Aquí, presentamos un protocolo para evaluar los efectos cardioprotectores de la señalización de NRG1 / ErbB4 en un modelo de rata de lesión por isquemia-reperfusión mediante la evaluación del estrés oxidativo y las vías de señalización apoptóticas.
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Artículo de investigación
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Aquí, presentamos un protocolo para evaluar los efectos cardioprotectores de la señalización de NRG1 / ErbB4 en un modelo de rata de lesión por isquemia-reperfusión mediante la evaluación del estrés oxidativo y las vías de señalización apoptóticas.
La lesión por isquemia-reperfusión miocárdica (IRMI) perdura como un impedimento sustancial para el tratamiento de la enfermedad cardiovascular. La fisiopatología de MIRI es compleja e involucra estrés oxidativo, sobrecarga de calcio, inflamación y apoptosis. La vía de señalización NRG1 / ErbB4 se ha implicado en la modulación de las respuestas de estrés oxidativo en el corazón, lo que podría reducir el daño celular causado por los radicales libres. Este estudio tuvo como objetivo dilucidar los mecanismos moleculares por los cuales la vía NRG1 / ErbB4 confiere protección en un modelo de rata de lesión por isquemia-reperfusión miocárdica (MIRI). Se estableció un modelo MIRI de rata, que involucró a 30 ratas Sprague-Dawley macho adultas asignadas aleatoriamente a cinco grupos: control, operación simulada, MIRI, NRG1 recombinante y AG1478. Las concentraciones de NRG1 en los tejidos cardíacos se midieron mediante ELISA, mientras que los niveles de proteína p-ErbB4 y ErbB4 total se evaluaron mediante Western blot. La apoptosis de cardiomiocitos y los niveles de especies reactivas de oxígeno (ROS) se evaluaron mediante citometría de flujo. En el grupo MIRI, los niveles de NRG1 se redujeron significativamente en comparación con los grupos control y operación simulada (p < 0,05). El tratamiento con NRG1 recombinante condujo a un marcado aumento en los niveles de NRG1 en el tejido cardíaco, junto con una relación de expresión de p-ErbB4 / ErbB4 mejorada (p < 0,05). El grupo AG1478 exhibió niveles más bajos de NRG1 y una relación p-ErbB4 / ErbB4 reducida en comparación con el grupo NRG1 recombinante (p < 0,05). En cuanto a los niveles de apoptosis y ROS, el grupo MIRI mostró tasas significativamente más altas que los grupos control y operación simulada (p < 0,05). El tratamiento con NRG1 recombinante redujo significativamente la apoptosis de células miocárdicas y los niveles de ROS (p < 0,05), mientras que AG1478 también atenuó estos efectos, pero en menor medida. La vía de señalización NRG1 / ErbB4 juega un papel protector fundamental en MIRI en ratas. La suplementación con NRG1 exógeno eleva eficazmente los niveles de NRG1 en el corazón, activa la vía de señalización ErbB4, reduce la apoptosis de las células miocárdicas y disminuye los niveles de ROS, mitigando así el daño inducido por MIRI.
La lesión por isquemia-reperfusión miocárdica (IRMI) representa un desafío crítico en el manejo de las enfermedades cardiovasculares1. Aunque restaurar el flujo sanguíneo al miocardio isquémico es esencial para tratar el infarto de miocardio, la reperfusión en sí misma puede exacerbar el daño del tejido cardíaco, limitando así el efecto terapéutico. Los mecanismos subyacentes a la IRM son complejos e incluyen diversos procesos fisiopatológicos, entre los que se encuentran el estrés oxidativo, la sobrecarga de calcio, las respuestas inflamatorias y la apoptosis 2,3,4.
El factor de crecimiento nervioso 1 (NRG1) y su receptor Erb-B2 Receptor Tirosina quinasa 4 (ERBB4) juegan un papel fundamental en la fisiología y patología cardíaca. NRG1, un ligando extracelular, interactúa con el receptor ErbB4 para activar una cascada de vías de señalización que son cruciales para el desarrollo del corazón, el mantenimiento de la integridad estructural y la respuesta a las lesiones cardíacas5. La evidencia emergente destaca el papel desempeñado por la vía de señalización NRG1 / ErbB4 en las enfermedades cardíacas. En condiciones de isquemia-reperfusión miocárdica, la expresión y función de NRG1 puede verse alterada6. Estudios anteriores han sugerido que NRG1 promueve la supervivencia de las células miocárdicas e inhibe la apoptosis excesiva mediante la activación de ErbB4. Además, la vía de señalización NRG1 / ErbB4 puede regular la respuesta al estrés oxidativo en el corazón y mitigar el daño celular causado por los radicales libres. Por lo tanto, dilucidar la función de la vía de señalización NRG1/ErbB4 en MIRI es vital para comprender la base biológica de esta lesión y desarrollar nuevas estrategias terapéuticas 7,8.
Este estudio especula que la vía de señalización NRG1 / ErbB4 juega un papel protector en MIRI. Por lo tanto, en este estudio, se construyó un modelo de rata de isquemia-reperfusión miocárdica para investigar sistemáticamente el mecanismo de la vía de señalización NRG1 / ErbB4 en MIRI. Regulando la concentración de NRG1 y observando los cambios en el estado de activación de ErbB4, la tasa de apoptosis de las células miocárdicas y el nivel de estrés oxidativo. Este estudio intenta revelar el mecanismo molecular por el cual la vía de señalización NRG1 / ErbB4 ejerce un efecto protector en MIRI. La novedad de este estudio radica en revelar la importancia de la vía de señalización NRG1/ErbB4 en la lesión por isquemia-reperfusión miocárdica, y también en proporcionar una nueva perspectiva para las estrategias de tratamiento de las enfermedades cardíacas basadas en esta vía.
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Animales de experimentación
Treinta ratas Sprague-Dawley macho adultas (SD), de 8 semanas de edad y con un peso de 180-200 g, se obtuvieron de un proveedor comercial. Estas ratas se alojaron en condiciones específicas libres de patógenos durante 1 semana antes de los experimentos. Los experimentos recibieron la aprobación del Comité de Ética del Primer Hospital de Nanping (NO. NPSY202208010).
Modelos animales de lesión por isquemia-reperfusión miocárdica
Las ratas fueron anestesiadas mediante inyección intraperitoneal de pentobarbital sódico al 3% a una dosis de 50 mg / kg. Después de confirmar la ausencia de reflejos, los animales se colocaron en posición supina, y las áreas del cuello y el pecho se afeitaron y desinfectaron con etanol al 75%. Se realizó una incisión cervical en la línea media (~2 cm) para exponer la tráquea, seguida de intubación oral con un catéter de 16 G para mantener la permeabilidad de las vías respiratorias durante la cirugía. Posteriormente, el músculo pectoral mayor izquierdo se diseccionó cuidadosamente para exponer el tercer y cuarto espacio intercostal. Se realizó una toracotomía haciendo una incisión entre estos espacios, y se abrió el pericardio para exponer completamente el corazón. Para inducir la isquemia, la arteria coronaria descendente anterior izquierda (LAD) se ligó con un 8-0 sutura de nylon. Se insertó un tubo de polietileno (PE-10) entre la DA y la ligadura para permitir la oclusión reversible. La isquemia se mantuvo durante 45 min, confirmada visualmente por blanqueamiento miocárdico y cambios en el ECG. La reperfusión se inició liberando la ligadura, lo que permitió que el flujo sanguíneo se reanudara durante 3 h. La ligadura se retiró 45 min después.
Agrupación experimental
Las ratas fueron asignadas aleatoriamente a cinco grupos (n = 6 cada uno). (1) Grupo de control: las ratas recibieron atención estándar sin ninguna intervención o tratamiento quirúrgico. (2) Grupo de operación simulada: las ratas se sometieron a toracotomía y enhebrado de la arteria coronaria descendente anterior izquierda (LAD) sin ligadura, sirviendo como controles quirúrgicos. (3) Grupo MIRI: las ratas se sometieron a inducción de lesiones por isquemia-reperfusión miocárdica y se les administró solución salina normal por vía intragástrica como control del vehículo. (4) Grupo NRG1 recombinante: las ratas recibieron una inyección intravenosa de NRG1 humano recombinante (rh-NRG1) a una dosis de 5 mg / kg, 30 min antes de la toracotomía, seguida del procedimiento MIRI. (5) Grupo AG1478: a las ratas se les administró rh-NRG1 intravenoso (5 mg / kg) combinado con AG1478 (20 mg / kg), un inhibidor de la quinasa del receptor ErbB, 30 min antes de la toracotomía, y luego se sometieron al procedimiento MIRI.
Ensayo inmunoenzimático (ELISA)
Los animales fueron sacrificados mediante inyección intraperitoneal de pentobarbital sódico (150 mg/kg). Los tejidos cardíacos se recolectaron inmediatamente después de la reperfusión y se homogeneizaron en hielo en un volumen apropiado de PBS helado. A continuación, los homogeneizados se centrifugaron a 1200 x g durante 10 min a 4 °C para separar el sobrenadante. La concentración de NRG1 en el sobrenadante se cuantificó utilizando un kit ELISA NRG1 disponible comercialmente, siguiendo exactamente las instrucciones del fabricante. Brevemente, se agregaron muestras y estándares a los pocillos de placas ELISA, se incubaron a temperatura ambiente durante el tiempo recomendado, seguido de lavado y adición de anticuerpos de detección. La absorbancia se midió a la longitud de onda especificada utilizando un lector de microplacas, y los niveles de NRG1 se calcularon en función de la curva estándar. El volumen de la muestra fue de 100 μL, la dilución del anticuerpo fue de 1:100 y la longitud de onda para medir la absorbancia se estableció en 450 nm.
Análisis de Western blot
Los tejidos cardíacos se extirparon de ratas anestesiadas y se enjuagaron en PBS helado para eliminar la sangre residual. Para cada corazón, se pesaron aproximadamente 0,5 g de tejido ventricular izquierdo y se colocaron en 500 μL de tampón de lisis RIPA recién preparado. Luego, el tejido se homogeneizó en hielo usando un molinillo de tejido mecánico hasta que se lisó por completo, seguido de incubación en hielo durante 30 min para asegurar la extracción completa de proteínas. Los lisados se centrifugaron a 12.000 × g durante 15 min a 4 °C para eliminar los residuos. Las concentraciones de proteínas se determinaron utilizando un kit de ensayo de BCA. Cantidades iguales de proteína total (por ejemplo, 30 μg por carril) se cargaron y separaron mediante SDS-PAGE. Luego, las proteínas se transfirieron a membranas de fluoruro de polivinilideno (PVDF) utilizando un sistema de transferencia húmeda a 100 V durante 90 min. Las membranas se bloquearon con leche en polvo descremada al 5% en solución salina tamponada con Tris con Tween-20 al 0,1% (TBST) durante 1 h a temperatura ambiente. Posteriormente, las membranas se incubaron durante la noche a 4 °C con anticuerpos primarios contra ErbB4 fosforilado (p-ErbB4) y ErbB4 total, cada uno diluido 1:1000. Después del lavado, las membranas se incubaron con anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa de rábano picante (HRP) durante 1 h a temperatura ambiente. Las bandas de proteínas se visualizaron utilizando un sustrato de quimioluminiscencia mejorada (ECL) y se capturaron mediante un sistema de imágenes en gel. Las intensidades de banda se cuantificaron utilizando el software ImageJ y se calculó la relación entre p-ErbB4 y ErbB4 total para evaluar los niveles de fosforilación.
Citometría de flujo
La apoptosis de los miocitos cardíacos se evaluó mediante citometría de flujo. Los tejidos cardíacos se picaron finamente y se digirieron enzimáticamente utilizando una mezcla de colagenasa tipo II (1 mg / ml) y proteasa (p. ej., tripsina, 0,25%) a 37 ° C con agitación suave durante 20-30 min. La digestión enzimática se terminó agregando un volumen igual de suero bovino fetal (FBS). La suspensión celular se filtró a través de una malla de nailon de 70 μm y se centrifugó a 300 × g durante 5 min a 4 °C para recolectar las células. El sedimento celular se resuspendió en tampón de unión, luego se incubó con anexina V-FITC y yoduro de propidio (PI) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Después de la incubación durante 15 min a temperatura ambiente en la oscuridad, las muestras se analizaron inmediatamente mediante citometría de flujo. Las células apoptóticas tempranas se identificaron como anexina V positiva y PI negativa, mientras que las células apoptóticas tardías o necróticas fueron positivas para ambos marcadores. Las tasas de apoptosis se cuantificaron y compararon entre los grupos experimentales. La estrategia de compuerta adopta una configuración de puerta cruzada / puerta rectangular. Al realizar la detección en la máquina, la puerta cruzada se estableció como una línea punteada y se aplicaron todos los parámetros para garantizar la consistencia de la detección de datos. El caudal se ajustó de acuerdo con la concentración de la celda (mantenida a 1000 celdas/s), y la carga de muestras a baja velocidad puede evitar la obstrucción de la boquilla.
Detección de niveles de especies reactivas de oxígeno (ROS)
Los cardiomiocitos se aislaron de los tejidos cardíacos, seguidos de centrifugación a 300 × g durante 5 min y lavado dos veces con solución salina tamponada con fosfato (PBS). Luego, las células se incubaron con colorante de diacetato de 2',7'-diclorofluoresceína (DCFDA) de 10 μM a 37 ° C durante 30 min en la oscuridad, siguiendo las instrucciones del fabricante. Después de la tinción, las células se lavaron dos veces con PBS para eliminar el exceso de tinte no unido. Los niveles de ROS intracelulares se midieron inmediatamente por citometría de flujo, detectando la intensidad de fluorescencia emitida tras la oxidación de DCFDA. La intensidad media de fluorescencia (MFI) de cada muestra se cuantificó utilizando el software FlowJo para comparar los niveles de ROS en los grupos experimentales. La estrategia de activación es la descrita anteriormente (sección de citometría de flujo).
Análisis estadístico
El análisis de los datos se realizó mediante el software SPSS, presentado como la media ± la desviación estándar (DE). Se realizó un análisis de varianza unidireccional con la prueba post hoc de Tukey para comparar múltiples grupos, y se utilizó la prueba t de Student para comparaciones por pares. Un valor de p < 0,05 se consideró estadísticamente significativo.
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NRG1 ejerce un efecto protector contra la apoptosis de cardiomiocitos inducida por MIRI
El análisis de citometría de flujo indicó una elevación notable en las tasas de apoptosis en el grupo MIRI en comparación con los grupos control y simulado (P < 0,05). Tanto el grupo recombinante NRG1 como el AG1478 exhibieron tasas de apoptosis significativamente reducidas en comparación con el grupo MIRI (P < 0,05). Por el contrario, el grupo NRG1 recombinante exhibió una tasa de apoptosis reducida en compa...
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La IRI sigue suponiendo un obstáculo importante en el manejo de la enfermedad cardiovascular, dado que el restablecimiento de la perfusión al tejido cardíaco isquémico puede, paradójicamente, intensificar la lesión miocárdica. La ocurrencia de MIRI es multifactorial, involucrando estrés oxidativo, sobrecarga de calcio, reacciones inflamatorias y disfunción mitocondrial 9,10.
NRG1, un ligando extracelul...
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Los autores no tienen conflictos de intereses que declarar.
Este trabajo fue apoyado por la Fundación de Ciencias Naturales de la Provincia de Fujian (número de subvención.2024J011604,2023J011877) y el Proyecto de Investigación Juvenil de la Comisión Provincial del Hogar de Fujian (número de subvención.2019-9-25).
CONTRIBUCIÓN DEL AUTOR:
Maozhi Huang dirigió la concepción y el diseño del proyecto de investigación, planificó y detalló el protocolo experimental, participó en experimentos clave y escribió el primer borrador del manuscrito. Jianping Zheng contribuyó igualmente a la investigación general, incluido el diseño, la recopilación de datos y la redacción del manuscrito. Xianlu Cheng contribuyó al diseño de la investigación, recolectó muestras y analizó datos. Chaoqun: Ayudó a escribir y estructurar el manuscrito. Ziguo Chen verificó los datos y ayudó a mejorar la sección de métodos y materiales. Ling Jiang proporcionó control académico y orientación durante todo el proceso de investigación. Shanghua Xu guió la dirección general del proyecto, coordinó los recursos y revisó y revisó el manuscrito final.
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| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| AG1478 | Tecnología BioLab | WD102925 | Fármaco de intervención AG1478 |
| Kit de detección de apoptosis ANNEXIN V-FITC/PI | Meilune | MA0220 | Apoptosis por citometría de flujo |
| Kit de ensayo de proteínas BCA | Meilunbio | MA0082-2 | Cuantificación de proteínas WB |
| Sistema de imágenes de quimioluminiscencia | Bio-Rad (Estados Unidos) | ChemiDoc Touch | Imágenes de Western blot |
| Clorhidrato de ciamemazina | Salud Animal Huamu | 20220601 | Anestésico para modelado animal |
| Kit de detección ECL | Meilunbio | MA0186-1 | Quimioluminiscencia WB |
| ERbB4 | Tecnología de proteínas | 19943-1-AP | Anticuerpo primario WB |
| Citómetro de flujo | BD | FACSCalibur | Detección de apoptosis por citometría de flujo |
| GAPDH | Tecnología de proteínas | 60004-1-IG | Anticuerpo de control de carga WB |
| IgG de cabra anti-ratón conjugada con HRP (H + L) | Tecnología de proteínas | SA00001-1 | Inmunohistoquímica |
| IgG anticonejo de cabra conjugada con HRP (H + L) | Tecnología de proteínas | SA00001-2 | Inmunohistoquímica |
| Lector de microplacas | Termo | K3 | Detección de ELISA |
| Kit de preparación de gel PAGE 15% | Meilunbio | MA0384 | Electroforesis WB |
| p-ERbB4 | Afinidad | AF3445 | Anticuerpo primario WB |
| Marcador de proteína preteñido | Meilunbio | MA0342 | Electroforesis WB |
| Kit ELISA de neuregulina-1 para ratas (NRG-1) | Meimian | MM-61434R2 | Detección de ELISA |
| Kit de ensayo de especies reactivas de oxígeno (ROS) | Meilune | MA0219 | Ensayo WB |
| rhNRG1 | Tecnología BioLab | WD091127 | Fármaco de intervención NRG1 |
| Tampón de lisis RIPA | Meilunbio | MA0151 | Extracción de proteínas para Western blot |
| Búfer de carga SDS-PAGE (5x) | Tiempo de beyo. | P0015L | Electroforesis WB |
| Dodecil sulfato de sodio | Sigma | 151-21-3 | Electroforesis WB |
| Su Tai 50 | Virbac (Francia) | 8X22A | Anestésico para modelado animal |
| Sistema de electroforesis vertical de proteínas | Bio-Rad (Estados Unidos) | POWER PAC 200 | Electroforesis Western blot |
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