directamente desde los componentes principales neuronales. Este estudio demuestra que este enfoque logra una precisión de decodificación de 3. ± 1,5 píxeles para la postura y una precisión del 89 ± 6% para la decodificación de motivos en animales, lo que destaca su robustez y generalización. Este método proporciona una herramienta poderosa para explorar cómo la actividad cerebral refleja estados de comportamiento estructurados y sienta las bases para futuros estudios de principios de codificación neuronal naturalista.

Introduction

Este marco está diseñado para capturar y decodificar datos de comportamiento y neuroimagen de animales que se mueven libremente en entornos experimentales naturalistas. Comprende tres componentes clave: métodos de estimación de poses y clasificación de comportamiento basados en el aprendizaje profundo, SBeA¹, técnicas de imágenes de fluorescencia en miniatura mTPM² y un algoritmo de incrustación neuroetológica basado en el aprendizaje contrastivo, CEBRA³. Estudios recientes han puesto de relieve la complejidad de los procesos neuroetológicos en animales que se mueven libremente, que supera la observada en paradigmas experimentales de cabeza fija ^4,5. Sin embargo, las limitaciones técnicas y la variabilidad han obstaculizado la aplicación generalizada de estos enfoques a investigaciones más amplias del comportamiento natural. Este protocolo presenta un marco estable e integrado que garantiza la accesibilidad de los datos conductuales y neuronales recopilados en contextos naturalistas para una amplia gama de laboratorios de investigación.

Dado que los animales se mueven libremente en entornos naturales, este marco incorpora la estimación de posturas basada en el aprendizaje profundo para lograr un seguimiento preciso de las posturas ^6,7. Los métodos tradicionales de seguimiento basados en el procesamiento de imágenes son insuficientes para capturar movimientos a escala fina, como la dinámica de las extremidades y las patas, en comparación con los enfoques basados en el aprendizaje profundo⁸. Los comportamientos diversos y complejos exhibidos por los animales que se mueven libremente plantean desafíos para los métodos de clasificación de comportamiento supervisados⁹, ya que las categorías de comportamiento predefinidas a menudo no abarcan la gama completa de fenotipos de comportamiento natural¹⁰. En consecuencia, los métodos de clasificación basados en el aprendizaje no supervisado son más adecuados para analizar el comportamiento en entornos naturalistas¹. Pueden descomponer de manera integral el comportamiento continuo en motivos discretos de subsegundos de acuerdo con sus similitudes estructurales intrínsecas, y luego sus definiciones consistentes se dan a través de grupos basados en datos.

Las imágenes cerebrales en animales que se mueven libremente requieren capturar la amplia variabilidad de la actividad de una sola neurona ^4,5. Los registros electrofisiológicos en animales que se mueven libremente están limitados en su capacidad para detectar neuronas con actividad predominantemente subumbral¹¹. Además, la microscopía de fotón único sufre de baja resolución y contraste, lo que dificulta mantener identidades neuronales consistentes en las sesiones de imágenes¹². mTPM ofrece una resolución y un contraste superiores en comparación con la microscopía de fotón único, lo que la convierte en una herramienta más eficaz para investigar la codificación neuronal de los comportamientos naturales 2,13,14,15.

Establecer un mapeo robusto entre el comportamiento y los datos neuronales requiere métodos capaces de revelar su estructura informativa compartida¹⁶. Las técnicas convencionales de reducción de dimensionalidad, como el análisis de componentes principales (PCA)¹⁷, la incrustación de vecinos estocásticos distribuidos (t-SNE)¹⁸ y la aproximación y proyección de variedades uniformes (UMAP)¹⁹, no pueden incrustar de manera efectiva datos neuronales y de comportamiento dentro de un espacio de características común. Por el contrario, los enfoques de incrustación basados en el aprendizaje profundo, como CEBRA, permiten la integración de múltiples modalidades de datos en marcos supervisados y autosupervisados, generando representaciones latentes de alta calidad³. Si bien en los últimos años han surgido varios métodos alternativos 20,21,22, este marco propuesto prioriza las aplicaciones prácticas mediante la incorporación de métodos bien establecidos que están disponibles comercialmente o respaldados por tutoriales completos.

En comparación con estudios recientes ^4,5, este marco ofrece tres avances clave. Primero, elimina el sesgo humano en la clasificación del comportamiento. Los estudios anteriores se basaron en el etiquetado manual del comportamiento, que requiere mucha mano de obra y es propenso a la inconsistencia, particularmente cuando los anotadores experimentan fatiga 23,24,25. Por el contrario, este marco emplea la clasificación de comportamiento no supervisada, que preserva la estructura natural de los patrones de comportamiento al descomponer y agrupar objetivamente los motivos de comportamiento antes de asignar definiciones^26,27. En segundo lugar, el uso de mTPM permite la captura de dinámicas neuronales más intrincadas a nivel de una sola neurona. Esta ventaja metodológica amplía la aplicabilidad de este marco para decodificar comportamientos naturales complejos de diversas poblaciones neuronales, incluidas las involucradas en la codificación por debajo del umbral²⁸. En tercer lugar, este marco integra datos conductuales y neuronales en un espacio representacional unificado, en lugar de emplear UMAP para incrustar cada modalidad por separado o usar máquinas de vectores de soporte para imponer un mapeo rígido entre la actividad neuronal y el comportamiento sin tener en cuenta su dinámica intrínseca ^4,5. Este enfoque de integración conjunta garantiza una representación más completa y biológicamente significativa de la relación entre el comportamiento y la actividad cerebral.

Este marco es adecuado para proyectos de investigación que involucran el registro y la decodificación de datos conductuales y neuronales de animales que se mueven libremente en condiciones experimentales naturalistas. Si bien la implementación actual está optimizada para estudios con ratones, adaptarla a otros modelos animales puede requerir un desarrollo adicional. Como los componentes de hardware utilizados en este marco están disponibles comercialmente, por un lado, el costo total puede ser relativamente alto. Por otro lado, esta disponibilidad comercial reduce significativamente el tiempo dedicado a la resolución de problemas logísticos y garantiza la adquisición de resultados estables y confiables de manera eficiente.

Este protocolo está diseñado para ser reproducible y accesible para los laboratorios de neurociencia equipados para imágenes de animales pequeños y seguimiento del comportamiento. El sistema completo integra un dispositivo mTPM disponible comercialmente con una configuración de adquisición de comportamiento de múltiples ángulos. Las grabaciones neuronales típicas se adquieren a 4,84 Hz con una resolución de 512 × 512 píxeles, y los datos de comportamiento se capturan a 30 fotogramas por segundo. La sincronización de datos se logra mediante la alineación de pulsos TTL durante el preprocesamiento. El entrenamiento y la decodificación se pueden realizar en una estación de trabajo estándar con una GPU (por ejemplo, NVIDIA RTX 3090 o equivalente) y la canalización completa requiere aproximadamente 100 GB de almacenamiento por experimento. Si bien la implementación actual está optimizada para ratones que se mueven libremente, el diseño modular del flujo de trabajo permite la adaptación a otras especies al ajustar la calibración de seguimiento y los parámetros de imagen en función del tamaño y la movilidad del animal. Estos detalles prácticos respaldan la adaptabilidad y reproducibilidad del protocolo en una variedad de entornos experimentales.

Protocol

El Comité de Cuidado y Uso de Animales del Instituto de Tecnología Avanzada de Shenzhen, Academia China de Ciencias, aprobó todos los procedimientos experimentales y de cría.

1. Establecimiento de la plataforma

NOTA: La plataforma consta de dos componentes principales: el dispositivo mTPM y el dispositivo de comportamiento 3D (Figura 1A). El dispositivo mTPM facilita la sincronización en tiempo real de las imágenes mTPM con los datos de comportamiento, lo que permite la adquisición eficiente, estable y continua de datos de alta calidad de animales que se mueven libremente. El dispositivo de comportamiento 3D está equipado con cuatro cámaras para capturar la escena completa del comportamiento animal y un módulo de calibración automática para reconstruir poses de animales en 3D. Ambos dispositivos deben incorporar módulos de sincronización en sus respectivas versiones.

1. Conexión de dispositivos
   1. Retire la carcasa exterior del dispositivo de comportamiento 3D. Coloque las partes restantes del dispositivo de comportamiento 3D, incluidas cuatro cámaras y un módulo de calibración automática, dentro de la cámara de registro de comportamiento del dispositivo mTPM.
   2. Conecte el cable de bus serie universal (USB) del módulo de sincronización del dispositivo de comportamiento 3D a la estación de trabajo del dispositivo de comportamiento 3D.
   3. Conecte el módulo de sincronización del dispositivo mTPM al controlador del dispositivo mTPM a través de un cable SubMiniature versión A (SMA).
   4. Conecte el puerto de salida Transistor-Transistor Logic (TTL) del módulo de sincronización del dispositivo de comportamiento 3D al puerto de entrada TTL del módulo de sincronización del dispositivo mTPM a través de un cable de conversión SMA-Bayonet Neill-Concelman (BNC).
2. Registro de marca de tiempo de tramas mTPM
   1. Encienda todas las fuentes de alimentación del dispositivo mTPM.
   2. Inicie el software de grabación mTPM y el software de sincronización mTPM.
   3. Establezca las rutas de guardado de las tramas mTPM y las marcas de tiempo de sincronización.
      NOTA: No utilice ninguna de las letras y caracteres especiales que no estén en inglés para asignar nombres a las rutas.
   4. Establezca el número de fotogramas de grabación del software de grabación mTPM. El número recomendado de fotogramas es 6000, que es suficiente para finalizar el paso de depuración de sincronización.
   5. Seleccione todos los canales del software de sincronización mTPM.
   6. Inicie la grabación de mTPM a través del software de grabación mTPM. Antes de comenzar la grabación, apague cualquiera de las luces dentro de la habitación para proteger el mTPM de la sobrequemadura de la luz. El software de sincronización mTPM se ejecutará automáticamente cuando el usuario inicie la grabación.
   7. Compruebe si el software de sincronización de mTPM captura las marcas de tiempo de fotogramas de mTPM.
      NOTA: Las marcas de tiempo de trama mTPM que se muestran en el software de sincronización mTPM son pulsos TTL nítidos. Cada fotograma de imagen activa un pulso TTL nítido, que es de 4,84 Hz por defecto. Si no se muestra ningún pulso en el panel de software, hay 2 problemas normales. La primera es que el controlador del controlador del dispositivo mTPM no admite la captura de marcas de tiempo. Mejorar la versión de su controlador para admitir la captura de marcas de tiempo puede resolver el primer problema. El segundo es la mala conexión del cable SMA. Asegúrese de que los conectores SMA estén bien apretados. Antes de comprobar las marcas de tiempo, vuelva a la versión 1.1.2 y, a continuación, pruebe paso a paso.
   8. Espere a que se detenga la grabación. Compruebe si se guardan el archivo .tif de las tramas mTPM, un archivo .tdms y un archivo .tdms_index de las marcas de tiempo.
3. Grabación de marca de tiempo de cuatro cámaras del dispositivo de comportamiento 3D
   1. Establezca la ruta de guardado de los vídeos y las marcas de tiempo de comportamiento en el script de sincronización de cámara personalizado.
      NOTA: El código de sincronización de cámara personalizado está en https://github.com/YNCris/natural_behavior_device/blob/main/camera_code/mul_camera_save_video_event.py.
   2. Inicie el software de sincronización mTPM. Establezca las rutas de acceso de guardado de las marcas de tiempo de sincronización de mTPM.
   3. Inicie la grabación del software de sincronización mTPM. Ejecute el script de sincronización de cámara personalizado.
   4. Compruebe si el software de sincronización mTPM captura las marcas de tiempo de comportamiento.
      NOTA: Las marcas de tiempo de comportamiento que se muestran en el software de sincronización mTPM son pulsos TTL nítidos. Se envía una marca de tiempo de comportamiento al software de sincronización mTPM por cada 30 fotogramas de la grabación de fotogramas de vídeo de comportamiento. Las marcas de tiempo de comportamiento también se guardarán en la estación de trabajo del dispositivo de comportamiento 3D.
   5. Compruebe si se guardan cuatro archivos .avi de vídeos de comportamiento, un archivo .txt de marcas de tiempo de comportamiento en el dispositivo de comportamiento 3D y un archivo .tdms y un archivo .tdms_index de marcas de tiempo de comportamiento en la estación de trabajo mTPM.
4. Calibración de la cámara del dispositivo de comportamiento 3D
   1. Ajuste el ángulo de disparo de cuatro cámaras. Las cuatro cámaras deben cubrir de manera integral toda la base del campo abierto y al mismo tiempo extender su campo de visión al menos 20 cm por encima del límite más lejano del campo abierto para garantizar que las instancias del ratón levantándose se capturen por completo.
   2. Coloque el módulo de calibración en el centro de las áreas de disparo. Ejecute el software de calibración de la cámara. Antes de ejecutar el software de calibración de la cámara, apague todas las luces.
      NOTA: Cuatro cámaras capturarán los fotogramas del tablero de verificación en movimiento que se muestra en la pantalla de calibración. La calibración de la cámara se basa en el método de calibración²⁹ de Zhang.
   3. Después de ejecutar el software de calibración de la cámara, se guardará un archivo .mat, que contiene la matriz de proyección de la cámara para la reconstrucción de poses 3D de animales. Dado que la indexación de datos de comportamiento en el paso de sincronización del sistema se basa en el archivo .mat de calibración, asegúrese de que el paso de calibración de la cámara finalice antes del paso de sincronización de todo el sistema.
5. Sincronización de todo el sistema
   NOTA: Antes de este paso, asegúrese de que el software de sincronización de mTPM pueda recibir las marcas de tiempo de los marcos mTPM y el dispositivo de comportamiento 3D por separado.
   1. Encienda todas las fuentes de alimentación del dispositivo mTPM y el dispositivo de comportamiento 3D.
   2. Inicie el software de grabación mTPM, el software de sincronización mTPM y el script de sincronización de cámara personalizado.
   3. Establezca su ruta y parámetros que se refieren al paso 1.3.1. Inicie la grabación de mTPM a través del software de grabación mTPM.
   4. Ejecute el script de sincronización de cámara personalizado. Asegúrese de que el inicio de la grabación de fotogramas mTPM sea anterior a la ejecución del script de grabación de comportamiento para que el software de sincronización mTPM pueda recibir las marcas de tiempo del dispositivo de comportamiento 3D. Establezca la hora de finalización de la grabación de fotogramas mTPM en más larga que la hora de grabación del comportamiento para que el software de sincronización mTPM pueda capturar las marcas de tiempo del comportamiento sin pérdida.
      NOTA: La recomendación del tiempo de grabación de las tramas mTPM es superior a 5 min de grabación del comportamiento. Por ejemplo, si el usuario desea grabar un comportamiento de 15 minutos, el número de fotogramas mTPM debe establecerse en 4,84 x (15+5) x 60 = 5808 fotogramas.
   5. Espere a que se detenga la grabación. Después de la grabación, hay un archivo de .tif de fotogramas mTPM, dos archivos .tdms de sincronización de mTPM, dos archivos .tdms_index, cuatro archivos de .avi de vídeo de comportamiento y un archivo de marca de tiempo de .txt de comportamiento.
   6. Ejecute el código de sincronización personalizado para alinear el fotograma mTPM y los vídeos de comportamiento. El código de sincronización personalizado está en https://github.com/YNCris/natural_behavior_device/blob/main/preprocess_code/step1_align_tpm_data.m.
      1. Antes de ejecutar este script, organice manualmente los archivos de la siguiente manera:
         ----\Ruta raíz # La ruta para guardar todos los datos
         --------\behavior_all # La ruta para guardar los datos de comportamiento
         ------------\A-B-C-D-E-caliParas.mat # Archivo de calibración de la cámara
         ------------\A-B-C-D-E-camera-1.avi # Vídeo de comportamiento de la cámara 1
         ------------\A-B-C-D-E-camera-2.avi # video de comportamiento de la cámara 2
         ------------\A-B-C-D-E-camera-3.avi # video de comportamiento de la cámara 3
         ------------\A-B-C-D-E-camera-4.avi # video de comportamiento de la cámara 4
         ------------\A-B-C-D-E-event.txt # marca de tiempo de comportamiento del dispositivo de comportamiento 3D
         ----\tpm_suite2p # La ruta para guardar datos mTPM
         --------\sep # La ruta para guardar marcos mTPM y marcas de tiempo
         ------------\A-B-C-D-E-event # La ruta para realizar la alineación de la marca de tiempo
         ----------------\beh.tdms # El archivo .tdms del canal de comportamiento
         ----------------\beh.tdms_index #The archivo de .tdms_index de canal de comportamiento
         ----------------\tpm.tdms # El archivo .tdms del canal mTPM
         ----------------\tpm.tdms_index # El archivo .tdms_index del canal mTPM
         ------------\A-B-C-D-E-tpm # La ruta para guardar tramas mTPM
         ----------------\F.tif # Los fotogramas mTPM de cada grabación
         --------\process # La ruta para extraer rastros neuronales
         ------------\C # La ruta de cada ratón
         ----------------\F.tif # Los marcos mTPM de cada mouse
         De la A a la G son definiciones de campos de nombre, donde
         A significa grupos experimentales, por ejemplo, libres,
         B significa la secuencia de videos, por ejemplo, seg1,
         C significa la identidad de los animales, por ejemplo, 1tpmss,
         D significa los socios de interacción, por ejemplo, 1wt,
         E significa la fecha experimental, por ejemplo, 20220226, y
         F significa el fragmento de fotograma de grabación mTPM (5000 fotogramas por fragmento), por ejemplo, social 1.
         NOTA: La velocidad de fotogramas del sistema de seguimiento del comportamiento 3D es de 30 Hz, mientras que la del mTPM es de 4,84 Hz. Dado que la precisión de sincronización máxima alcanzable está limitada por la velocidad de fotogramas más baja (4,84 Hz), la resolución temporal de la sincronización es de aproximadamente 206 ms. Las marcas de tiempo de comportamiento sirven como referencia y cada fotograma mTPM se alinea con el punto de tiempo de comportamiento más cercano. Los intervalos entre fotogramas mTPM sucesivos con respecto a la línea de tiempo de comportamiento se interpolan mediante un enfoque paso a paso.

2. Registro de datos neuroetológicos

NOTA: El proceso de registro de datos neuroetológicos consta de cuatro pasos clave (Figura 1B).

1. Montaje de mTPM
   NOTA: Debido a que los detalles del montaje de mTPM se encuentran en el tutorial del mTPM, aquí solo se presentan los pasos clave.
   1. Prepara la ventana craneal.
      NOTA: La preparación de la ventana craneal incluye principalmente la inyección del virus, la implantación de la cubierta de vidrio y la fijación de la placa metálica. Debido a que los sitios de imágenes son diferentes en varias investigaciones, los detalles de la preparación de la ventana craneal son diferentes. En este caso, la preparación de la ventana craneal se realiza mediante un servicio de subcontratación. El área del cerebro de imágenes en los datos de ejemplo es la corteza somatosensorial primaria (S1).
   2. Fije el inmovilizador del mouse al micromanipulador mTPM. Fije la cabeza del ratón al inmovilizador a través de la placa de metal.
   3. Encuentra la fluorescencia a través de mTPM. Apague todas las luces antes de encender las imágenes mTPM. Fije el mTPM al soporte antes de los siguientes pasos.
      1. Agregue una gota de gel para ojos Carbomer en la parte superior de la ventana craneal. Mueva el mouse a través de la plataforma de movimiento cuando la ventana craneal esté alineada debajo del objetivo mTPM.
      2. Mueva el micromanipulador verticalmente para encontrar el plano de imagen. Mueva el micromanipulador en el plano para centrar el plano de imagen.
   4. Fije la base superior al mTPM. Pega la base inferior a la base superior y a la ventana craneal.
      1. Para garantizar la estabilidad estructural, rellene el espacio entre las dos bases y el soporte de la placa de metal unido a la cabeza del mouse y péguelo con un adhesivo estructural acrílico de alto rendimiento. Cure el adhesivo durante 30 minutos antes de evaluar la estabilidad de la unión sondeando suavemente la base con pinzas. Si es necesario, se aplica adhesivo adicional hasta lograr una fijación segura.
         NOTA: Es esencial evitar cualquier adhesión directa entre la base y el propio mTPM. Las bases superior e inferior son pequeños marcos de aluminio. La base superior está fabricada a medida para adaptarse perfectamente al contorno inferior de la carcasa mTPM. Las bases inferiores con múltiples opciones de altura se utilizan para cerrar el espacio entre la base superior y la ventana craneal. Todas las bases inferiores tienen las mismas dimensiones planas que la base superior para garantizar la compatibilidad mecánica, diferenciándose únicamente en altura para adaptarse a las diferentes distancias del cráneo a la base superior.
   5. Agregue una gota de gel para ojos Carbomer dentro de la cámara base. Verifique la fluorescencia neuronal a través de mTPM. Si la fluorescencia neuronal no es claramente visible, retire el adhesivo con un taladro craneal, permitiendo la separación de la base, después de lo cual se repite el procedimiento anterior hasta lograr la claridad de la fluorescencia.
   6. Asegure el papel de aluminio con cinta adhesiva entre la fibra de mTPM y la ventana craneal.
      NOTA: Este paso es para mantener una protección de luz adecuada durante todo el proceso de grabación. Se minimizó el uso de papel de aluminio y cinta adhesiva para reducir el peso total.
   7. Encienda la luz de la habitación y pruebe la claridad de los marcos mTPM.
2. Poner el ratón en campo abierto
   NOTA: Este paso implica colocar el mouse en campo abierto mientras se garantiza un equilibrio de peso adecuado para la fibra y el mTPM.
   1. Infla al menos 10 globos de helio y átalos por separado con hilo de algodón. Separe la placa de metal del sujetador del ratón.
   2. Sostenga el mouse por la cola con una mano. Apoye la fibra mTPM con la otra mano.
   3. Coloque suavemente el mouse en campo abierto. Suspenda los globos de helio con hilo de algodón a la fibra. Ajuste el número de globos hasta que el mouse pueda moverse libremente y explorar el campo abierto sin restricciones.
      NOTA: El número óptimo de globos se determina cuando el ratón permanece en el suelo, con sus extremidades anteriores no levantadas por la flotabilidad hacia arriba, mientras que aún equilibra lo suficiente el peso del mTPM para permitir que el animal mantenga una postura natural de la cabeza y se ponga de pie espontáneamente. El cordel de algodón debe atarse a una altura por encima del campo abierto para garantizar una longitud de fibra suficiente para el movimiento sin restricciones del ratón. El cordel de algodón se ató a la altura de la fibra óptica, que estaba aproximadamente alineada con el borde superior de la cámara de campo abierto. En el ejemplo dado, una vez que se completa este paso, se introduce un mouse sin tratar en el campo abierto para permitir la interacción social libre.
   4. Cierre la puerta del gabinete mTPM para minimizar las perturbaciones externas.
3. Activar la grabación mTPM.
   1. Inicie el software de grabación mTPM y el software de sincronización mTPM. Establezca su ruta y parámetros que se refieran al paso de establecimiento de la plataforma.
   2. Inicie la grabación de mTPM a través del software de grabación mTPM. Verifique la presencia de marcadores de tiempo correspondientes a cada fotograma de dos fotones dentro del software de sincronización.
   3. Evalúe si el contraste de las imágenes de dos fotones no se ve afectado y confirme que la locomoción del ratón no compromete la estabilidad de los fotogramas grabados. Si se detecta algún problema, repita el procedimiento de sincronización y el proceso de montaje de mTPM hasta que la imagen de dos fotones produzca fotogramas claros con marcadores de tiempo alineados con precisión.
4. Activar el registro de comportamiento
   1. Inicie el script de sincronización de cámara personalizado.
      NOTA: El código de sincronización de cámara personalizado está en https://github.com/YNCris/natural_behavior_device/blob/main/camera_code/mul_camera_save_video_event.py.
   2. Establezca la ruta y los parámetros que hacen referencia al paso de establecimiento de la plataforma.
   3. Inicie la grabación del comportamiento a través del script de sincronización de cámara personalizado. Verifique la presencia de marcadores de tiempo correspondientes a cada 30 fotogramas de comportamiento dentro del software de sincronización mTPM.
   4. Compruebe si las cuatro secuencias de vídeo de las cámaras están correctamente sincronizadas y compruebe los parámetros de captura de vídeo del sistema de seguimiento del comportamiento 3D.
      NOTA: En la configuración anterior, las cámaras utilizan una resolución de fotogramas de 640 × 480 píxeles, una velocidad de fotogramas de 30 fotogramas por segundo, fotogramas RGB y exposición automática. La exposición automática permite que la cámara ajuste dinámicamente el brillo en función de las condiciones de iluminación ambiental. Dado que el tiempo de exposición afecta directamente a la velocidad de fotogramas alcanzable, especialmente en condiciones de poca luz en las que se requieren exposiciones más largas, la velocidad de fotogramas puede disminuir. Para garantizar una adquisición de fotogramas estable a 30 Hz, es importante controlar la iluminación de fondo para minimizar el tiempo de exposición. La ganancia de la cámara y la configuración de binning se mantienen en sus valores predeterminados durante toda la grabación.
   5. La grabación de comportamiento se detendrá automáticamente una vez que se alcance la duración predefinida. Después de completar la grabación de comportamiento, desactive manualmente la grabación y sincronización de mTPM. Siguiendo estos pasos, se completa una única prueba de adquisición simultánea de datos neuronales y conductuales.

3. Preprocesamiento de datos neuroetológicos

NOTA: Si todos los pasos anteriores se completan con éxito, se deben obtener tres categorías de archivos de datos: fotogramas de imágenes de dos fotones (.tif), cuatro grabaciones de video de comportamiento (.avi) junto con un archivo de calibración de cámara (.mat) y dos archivos de marca de tiempo de sincronización (.tdms) para el preprocesamiento de datos posterior (Figura 1C). Estos datos deben cambiarse manualmente y colocarse en las carpetas que se refieren al paso 1.5.7.

1. Preprocesamiento de datos de mTPM
   1. Extraiga trayectorias de señales neuronales de tramas mTPM a través de suite2p³⁰. Mantenga los parámetros de suite2p en sus valores predeterminados para garantizar la reproducibilidad. Ajuste solo la velocidad de fotogramas para que coincida con la configuración de adquisición de mTPM.
      NOTA: Dado que los pasos posteriores incluyen el procesamiento de señales y el control de calidad, no es necesario ajustar ampliamente los parámetros de suite2p en esta etapa. Mantener la coherencia entre los conjuntos de datos es de mayor importancia.
   2. Ejecute el código personalizado para alinear las marcas de tiempo entre los fotogramas mTPM y los vídeos de comportamiento.
      NOTA: Este script alinea las marcas de tiempo de eventos de comportamiento con los tiempos de adquisición de mTPM correspondientes. Genera y guarda asignaciones de índices para cada grabación, lo que permite un análisis sincronizado del comportamiento y los datos neuronales. Este código personalizado está en https://github.com/YNCris/natural_behavior_device/blob/main/preprocess_code/step1_align_tpm_data.m.
   3. Ejecute el código personalizado para convertir el formato de datos de la salida suite2p.
      NOTA: Este script extrae y reorganiza los datos de mTPM para animales individuales mediante la identificación y el mapeo de índices de trama relevantes. Selecciona los rastros de actividad neuronal correspondientes y los reestructura en un formato de datos estandarizado, lo que permite un análisis posterior simplificado de grabaciones segmentadas. Este código personalizado está en https://github.com/YNCris/natural_behavior_device/blob/main/preprocess_code/step2_separate_tpm_data.m.
   4. Ejecute el código personalizado para volver a muestrear las señales neuronales para alinearlas con los marcos de comportamiento.
      NOTA: Este script realiza un remuestreo temporal de los datos de mTPM para alinear los seguimientos de actividad neuronal con las marcas de tiempo de comportamiento. Carga datos neuronales e índices de sincronización previamente segmentados, extrae trazas remuestreadas en consecuencia y guarda la salida en un formato estandarizado para su posterior procesamiento de señales. El método de remuestreo temporal es la interpolación escalonada. Este código personalizado está en https://github.com/YNCris/natural_behavior_device/blob/main/preprocess_code/step3_resample_tpm_data.m.
   5. Ejecute el código personalizado para refinar las trayectorias neuronales.
      1. Como la interpolación escalonada puede introducir artefactos de timbre y ruido de alta frecuencia, diseñe un filtro de paso bajo equiripple con una frecuencia de banda de paso de 2 Hz y una frecuencia de banda de parada de 2,2 Hz para mitigar estos artefactos. El orden del filtro es 61.
      2. Después de eso, use el método de eliminación de ruido de Weijian Zong para refinar las trazas de calcio mTPM¹³ remuestreadas. Estima las líneas de base locales utilizando criterios de varianza local y percentil y calcula las señales ΔF / F. ΔF / F es una medida adimensional que representa el cambio relativo en la intensidad de la fluorescencia sobre la línea de base, comúnmente utilizada para cuantificar la actividad neuronal en imágenes de calcio. Dado que tanto el numerador (ΔF) como el denominador (F) están en unidades de fluorescencia arbitrarias, el valor ΔF / F resultante no tiene unidad física y se expresa como una relación o porcentaje. Las celdas con señales extremadamente planas o saturadas se excluyen en función de los umbrales de rango de señal. Los rastros de actividad neuronal de alta calidad resultantes se guardan para el análisis posterior ( Figura 2A, Figura 3A y Figura 4A).
         NOTA: El código personalizado está disponible en https://github.com/YNCris/natural_behavior_device/blob/main/preprocess_code/step4_filter_tpm_data.m.
2. Preprocesamiento de datos de comportamiento
   1. Extraiga poses de comportamiento de grabaciones de video usando un rastreador de poses antideriva (ADPT)⁷.
      NOTA: ADPT aborda el problema de la deriva puntual frecuente observada en métodos basados en redes neuronales convolucionales como DeepLabCut⁶ y SLEAP²². ADPT es particularmente adecuado para escenarios que involucran dispositivos de grabación neuronal, como imágenes mTPM en animales que se mueven libremente, ya que reduce efectivamente la deriva puntual causada por el movimiento de la fibra. El repositorio de ADPT está en https://github.com/tangguoling/ADPT.
      1. Dado que la configuración experimental involucra a dos ratones, con el mTPM sirviendo como identificador para uno de ellos, entrene dos modelos ADPT independientes de un solo ratón para estimar las poses de cada ratón por separado.
      2. Para cada modelo, anote manualmente 16 puntos clave 1,10,15,31, incluyendo la nariz, la oreja izquierda, la oreja derecha, el cuello, las extremidades delanteras izquierda y derecha, las extremidades traseras izquierda y derecha, las patas delanteras izquierda y derecha, las patas traseras izquierda y derecha, la espalda, la base de la cola, la cola media y la punta de la cola, durante aproximadamente 600 fotogramas, con 150 fotogramas etiquetados manualmente por vista de cámara para un video de 15 minutos.
      3. Entrene los modelos ADPT con parámetros predeterminados. Los detalles de los parámetros de entrenamiento y predicción están en https://github.com/tangguoling/ADPT/blob/main/code/config.yaml y https://github.com/tangguoling/ADPT/blob/main/code/config_predict.yaml.
   2. Reconstruyendo poses de animales en 3D. Una vez entrenado, aplique los dos modelos de forma independiente para predecir las poses de cada mouse a partir de cada uno de los videos capturados por diferentes cámaras. Combine los datos resultantes en un único archivo de tabla para su posterior procesamiento.
   3. Realice una reconstrucción 3D de las trayectorias de comportamiento utilizando la triangulación en combinación con el archivo de calibración de la cámara³². Después de la reconstrucción, obtenga las trayectorias de movimiento del ratón sujeto (el que lleva el mTPM, Figura 2B, Figura 3B, Figura 4B) y el ratón objeto (el conespecífico que interactúa, Figura 2C, Figura 3C, Figura 4C) para su posterior análisis.
   4. En los estudios de interacción social, las distancias interindividuales sirven como indicadores críticos de la dinámica social³³. Calcule las distancias corporales relativas entre los dos ratones utilizando distancias euclidianas por pares entre los puntos corporales correspondientes, proporcionando medidas cuantitativas para un mayor análisis del comportamiento social ( Figura 2D, Figura 3D, Figura 4D).
   5. Descomponer y clasificar motivos de comportamiento.
      NOTA: Aunque los pasos anteriores producen trayectorias de pose de grano fino, aún no nos dicen qué está haciendo el animal. El comportamiento se refiere a cómo se mueve un animal durante un período específico, y asignar el comportamiento implica dar a cada uno de esos períodos una etiqueta significativa e interpretable por humanos. La forma normal es usar anotaciones humanas.
      1. Debido a que las grabaciones de comportamiento a menudo son demasiado largas para etiquetarlas manualmente en su totalidad, use métodos de aprendizaje automático.
         NOTA: El aprendizaje supervisado se adhiere a reglas de etiquetado predefinidas: los anotadores humanos asignan etiquetas a segmentos de comportamiento seleccionados, que luego se utilizan para entrenar modelos de aprendizaje automático o IA para predecir etiquetas en todo el conjunto de datos. Si bien este enfoque mejora la eficiencia de la clasificación del comportamiento, sigue estando limitado por el conjunto limitado de etiquetas interpretables por humanos, una limitación especialmente significativa cuando se trata de comportamientos complejos y naturalistas. Para capturar la rica variabilidad de los comportamientos naturalistas, se han desarrollado métodos de clasificación de comportamientos no supervisados. Estos enfoques identifican similitudes intrínsecas entre los motivos de comportamiento a lo largo del tiempo y los agrupan dentro de espacios de características de baja dimensión, lo que permite una interpretación humana más eficiente e imparcial. En esencia, la clasificación supervisada se basa en etiquetas humanas predefinidas para guiar el reconocimiento del comportamiento, mientras que la clasificación no supervisada descubre estructuras de comportamiento latentes sin etiquetado previo, lo que ofrece una mayor flexibilidad para capturar dinámicas naturalistas complejas.
      2. Dentro del marco del comportamiento naturalista, identifique los motivos conductuales de los dos ratones utilizando el Atlas de Comportamiento (BeA)¹⁰ y el Atlas de Comportamiento Social (SBeA)¹ ( Figura 2E, Figura 3E, Figura 4E), los cuales son métodos de agrupación no supervisados diseñados para la segmentación del comportamiento. Estos métodos descomponen y agrupan el comportamiento animal en motivos de subsegundos basados en sus estructuras dinámicas y jerárquicas intrínsecas³⁴, asociándolos posteriormente con categorías de comportamiento definidas.
   6. Extraiga motivos de comportamiento de ratones individuales usando BeA.
      1. Para reducir el ruido, aplique un filtro mediano con una ventana de tiempo de 500 ms. Realice la alineación del cuerpo utilizando los puntos clave de la base de la espalda y la cola para facilitar la descomposición de los movimientos no locomotores, mientras que los puntos clave de la extremidad delantera derecha, la extremidad delantera izquierda, la extremidad trasera derecha y la extremidad trasera izquierda se utilizan para la normalización del tamaño corporal.
      2. Para la descomposición del comportamiento, use 39 coordenadas corporales alineadas, que incluyen: nariz (x, y, z), oreja izquierda (x, y, z), oreja derecha (x, y, z), cuello (x, y, z), extremidad delantera izquierda (x, y, z), extremidad delantera derecha (x, y, z), extremidad trasera izquierda (x, y, z), extremidad trasera derecha (x, y, z), pata delantera izquierda (x, y, z), pata delantera derecha (x, y, z), pata trasera izquierda (x, y, z), pata trasera derecha (x, y, z), espalda (z) y base de la cola (x, z).
      3. Establezca el índice de reducción temporal en 5, con una resolución de agrupación en clústeres de 3. Utilice la agrupación espectral para la inicialización, empleando un kernel gaussiano con un ancho de banda sigma de 30. Establezca las longitudes de segmentación mínima y máxima en 500 ms y 2000 ms, respectivamente.
      4. Para la incrustación de motivos de comportamiento, aplique UMAP con 30 vecinos más cercanos y una distancia mínima de 0,05. Agrupe los motivos a través de la agrupación jerárquica utilizando el enlace de Ward y la distancia euclidiana por pares para mejorar la estabilidad de la clasificación. El repositorio de BeA está en
      5. Identifique motivos de comportamiento social utilizando SBeA. Establezca los parámetros de inicialización para SBeA para que sean consistentes con los utilizados en BeA, con las siguientes modificaciones: el tamaño medio de la ventana del filtro se establece en 1000 ms, la longitud mínima de segmentación se aumenta a 2000 ms y la longitud máxima de segmentación se extiende a 5000 ms para la descomposición del comportamiento social.
      6. Para la incrustación de motivos, aplique un kernel gaussiano con un sigma de ancho de banda de 2. El número final de grupos de comportamiento social varía de 16 (límite inferior) a 280 (límite superior). En los ejemplos presentados, solo los 16 clústeres más grandes se utilizan con fines de demostración. El repositorio de SBeA está en https://github.com/YNCris/SBeA_release/blob/main/README_SBeA_mapper.md.

4. Mapeo de datos neuroetológicos

1. Preparar conjuntos de datos de asignación. Siguiendo las preparaciones antes mencionadas, hay siete conjuntos de datos disponibles para el mapeo neuroetológico, incluidas las actividades neuronales, las poses de los sujetos, las poses de los objetos, las distancias corporales, los motivos de comportamiento del sujeto, los motivos de comportamiento de los objetos y los motivos de comportamiento social. Organice manualmente estos archivos de la siguiente manera:
   Ruta de acceso de datos # La ruta para guardar todos los datos
   ----\A-B-C-D-E-neu.mat # Actividades neuronales
   ----\A-B-C-D-E-pose-tpm.mat # Poses del sujeto
   ----\A-B-C-D-E-pose-free.mat # Poses de objetos
   ----\A-B-C-D-E-rel_dist.mat # Distancias corporales
   ----\A-B-C-D-E-mov-tpm.mat # Motivos de comportamiento del sujeto
   ----\A-B-C-D-E-mov-free.mat # Motivos de comportamiento de objetos
   ----\A-B-C-D-E-sbea.mat # Motivos de comportamiento social
   Las definiciones de los campos A, B, C, D y E son las mismas que las de 1.5.7. Los datos de demostración para la reproducción están en https://doi.org/10.6084/m9.figshare.29606795.v1.
2. Cree las incrustaciones de la asignación utilizando CEBRA.
   NOTA: Dado que CEBRA integra enfoques basados en hipótesis y en descubrimientos para construir incrustaciones, es muy adecuado para descubrir representaciones neuronales asociadas con varias variables auxiliares (Figura 5A).
   1. Para garantizar una comparación sistemática de incrustaciones en diferentes modalidades, estandarice los parámetros de los modelos CEBRA. La arquitectura del modelo emplea los 10 desplazamientos, con un tamaño de lote de 1024, una tasa de aprendizaje de 0,0001 y un parámetro de temperatura de 1.
   2. Establezca la dimensión de salida en 3 y realice el entrenamiento durante un máximo de 15.000 iteraciones. Utilice la distancia de coseno como métrica de similitud, mientras que la variable condicional se define como el delta de tiempo con un desplazamiento de tiempo de 10. Utilice los datos de actividad neuronal como entrada y las variables auxiliares como etiquetas para generar incrustaciones conjuntas.
3. Para la autoincrustación de actividades neuronales, aplique los mismos parámetros de CEBRA, pero solo use datos de actividad neuronal como entrada.

Results

El estudio del comportamiento natural presenta una mayor complejidad en comparación con los experimentos basados en ensayos. Primero, en condiciones naturales, tanto la actividad neuronal como el comportamiento carecen de una línea de base fija. Estas actividades son recurrentes, lo que significa que están influenciadas por estados anteriores y, por lo tanto, alinear el inicio de comportamientos específicos para la comparación de la actividad neuronal no logra desenredar los efectos de los estados neuroetológicos anteriores. En segundo lugar, la codificación neuronal en el comportamiento natural ocurre principalmente a nivel de población ^4,5. La variabilidad observada en neuronas individuales es lo suficientemente sustancial como para ser considerada como ruido. Para validar esto, esta parte realizó un análisis de correlación entre la actividad neuronal y las posturas conductuales naturales (Figura 2F, Figura 3F, Figura 4F). Las matrices de coeficiente de correlación resultantes no revelaron ninguna correspondencia específica de neuronas con los rastros de pose. Específicamente, los coeficientes de correlación entre las señales neuronales y las poses de los sujetos, las poses de los objetos o las distancias entre cuerpos se encontraban dentro del rango de -0,3 a +0,3, comúnmente considerados como correlaciones débiles¹⁵ (Figura 2G, Figura 3G, Figura 4G). Estos hallazgos indican que, en condiciones naturalistas, la información relacionada con la pose no está codificada de una manera específica para las neuronas.

Dados estos factores, este marco ofrece un enfoque objetivo para capturar y mapear datos neuroetológicos a nivel de población neuronal. Las imágenes mTPM garantizan que la variabilidad de las neuronas individuales se conserve en la mayor medida posible. Además, el uso de la estimación de la pose basada en el aprendizaje profundo mediante ADPT y métodos de descomposición del comportamiento no supervisados, como BeA y SBeA, genera ricas variables auxiliares, lo que permite a CEBRA interpretar eficazmente la variabilidad dentro de las poblaciones neuronales.

Estos ejemplos demuestran que las incrustaciones conjuntas de CEBRA están presentes en todas las variables auxiliares, incluidas las poses del sujeto, las poses de los objetos, las distancias corporales, los motivos de comportamiento del sujeto, los motivos de comportamiento de los objetos y los motivos de comportamiento social (Figura 5A). Para verificar la consistencia de los motivos conductuales y las incrustaciones neuronales entre sesiones o sujetos, se utiliza el análisis de Procusto³⁵ en tres pares de ratones (Figura 5B). Dado que las incrustaciones de CEBRA se distribuyen en una esfera unitaria, solo se habilitó el parámetro de rotación en el análisis de Procusto. Dado que las incrustaciones de CEBRA de comportamiento natural carecen de una línea de base clara, esta parte primero realizó un muestreo de alineación guiado por etiquetas en las incrustaciones para alinear, asegurando puntos de anclaje consistentes antes de aplicar el análisis de Procusto. Visualmente, estas incrustaciones de CEBRA exhiben un grado de consistencia intrínseca, con la distancia corporal y los motivos sociales que muestran la mayor alineación. Se ajusta a la cuantificación del RMSE antes y después de la alineación de Procusto (Figura 5C). Luego, se compara la precisión de decodificación de incrustación para poses (Figura 5D) y motivos (Figura 5E). Si bien sus representaciones difieren, cada una se puede decodificar con alta precisión. Aunque la decodificación RMSE de la distancia corporal es significativamente mayor que la que poseen el sujeto y el objeto, no es más que la precisión de seguimiento de ADPT⁷.

Para explorar los orígenes de estas incrustaciones basadas en hipótesis, se generó una incrustación autoorganizada de la actividad neuronal a través de CEBRA (Figura 5A, columna derecha). La forma de la incrustación neural es más intrincada que la de las otras incrustaciones articulares, incorporando patrones de varias incrustaciones articulares. Además, se compararon las similitudes entre las incrustaciones neuronales y las incrustaciones articulares mediante la transformación de Procusto, y luego se compararon sus similitudes de coseno (Figura 5F). La similitud del coseno se deriva por minuto entre las incrustaciones alineadas en los puntos de tiempo correspondientes.

La inclusión conjunta de la pose del sujeto S1 se seleccionó como línea de base para las comparaciones de similitud basadas en el papel bien establecido del S1 en la codificación de entradas somatosensoriales autoorganizadas³⁶. Esta incrustación sirve como un punto de referencia biológicamente significativo para evaluar cómo se representan otras variables, como los motivos relacionados con objetos, dentro del mismo espacio neuronal. Tales comparaciones nos permiten evaluar la fuerza relativa de la codificación para diferentes dimensiones conductuales con respecto a una línea de base somatosensorial autorelacionada.

Al comparar la similitud del coseno de las incrustaciones neuronales con la S1, el sujeto plantea la incrustación conjunta como línea de base, este estudio encuentra que las incrustaciones conjuntas para los motivos de objetos son significativamente más bajas. Esto sugiere que, durante el período de 15 minutos de interacción social libre en este ejemplo, las actividades neuronales S1 del ratón sujeto codifican principalmente tanto su comportamiento como las interacciones sociales en curso. Si bien este análisis sirve como un caso demostrativo, el mismo marco metodológico se puede aplicar fácilmente a investigaciones más granulares, por ejemplo, comparando estructuras de incrustación en distintas épocas temporales para descubrir cambios dinámicos en la codificación neuronal.

Figura 1: Procedimiento para la recolección de datos neuroetológicos. (A) La integración de dispositivos. (B) La operación de registro de datos. (C) Extracción de señales neuronales, estimación de pose 2D y reconstrucción de trayectoria corporal 3D después de la grabación. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Datos preprocesados del ratón 1 para su posterior análisis. (A) Actividades neuronales. (B) Poses del sujeto. (C) Poses de objetos. (D) Distancia corporal. (E) Motivos de comportamiento. De arriba a abajo están los motivos de sujeto, objeto y comportamiento social. (F) Las matrices de coeficiente de correlación entre la actividad neuronal y las poses. Izquierda: los coeficientes de correlación entre la actividad neuronal y las poses del sujeto. Centro: los coeficientes de correlación entre la actividad neuronal y las poses de los objetos. Derecha: los coeficientes de correlación entre la actividad neuronal y la distancia corporal. Los coeficientes de correlación se encuentran entre cada traza de neurona y cada dimensión de pose. (G) Las distribuciones de los coeficientes de correlación de F. Los índices de neuronas se ordenan de acuerdo con los coeficientes de correlación entre la actividad neuronal y las poses de los sujetos. Abreviaturas: N y S = actividad neuronal y poses de sujeto, N y O = actividad neuronal y poses de objetos, N y B = actividad neuronal y distancias corporales, CC = coeficientes de correlación. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Datos preprocesados del ratón 2 para su posterior análisis. (A) Actividades neuronales. (B) Poses del sujeto. (C) Poses de objetos. (D) Distancia corporal. (E) Motivos de comportamiento. De arriba a abajo están los motivos de sujeto, objeto y comportamiento social. (F) Las matrices de coeficiente de correlación entre la actividad neuronal y las poses. Izquierda: los coeficientes de correlación entre la actividad neuronal y las poses del sujeto. Centro: los coeficientes de correlación entre la actividad neuronal y las poses de los objetos. Derecha: los coeficientes de correlación entre la actividad neuronal y la distancia corporal. Los coeficientes de correlación se encuentran entre cada traza de neurona y cada dimensión de pose. (G) Las distribuciones de los coeficientes de correlación de F. Los índices de neuronas se ordenan de acuerdo con los coeficientes de correlación entre la actividad neuronal y las poses de los sujetos. Abreviaturas: N y S = actividad neuronal y poses de sujeto, N y O = actividad neuronal y poses de objetos, N y B = actividad neuronal y distancias corporales, CC = coeficientes de correlación. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Datos preprocesados del ratón 3 para su posterior análisis. (A) Actividades neuronales. (B) Poses del sujeto. (C) Poses de objetos. (D) Distancia corporal. (E) Motivos de comportamiento. De arriba a abajo están los motivos de sujeto, objeto y comportamiento social. (F) Las matrices de coeficiente de correlación entre la actividad neuronal y las poses. Izquierda: los coeficientes de correlación entre la actividad neuronal y las poses del sujeto. Centro: los coeficientes de correlación entre la actividad neuronal y las poses de los objetos. Derecha: los coeficientes de correlación entre la actividad neuronal y la distancia corporal. Los coeficientes de correlación se encuentran entre cada traza de neurona y cada dimensión de pose. (G) Las distribuciones de los coeficientes de correlación de F. Los índices de neuronas se ordenan de acuerdo con los coeficientes de correlación entre la actividad neuronal y las poses de los sujetos. Abreviaturas: N y S = actividad neuronal y poses de sujeto, N y O = actividad neuronal y poses de objetos, N y B = actividad neuronal y distancias corporales, CC = coeficientes de correlación. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5: Análisis de las incrustaciones de datos neuroetológicos de CEBRA. (A) Incrustaciones de CEBRA. De izquierda a derecha están la incrustación conjunta de la actividad neuronal S1 y las poses del sujeto, la incrustación conjunta de la actividad neuronal S1 y las poses de los objetos, la incrustación conjunta de la actividad neuronal S1 y las distancias corporales entre dos animales, la incrustación conjunta de la actividad neuronal S1 y los motivos de comportamiento del sujeto, la incrustación conjunta de la actividad neuronal S1 y los motivos de comportamiento de los objetos, la incorporación conjunta de la actividad neuronal S1 y los motivos del comportamiento social, y la incorporación neuronal de S1. (B) El análisis de Procusto alinea las incrustaciones anteriores. Los círculos grises representan el par de ratones 1, que sirve como incrustación de referencia. Los signos más verdes representan el par de ratones 2 y las cruces naranjas representan el par de ratones 3, ambos alineados con el par de ratones 1. (C) El error cuadrático medio (RMSE) antes (izquierda) y después (derecha) de la alineación de Procusto (prueba t pareada, n = 3, media ± SEM). (D) El RMSE de la reconstrucción de la pose a partir de incrustaciones de CEBRA (ANOVA de una vía seguido de la prueba de comparaciones múltiples de Tukey, n = 3, media ± SEM). (E) La precisión de la reconstrucción del motivo a partir de incrustaciones de CEBRA (ANOVA de una vía seguido de la prueba de comparaciones múltiples de Tukey, n = 3, media ± SEM). (F) Las similitudes de coseno entre las incrustaciones conjuntas y la inclusión neuronal de S1 (ANOVA de una vía seguida de la prueba de comparaciones múltiples de Dunnett, n = 45, media ± SEM). *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

No.	Problema observado	Causa probable	Posibles soluciones
1	Sin marcas de tiempo de comportamiento	(1) Cables SMA o BNC defectuosos	(1) Reemplace los cables SMA y BNC
		(2) Falta el controlador de USB a TTL	(2) Instale el controlador USB Prolific PL2303
		(3) Selección incorrecta del puerto COM	(3) Verifique el número de puerto COM en el Administrador de dispositivos y actualícelo tanto en el software mTPM como en el script de cámara de comportamiento.
2	Sin fluorescencia visible durante el montaje de mTPM	(1) Falta de expresión viral	(1) Usa un mouse diferente
		(2) Campo de visión incorrecto	(2) Reajustar el campo de visión
		(3) Potencia láser insuficiente	(3) Aumente gradualmente la potencia del láser
		(4) Gel de carbómero seco	(4) Vuelva a aplicar gel de carbómero fresco
3	Las imágenes de mTPM muestran una pantalla completamente blanca	(1) Fuga de luz	(1) Vuelva a envolver el papel de aluminio para un blindaje adecuado
		(2) Potencia láser insuficiente	(2) Aumente gradualmente la potencia del láser
		(3) Fibra separada del cabezal mTPM	(3) Vuelva a insertar la fibra en el mTPM y apriete el tornillo de fijación
4	Fotogramas perdidos en vídeo de comportamiento	(1) Iluminación ambiental baja	(1) Aumentar la iluminación de fondo
		(2) Puerto USB incorrecto	(2) Utilice al menos puertos USB 3.0
		(3) Rendimiento insuficiente de la computadora	(3) Utilice una máquina con Intel i7-9700K o superior, RAM de doble canal y almacenamiento SSD.
5	Sin locomoción en ratones montados en mTPM	(1) Uso repetitivo del mismo mouse	(1) Evite reutilizar ratones dentro de los 3 días
		(2) Uso excesivo de papel de aluminio	(2) Use una lámina mínima necesaria para el blindaje de la luz
		(3) Número o volumen insuficiente de globos de helio	(3) Ajuste el número y el inflado de los globos para soportar la fibra mTPM mientras permite la postura y el movimiento naturales de los ratones.
6	Estimación de pose 2D inexacta	(1) Número insuficiente de marcos etiquetados manualmente	(1) Anote al menos 200 fotogramas de forma incremental
		(2) Modelo ADPT poco entrenado	(2) Aumentar las épocas de entrenamiento en el archivo config.yaml de ADPT
7	Reconstrucción de pose 3D anormal	(1) Calibración incorrecta de la cámara	(1) Mejorar el contraste de calibración y el ángulo de inclinación
		(2) Entrada de pose 2D inexacta	(2) Aumentar el número de marcos de tablero de ajedrez capturados
			(3) Resuelva primero los problemas de planteamiento 2D (consulte el Problema 6)
8	Desalineación entre datos neuronales y de comportamiento	(1) Secuencia incorrecta de inicialización de software	(1) Inicie siempre la grabación de mTPM antes de la cámara de comportamiento
		(2) Fotogramas de comportamiento eliminados	(2) Solucionar problemas de eliminación de fotogramas (consulte el Problema 4)
			(3) Asegúrese de que haya suficiente espacio en disco disponible
9	Desbordamiento de memoria durante el procesamiento BeA/SBeA	(1) Duración excesiva de la grabación	(1) Divida las grabaciones en segmentos más cortos (5-60 minutos), luego ejecute BeA / SBeA
		(2) RAM limitada del sistema	(2) Aumentar el factor de reducción temporal (por ejemplo, de 5 a 10) en BeA
			(3) Actualice la RAM a al menos 64 GB
10	CEBRA no se ejecuta en GPU	(1) Discrepancia entre CUDA y el controlador de GPU	(1) No siga directamente el tutorial para instalar CUDA 11.3
		(2) Versión de PyTorch incompatible	(2) Verifique el modelo de su GPU y la versión del controlador (nvidia-smi)
			(3) Instale las versiones correctas de CUDA y PyTorch en consecuencia y luego instale CEBRA a través de pip

Tabla 1: Lista de solución de problemas. La siguiente es una lista de 10 problemas no triviales encontrados anteriormente y posibles soluciones.

Discussion

Este marco de registro y decodificación neuroetológico se basa en dispositivos disponibles comercialmente, lo que garantiza que la mayoría de los problemas de resolución de problemas puedan ser abordados por las respectivas empresas. Aun así, este estudio proporciona una lista de problemas frecuentes para facilitar la referencia y agilizar la resolución de problemas (Tabla 1). Esta accesibilidad hace que el marco sea más fácil de usar para los recién llegados. Además, el marco es muy flexible, con sincronización entre grabaciones neuronales y de comportamiento que se basan en señales TTL estándar. Como resultado, es sencillo integrar otros dispositivos de registro fisiológico en el marco si es necesario. Los procedimientos de análisis posteriores también son lo suficientemente generales como para admitir sistemas de registro neuronal y conductual totalmente personalizados.

El costo asociado con este marco, que se basa en dispositivos comercializados, es relativamente alto (~ 500,000 USD), lo que impone una carga financiera adicional al laboratorio. Si bien las herramientas de código abierto recientes como MINI2P¹³ y Anipose³⁷ pueden ayudar a reducir los costos de materiales, esta experiencia sugiere que los gastos generales seguirán siendo similares al tener en cuenta los costos de recursos humanos involucrados en la depuración. Otra limitación de este marco radica en la interpretabilidad de las incrustaciones de CEBRA. Como método basado en redes neuronales artificiales, es intrínsecamente difícil de interpretar. Si bien este ejemplo proporciona un enfoque simple para explicar las incrustaciones, será necesario desarrollar más métodos caso por caso para diferentes proyectos. Una posible solución para una mayor interpretación de las incrustaciones de CEBRA es la aplicación de sistemas dinámicos³⁸. Además, el comportamiento natural se puede segmentar en distintas fases, como interacciones cuando los dos ratones están distantes o cerca. Diferentes preguntas científicas pueden requerir el desarrollo de flujos de trabajo de análisis de datos personalizados.

Si bien el sistema actual de cámara mTPM + 3D se implementa en un campo abierto, su aplicación no se limita a este contexto de comportamiento específico. Las principales limitaciones surgen de la atadura física del sistema de imágenes, que limita el alcance de la movilidad de los animales, y el campo de visión de la cámara 3D, que restringe el volumen rastreable. Estos factores pueden abordarse en futuras iteraciones mediante la incorporación de módulos de imágenes inalámbricas³⁹ o matrices de cámaras trampa⁴⁰ para permitir paradigmas de comportamiento más complejos y naturalistas. En particular, tanto el sistema mTPM como la configuración de la cámara 3D son capaces de una adquisición de datos continua de 24 horas^10,41, lo que hace que toda la tubería sea adecuada para estudios de registro neuronal y de comportamiento a largo plazo.

Este estudio adopta un enfoque totalmente basado en datos para investigar la codificación neuronal del comportamiento espontáneo y, por lo tanto, se abstiene intencionalmente de asignar etiquetas semánticas predefinidas a motivos conductuales agrupados. Esta decisión se basa en el objetivo de preservar la generalización del marco de mapeo del comportamiento neuronal, lo que le permite operar independientemente de las categorías de comportamiento impuestas por el experimentador. Los lectores interesados en la interpretabilidad biológica y la clasificación supervisada de los motivos conductuales pueden consultar trabajos anteriores ^1,10, así como un estudio reciente⁴², que comparó sistemáticamente la agrupación de motivos no supervisados con comportamientos etiquetados manualmente utilizando el mismo marco subyacente del Atlas de Comportamiento. Estos estudios también proporcionan visualizaciones extensas, incluidas secuencias de poses 3D, trayectorias e incrustaciones a nivel de motivo, disponibles a través de repositorios públicos. Juntos, estos recursos ofrecen información complementaria sobre la estructura semántica del comportamiento al tiempo que respaldan el enfoque de decodificación neuronal flexible y generalizable adoptado aquí.

Esta canalización de procesamiento de datos se diseñó teniendo en cuenta la modularidad y la flexibilidad, lo que permite la adaptación a diversos entornos experimentales y preferencias del usuario. Cada componente principal de la canalización, que va desde la estimación de la pose 3D, la agrupación de motivos conductuales no supervisados, el preprocesamiento de señales neuronales hasta la incrustación neuroetológica conjunta, se implementa como un módulo independiente con interfaces de entrada y salida claramente definidas. Esta arquitectura permite a los usuarios sustituir herramientas o algoritmos alternativos en cada etapa (por ejemplo, diferentes marcos de estimación de poses ^6,22, algoritmos de agrupación de comportamientos^43,44 o decodificadores neuronales^45,46) sin interrumpir el flujo de trabajo general. Si bien estos componentes están diseñados para ser interoperables, este estudio no ha probado exhaustivamente todas las combinaciones posibles de métodos alternativos, y es posible que los usuarios deban realizar ajustes adicionales para garantizar la compatibilidad en sus aplicaciones específicas. Dicha modularidad facilita tanto la reproducibilidad como la extensibilidad, y permite que el marco se adapte a las especies, modalidades de registro o paradigmas de comportamiento más allá de los que se demuestran aquí. Para apoyar un uso comunitario más amplio, este estudio proporciona una descripción general esquemática y una tabla de resumen (Figura 1, Tabla de materiales).

La configuración de parámetros utilizada para SBeA y CEBRA en esta canalización se basa en una combinación de valores predeterminados y ajustes empíricos específicos de este contexto experimental, ratones que se mueven libremente bajo interacción social natural. Estos parámetros han sido validados para reproducir todos los resultados presentados en este estudio sin necesidad de ajustes adicionales. Si bien es posible que los usuarios deseen ajustar ciertos parámetros para adaptarse a diferentes configuraciones de grabación o tareas de comportamiento, tales modificaciones no son necesarias para replicar esta canalización. Para los usuarios que trabajan en otros contextos, se recomienda consultar la documentación y la literatura originales de SBeA y CEBRA, donde se proporcionan rangos de parámetros y orientación específica para la tarea. Esta implementación sirve como una configuración de referencia robusta que se puede aplicar directamente o adaptar según sea necesario.

El principal avance de este marco radica en su aplicación a los animales que se mueven libremente. Los estudios previos realizados con animales con cabeza fija se pueden adaptar a las condiciones de movimiento libre dentro de este marco. Por ejemplo, tareas como la Tarea⁴⁷ de Ir / No Ir y la Elección Forzada de Dos Alternativas⁴⁸ pueden modificarse e integrarse en este marco en función de los paradigmas de comportamiento natural. Este enfoque elimina los artefactos causados por la restricción de la cabeza, lo que permite el estudio de la relación entre la tarea y los estados de comportamiento natural. Este marco proporciona a los animales una mayor autonomía en la toma de decisiones. También apoya los estudios de la médula espinal en contextos naturalistas, combinando el método de registro de la médula espinal mTPM⁴⁹. Además, facilita el estudio del comportamiento grupal libre, un fenómeno que no es factible en configuraciones de cabeza fija. El flujo de trabajo de análisis de datos permite la interpretación de la actividad de la población neuronal a través de múltiples variables, utilizando incrustaciones para desentrañar la complejidad de la función cerebral detrás de las poblaciones neuronales.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sistema de registro de comportamiento 3D	BayONE Científico	Ratón BA-3D	Módulo de sincronización integrado
Globo	AliExpress	URL: https://tinyurl.com/3uex669s	Cualquier globo que sea lo suficientemente ligero como para volar cuando está lleno de helio. Los globos son globos de lámina esféricos, de aproximadamente 45 cm de diámetro, y cuentan con válvulas autosellantes. La URL proporciona un ejemplo de los globos.
Gel ocular Carbomer	Vidisic	Gel lubricante para ojos a base de Carbomer 980	10g
Cordel de algodón	AliExpress	URL: https://tinyurl.com/ywu7u754	Grueso y ligero, de 1-2 mm de diámetro. La URL proporciona un ejemplo del cordel de algodón.
Taladro craneal	RWD	78001	Taladro de 0,8, 1,4 y 2,1 mm
Módulo de cámara personalizado configurable	Intel	RealSense D435	/
Adhesivo estructural acrílico de alto rendimiento	HUITIAN	1320	490 ml
Ratón para imágenes	TRASCENDER VIVOSCOPIO	URL: https://en.tv-scope.com/	El ratón macho con fondo C57BL/6J (10 semanas de edad) se alojó en 1 ratón por jaula bajo un 12  h ciclo de luz-oscuridad a 22– 25  ° C con 40%– 70% de humedad y se le permitió acceder al agua y a los alimentos ad libitum. Los virus AAV9-CaMKII-GCaMP6s se inyectaron en su corteza somatosensorial primaria (AP, &menos; 0,60 milímetros; ML, &menos; 2,40 milímetros; DV, 2,00 mm). En nuestro estudio, los ratones fueron preparados por TRANSCEND VIVOSCOPE como parte de su servicio profesional de preparación animal. Este servicio incluye inyección de virus, implantación de ventana craneal e instalación de placa base específicamente diseñada para su sistema de microscopía de dos fotones en miniatura.
Ratón para interacción	BayONE LAC	URL: https://lac.bayonesci.com/	Los ratones machos con fondo C57BL/6J (10 semanas de edad) se alojaron en 5 ratones por jaula bajo un 12  h ciclo de luz-oscuridad a 22– 25  ° C con 40– 70% de humedad y se les permitió acceder al agua y a los alimentos ad libitum. Todos los procedimientos experimentales y de cría fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales del Instituto de Tecnología Avanzada de Shenzhen, Academia China de Ciencias.
Sistema de grabación neuronal mTPM	TRASCENDER VIVOSCOPIO	SUPERNOVA-600	El SUPERNOVA-600 es un sistema de imágenes de dos fotones en miniatura totalmente integrado para roedores que se mueven libremente, incluidos todos los componentes ópticos y de registro esenciales, pero excluyendo los dispositivos de estimulación externa. Debe contener el módulo de sincronización integrado.