Method Article

Papel protector óseo del bupleurum en un modelo de rata de osteoporosis posmenopáusica

DOI:

10.3791/68675

⸱

August 22nd, 2025

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1YouJiang Medical University for Nationalities, 2Affiliated Hospital of YouJiang Medical University for Nationalities, 3ShenZhen International Travel Health Care Center (ShenZhen Customs Port Clinic)

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

En este estudio, utilizamos un modelo de rata ovariectomizada de osteoporosis posmenopáusica para demostrar que el líquido oral Bupleurum (Chai hu) mejora la microestructura ósea al suprimir los factores proinflamatorios y mejorar los antiinflamatorios. Esto sugiere que su mecanismo antiinflamatorio mitiga parcialmente la osteoporosis inducida por deficiencia de estrógenos.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El protocolo tiene como objetivo investigar los efectos de la administración de Chai hu sobre la osteoporosis posmenopáusica en ratas ovariectomizadas (OVX). Las ratas Sprague-Dawley hembras de ocho semanas de edad se sometieron a ovariectomía bilateral utilizando el enfoque dorsal para establecer un modelo de osteoporosis posmenopáusica. Se administraron diferentes dosis de Chai hu líquido oral por sonda oral durante 12 semanas consecutivas, seguidas de evaluaciones de la microestructura ósea y mediciones de los niveles de citoquinas inflamatorias. El tratamiento con Chai hu en dosis medias y altas inhibió parcialmente la pérdida ósea, redujo la expresión de citoquinas proinflamatorias y reguló al alza los niveles de citoquinas antiinflamatorias en ratas OVX. Hubo una reducción significativa en la gravedad de la destrucción ósea de dosis bajas a altas, y se observaron mejoras relacionadas con la dosis en la reconstrucción microestructural ósea. Chai hu mitigó la pérdida ósea inducida por la deficiencia de estrógenos y el deterioro microestructural, suprimiendo así la progresión de OP en este modelo OVX. Es probable que esto se deba a los efectos antiinflamatorios de las vías involucradas.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La osteoporosis (OP) es una enfermedad ósea metabólica común caracterizada por disminución de la masa ósea, reducción de la resistencia ósea y destrucción de la microarquitectura ósea1. La OP puede manifestarse como primaria o secundaria, y la OP primaria se clasifica como OP posmenopáusica (PMOP), OP senil y OP idiopática (que a menudo ocurre en adolescentes). Entre ellos, la PMOP tipo I ocurre principalmente en mujeres PM, donde hay una marcada disminución de la densidad ósea después de la menopausia debido a la reducción de los niveles circulantes de estrógeno2. Es una enfermedad ósea metabólica sistémica, que resulta en un aumento de la actividad de los osteoclastos y una diferenciación intensa3. Además, la intensidad de la reabsorción ósea es mucho mayor que su formación, lo que resulta en una disminución de la masa ósea, así como en un aumento de la fragilidad ósea y el riesgo de fractura4.

La investigación actual ha encontrado que muchas enfermedades inflamatorias crónicas, como la osteoartritis y la periodontitis, están asociadas con una pérdida ósea significativa, lo que sugiere que la inflamación puede estar estrechamente relacionada con OP5. A medida que las mujeres PM envejecen, además de los cambios endocrinos, las funciones fisiológicas e inmunológicas disminuyen, y el cuerpo queda en un estado de inflamación crónica durante largos períodos de tiempo. Muchos de estos factores promotores de la inflamación y las citocinas derivadas de las células T desempeñan un papel importante en la pérdida ósea. Por lo tanto, la PMOP también se reconoce como una enfermedad inflamatoria crónica 6,7.

La medicina tradicional china (MTC) tiene una larga historia y una rica experiencia clínica en la prevención y el tratamiento de la PMOP, centrándose en el manejo holístico y el diagnóstico y tratamiento individualizados, y puede regular los sistemas endocrino e inmunológico al mismo tiempo, lo cual es una bendición para las mujeres posmenopáusicas8. Permite que una gran proporción de mujeres tengan acceso a tratamiento médico. Los estudios farmacológicos modernos y los ensayos clínicos han demostrado que la MTC tiene las ventajas de la multifocalización, baja toxicidad y efectos secundarios, y es barata. El riesgo de complicaciones puede reducirse en gran medida en el tratamiento de la MTC de PMOP9.

El chai hu en sí mismo tiene propiedades antiinflamatorias10 y antidepresivas11, y puede regular la secreción de hormonas en el cuerpo12 y ayudar a la buena salud13. Chai hu es el ingrediente principal que juega un papel importante en la fórmula del compuesto de la medicina tradicional china, Xiaoyao Pills, que tiene el efecto de calmar las emociones, promover la digestión y la absorción en el estómago y los intestinos. También es conocido por reponer el qi y la energía de la sangre, así como por regular los síntomas del ciclo menstrual ysu malestar asociado. El principal componente de Chai hu es la saponina Chai hu, que tiene una fuerte actividad antiinflamatoria, que se manifiesta principalmente en la inhibición de la expresión de citocinas proinflamatorias, como el factor de necrosis tumoral α (TNF-α), la interleucina 1β y la IL-615. Además, mejora la expresión de citoquinas antiinflamatorias, IL-10, aliviando así la inflamación, como la colitis, la endometritis y la hepatitis16.

En comparación con los tratamientos OP estándar (incluido el uso de bifosfonatos17, moduladores selectivos de los receptores de estrógeno18 y denosumab19), Chai hu, como MTC de uso común, tiene la ventaja potencial de un mecanismo de acción multicomponente y multiobjetivo. Las terapias estándar generalmente se dirigen a vías metabólicas óseas específicas20 (inhibición de la actividad de los osteoclastos), que pueden estar asociadas con ciertos efectos secundarios como molestias gastrointestinales, mayor riesgo de osteonecrosis de los maxilares y síntomas similares a los de la gripe, así como altos costos de medicamentos a largo plazo21.

Una revisión de la literatura relevante encontró que el uso de Chai hu para intervenir en ratas PM con OP podría tener efectos terapéuticos de alivio22. Por lo tanto, basándonos en la bioinformática y el análisis farmacológico, así como en la simulación de acoplamiento molecular para predecir los sitios de acoplamiento23, planteamos la hipótesis de que Chai hu podría intervenir en el proceso inflamatorio, modular el estado inmunológico del cuerpo y restaurar la homeostasis inmune ósea. Estos favorecerán la estabilidad del estado de reconstrucción ósea y lograrán el efecto terapéutico deseado de aliviar la OP.

Este estudio empleó la administración de líquido oral Chai hu (concentración: 1 g / ml) durante 12 semanas consecutivas. El régimen de dosificación se diseñó en base a dosis clínicamente comunes en MTC y estudios farmacocinéticos24.

El objetivo general de este método de administración es establecer un protocolo de dosificación estable y clínicamente relevante, evaluando así sistemáticamente el efecto de intervención sostenido de Chai hu en el modelo objetivo (un modelo de rata de osteoporosis posmenopáusica). Este enfoque de administración garantiza que el fármaco mantenga una concentración plasmática efectiva durante todo el período experimental, proporcionando una base de intervención confiable para evaluaciones posteriores (como indicadores de metabolismo óseo y niveles de factores inflamatorios). Además, ayuda a aclarar el papel del Chai hu en enfermedades relacionadas, así como su relación dosis-efecto, al tiempo que ofrece un paradigma de referencia para la administración estandarizada de medicinas tradicionales chinas en la investigación experimental.

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Todos los procedimientos experimentales con animales se llevaron a cabo de acuerdo con la Guía de los NIH para el cuidado y uso de animales de laboratorio (8.ª edición) y fueron aprobados específicamente por el Comité de Ética Animal de la Universidad Médica de Youjiang para Nacionalidades (Aprobación No. 2024071001).

1. Análisis de la farmacología de la red

NOTA: La ciberfarmacología es un enfoque que combina biología de sistemas, biología computacional y farmacología y tiene como objetivo comprender el mecanismo de acción de los medicamentos y las interacciones entre medicamentos mediante el análisis de redes biomoleculares25.

  1. Cribar compuestos activos con buena biodisponibilidad oral (OB) y similitud con el fármaco (DL) utilizando herramientas como la Base de Datos y Plataforma de Análisis de Farmacología de Sistemas de Medicina Tradicional China (TCMSP: http://ibts.hkbu.edu.hk/LSP/tcmsp.php). Establezca el OB en ≥30% y el DL en ≥0.1826. Busque Chai hu y haga clic en Detalles de la hierba y descargue todos los datos de compuestos. Asigne al archivo descargado el nombre Chaihu.
  2. Obtenga el nombre objetivo del ingrediente principal pegando el ID de MOL del ingrediente principal en la base de datos de TCMSP. Pegue en la búsqueda por lotes de TCMSP y seleccione Predicción de destino, luego haga clic en Enviar.
  3. Abra la base de datos UniProtsh, copie la columna Nombre del objetivo en la búsqueda y busque el nombre de la proteína en negrita, que es exactamente el mismo que el nombre de la proteína objetivo pegado. Después de encontrar el nombre de la proteína correspondiente, recopile los nombres de genes correspondientes en la columna siguiente.
  4. Filtrar los genes relacionados con la osteoporosis en la base de datos GeneCards (https://www.genecards.org) según la puntuación de relevancia ≥ 1 y obtener todos los (5741) genes27.
    NOTA: Las razones para la selección de genes con una puntuación de relevancia ≥ 1 de la base de datos GeneCards son las siguientes: Una puntuación ≥ 1 indica que el gen tiene asociaciones documentadas con la enfermedad objetivo, distinguiéndolo claramente de los genes sin asociaciones reportadas (puntuación = 0). Este umbral garantiza la retención de genes con relevancia creíble para la enfermedad, al tiempo que evita la interferencia excesiva de genes no relacionados. Un umbral más bajo (<1) podría incluir genes sin asociaciones validadas, lo que aumenta los falsos positivos.
  5. Obtenga los genes que se cruzan después de combinar conjuntos de genes relacionados con enfermedades con dianas farmacológicas para la intersección. Con base en las interacciones entre los objetivos de la enfermedad y los ingredientes activos de los medicamentos, construya una red de intersección de ingredientes activos-diana-enfermedad de la medicina tradicional china utilizando el software Cytoscape.
  6. Obtenga información de interacción proteína-proteína (PPI) a través de la base de datos String (https://cn.string-db.org/) y construya una red PPI. Abra Cytoscape (https://www.cytoscape.org), cargue el archivo TSV descargado en la red de carga, luego seleccione Calcular > TOP10 o TOP20 y haga clic en Enviar.
  7. Cree dos tablas para importar a Cytoscape. Cree un archivo de hoja de cálculo electrónico llamado Red. En la columna A, ingrese los mismos ID de MOL (CH1, CH2 ...) que han sido reemplazados por la abreviatura de la medicina tradicional china. Etiquete la columna B como ID de MOL y ordénela en orden ascendente por ID de MOL. Etiquete la columna C como símbolo. Copie los ID de componentes (ID MOL) y los nombres de genes de los archivos relacionados con Chaihu en las columnas B y C, respectivamente. A continuación, elimine la columna B y cambie el nombre de la columna A a ID de MOL.
  8. Extienda la tabla hasta el final del texto. En la columna Símbolo, ingrese los ID de MOL (CH1, CH2...), reemplazados por la abreviatura de la medicina tradicional china. En la columna ID de MOL, ingrese la abreviatura de la medicina tradicional china: CH. Con los pasos anteriores, se completa la suplementación de la información y la construcción de la red de Medicina Tradicional China - Componente - Objetivo.
  9. A continuación, haga la segunda forma, el archivo TYPE. Crea una nueva hoja de cálculo y nómbrala TYPE. Etiquete la columna A como Término y la columna B como TIPO. Copie el nombre del gen en la columna de términos y asígnele el atributo del gen en la columna de tipo (el propósito es buscar el gen; se seleccionarán todos los nombres de los genes, para que sea fácil de operar). Ingrese los ingredientes en la columna Término y asigne al ingrediente el atributo drug1.
  10. Importar al software Cytoscape. Importar red para cargar el archivo de red e importar tabla para cargar el archivo de tipo. En el cuadro de búsqueda, escriba gene, presione Intro para que se seleccionen todos los genes, tire de los genes seleccionados hacia la izquierda y, a continuación, haga clic en Diseño > Atributo() > Seleccionado (elija redondo o cuadrado entre paréntesis).
  11. Combine los resultados del análisis farmacológico de red con datos experimentales para identificar los compuestos clave y los mecanismos moleculares de acción de los fármacos.

2. Acoplamiento molecular

NOTA: El acoplamiento molecular es una técnica computacional para predecir el modo de unión óptimo y la afinidad entre una molécula pequeña (ligando) y una proteína o biomolécula diana28.

  1. Preparación de receptores y ligandos
    1. Fuente del receptor (proteína): Obtenga el archivo PDB de las proteínas diana del Banco de datos de proteínas RCSB (https://www.rcsb.org). Busque 3Q4B (ejemplo de receptor IL-6), haga clic en Descargar archivos > formato PDB.
    2. Elimine las moléculas de agua cristalográficas haciendo clic en Editar > Eliminar > Agua, iones extraños y ligandos no esenciales (conserve cofactores críticos como iones metálicos) haciendo clic en Editar > Eliminar > Heteroátomos. Para añadir los átomos de hidrógeno que faltan, haga clic en Editar > Hidrógenos > Añadir. Guardar como proteína.pdbqt. haciendo clic en Editar > Cargas > Calcular Gasteiger y, a continuación, en Cuadrícula > Macromolécula > Elegir > Guardar como PDBQT.
    3. Fuente del ligando (molécula pequeña): Descargue la estructura del ligando de PubChem (https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov). Busque Saikosaponina A (CID:6443568), haga clic en Conformador 3D > Descargar SDF.
    4. Utilice el software Open Babel para convertir el archivo Saikosaponina A en formato SDF en un archivo en formato PDB con conformaciones tridimensionales de baja energía, y nómbralo saikosaponinaA.
  2. Configuración de parámetros de acoplamiento (herramientas AutoDock)
    1. Cargar archivos de receptores y ligandos. Importe el archivo de molécula pequeña saikosaponina A y guárdelo como un archivo PDBQT. Posteriormente, cargue el receptor y el ligando: haga clic en Acoplamiento > macromolécula > Abrir, seleccione IL6_receptor.pdbqt; y, a continuación, haga clic en Acoplamiento > ligando > Abrir, seleccione saikosaponinA.pdbqt.
    2. Configure el cuadro de cuadrícula: haga clic en Cuadrícula > Cuadro de cuadrícula, ajuste el tamaño del cuadro para abarcar completamente el sitio activo (use el dial de control en el panel izquierdo para ajustar) luego guarde la configuración actual haciendo clic en Archivo > Cerrar Guardando actual y asigne al archivo el nombre grid.gpf.
    3. Configurar el programa en ejecución de AutoGrid: haga clic en Ejecutar AutoGrid, seleccione el archivo grid.gpf y, a continuación, haga clic en Iniciar. A continuación, configure los parámetros de acoplamiento: En secuencia, en el menú Acoplamiento, haga clic en Macromolécula y seleccione el archivo de proteína IL6_receptor.pdbqt; haga clic en Ligando y seleccione el archivo de molécula pequeña saikosaponina A.pdbqt; establecer el algoritmo genético y confirmarlo; ajuste los parámetros de acoplamiento y confírmelos. Finalmente, en Salida, seleccione el algoritmo lamarckian (4,2), asigne al archivo el nombre dock.dpf y guárdelo.
    4. Ejecute AutoGrid y guarde los resultados: haga clic en Ejecutar AutoDock, seleccione el archivo dock.dpf e inicie la simulación. Al finalizar, haga clic en Escribir complejo, asigne un nombre a la estructura compleja y guárdela en formato PDBQT.
  3. Análisis de resultados usando PyMOL
    1. Convierta el archivo de formato PDBQT obtenido del paso de acoplamiento molecular anterior al formato PDB utilizando el software Open Babel. A continuación, importe el archivo de formato PDB en el software PyMOL para las operaciones de visualización posteriores.
    2. Busque el ligando y sepárelo individualmente: después de seleccionar el ligando, cambie su color haciendo clic en Sele y luego eligiendo un Color de Color. En la columna Sele, haga clic en Extraer objeto en Acción para extraer el ligando como un nuevo objeto independiente.
    3. Medición de la distancia del enlace de hidrógeno: En la columna siguiente, haga clic en Acción, busque Contactos polares y haga clic en Otros átomos en el objeto; Los enlaces de hidrógeno se mostrarán como líneas amarillas. Haga clic en la opción Medición en la columna Asistente, haga clic en los átomos en ambos extremos del enlace de hidrógeno en secuencia y, a continuación, haga clic en Listo para completar la medición.
  4. Exportar la imagen: haga clic en Exportar imagen como PNG en Archivo. Si se necesita renderizado de alta definición, ingrese ray 300 (píxeles ajustables) y presione Enter.

3. Análisis de micro-CT

  1. Inyectar ratas SD hembras (32 semanas de edad, 320-350 g) por vía intraperitoneal con pentobarbital sódico (40 mg / kg) para anestesia profunda, confirmada por ausencia de reflejo corneal (sin parpadeo al tocar el hisopo de algodón) y reflejo de dolor (sin contracción de las extremidades posteriores al pellizco de fórceps).
    1. Realizar cirugía de aislamiento de extremidades posteriores. Eutanasia a las ratas mediante inyección intraperitoneal de pentobarbital sódico a una dosis de 3-5 veces la dosis de anestésico quirúrgico (40 mg / kg), colóquelas en decúbito supino y haga una incisión transversal de 3 cm, 1 cm por encima de la sínfisis púbica a lo largo del ligamento inguinal. Diseccionar sin rodeos el espacio entre los músculos gracilis y sartorio para exponer la arteria femoral (estructura tubular pulsátil). Lite ambos extremos de la arteria femoral con suturas 4-0, dejando una sección sin ligar en el medio, antes de truncar el vaso con unas tijeras oftálmicas y seccionarlo.
    2. Gire la extremidad inferior internamente para dislocar la cabeza femoral del acetábulo y corte la cápsula articular y el ligamento redondo, preservando la integridad de la cabeza femoral. Sumerja la extremidad posterior intacta en solución salina preenfriada, luego fíjela en una solución de formaldehído al 4% durante 24-48 h.
  2. Configuración de imágenes: Entregue el fémur fijo a la instalación para la exploración por micro-CT. Encienda el dispositivo Micro-CT y seleccione el programa preestablecido Small Animal Bone Scan . Utilice los siguientes parámetros de escaneo: Voltaje de rayos X = 90 kV, Corriente de rayos X = 80 μA, Campo de visión (FOV) = 36 mm, Tamaño de píxel = 72,0 μm, Rotación = 360°, Duración del escaneo = 14 min.
  3. Coloque el fémur de la pierna izquierda de la rata fija en el portamuestras, fije la epífisis femoral que se va a fotografiar, inicie el dispositivo y espere a que se complete la autoprueba de la máquina. Inicie un escaneo de vista previa (escaneo rápido de baja resolución) para confirmar que la muestra está centrada, luego ajuste la región de interés para cubrir todo el fémur.
  4. Cuando se complete el escaneo y la fotografía, la fuente de luz de rayos X se apagará automáticamente. En este momento, el valor de radiación dentro de la máquina excede el estándar y está absolutamente prohibido sacar la muestra sin equipo de protección.
  5. Análisis de imágenes: analice los parámetros óseos (densidad mineral ósea [DMO], número trabecular) utilizando el software integrado del escáner. Guarde y exporte imágenes reconstruidas para su posterior evaluación.

4. PCR cuantitativa en tiempo real para la extracción de ARN del tejido óseo de rata

  1. Extirpar los músculos adherentes y la fascia del fémur derecho. Corta 100-200 mg de tejido óseo en trozos pequeños. Agregue 2-3 perlas de molienda y 500 μL de tampón de extracción de ARN. Homogeneizar con un molinillo de tejidos a 70 Hz durante 5 min a 4 °C.
  2. Separación de fases: Después de la centrifugación, la solución se separa en una fase acuosa superior (contiene ARN) y un precipitado oscuro inferior (contiene proteínas, ADN y polisacáridos). Transfiera cuidadosamente 500 μL del sobrenadante a un nuevo tubo de 1,5 ml sin ARNasa.
  3. Procese la solución superior obtenida del aislamiento para la extracción total de ARN de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
  4. Después de agregar isopropanol a la solución de lisis, invierta suavemente el tubo para mezclar la solución y déjelo reposar a temperatura ambiente durante 10 min. Realice una comprobación visual en este punto; si se observan precipitados de ARN floculante blanco (adheridos a la pared del tubo), indica que el ARN se ha precipitado efectivamente.
  5. Utilice una punta de pipeta de 200 μl para aspirar el líquido residual. Retenga el gránulo de ARN blanco en el fondo / pared del tubo. Vuelva a suspender el ARN en 50-100 μL de agua libre de ARNasa y guárdelo a -80 °C.
  6. Mezcle 2 μL de plantilla de ARN, 10 μL de mezcla maestra, 2 μL de DNasa y 5 μL de agua libre de nucleasas en un tubo libre de nucleasas. Mezclar suavemente pipeteando.
  7. Incubar a 37 °C durante 2 min para eliminar la contaminación del ADN genómico. Incubar a 55 °C durante 15 min. Al final de la reacción, incubar a 85 °C durante 5 min para abortar la reacción.
  8. Configure el sistema de PCR cuantitativa de fluorescencia en tiempo real colocando el ADN transcrito de forma inversa en hielo. Premezcle todos los componentes: 10 μL de qPCR SYBR Green Master Mix (sin Rox), 0,4 μL de cebador directo e imprimador inverso, y 8,2 μL de agua libre de ARNasa, divida y agregue 1 μL de ADN, manipule sobre hielo y proteja de la luz.
  9. Ejecute el programa qPCR de la siguiente manera: Predesnaturalización a 95 °C durante 5 min, 1 ciclo seguido de desnaturalización a 95 °C durante 10 s durante 40 ciclos. Realice recocido, extensión, adquisición de fluorescencia a 60 °C durante 30 s durante 40 ciclos en el canal SYBR Green. Obtenga una curva de fusión para temperatura de 65-95 °C con incrementos de 0,5 °C/paso y 5 s/paso. Los cebadores utilizados se proporcionan en la Tabla 1.

5. Preparación de animales

  1. Obtener 48 ratas SD nulíparas hembras (grado SPF, 8 semanas de edad, peso corporal 200-220 g).
  2. Antes de los procedimientos experimentales, aclimatar a todas las ratas con un período de cuarentena de 7 días en una instalación de aislamiento de grado SPF y alojarlas en un entorno de laboratorio controlado por SPF (temperatura: 22-24 °C, humedad: 45%-55%).

6. Preparación del fármaco de ensayo

  1. Obtenga el líquido oral Chai hu (Aprobación Nacional de Productos Médicos de China No. Z41021539). La formulación contiene Chai hu (fuente del norte) como ingrediente activo, con excipientes que incluyen agente aromatizante, sacarosa y propilenglicol. Cada vial de 10 ml contiene un extracto equivalente a 10 g de hierba cruda.

7. Preparación del modelo de rata ovariectomizada

  1. Preparación preoperatoria: Ratas rápidas durante 12 h con acceso ad libitum al agua. Realice la esterilización de instrumentos mediante autoclave de todas las herramientas quirúrgicas.
  2. Anestesia y preparación: Administrar pentobarbital sódico por inyección intraperitoneal (40 mg/kg). Verifique la profundidad de la anestesia evaluando la ausencia del reflejo corneal (sin parpadeo al tocar la córnea con un hisopo de algodón) y la ausencia del reflejo de pellizco del dedo del pie (sin retracción de las extremidades posteriores al pinzar). Después de 15-20 min, afeitar el sitio quirúrgico, desinfectar con yodo y cubrir con un paño fenestrado. Aplique ungüento ocular de vitamina A (que contiene 15,000 UI / g) durante la operación para evitar que los ojos del animal se sequen (Tabla 2).
  3. Modelo de rata ovariectomizada: Realice la cirugía en un quirófano estéril dedicado. Todo el personal llevaba batas de aislamiento completas. Limpie la encimera y el equipo circundante con etanol al 75% (Tabla 2) antes de la cirugía y encienda las lámparas ultravioleta durante al menos 30 minutos para eliminar los microbios en el aire y en las superficies.
    1. Haga una incisión de 1 cm en la piel dorsal, diseccione sin rodeos el tejido subcutáneo, pellizque la capa muscular y haga una incisión de 1 cm. Localice la almohadilla de grasa y exteriorícela para identificar el ovario (de color rojo brillante). Ligue la trompa de Falopio con sutura 4-0, extirpe el tejido ovárico y colóquelo en un tubo centrífugo de 50 ml que contenga paraformaldehído al 4% (Tabla 2).
  4. Cierre y desinfección de heridas: Espolvoree polvo de penicilina en la herida antes de suturar. Sutura la capa muscular con la sutura no absorbible No. 6 y cierra la piel con la sutura No. 2. Desinfecte la incisión cerrada con yodo y aplique penicilina tópica en polvo.
  5. Cuidados postoperatorios: Coloque a las ratas en jaulas frescas con botellas de agua tibia y toallas para mantener la temperatura corporal. Animales rápidos (se permite agua) durante 24 h después de la cirugía para prevenir la obstrucción intestinal. Aplique polvo de penicilina en el sitio de la incisión diariamente durante 3 días consecutivos.
    1. Inyecte lidocaína (concentración de 1% a 2%, máximo 5 mg / kg) alrededor de la incisión quirúrgica para reducir el dolor postoperatorio inmediato. Proporcionar analgesia continua durante 3-5 días, disminuyendo la dosis gradualmente en función de la gravedad del dolor para evitar la interrupción brusca.
    2. Mantenga al animal en posición lateral o con la cabeza hacia abajo antes de despertarse para evitar la caída de la lengua y la obstrucción de las vías respiratorias; Permite un posicionamiento cómodo y autónomo después de despertarse. Aísle los animales postoperatorios de los demás hasta su recuperación completa para evitar peleas o infecciones cruzadas (Figura 1).

8. Agrupación experimental y administración de fármacos

  1. Asignación de grupos: Divida un total de 40 ratas SD en cinco grupos (n = 8 por grupo), a saber, control normal, control modelo, Chai hu de baja concentración, Chai hu de concentración media y Chai hu de alta concentración.
  2. Para el grupo de dosis media (5 ml / kg), seleccione la dosis según las pautas encontradas en29,30. Siga una ración de gradiente de concentración de 1:2:4 para el grupo de baja concentración: 2,5 mL/kg, el grupo de concentración media: 5 mL/kg y el grupo de alta concentración: 10 mL/kg.
  3. Administración del medicamento: Use sonda oral y administre el medicamento una vez al día. Para el grupo de control normal y el grupo de control modelo (animales sometidos a ovariectomía bilateral), realice una sonda oral con una cantidad igual de solución salina. Comience el tratamiento en la semana 1 después de la cirugía y continúe durante 12 semanas.

9. Análisis posterior al experimento y recopilación de datos

  1. Realizar los siguientes análisis en cinco grupos de animales: micro-CT de la estructura ósea y determinación de la expresión de ARNm de citoquinas inflamatorias en tejidos femorales de rata.
  2. Recopilar datos que incluyan imágenes visualizadas de la microestructura trabecular femoral; parámetros óseos cuantitativos (incluida la densidad mineral ósea, la fracción de volumen óseo, la desviación estándar del grosor trabecular, el espaciado trabecular, el número trabecular y la densidad de conectividad); y niveles relativos de expresión de ARNm de citocinas proinflamatorias (IL-6, IL-17) y citocinas antiinflamatorias (IL-4, IL-10) en tejidos femorales.
  3. Realice análisis de datos utilizando el software GraphPad Prism 10.1.2 mediante análisis de varianza unidireccional (ANOVA). La significación estadística para las diferencias de medias entre grupos se definió como p < 0,05. Se realizaron comparaciones múltiples post-hoc mediante la prueba de Tukey.

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Análisis de enriquecimiento de la función GO y la vía KEGG

Nos basamos en el análisis de enriquecimiento de GO y KEGG en bioinformática para predecir el mecanismo de acción potencial de Chai Hu en PMOP. El análisis de enriquecimiento de GO de genes diana que se cruzan con los ingredientes activos de Chai hu para enfermedades produjo 2138 entradas significativas, y los diez principales resultados significativos se enumeran para cada grupo (...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La PMOP es un trastorno sistémico del metabolismo óseo que ocurre a menudo en mujeres con MP, y es causada por una falta de estrógeno que resulta en una alteración del equilibrio osteoblasto-osteoclasto, lo que lleva a una mayor reabsorción ósea de osteoclastos y una disminución de la producción ósea de osteoblastos31. Un número creciente de estudios ha demostrado que los niveles de factores inflamatorios en el cuerpo también afectan la diferenciación entre osteoc...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores declaran que no hay conflicto de intereses.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este trabajo fue apoyado por el Programa de Investigación Científica y Desarrollo Tecnológico de la Ciudad de Baise, y el Proyecto de Mejora de la Capacidad Básica de Investigación Científica de Maestros Jóvenes y de Mediana Edad de las Universidades de Guangxi 2025 (Proyecto No.: 2025KY0549). Los autores agradecen al Dr. Dev Sooranna del Imperial College de Londres y YMUN por la edición del manuscrito. ZY y LYR contribuyeron igualmente a este trabajo.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Inyección de cloruro de sodio al 0,9%HuarenfarmacéuticaH1712059
1&veces; PBS Termopescador10010023
75% de alcohol NanjingreagentC069156931
95% etanolNanjingreagentC0691520075
Etanol anhidroMacklinE809056
Bupleurum chinense Farmacia Henan Baiquan Co.Z41021539
solución de descalcificación SolarBioE1171
ungüento de eritromicina Guangzhou Baiyunshan Pharmaceutical Group Company Limited Fábrica farmacéutica Baiyunshan HejigongH44023088
Alcohol isopropílico Jinan Jinrihe Chemical Co.23727-29-9
cápsulas de penicilina V potásicaFarmacéutica de SichuanH20103156
poliformaldehído (CH2O)nTiempo de beyo.P0099
desinfectante de povidona yodadaCompañía farmacéutica Guangdong HengjianH44023924
Kit de PCR de fluorescencia en tiempo realYeasen Biotecnología11201ES03
Kit de extracción de ARNMonadbiotechMI20201S
Kit de transcripción inversa de ARNYuGongBiotechEG15123S
Pentobarbital sódicoCompañía de Biotecnología Jixiang de ShangháiJX082085
Trizol Termopescador15596026CN

References

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