Artículo de método

Ensayo de dilución FRET para analizar el intercambio dinámico entre conjuntos de proteínas

DOI:

10.3791/68678

⸱

19 de septiembre de 2025

 , 
1Department of Molecular, Cellular and Developmental Biology and the Institute for Collaborative Biotechnologies, University of California, Santa Barbara

En este artículo

Resumen

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Este protocolo describe la purificación y el etiquetado covalente de la reflectina A1, así como un ensayo de dilución FRET para caracterizar el intercambio dinámico de la proteína reflectina entre conjuntos de proteínas en función de la edad.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Como impulsor molecular de la iridiscencia sintonizable en cefalópodos, el comportamiento de la fase sintonizable de la proteína reflectina A1 sigue siendo un foco de la ingeniería de biomateriales. La modulación de la concentración de sal y la densidad de carga neta de proteínas de la reflectina A1 impulsa a la proteína a formar ensamblajes dinámicos como intermedios para la separación de fases líquido-líquido. Los ensamblajes de reflectina, aunque limitados en tamaño por el grado de neutralización de carga de la repulsión catiónica de la proteína catiónica, están inicialmente en intercambio dinámico con monómeros u oligómeros de la solución circundante. Se utilizó un nuevo ensayo de dilución de transferencia de energía de resonancia de fluorescencia (FRET), junto con ensayos de dispersión dinámica de luz (DLS) y concentración de proteínas, para caracterizar el flujo bidireccional de proteínas entre los ensamblajes de reflectina A1 y una fase diluida en función de la edad de ensamblaje. Este ensayo de dilución FRET distingue entre el flujo unidireccional y bidireccional de proteínas dentro y fuera de los conjuntos de proteínas y, por lo tanto, se puede aplicar durante la formación del ensamblaje. Diferenciar entre ensamblajes de proteínas dinámicos y cinéticamente detenidos es crucial para comprender sus orígenes biofísicos, y este nuevo ensayo de dilución FRET se puede adaptar para complementar las investigaciones biofísicas de otros ensamblajes de proteínas.

Introducción

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La iridiscencia sintonizable en calamares loligínidos está mediada por proteínas reflectinas en células de iridocitos 1,2,3. Los iridocitos contienen invaginaciones de membrana extensas y regulares que forman pilas de laminillas de Bragg densas en proteínas, que reflejan la luz de una manera dependiente del ángulo y la longitud de onda 1,4,5,6. Una cascada de señales activada por acetilcolina culmina en la fosforilación de las proteínas de reflectina catiónica 1,2,7, reduciendo la repulsión electrostática intra e interproteica e impulsando la condensación de reflectinas en las láminas de Bragg de partículas de radio hidrodinámico de 10-50 nm a un condensado líquido denso 3,8,9. La reflectina A1 in vitro forma conjuntos de radio de 10+ nm de tamaño estable cuyos tamaños se ajustan con precisión mediante la densidad de carga neta de proteínas 10,11,12, y este comportamiento coloidal sintonizable ha generado mucho interés en la bioingeniería en el diseño de materiales biofotónicos sintonizables basados en reflectina 13,14,15,16,17,18. Recientemente se demostró que el NaCl impulsa el ensamblaje de reflectina A1 y LLPS (separación de fase líquido-líquido) aumentando entrópicamente la contribución energética del efecto hidrofóbico y cribando las cargas repulsivas de los enlazadores catiónicos alternos19.

Para condensados similares a líquidos densos en proteínas, el intercambio dinámico entre la fase densa y la fase diluida se puede analizar fácilmente utilizando FRAP (recuperación de fluorescencia después del fotoblanqueo) de gotas enteras20; Se necesita un ensayo análogo para ensamblajes de proteínas a escala nanométrica. Informes recientes de ensamblajes de proteínas fisiológicamente relevantes como intermedios de LLPS 19,21,22 sugirieron la necesidad de métodos equivalentes para interrogar la dinámica de ensamblaje y el intercambio dinámico entre ensamblajes y la fase diluida coexistente. Los grupos de proteínas pueden incluir coloides similares al vidrio detenidos cinéticamente producidos por la descomposición espinosa detenida, ensamblajes de equilibrio dinámico que intercambian monómeros u oligómeros de la fase diluida y grupos metaestables 23,24,25,26,27. Por lo tanto, la dinámica de ensamblaje de proteínas dependiente de la edad es clave para comprender los procesos físicos que impulsan la formación de ensamblajes de proteínas en el contexto de un comportamiento de fase más complejo.

Se han utilizado enfoques basados en FRET que analizan la interacción entre los ensamblajes de proteínas marcadas con fluoróforos de donantes y los ensamblajes de proteínas marcadas con fluoróforos aceptores para caracterizar la dinámica de grupos de proteínas metaestables21. Al mezclar estos grupos, la aparición de FRET demuestra el intercambio y el transporte de proteínas a los grupos21. Sin embargo, para algunas proteínas, como la reflectina A1, los grupos se forman y crecen continuamente durante la duración del experimento19. Para tales proteínas, se necesita un enfoque que desconvolucione el transporte unidireccional de proteínas en grupos, como podría ocurrir durante la formación continua de grupos detenidos dinámicamente, y el transporte bidireccional de proteínas entre ensamblajes.

Un enfoque de dilución de FRET logra esto a través de la dilución de fluoróforos (Figura 1), en la que una disminución en FRET significa transporte bidireccional de proteínas entre ensamblajes. Se prepararon conjuntos de proteínas de la proteína reflectina que contenían cantidades iguales de proteína marcada con fluoróforo aceptor o fluoróforo donante. Estos ensamblajes de reflectina comarcados se diluyeron con una solución que contenía ensamblajes de reflectina no marcados, y se analizó el intercambio dinámico de proteínas entre ensamblajes en función de la edad de ensamblaje. Este método distingue la formación continua de grupos de proteínas detenidas cinéticamente de los grupos dinámicos, incluidos, entre otros, grupos metaestables, grupos que crecen debido a la maduración de Ostwald o procesos de engrosamiento similares, grupos que crecen por fusión y grupos que no son intermedios a LLPS. No solo distingue entre estos diferentes mecanismos de intercambio dinámico, lo que requiere métodos ortogonales como la dispersión dinámica de la luz, el análisis de seguimiento de nanopartículas (NTA) y los ensayos de Bradford19,21. Este protocolo describe métodos para la purificación de reflectina A1 de tipo salvaje y el mutante único que contiene cisteína A1-C232S, el marcado covalente de A1-C232S y el análisis de dilución FRET.

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Protocolo

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Los reactivos y el equipo utilizado se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Purificación de proteínas y etiquetado covalente

  1. Transformación
    1. Clone los genes reflectina A1 y reflectina A1 C232S (GenBank KF661517.1) en los plásmidos pj411.
    2. Transfecte células Rosetta 2 (DE3) con plásmidos mediante tratamiento de choque térmico28.
    3. Placas transfectadas de células en agar que contienen 50 μg/mL de kanamicina.
    4. Seleccione una colonia aislada y agregue a 5 ml de TB (Terrific Broth) que contenga 50 μg / ml de kanamicina e incube a 37 ° C en un agitador a 250 rpm durante la noche.
    5. Aísle plásmidos utilizando el protocolo del kit de aislamiento de plásmidos para la secuenciación.
  2. Expresión de proteínas, lisis y purificación del cuerpo de inclusión
    1. Agregue 5 ml de cultivo a 1 L LB (caldo de lisogenia) con 50 μg / ml de kanamicina e incube a 37 ° C mientras agita. A un A600 de 0,6-0,7, induzca la expresión agregando IPTG (isopropil-β-D-tiogalactopiranósido) a una concentración final de 5 mM.
    2. Después de 16 h, las células de pellets se centrifugaron a 12.000 x g durante 10 min. Decantar sobrenadante y congelar los pellets de celda en un congelador a -80 ° C.
    3. Lisar las células y purificar los cuerpos de inclusión utilizando un reactivo de purificación de cuerpos de inclusión según el protocolo del fabricante, incluido un tratamiento de 20 minutos con 1 μL (25-29 unidades) de benzonasa y 3-5 KU de lisozima por ml de reactivo de purificación del cuerpo de inclusión después de la resuspensión inicial del sedimento celular. Los cuerpos de inclusión purificados aparecerán como gránulos de color marrón oscuro.
  3. FPLC (Cromatografía líquida rápida de proteínas)
    1. Preparar 2 L de urea 8 M: solución de ácido acético al 5% v/v (Tampón A) y 1 L de clorhidrato de guanidinio 8 M: solución de ácido acético al 5% v/v (Tampón B). Filtre ambos con un filtro de matraz de vacío de 0,22 μm.
      PRECAUCIÓN: Evite la inhalación, el contacto con los ojos y la piel con clorhidrato de guanidinio y use el EPP (equipo de protección personal) adecuado cuando lo manipule. Deséchelo en un contenedor de residuos dedicado.
    2. Resuspender los gránulos del cuerpo de inclusión en urea 8 M: solución de ácido acético al 5% mediante agitación vigorosa con una barra de agitación magnética. La solución parecerá turbia. Centrifugar previamente a 4 °C, centrifugar a 18.000 x g a 4 °C durante 70 min y recoger sobrenadante para FPLC. El sobrenadante aparecerá marrón y transparente.
    3. Utilizando un caudal de 2 ml/min para todos los pasos siguientes, equilibre 10 ml de la columna de intercambio catiónico con 5 volúmenes de columna (CV) de tampón A al 95 %, tampón B al 5 % y cargue la muestra. Lave la muestra no unida con 5 CV, luego realice el gradiente escalonado: 5 CV de tampón A al 94% / tampón B al 6%, luego 5 CV tampón B al 10%. La reflectina A1 eluye al 10% del tampón B.
    4. Evalúe la pureza de las fracciones correspondientes al cambio de paso inicial al 10% del tampón B mediante SDS-PAGE y agrupe si es similar. Preenfríe una centrífuga a 4 °C y concentre las fracciones hasta un volumen final de 4-5 ml utilizando un concentrador de centrifugación MWCO de 15 ml y 10 kDa.
  4. HPLC (cromatografía líquida de alta resolución)
    1. Prepare 2 L de agua de 18 mΩ con ácido trifluoroacético (TFA) al 0,1% y 2 L de acetonitrilo con TFA al 0,1%. Filtre ambos con un filtro de matraz de vacío de 0,22 μm.
      PRECAUCIÓN: El TFA es un ácido humeante fuerte. Manipule en una campana extractora, use el EPP adecuado y transfiera solo con vidrio. Evite la inhalación, el contacto con los ojos y la piel con acetonitrilo, y use el EPP adecuado cuando lo manipule. Deséchelo en un contenedor de residuos dedicado.
    2. Usando un caudal de 1 ml / min para todos los pasos siguientes, equilibre la columna C4 con 5 CV de 85% de agua de 18 mΩ, 0.1% de TFA y 15% de acetonitrilo, 0.1% de TFA.
    3. Comience a fluir e inyecte la muestra. Fluya 2 CV, luego comience un gradiente constante a 80% acetonitrilo, 0.1% TFA sobre 5 CV. La reflectina A1 generalmente eluye al 73% de acetonitrilo.
    4. Fracciones de congelación de cáscara que contienen proteína reflectina en tubos de 5 ml utilizando un baño de etanol y hielo seco. Liofilizar y almacenar a - 80 °C. La proteína aparecerá como finas láminas blancas.
  5. Preparación de caldo de proteínas sin etiquetar
    1. Prepare 4 L de tampón de ácido acético pH 4, 25 mM (21,05 mM de ácido acético, 3,95 mM de acetato de sodio trihidratado) utilizando ácido acético glacial y acetato de sodio trihidrato. Ajuste el pH si es necesario con HCl 4 M o NaOH 4 M. Filtre con un filtro de vacío de 0,22 μm.
      PRECAUCIÓN: Manipule ácidos/bases fuertes con el EPP adecuado. Nunca agregue agua a un ácido fuerte concentrado o base.
    2. Descongele el tubo que contiene la proteína reflectina liofilizada y, con el tubo en un baño de hielo, resolubilice con tampón de ácido acético pH 4, 25 mM. Una solución proteica completamente resolubilizada aparecerá incolora sin turbidez o precipitado visible.
      1. Utilizando un casete de diálisis de corte de peso molecular de 10 kDa, dialice la proteína reflectina resolubilizada en un volumen de muestra de pH 4, tampón de ácido acético de 25 mM preenfriado a 4 °C utilizando dos cambios de 12 h a 4 °C.
    3. Diluir la muestra con un tampón de ácido acético pH 4, 25 mM para obtener una concentración final de proteína de 100 μM y un volumen final de al menos 150 μL. Con un espectrómetro UV-VIS, mida la absorbancia a 280 nm y utilice el coeficiente de absorción molar29 de la reflectina A1 (123.685 M-1 cm-1) para determinar la concentración de proteínas.
    4. Transfiera el caldo de proteína reflectina a un tubo de microcentrífuga con tapón a presión de 0,5 ml y guárdelo a 4 °C hasta 7 días. Inmediatamente antes de los experimentos, centrifugar el stock de proteínas reflectin a 4 °C en una microcentrífuga preenfriada a 18.000 x g durante 15 min. Prepare el material reflectin A1 C232S de manera similar utilizando el coeficiente de absorción molar de 123,540 M-1 cm-1.
  6. Etiquetado de proteínas
    1. Prepare por separado existencias de 10 mg/ml de FMTS (metanosulfonato de fluoresceína) y SRMT (metanetilsulfonato de sulforrodamina) agregando 1 ml de dimetilsulfóxido seco (DMSO) a un vial que contenga 10 mg de mezcla de sonda fluorescente y pipeta.
      PRECAUCIÓN: Evite la inhalación, el contacto con los ojos y la piel con los reactivos de metanoetiosulfonato.
    2. Agregue 7,7 μl de la reserva de 10 mg/ml de FMTS o 10,4 μl de la reserva de 10 mg/ml de SRMT a un tampón de ácido acético de pH 4, 25 mM hasta un volumen final de 150 μl y una concentración final de 500 μM de FMTS o SRMT. La solución parecerá turbia. Alícuotas y congelar el resto de las existencias de sondas fluorescentes a -80 °C.
    3. Combinar con 150 μL de caldo de proteína de reflectina 100 μM y pipetear bien la mezcla. La concentración final de proteínas es de 50 μM y la concentración final de la sonda fluorescente es de 500 μM. La turbidez de la solución disminuirá.
    4. Envuelva en papel de aluminio e incube en posición vertical con agitación orbital suave a temperatura ambiente durante 4 h, luego durante la noche a 4 ° C. La turbidez de la solución no debería cambiar.
    5. Si hay algún precipitado, vuelva a suspender mezclando vigorosamente las pipetas. La solución será turbia. Concentre la reflectina utilizando un filtro centrífugo MWCO de 10.000 kDa hasta un volumen objetivo de 100 μL y una concentración de 150 μM.
    6. Utilice el mismo método de HPLC y liofilización que para la purificación de proteínas para eliminar la sonda fluorescente no unida y almacenar la proteína a -80 °C envuelta en papel de aluminio. Resolubilice la proteína marcada utilizando el mismo método para la proteína no marcada. Determine el grado de etiquetado.
      NOTA: La proteína reflectina resolubilizada marcada con fluorescencia aparecerá de color amarillo verdoso (C199-F) o rojo oscuro (C199-R) sin turbidez ni precipitación.
  7. Preparación de caldo de proteína co-marcado
    1. Agregue 27 μL de caldo de proteína A1 de 100 μM a una microcentrífuga de tapón a presión de 0,5 ml.
    2. Agregue 1,5 μl de reflectina A1-C232S marcada con fluoresceína (denominada C199-F para indicar la posición de aminoácidos de la fluoresceína) al mismo tubo.
    3. Agregue 1,5 μl de reflectina A1-C232S marcada con sulforrodamina (denominada C199-R para indicar la posición de aminoácidos de la fluoresceína) al mismo tubo. Las concentraciones finales son 90 μM A1, 5 μM C199-F y 5 μM C199-R.
    4. Envuelva en papel de aluminio y guárdelo a 4 °C hasta 7 días.

2. Series temporales FRET

  1. Preparación de tampones y filtración
    1. Preparar 500 ml de tampón de ácido 3-(N-morfolino)propanosulfónico (MOPS) 25 mM. Ajuste el pH de la solución a 7 agregando lentamente hidróxido de sodio 4 M. Filtre 10 ml con una jeringa de 10 ml y un filtro de jeringa de 0,22 μm.
  2. Centrifugación de proteínas
    1. Preenfríe la microcentrífuga de sobremesa a 4 °C. La centrífuga sin etiquetar y coetiquetada contiene reflectina A1 a 18.000 x g durante 15 min a 4 °C.
  3. Preparación de ensamblajes A1 etiquetados
    1. Para preparar tres réplicas, pipetee 9,6 μl de tampón MOPS (pH 7, 25 mM) en tres tubos de microcentrífuga con tapón a presión de 0,5 ml.
    2. Agregue 0,4 μl de caldo de proteína marcado a cada tubo que ya contenga 9,6 μl de tampón MOPS hasta una concentración final de proteína de 4 μM. Pipetee lentamente la mezcla dos veces aspirando y dispensando todo el volumen de muestra.
    3. Envuelva inmediatamente en papel de aluminio y colóquelo en la incubadora a 25 °C. Esta y todas las siguientes soluciones de ensamblajes carecen de turbidez o precipitación aparentes antes o después de la incubación.
  4. Preparación de ensamblajes A1 sin etiquetar
    1. Para preparar tres réplicas, pipetee 38,4 μl de tampón MOPS en tres tubos de microcentrífuga de 0,5 ml con tapón a presión.
    2. Agregue 1,6 μl de reserva de proteína reflectina A1 a cada tubo que ya contenga 38,4 μl de tampón MOPS hasta una concentración final de proteína de 4 μM. Pipetee lentamente la mezcla dos veces aspirando y dispensando todo el volumen de la muestra.
    3. Envuelva inmediatamente en papel de aluminio y colóquelo en la incubadora a 25 °C.
  5. Temporización y mezcla de conjuntos A1 comarcados y no etiquetados
    1. Ordene la preparación de los ensamblajes de la siguiente manera: prepare simultánea y separadamente los ensamblajes de reflectina experimental co-marcada y uno experimental sin etiquetar. Repita los pasos 2.3 y 2.4.
    2. Mezcle agregando 40 μl de ensamblaje A1 experimental sin etiquetar a 10 μl de experimental comarcado respectivo, y pipetee suavemente la mezcla aspirando y dispensando todo el volumen dos veces. Las mediciones se realizarán 24 h después de este paso.
    3. El tiempo entre la conducción del ensamblaje de la reflectina A1 por dilución en el tampón MOPS (pH 7, 25 mM) y la mezcla de conjuntos marcados y no marcados es la edad de ensamblaje. Las edades de los ensamblados usados para estos datos fueron 0 min, 1 min, 10 min, 30 min, 60 min, 120 min, 180 min, 540 min, 1080 min y 1620 min.
  6. Mandos
    1. Control positivo
      1. A partir de las existencias de proteínas A1 y marcadas, prepare 20 μL de existencias de proteínas que sean 80 μM A1 y 20 μM existencias de proteínas comarcadas.
      2. Agregue 38,4 μl de tampón MOPS a tubos de microcentrífuga con tapón a presión de 0,5 ml, luego agregue 1,6 μl de proteína marcada con A1/20 μM de 80 μM y mezcla de pipeta dos veces aspirando lentamente y dispensando todo el volumen. Cubrir inmediatamente con papel de aluminio y colocar en la incubadora a 25 °C. Repita para un total de 9 muestras.
    2. Control negativo
      1. Agregue 0,4 μl de material etiquetado a un tubo de microcentrífuga con tapón a presión de 0,5 ml que ya contenga 9,6 μl de tampón MOPS. Pipetee lentamente la mezcla dos veces aspirando y dispensando todo el volumen de la muestra.
      2. Agregue 40 μL de tampón MOPS y mezcla de pipeta dos veces aspirando y dispensando todo el volumen de muestra. Cubrir inmediatamente con papel de aluminio y colocar en la incubadora a 25 °C. Repita para un total de 9 muestras.
  7. Cubeta y tampón en blanco
    1. Configure el fluorímetro para excitar a 488 nm y registre espectros continuos de 520 a 700 nm.
    2. Llene una cubeta limpia de microfluorímetro de cuarzo con 50 μL de tampón MOPS (pH 7, 25 mM) y mida.
    3. Retire el búfer.
  8. Procedimiento experimental
    NOTA: Todos los experimentos deben registrarse 24 h después de mezclar conjuntos de reflectina A1 comarcados y no marcados. Pipetear suavemente 50 μL de la solución experimental en la cubeta y medir.
    1. Retire la muestra, enjuague con tampón de ácido acético de 500 μL y, a continuación, con 500 μL de agua de 18 mΩ filtrada a 0,22 μm. Realice el búfer en blanco.
  9. Mandos
    1. Mida a 1440 min, 1960 min y 3060 min después de preparar los controles (correspondientes a las edades de ensamblaje de 0 min, 520 min y 1620 min). Estas mediciones concluyen la parte experimental del protocolo.

3. Análisis de datos

  1. Reste los espectros del blanco de la zona de influencia de los espectros experimentales.
  2. Determine la relación de Em588/Em520.
  3. Para cada réplica, determine la media y la desviación estándar de cada grupo de tres réplicas. Parcela Em588/Em520 en función de la edad de montaje.

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Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Después de diluir los conjuntos de reflectina A1 que contenían tanto la proteína marcada con fluoróforo del donante como la proteína marcada con fluoróforo aceptor con conjuntos de reflectina A1 no marcados, se observó una disminución inicial en la emisión de FRET a 588 nm en relación con los ensamblajes sin diluir (Figura 2A). FRET para ensamblajes de 0 min de edad fue similar al control positivo, y FRET para ensamblajes de 1620 min de edad (el tiempo entre la formación del ensamblaje y la ...

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Discusión

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Un punto común de pérdida de proteínas durante la purificación es la resuspensión incompleta de los gránulos del cuerpo de inclusión para todos los pasos del protocolo de purificación del cuerpo de inclusión, y la resuspensión final de los cuerpos de inclusión purificados en urea 8 M al 5% v/v ácido acético. La resolubilización del cuerpo de inclusión puede llevar hasta 24 h de agitación vigorosa con una pequeña barra de agitación magnética en un tubo cónico de 40 ml. Para evitar una pér...

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Divulgaciones

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La investigación fue apoyada por el Instituto de Biotecnologías Colaborativas a través de las subvenciones W911NF-19-2-0026 y W911NF-23-1-0330 de la Oficina de Investigación del Ejército de los EE. UU. El contenido de la información no refleja necesariamente la posición o la política del Gobierno, y no debe inferirse ningún respaldo oficial.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
10 μ Micropipeta de capacidad L
2 μ Micropipeta de capacidad L
2-[(5-fluoresceinil)aminocarbonil]etil metaniliosulfonatoSanta Cruz BiotechnologiesSC-216155CAS  351330-42-2
20 μ Micropipeta de capacidad L
200 μ Micropipeta de capacidad L
Ácido 3-(N-Morfolino)propanosulfónico, 4-MorfolinoÁcido propanosulfónicoSigma-AldrichM1254CAS 1132-61-2
Ácido acéticoSigma-AldrichA6283CAS 64-19-7
AcetonitriloSigma-Aldrich34851-1LCAS 75-05-8
Agar en polvoCarolina Biological842133CAS 9002-18-0
Papel de aluminio
Filtro centrífugo Amicon Ultra, 10 kDa MWCOMillipore SigmaUFC501008Capacidad de 0,5 ml
Filtro centrífugo Amicon Ultra, 10 kDa MWCOMillipore SigmaUFC90100815 ml de capacidad
balanza analítica
BenzonasaMillipore-Sigma70664-3CAS 9025-65-4
Reactivo de extracción de proteínas BugBusterMillipore Sigma70584-3
Espectrómetro de fluorescencia Cary EclipseCary-Eclipse
Cary Eclipse Software
Tubos de centrífuga Corning de 50 mlMillipore-SigmaCLS430829
Jeringas desechables, Luer-Lok 10 mLCole-ParmerUX-12915-02
DMSOSigma-AldrichD8418CAS 67-68-5
Hielo seco
Sistema FPLC de doble bomba
Sistema HPLC de doble bomba
EtanolMillipore SigmaEX0280-3CAS 64-17-5
Rotor centrífugo de pie de 500 ml de capacidad vial
Centrífuga de pie 
Congelador, -80° C
Campana extractora
Clorhidrato de guanidinaThermo ScientificAAA135430B50-01-1
Columna de cromatografía de intercambio catiónico HiTrap SP HPCytiva17115101
Ácido clorhídricoSigma-Aldrich258148-25MLCAS 7647-01-0
Incubadora
Isopropilo β-D-1-tiogalactopiranósidoSigma-AldrichI6758-1G
Sulfato de kanamicinaSigma-AldrichK1637CAS 25389-94-0
Liofilizador
LisozimaThermo Scientific90082
Barra de agitación magnética
Placa de agitación magnética
Micro electrodo de pH S7Metler Toledo51343160
Microcentrífuga con control de temperatura
Filtro de jeringa de PVDF MillexMilliporeSLGVR33RS0.22 μ m, 33 mm de diámetro.
Filtro Milli-Q MillipakMillipore SigmaMPGP002A1
Sistema de purificación de agua ultrapura Milli-QMillipore Sigma
NaClThermo ScientificAA12314A9CAS 7647-14-5
Frascos centrífugos Nalgene, estilo 3120Millipore-SigmaB1283-4EAPara granular bacterias
Laboratorio orbital  agitador con incubadora
PC
Placas de PetriSigma-AldrichP5731-500EA
Plásmido PJ411ADN 2.0
Proteína LoBind  Tubos cónicosEppendorfEP30108302Capacidad de 5 ml
Proteína LoBind  Tubos de microcentrífugaEppendorfEP022431102Capacidad de 0,5 ml
Matraz Erlenmeyer con deflectores Pyrex 1.000 mlMillipore-SigmaCLS44501Para incubar cultivos bacterianos
Vasos de precipitados Pyrex Griffin 2.000 mLMillipore-SigmaCLS10002LPara todas las preparaciones de tampón y solución
Botellas redondas de almacenamiento de medios Pyrex 1.000 mlMillipore-SigmaCLS13951LPara el almacenamiento de todo el tampón y la preparación de la solución, utilícelo con filtros de matraz de vacío
Qiaprep Spin Miniprep KitQiagen27104
Refrigerador
Células competentes de Rosetta 2(DE3)Novagen71397-3
Casetes de diálisis Slide-a-lyzer 10K MWCOThermo ScientificPI66383Capacidad de 0,5 ml
Acetato de sodio trihidratoSigma-AldrichS8625CAS 6131-90-4
Hidróxido sódicoSigma-Aldrich567530-250GMCAS 1310-73-2
Filtro superior de botella de vacío SteritopMillipore SigmaS2GPT05RE0.22 μ Filtro estéril M
Submicrocubeta, capacidad de 50 uLCélulas Starna16.40F-Q-10/Z15
metanoetiosulfonato de sulforodaminaSanta Cruz BiotechnologiesSC-220172CAS  386229-71-6
Ácido trifluoroacéticoSigma-Aldrich106232-25GCAS 407-25-0
TriptonaSpectrum Chemical T1333
UreaThermo ScientificAAA123600ECAS 57-13-6
Espectrómetro UV-VIS
Extracto de levaduraGibco211929

Referencias

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