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Explorando las interacciones proteína-glicano: avances en la resonancia magnética nuclear

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DOI:

10.3791/68674

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26 de agosto de 2025

 ,  , 
1Institute of Medical Biochemistry Leopoldo de Meis (IBqM), Federal University of Rio de Janeiro (UFRJ), 2National Center for Structural Biology and Bioimaging (CENABIO), Federal University of Rio de Janeiro (UFRJ), 3Laboratory of Connective Tissue, Clementino Fraga Filho University Hospital

En este artículo

Resumen

Este protocolo basado en RMN investiga las interacciones débiles proteína-glicano utilizando cianovirina-N y D-manosa. Combinando métodos detectados por ligandos y proteínas, mapea sitios de unión, detecta efectos alostéricos e identifica complejos de encuentro. El enfoque describe la preparación de muestras y el análisis de datos, ofreciendo información estructural y dinámica valiosa para el diagnóstico específico de glicanos y los mecanismos de reconocimiento.

Resumen

Las interacciones proteína-glicano son fundamentales para muchos procesos biológicos y se reconocen cada vez más como objetivos prometedores para las estrategias de diagnóstico en enfermedades infecciosas, inflamatorias y neoplásicas. Sin embargo, caracterizar estas interacciones, especialmente cuando son débiles y transitorias, sigue siendo un desafío técnico. La espectroscopia de resonancia magnética nuclear (RMN) ofrece ventajas únicas para estudiar tales interacciones en condiciones casi fisiológicas, proporcionando información de resolución atómica sobre aspectos estructurales y dinámicos. En este estudio, presentamos un protocolo integrado de RMN diseñado para investigar las interacciones proteína-glicano de baja afinidad utilizando la lectina cianovirina-N específica de manosa y el monosacárido D-manosa como sistema modelo. El protocolo combina enfoques de RMN basados en ligandos y proteínas para mapear los sitios de unión de manera integral y detectar eventos de unión sutiles, incluidos posibles efectos alostéricos o complejos de encuentro. Los pasos críticos del protocolo incluyen una preparación cuidadosa de la muestra, un control preciso de las concentraciones y la estandarización espectral para garantizar la reproducibilidad y confiabilidad de los datos. La RMN en solución permite la detección de interacciones transitorias que a menudo son inaccesibles por otras técnicas. Aunque las interacciones débiles son esenciales para la vida, existe un sesgo en la literatura hacia complejos de mayor afinidad, aunque los complejos de baja afinidad son relevantes en muchas funciones biológicas importantes, como la transducción de señales y la comunicación célula-célula. Esta técnica proporciona una plataforma poderosa para investigar el reconocimiento proteína-glicano y puede servir como una herramienta valiosa para identificar nuevos marcadores de diagnóstico sobre la base de interacciones específicas de glicanos.

Introducción

Las interacciones proteína-glicano son fundamentales para una amplia gama de procesos biológicos, incluido el reconocimiento célula-célula, la modulación de la respuesta inmune y las interacciones patógeno-huésped 1,2. Estas interacciones moleculares son altamente específicas y dinámicas y juegan un papel crucial en los mecanismos fisiológicos y patológicos 3,4,5. Un ejemplo clásico de tales interacciones ocurre con las lectinas, proteínas que reconocen y se unen específicamente a los glicanos. La cianovirina-N (CVN), por ejemplo, ha sido ampliamente estudiada como modelo experimental debido a su capacidad para interactuar en alta afinidad con oligosacáridos de manosa altos 5,6,7.

Además de las lectinas, muchas proteínas glicosiladas, como las integrinas, también juegan un papel esencial en el reconocimiento y la señalización celular. Las integrinas son receptores transmembrana que con frecuencia sufren glicosilación de sus subunidades, lo que influye en su estabilidad y afinidad por los ligandos, incluidos los glicanos 5,8,9,10. Sin embargo, la caracterización estructural de estas interacciones sigue siendo un desafío debido a la heterogeneidad intrínseca y la flexibilidad de los glicanos, lo que complica los enfoques tradicionales de biología estructural. En este contexto, el desarrollo de metodologías avanzadas capaces de capturar estas interacciones en solución es de gran valor para este campo, particularmente para la glicobiología11,12.

La espectroscopia de resonancia magnética nuclear (RMN) se ha convertido en una poderosa herramienta para investigar las interacciones proteína-ligando a nivel atómico. A diferencia de otras técnicas, como la cristalografía de rayos X y la criomicroscopía electrónica, la RMN permite el estudio de las interacciones biomoleculares en condiciones casi fisiológicas, proporcionando información tanto sobre la estructura como sobre la dinámica. Esta flexibilidad permite a los investigadores modular parámetros ambientales como el pH (generalmente entre 4.0-8.0), la fuerza iónica (por ejemplo, 0-500 mM de NaCl) y la temperatura (generalmente 273-330 K), adaptando así las condiciones a las especificidades de los complejos proteína-glicano. Además, la RMN es particularmente ventajosa para analizar interacciones transitorias y débiles, que a menudo son características de los eventos de reconocimiento proteína-glicano13,14.

Se han empleado varias técnicas de RMN para investigar las interacciones proteína-glicano, utilizando enfoques basados en proteínas y ligandos. Desde la perspectiva de las proteínas, la valoración heteronuclear de coherencia cuántica única (HSQC) se usa ampliamente para mapear sitios de unión mediante el monitoreo de perturbaciones de cambio químico tras la adición de ligandos. Los experimentos de dispersión por relajación permiten la detección de procesos conformacionales y de intercambio químico que ocurren en la escala de tiempo de micro a milisegundos, proporcionando información sobre los aspectos dinámicos del reconocimiento de glicanos15,16. Estas técnicas basadas en proteínas generalmente requieren concentraciones de muestra en el rango de 50 μM a 2 mM, dependiendo de la estabilidad de la proteína y la eficiencia de etiquetado17,18.

Las técnicas de RMN basadas en ligandos ofrecen información complementaria al centrarse en los cambios de glicanos durante la unión. La diferencia de transferencia de saturación (STD-NMR) es particularmente útil para identificar epítopos de glicanos involucrados en el reconocimiento, ya que satura selectivamente las señales de RMN de las regiones de ligando en estrecho contacto con la proteína19,20. Los ligandos de agua observados mediante espectroscopia de gradiente (WaterLOGSY)21,22 y la espectroscopia de efecto de sobreuso nuclear transferido (Tr-NOESY) proporcionan medios adicionales para evaluar la unión de ligandos y los cambios conformacionales durante las interacciones23. Además, los experimentos de relajación de Carr-Purcell-Meiboom-Gill (CPMG) ayudan a identificar interacciones débiles y transitorias que son difíciles de detectar con métodos convencionales24. Los experimentos basados en ligandos a menudo se realizan a concentraciones de proteína de 10-50 μM y pueden requerir la optimización de los tiempos de mezcla y los parámetros de saturación25. En particular, estos métodos pueden estar limitados por la baja solubilidad de los glicanos o la mala relación señal-ruido cuando se trabaja con ligandos pequeños.

Juntos, estos métodos de RMN proporcionan un marco integral para dilucidar las propiedades estructurales y dinámicas de las interacciones proteína-glicano. Con los continuos avances en las estrategias de sensibilidad y etiquetado isotópico, esta técnica se está volviendo cada vez más esencial en glicobiología, ofreciendo nuevas perspectivas sobre los mecanismos de reconocimiento molecular con aplicaciones potenciales en el desarrollo de fármacos y el descubrimiento de biomarcadores. Sin embargo, el éxito de estos enfoques depende de factores como la homogeneidad de la muestra, la complejidad de los glicanos y la presencia de regiones flexibles o desordenadas que pueden ampliar las señales de RMN o dificultar la interpretación26. La RMN es un método poderoso para estudiar eventos transitorios, lo cual es un desafío importante en biología estructural.

CVN reconoce residuos de manosilo unidos a α(1,2) presentes en oligosacáridos con alto contenido de manosa con afinidades nanomolares 27,28,29. Sin embargo, reconoce mal el monosacárido D-manosa. En el presente trabajo, estudiamos la interacción de CVN con D-manosa como una forma de ilustrar cómo la RMN es poderosa para comprender las interacciones transitorias.

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Protocolo

NOTA: Realice todos los pasos que involucren cultivos bacterianos y preparaciones tampón de acuerdo con los protocolos institucionales de bioseguridad. Use equipo de protección personal (EPP) y, cuando manipule cultivos abiertos o productos químicos, trabaje en un gabinete de bioseguridad o campana extractora de productos químicos si es necesario.

1. Expresión de cianovirina-N

  1. Transformar las células de E. coli BL21 con un plásmido que codifica el gen CVN insertado en el vector pET26a.
  2. Cultivar las células en 1 L de Super Broth (32 g de triptona, 20 g de extracto de levadura, 5 g de NaCl por L), suplementado con kanamicina (50 μg/mL), 0,5% (p/v) de glucosa y 1,6 mM de MgSO4. Incubar bajo agitación continua a ~250 rpm a 37 °C.
  3. Para la producción de CVN marcado con 15N, cultive las células en un medio mínimo M9 modificado utilizando 15NH4Cl como única fuente de nitrógeno.
    1. Preparar 1 L de medio mínimo M9 mezclando 200 mL de solución estéril de sales 5x M9 que contenga 64 g/L de Na2HPO4, 15 g/L de KH2PO4, 2,5 g/L de NaCl, 5 g/L de NH4Cl.
    2. Agregue 2 ml de 1 M de MgSO4 (0,22 μm esterilizado por filtro), 0,1 ml de 1 M de CaCl2 (0,22 μm esterilizado por filtro) y 4 g de glucosa (concentración final 0,4%, disuelta en agua destilada estéril y 0,22 μm esterilizada por filtro).
    3. Llevar el volumen final a 1 L con agua destilada estéril.
      NOTA: Se pueden agregar suplementos como aminoácidos o vitaminas según sea necesario.
  4. Monitorizar el cultivo hasta que alcance una densidad óptica (OD600) de aproximadamente 1,2. Luego, agregue isopropil-beta-D-tiogalactopiranósido (IPTG) a una concentración final de 1.0 mM para inducir la expresión de proteínas.
  5. Incubar durante 20 h después de la inducción a 37 °C.
  6. Cosechar las células por centrifugación a 7.000 × g durante 10 min a 4 °C.
  7. Aísle la fracción periplásmica de la siguiente manera:
    1. Vuelva a suspender los gránulos celulares en 0,4 volúmenes de tampón Tris-HCl 30 mM (pH 8,0) que contenga sacarosa al 20% y EDTA 1 mM e incube a temperatura ambiente agitando durante 10 min.
    2. Centrifugar a 10.000 × g durante 10 min a 4 °C.
    3. Vuelva a suspender los gránulos resultantes en 0,4 volúmenes de agua destilada helada e incube en hielo agitando durante 10 min.
    4. Centrifugar de nuevo a 10.000 × g durante 10 min a 4 °C.
    5. Recoger el sobrenadante, que corresponde a la fracción periplásmica, para la extracción de proteínas.
      NOTA: Todos los tampones deben contener un cóctel inhibidor de la proteasa para evitar la degradación de las proteínas.

2. Experimentos de RMN

NOTA: Todos los experimentos se adquirieron a 14,1 T utilizando una sonda de detección inversa de triple resonancia de 1H / 15N / 13C (ver Tabla de materiales) a 298K.

  1. Experimentos basados en ligandos
    1. Preparación de muestras
      1. Prepare dos muestras: una que contenga CVN y otra sin CVN (control solo de ligando). Cada muestra contiene 600 μL de 80 μM de CVN en tampón de fosfato de sodio (pH 7,4) que contiene 50 mM de NaCl.
      2. Agregue D-manosa a una concentración final de 4 mM.
      3. Agregue 5% (v / v) D2O a cada muestra.
      4. Transfiera la muestra a un tubo de RMN de 5 mm.
      5. Use un exceso molar de 50 veces del ligando en relación con la proteína.
        NOTA: Por lo general, se recomienda un exceso de ligando en el rango de 10 a 1000 veces, y se prefieren excesos más bajos para proteínas pequeñas.
    2. Adquisición espectral para la asignación de D-manosa
      1. Adquiera espectros 2D TOCSY y 2D 1 H-13C HMBC utilizando secuencias de pulsos estándar:
        2D TOCSY: Espectroscopia de correlación total sensible a la fase (TOCSY) con escultura de excitación para la supresión de agua (DIPSI2ESGPPH).
        2D HMBC: 1 H-13C Correlación heteronuclear de enlaces múltiples con selección de gradiente y adquisición no desacoplada (HMBCGPNDQF).
        NOTA: Estos experimentos se realizaron con el propósito de la asignación de D-manosa, pero no se muestran, ya que la asignación de cambios químicos no está dentro del alcance de este estudio.
    3. Mapeo de la unión del ligando a través de la perturbación del cambio químico (CSP) del ligando
      1. Para la preparación de muestras y la adquisición de espectros HSQC ¹H-¹³C, prepare una solución de 4 mM de D-manosa en tampón de fosfato de sodio (pH 7,4), con 50 mM de NaCl y 5% de D2O. Divida la solución en dos muestras: una con 80 μM de CVN y otra sin CVN (referencia de solo ligando).
        NOTA: Estos espectros se utilizarán para determinar la CSP de la D-manosa tras la interacción con CVN.
      2. Para la configuración de losparámetros de adquisición de 1 H-13C HSQC, utilice la secuencia de pulsos estándar HSQCETGPSI (selección de gradiente y sensibilidad mejorada 1 H-13C HSQC). Establezca los siguientes parámetros para la adquisición:
        Dominio del tiempo (TD): 1024 × 128 puntos complejos (dimensiones ¹H × ¹³C)
        Ancho espectral (SW): 10,0171 ppm (6009,615 Hz) para ¹H, 80 ppm (12069,106 Hz) para ¹³C
        Frecuencias portadoras: 4,7 ppm para ¹H, 75 ppm para ¹³C
        - Número de escaneos: 448.
      3. Calcule el CSP usando la siguiente ecuación:
        figure-protocol-1
        donde figure-protocol-2 y figure-protocol-3 representan las diferencias de cambio químico entre la D-manosa en presencia de CVN (Figura 1A, etiquetada en rojo) y la D-manosa libre (Figura 1B).
    4. Mapeo de la unión del ligando a través de la diferencia de transferencia de saturación (STD)
      1. Cree un nuevo conjunto de datos y configure parámetros para experimentos de RMN STD. Pueden aplicarse dos estrategias experimentales: i) cribado de diferentes frecuencias de saturación para optimizar la relación señal/ruido; (ii) fijar la frecuencia de saturación y variar el tiempo de saturación para evaluar la acumulación.
      2. Configure experimentos de RMN 1D ¹H utilizando la secuencia de pulsos zgpr. Ajuste el espectrómetro para ¹H, realice calzas y mida un pulso duro de 90° (por ejemplo, ~10 μs con una atenuación de -10,6 dB, equivalente a ~11,482 W).
      3. Centre la frecuencia portadora ¹H en aproximadamente 4,7 ppm, correspondiente a la señal de agua.
      4. Seleccione la secuencia de impulsos STDDIFFESGP.3 y configure los parámetros de adquisición de la siguiente manera:
        Establezca el ancho espectral de acuerdo con los requisitos de la muestra.
        Ajuste el retardo de interescaneo (d1) en 4 s.
        Defina el tiempo de saturación (d20) en función del experimento deseado.
        Cargue el FQ2LIST que contiene la frecuencia de saturación fuera de resonancia (-40 ppm) y las frecuencias de resonancia para saturar solo la señal de proteína.
        NOTA: Las frecuencias de resonancia deben corresponder a protones de proteínas y deben estar al menos a 1000 Hz de distancia de cualquier señal de ligando para evitar la saturación directa.
      5. Pruebe las siguientes frecuencias de saturación en resonancia para determinar las condiciones óptimas: -0.59 ppm, 0.73 ppm y 8.1 ppm (ver Figura 2A).
        NOTA: Se seleccionó 0,73 ppm como frecuencia de saturación en resonancia, ya que proporcionaba la mejor relación señal/ruido. Usando esta frecuencia, el factor de amplificación de STD (ASTD) se cuantificó en función del tiempo de saturación. Con este fin, se adquirieron espectros STD en diferentes momentos de saturación (0.5, 1, 1.5, 2, 2.5, 3 y 4 s) para construir la curva de acumulación de STD (Figura 2B). A continuación, se trazaron los valores deA STD correspondientes en función del tiempo de saturación (Figura 2C), lo que permitió evaluar la eficiencia de la transferencia de saturación, que es proporcional al tiempo y la proximidad del ligando hidrógeno a la proteína. Un factorde ETS se define como:
        figure-protocol-4
        ISTD es la diferencia en la intensidad de la señal entre los espectros de resonancia y sin resonancia, I0 es la intensidad de la señal en el espectro de resonancia, [L]T es la concentración total del ligando y [P] es la concentración de proteína. Esta normalización tiene en cuenta los efectos de concentración y permite la comparación entre diferentes condiciones experimentales. STD se basa en la difusión del espín y la caída molecular lenta para transferir eficientemente la saturación de la proteína al ligando unido. Las proteínas más grandes (volteo lento) permiten una saturación más eficiente y la propagación de la magnetización dentro de la proteína 19,30,31,32.
      6. Establezca el número de escaneos (ns) en 64 y promedie el experimento l4 (bucle 4) veces.
      7. Calcule el número total de exploraciones como: Total de exploraciones = ns × l4. Utilice 32.768 puntos complejos en la dimensión directa (TD) con una anchura espectral (SW) de 10,0171 ppm (6.009,615 Hz).
      8. Ajuste el retardo entre barridos (d1) en 4 s y el tiempo de adquisición (AQ) en 2,7262976 s. El retardo de relajación total es igual a d1 + AQ.
      9. Configure el pulso de saturación de la siguiente manera: duración 50 ms; forma gaussiana (p42); controlado a través del programa conformado 9 (SP9).
      10. Utilice una variante de secuencia de pulsos STD que incluya un filtro T1ρ para suprimir las señales de proteínas residuales. Establezca el tiempo de bloqueo de giro (d29) en función del peso molecular de la proteína. Para proteínas más grandes, use tiempos de bloqueo de giro más pequeños (~ 20 ms) y para proteínas más pequeñas, más grandes (> 40 ms).
        NOTA: Todos los espectros STD se adquirieron a 599,93 MHz (BF1). El ajuste de d29 es fundamental para minimizar el fondo de proteínas y preservar la integridad de la señal del ligando. Optimice este parámetro empíricamente si es necesario.
    5. Mapeo de la unión de ligandos a través de 1H-R2
      1. Seleccione el programa de pulso CPMG_ESGP2D de la biblioteca estándar de Bruker. Esta secuencia se basa en el experimento Carr-Purcell-Meiboom-Gill (CPMG), que incorpora la escultura de excitación para la supresión del agua33.
      2. Establezca el experimento como una adquisición 2D.
        NOTA: Este es un experimento pseudo-2D en el que solo se usa la dimensión directa para la información de desplazamiento químico.
      3. Configure los parámetros de adquisición de la siguiente manera:
        Dominio del tiempo (TD): 32.768 puntos complejos en la dimensión directa ¹H.
        (TD1): 2 puntos.
        Ancho espectral (SW): 7.9932 ppm (4,795.396 Hz).
        Retardo entre barridos (d1): 4 s.
        Frecuencia portadora (o1): 4,7 ppm (centrada en la señal de agua).
        Número de exploraciones (ns): 8.
        Número de escaneos simulados (ds): 4.
        Retardo de CPMG (d20): ≤1 ms (es decir, menos de 1⁄3 J_HH).
        Número de promedios (TDav): 200.
      4. Ejecute el experimento durante 200 ciclos de 8 escaneos cada uno, lo que da como resultado una acumulación total de 1.600 escaneos. Ajuste la lista de contadores variables (vclist) de acuerdo con el tiempo total deseado del ciclo de CPMG (TCPMG). Aquí, se eligieron 2 ciclos para unT CPMG = 8 ms y 200 ciclos para un TCPMG = 800 ms.
      5. Realice dos experimentos de 1H-CPMG, uno para la muestra que contiene la proteína (4 mM de D-manosa y 80 μM de CVN) y el otro para la D-manosa libre (4 mM de D-manosa).
      6. Grafique los espectros de 1H para cadaT CPMGmediante el comando efp (multiplicación exponencial seguida de transformada de Fourier y corrección de fase) o sinm (multiplicación sinusoidal desplazada 90°, SSB=2) seguido de fp (transformada de Fourier y corrección de fase). Ajuste la función de ventana de acuerdo con la mejor estrategia de procesamiento.
        NOTA: En este experimento se utilizaron sinm y fp. La1ª serie será el espectro con unT CPMG de 8 ms (primero en la lista de vc), y la2ª serie será de 800 ms (segundo en la lista de vc). Los espectros H 1procesados se representan en la Figura 3.
      7. Calcule el cociente CPMG (Q) mediante la ecuación 3.
        ​figure-protocol-5
  2. Experimentos basados en proteínas
    1. Preparación de muestras
      1. Preparar 600 μL de una muestra que contenga 436 μM uniformemente 15CVN marcado con N en tampón de fosfato de sodio (pH 7,4) suplementado con 50 mM de NaCl y óxido de deuterio al 5% (D2O). Valorar la D-manosa en la muestra hasta una concentración final de 60 mM. Para la valoración, utilice un tubo de RMN de 5 mm.
    2. Asignación de resonancia (paso de validación opcional)
      1. Confirme la asignación de CVN libre en solución utilizando los valores de desplazamiento químico informados anteriormente34. Adquirir los siguientes espectros de triple resonancia: HNCO, HNCA, HNCACB y CBCACONH 35,36,37.
        NOTA: Estos experimentos sirven solo para validar la asignación y no se muestran, ya que la asignación de desplazamiento químico no es el objetivo principal de este protocolo.
    3. Mapeo de la unión de la D-manosa en CVN por perturbación del cambio químico de la proteína
      1. Adquiera 1espectro HSQC H-15N de CVN marcado con 15N a 298 K. Realice una valoración agregando D-manosa para alcanzar las siguientes concentraciones finales: 0, 1, 2, 5, 10, 20, 40 y 60 mM.
      2. Configure el experimento 1 H-15N Fast-HSQC utilizando la secuencia de pulsos FHSQCF3GPPH sensible a la fase de la biblioteca estándar de Bruker. Utilice los siguientes parámetros:
        Dominio del tiempo (TD): 1024 × 140 puntos complejos en las dimensiones 1H y 15N.
        Anchura espectral (SW): 16,0274 ppm (9615,385 Hz) en la dimensión 1H y 34 ppm (2067,119 Hz) en la dimensión 15N.
        Frecuencia portadora: 4,7 ppm (1H) y 119 ppm (15N).
        Número de escaneos: 128.
      3. Calcule la perturbación del desplazamiento químico (Δδ) usando la siguiente ecuación:
        figure-protocol-6
        donde figure-protocol-7 y figure-protocol-8 son las diferencias de cambio químico entre el CVN en presencia y ausencia de D-manosa (Figura 4A).
        NOTA: El factor 10 explica la diferencia en los anchos espectrales entre las dimensiones de protones y nitrógeno.
      4. Calcule la constante de disociación (KD) trazando los valores de CSP para cada residuo en función de la concentración de D-manosa. Ajuste los datos resultantes a una isoterma de unión de un solo sitio usando la siguiente ecuación (5).
        figure-protocol-9Ecuación 5
        donde [PT] es la concentración de proteína utilizada en la titulación (CVN), [PT] es la concentración de ligando (D-manosa) y CSPmax es la CSP a la concentración de saturación del ligando y CSPmin en ausencia del ligando.
    4. Mapeo de la unión de la D-manosa al CVN a través de la posición 15N-R2 de la proteína.
      1. Mida los 15valores N-R2 de los residuos individuales de CVN en ausencia y presencia de 60 mM de D-manosa. Realice todos los experimentos a 298 K.
      2. Configure el experimento 15N-R2 utilizando el HSQCT2ETF3GPSI3D de secuencia de pulsos basado en CPMG sensible a la fase de la biblioteca estándar de Bruker. Utilice los siguientes parámetros:
        Dominio del tiempo (TD): 1024 × 128 puntos complejos en las dimensiones 1H y 15N, con 8 puntos en la pseudodimensión.
        Ancho espectral (SW): 16.0274 ppm (1H; 9615.385 Hz) y 34 ppm (15N; 2067.119 Hz).
        Frecuencia portadora: 4,7 ppm (1H) y 119 ppm (15N).
        Número de escaneos: 32. (v) Lista de contadores variables: 1, 8, 2, 6, 3, 5, 4 y 7, correspondientes a retardos de relajación (Trelax) de 16,96, 135,68, 33,92, 101,76, 50,88, 84,96, 67,84 y 118,72 ms, respectivamente.
      3. Procese los espectros pseudo3D como una serie de espectros de relajación de correlación 1H/15N similares a HSQC utilizando NMRPipe38, siguiendo el tutorial del software (consulte la Tabla de materiales para obtener un enlace al tutorial).
      4. Importe los espectros procesados a una plataforma de análisis de RMN adecuada (por ejemplo, CCPNMR39). Seleccione todos los espectros y aplique la herramienta "Seguir cambios de intensidad". Grafique la intensidad de cada pico cruzado en función de larelajación de T y ajuste la desintegración a una función monoexponencial para extraer 15valores N-R2 para cada residuo.
      5. Calcule el error experimental a partir de la relación señal/ruido de los espectros similares a HSQC a 67,84 ms. Procese una región del espectro que contenga solo ruido y conviértala en un archivo de texto usando el siguiente comando:
        pipe2txt.tcl ./PROCs/ft/R2_67_84.ft2 > noise67_84.txt"
      6. Determine la desviación estándar de la región de ruido utilizando software estadístico (por ejemplo, Origin(Pro), versión 2021). Defina este valor como la intensidad del ruido Iruido.
      7. Calcule el error experimental para cada residuo utilizando la siguiente ecuación:
        figure-protocol-10
        NOTA: Es importante utilizar el error experimental en lugar del error de ajuste. El error experimental define los límites de interpretación al comparar el 15N-R2 en ausencia y presencia de D-manosa.

figure-protocol-11
Figura 1: Perturbación del desplazamiento químico de la D-manosa en presencia de CVN. (A) 1espectro H-13C-HSQC de D-manosa en presencia de CVN. (B) 1espectro H-13C-HSQC de D-manosa libre. Las etiquetas en los espectros muestran cada una de las asignaciones de desplazamiento químico y la configuración anomérica respectiva (α o β). Las etiquetas en rojo son las asignadas a la conformación ligada, y las de color negro son las asignadas a la conformación libre. (C) Superposición de los espectros 1 H-13C-HSQC en presencia (verde) y ausencia (azul) de CVN. (D) Estructura química de la α y β-D-manosa destacando la CSP observada, que se calculó de acuerdo con la ecuación (1). Los valores de CSP se representan debajo de los círculos verdes. El círculo rojo representa el hidrógeno β-anomérico que desapareció en presencia de CVN. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

figure-protocol-12
Figura 2: Espectros de diferencia de transferencia de saturación (STD) de D-manosa en presencia de CVN. (A) STD adquiridas a diferentes frecuencias de saturación: -0,59, 0,73 y 8,1 ppm. (B) ETS adquiridas en diferentes tiempos de saturación: 0,5, 1, 1,5, 2, 2,5, 3 y 4 s. (C) Factor de amplificación de STD (ASTD) calculado según la ecuación 2 en función del tiempo de saturación. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 3: 1H-R2 de D-manosa en presencia y ausencia de CVN. (A) Representación de los espectros esperados de D-manosa 1H-CPMG para un aglutinante y un no aglutinante adquiridos con tiempos de relajación R2 de 8 y 800 ms en ausencia (abajo) y presencia (arriba) de CVN. Q se calculó de acuerdo con la ecuación 3. En ausencia de interacción (Q ≈ 1), las intensidades de la señal siguen siendo similares en ambos tiempos de relajación del ligando con o sin la proteína. Tras la unión (Q < 1), las intensidades de la señal disminuyen con el aumento de la relajación para la muestra que contiene la proteína. (B) Representación esquemática del intercambio químico entre los estados libres y unidos de D-manosa. Dependiendo de los valores relativos de la diferencia de desplazamiento químico (Δω) y la constante del tipo de cambio (kex = kencendido + kapagado), el sistema cae en regímenes de intercambio lento, intermedio o rápido. (C)1Espectros de RMN H de D-manosa libre y D-manosa en presencia de NVC, mostrando diferencias en las intensidades de la señal a tiempos de relajación de 8 ms y 800 ms. Se muestran los factores Q calculados para hidrógenos específicos (H6β, H3β, H5α, H4β), con valores Q más bajos que indican interacciones más fuertes con CVN e identifican las regiones del azúcar involucradas en la unión. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 4: Análisis de perturbación por desplazamiento químico (CSP) que revela residuos de CVN involucrados en la unión de D-manosa. (A) Gráficos de barras que muestran los CSP de amida de la columna vertebral (15 N-1H) de CVN tras la titulación con D-manosa a concentraciones de 10 mM (arriba) y 60 mM (abajo). Las líneas horizontales indican la CSP media más una o dos desviaciones típicas (av + sd, av + 2 sd), que se utilizaron como umbrales para identificar residuos significativamente perturbados. (B) Mapeo de residuos significativamente perturbados en la estructura de CVN complejado con el disacárido Manα1-2Manα (PDB ID: 1IIY40). Los residuos con CSP por encima del umbral av + 2 sd se resaltan en rojo, y los que se encuentran entre av + sd y av + 2 sd se muestran en azul. Las moléculas de disacárido Manα1-2Manα se muestran en naranja para indicar su ubicación de unión. (C) Curvas de unión seleccionadas que representan CSP en función de la concentración de D-manosa. Los datos se ajustaron de acuerdo con la ecuación 5 como un modelo de unión de un solo sitio para estimar KD, revelando un rango de afinidades, con D44 mostrando la interacción más fuerte (KD = 1,1 ± 0,35 mM) y E41 la más débil (KD = 35 ± 29 mM). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 5: Análisis de 15N-R2 para CVN libre y unido a D-manosa. (A, B) Tasas de relajación transversal (15N-R2) medidas para cada residuo de CVN en sus estados (A) libre y (B) unidos a D-manosa. (C) Diferencia en los valores de R2 (ΔR2 = R2bound− R2free) graficada por residuo. Las líneas azul y roja representan una y dos desviaciones estándar del promedio (av ± sd y av ± 2 sd), respectivamente. Los residuos con valores significativos de ΔR2 están etiquetados. (D) Mapeo de los valores de ΔR2 para la estructura de CVN complejado con el disacárido Manα1-2Manα (ID de PDB: 1IIY40). Los residuos con ΔR2 por encima o por debajo de av± 2 sd se muestran en rojo; Los que se encuentran entre AV± SD y AV± 2 SD se muestran en azul. Las moléculas de D-manosa se muestran en naranja para indicar su ubicación de unión. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Resultados

En el presente trabajo, presentamos experimentos de RMN para investigar las interacciones proteína-glicano. El reconocimiento molecular de proteínas-glicanos subyace a numerosos procesos biológicos que involucran la matriz extracelular (ECM), incluida la regulación de la adhesión celular, la migración, la proliferación y varias otras formas de comunicación celular.

Aquí, elegimos trabajar con el monosacárido D-manosa, que se describe como un aglutinante débil. El objetivo era describir métodos...

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Discusión

La espectroscopia de RMN representa un enfoque versátil para investigar las interacciones proteína-glicano, particularmente debido a su capacidad para detectar interacciones débiles y transitorias, como las observadas entre CVN y D-manosa. El protocolo descrito aquí combina métodos de RMN basados en ligandos y proteínas, lo que permite una caracterización más completa de la interfaz de interacción.

Los pasos críticos del protocolo incluyen una preparación cuid...

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Divulgaciones

Los autores declaran que no tienen intereses contrapuestos.

Agradecimientos

Agradecemos al Centro Nacional de Resonancia Magnética Nuclear Jiri Jonas (CNRMN) por el uso de los espectrómetros de RMN. Agradecemos a la Dra. Carole Bewley por compartir con nosotros las asignaciones de turnos químicos de CVN en complejo con Manα1-2Manα. También agradecemos a las agencias de financiación FAPERJ y CNPq.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Glucosa 13CLaboratorio isotópico de Cambrige.CLM-481
Cloruro de amonio 15NLaboratorio isotópico de Cambrige.NLM-467
Cloruro de calcioSigma-AldrichC4901
Coquetel inhibe la proteasaSigma-Aldrich4693159001
D2OLaboratorio isotópico de Cambrige.DLM-4
D-ManosaSigma-AldrichM2069-5G
Cloruro de magnesioSigma-AldrichM8266
NMRPipeEnlace al tutorial del software: https://www.ibbr.umd.edu/nmrpipe/demo.html
Cloruro de potasio (K2HPO4)Sigma-AldrichP3786
Cloruro de potasio (KCl)Sigma-AldrichP3911
Cloruro de potasio (KH2PO4)Sigma-AldrichP0662
Tubo ShigemiBrukerZ1Z10684A
Cloruro de sodio (NaCl)Sigma-AldrichS9625
Fosfato de sodio (Na2HPO4)Sigma-Aldrich567545
Fosfato de sodio (NaH2PO4)Sigma-AldrichS97263
Espectrómetro Bruker 600 MHzBruker
Espectrómetro Bruker 800 MHzBruker
TiaminaSigma-AldrichT1270
Sonda TXI de triple resonanciaBruker
TriptonaSigma-Aldrich93657
Extracto de levaduraSigma-AldrichY1625

Referencias

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